Forbidden

You don't have permission to access /zzz_siteguard.php on this server.

“–јЌ—‘≈ ÷»ќЌЌјя  ќћѕќ«»÷»я ƒЋя ¬џ—Ў»’ Ё” ј–»ќ“Ќџ’  Ћ≈“ќ ,  ќћѕЋ≈ — Ќ” Ћ≈»Ќќ¬ќ…  »—Ћќ“џ, ѕ–»√ќƒЌџ… ¬  ј„≈—“¬≈  ќћѕќЌ≈Ќ“ј “–јЌ—‘≈ ÷»ќЌЌќ…  ќћѕќ«»÷»»,  ќЌЏё√ј“, ѕ–»√ќƒЌџ… ¬  ј„≈—“¬≈  ќћѕќЌ≈Ќ“ј “–јЌ—‘≈ ÷»ќЌЌќ…  ќћѕќ«»÷»», ЁЌƒќ—ќћќЋ»“»„≈— »… ѕ≈ѕ“»ƒ, ѕ–»√ќƒЌџ… ¬  ј„≈—“¬≈  ќћѕќЌ≈Ќ“ј “–јЌ—‘≈ ÷»ќЌЌќ…  ќћѕќ«»÷»» - ѕатент –‘ 2138553
√лавна€ страница  |  ќписание сайта  |   онтакты
“–јЌ—‘≈ ÷»ќЌЌјя  ќћѕќ«»÷»я ƒЋя ¬џ—Ў»’ Ё” ј–»ќ“Ќџ’  Ћ≈“ќ ,  ќћѕЋ≈ — Ќ” Ћ≈»Ќќ¬ќ…  »—Ћќ“џ, ѕ–»√ќƒЌџ… ¬  ј„≈—“¬≈  ќћѕќЌ≈Ќ“ј “–јЌ—‘≈ ÷»ќЌЌќ…  ќћѕќ«»÷»»,  ќЌЏё√ј“, ѕ–»√ќƒЌџ… ¬  ј„≈—“¬≈  ќћѕќЌ≈Ќ“ј “–јЌ—‘≈ ÷»ќЌЌќ…  ќћѕќ«»÷»», ЁЌƒќ—ќћќЋ»“»„≈— »… ѕ≈ѕ“»ƒ, ѕ–»√ќƒЌџ… ¬  ј„≈—“¬≈  ќћѕќЌ≈Ќ“ј “–јЌ—‘≈ ÷»ќЌЌќ…  ќћѕќ«»÷»»
“–јЌ—‘≈ ÷»ќЌЌјя  ќћѕќ«»÷»я ƒЋя ¬џ—Ў»’ Ё” ј–»ќ“Ќџ’  Ћ≈“ќ ,  ќћѕЋ≈ — Ќ” Ћ≈»Ќќ¬ќ…  »—Ћќ“џ, ѕ–»√ќƒЌџ… ¬  ј„≈—“¬≈  ќћѕќЌ≈Ќ“ј “–јЌ—‘≈ ÷»ќЌЌќ…  ќћѕќ«»÷»»,  ќЌЏё√ј“, ѕ–»√ќƒЌџ… ¬  ј„≈—“¬≈  ќћѕќЌ≈Ќ“ј “–јЌ—‘≈ ÷»ќЌЌќ…  ќћѕќ«»÷»», ЁЌƒќ—ќћќЋ»“»„≈— »… ѕ≈ѕ“»ƒ, ѕ–»√ќƒЌџ… ¬  ј„≈—“¬≈  ќћѕќЌ≈Ќ“ј “–јЌ—‘≈ ÷»ќЌЌќ…  ќћѕќ«»÷»»

“–јЌ—‘≈ ÷»ќЌЌјя  ќћѕќ«»÷»я ƒЋя ¬џ—Ў»’ Ё” ј–»ќ“Ќџ’  Ћ≈“ќ ,  ќћѕЋ≈ — Ќ” Ћ≈»Ќќ¬ќ…  »—Ћќ“џ, ѕ–»√ќƒЌџ… ¬  ј„≈—“¬≈  ќћѕќЌ≈Ќ“ј “–јЌ—‘≈ ÷»ќЌЌќ…  ќћѕќ«»÷»»,  ќЌЏё√ј“, ѕ–»√ќƒЌџ… ¬  ј„≈—“¬≈  ќћѕќЌ≈Ќ“ј “–јЌ—‘≈ ÷»ќЌЌќ…  ќћѕќ«»÷»», ЁЌƒќ—ќћќЋ»“»„≈— »… ѕ≈ѕ“»ƒ, ѕ–»√ќƒЌџ… ¬  ј„≈—“¬≈  ќћѕќЌ≈Ќ“ј “–јЌ—‘≈ ÷»ќЌЌќ…  ќћѕќ«»÷»»

ѕатент –оссийской ‘едерации
—уть изобретени€: »зобретение относитс€ к области биотехнологии и может быть применено дл€ переноса нуклеиновых кислот в высшие эукариотные клетки. ќхарактеризована трансфекционна€ композици€, содержаща€ комплекс нуклеиновой кислоты, вещества со сродством к нуклеиновой кислоте и эндосомолитический пептид. »спользование изобретени€ позволит облегчить процесс введени€ нуклеиновых кислот в клетки. 4 с. и 71 з.п. ф-лы, 54 ил., 1 табл.
ѕоиск по сайту

1. — помощью поисковых систем

   — помощью Google:    

2. Ёкспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. ѕо номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Ќомер патента: 2138553
 ласс(ы) патента: C12N15/00, C12Q1/08
Ќомер за€вки: 5053083/13
ƒата подачи за€вки: 29.09.1992
ƒата публикации: 27.09.1999
«а€витель(и): Ѕерингер »нгельгейм »нтернациональ √мб’ (DE); ƒзе ёниверсити оф Ќорс  аролайна эт „епел ’илл (US)
јвтор(ы): ƒейвид  ариел (US); Ёрнст ¬агнер (AT); ћэтт  оттен (US);  урт ÷атлоукал (AT);  ристиан ѕланк (AT); ћакс Ѕирнштиль (CH); Ѕернд ќберхаузер (AT)
ѕатентообладатель(и): Ѕерингер »нгельгейм »нтернациональ √мб’ (DE); ƒзе ёниверсити оф Ќорс  аролайна эт „епел ’илл (US)
ќписание изобретени€: »зобретение относитс€ к генной инженерии, более конкретно к трансфекционной композиции дл€ высших эукариотных клеток, комплексу нуклеиновой кислоты и эндосомолитическому пептиду в качестве компонентов композиции, конъюгату в качестве компонента комплекса.
¬ особенности в терапии генами требуетс€ эффективна€ система дл€ введени€ нуклеиновой кислоты в живые клетки. √ены перевод€т в клетки с тем, чтобы достигнуть синтеза терапевтических активных генетических продуктов в живом организме, например, с целью замены дефектного гена в случае генетического дефекта. "—тандартные" терапии генами основаны на принципе достижени€ длительного лечени€ путем осуществлени€ одного единственного приема. ќднако также существует потребность в методах лечени€, в которых терапевтически активную ƒЌ  (или м–Ќ ) дают в качестве лекарства ("терапевтического генного агента") раз или же в случае необходимости повторно. ѕримерами генетически вызываемых заболеваний, при которых терапи€ генами представл€ет многообещающий подход, €вл€ютс€ гемофили€, β-талласеми€ и "серозна€ комбинированна€ иммунна€ слабость", синдром, вызываемый генетически индуцированным отсутствием энзима деаминазы аденозина. ƒругой областью применени€ €вл€етс€ иммунна€ регул€ци€, при которой гуморальный или внутриклеточный иммунитет обеспечиваетс€ дачей функциональной нуклеиновой кислоты, кодирующей выдел€емый протеиновый антиген или не выдел€емый протеиновый антиген, который можно рассматривать как вакцинацию. ƒругими примерами генетических дефектов, при которых можно давать нуклеиновую кислоту, кодирующую дефектный ген, например, в согласованной в каждом конкретном случае форме, включают мышечную дистрофию (ген дистрофина), фиброзно-кистозную дегенерацию (регул€торный ген трансмембранной проводимости висцидозы), гиперолестиролемию (ген рецептора липопротеина низкой плотности). “ерапи€ генами также включает метод, согласно которому гормоны, факторы роста или белки цитотоксичной или про€вл€ющей модул€цию иммунной системы активностью должны синтезироватьс€ в теле.
“ерапи€ генами также рассматриваетс€ как многообещающий метод лечени€ рака путем дачи так называемых "раковых вакцин". ƒл€ повышени€ иммуногенности опухолевых клеток раковым вакцинам сообщают либо большую антигенность либо способность к производству определенных веществ, способных к модул€ции иммуносистемы, например, цитокинов, с тем, чтобы вызвать иммунную реакцию. Ётот метод осуществл€етс€ путем трансфекции клеток ƒЌ , кодирующей цитокин, например, IL-2, IL-4, γ-интерферон, α-фактор опухолевого некроза. ¬плоть до насто€щего времени введение гена в аутогенные опухолевые клетки осуществл€лось через ретровирусные векторы.
»звестна трансфекционна€ композици€ дл€ гепатоцитов, представл€юща€ собой конъюгат поликатиона, обладающего способностью к модифицированию, например, полилисина, и гликопротеина, обладающего способностью к модифицированию, причем конъюгат св€зываетс€ рецепторами на поверхности гепатоцитов (см. √.». ¬у, —.Ќ. ¬у, J. Biol. Chem. 263, 29, стр. 14621 - 14624, 1988).
Ќедостаток известной композиции заключаетс€ в том, что она может использоватьс€ только дл€ переноса нуклеиновых кислот в гепатоциты. ѕоэтому эксплуатационные возможности известной композиции ограничены.
«адачей изобретени€ €вл€етс€ расширение эксплуатационных возможностей трансфекционных систем с помощью композиции, позвол€ющей перенос нуклеиновых кислот в высшие эукариотные клетки.
ѕод термином "перенос" понимаетс€ в рамках данного изобретени€ не только введение комплексов нуклеиновой кислоты в клетку через клеточную мембрану, но и транспорт выдел€ющихс€ из них комплексов или нуклеиновой кислоты внутри клетки до достижени€ подлежащего экспрессии подход€щего сайта. ¬ысшие эукариотные клетки общеизвестны. ќни не включают дрожжей.
ћножество вирусов вход€т в эукариотный хоз€ин на основании механизмов, которые в принципе соответствуют механизму эндоцитоза, осуществл€емого с участием рецептора. ќснованна€ на этом механизме вирусна€ инфекци€ обычно начинаетс€ с того, что частицы вируса св€зываютс€ с рецепторами на клеточной мембране, после чего вирус входит вовнутрь клетки. ѕроцесс захода вовнутрь клетки осуществл€етс€ тем же образом, что и заход физиологических лигандов или макромолекул в клетку. —начала рецепторы на поверхности клетки классифицируют себ€ по группам и мембрана инвертируетс€ во внутрь и образует везикулу, снабженную сетчатым покрытием. ѕосле того, как везикула освободилась от сетчатого покрыти€, в ней имеет место окисление при помощи пропонного насоса в мембране. Ёто приводит к отделению вируса от €дрышка. ¬ зависимости от того, снабжен ли вирус липидным покрытием или нет, возможны два вида отделени€ вируса от €дрышка. ¬ случае так называемых "голых" вирусов (таких, как, например, аденовирус, полиовирус, риновирус) полагалось, что низкое значение pH вызывает изменение конфигурации белков вируса, что приводит к разделению гидрофобных доменов, которые не доступны при физиологическом значении pH. “аким образом эти домены приобретают способность к взаимодействию с мембраной €дрышка и тем самым обуславливают отделение генома вируса от €дрышка и его заход в цитоплазму. ƒл€ вирусов с липидным покрытием (таких, как, например, вирусы везикул€рного стоматита, вирус Semliki Forest, вирус гриппа) предполагают, что низка€ величина pH модифицирует структуру или конфигурацию некоторых белков вируса, в результате чего имеет место сли€ние мембраны вируса с мембраной €дрышка. ¬ирусы, которые проникают в клетку с помощью этого механизма, имеют определенные молекул€рные способности, которые сообщают им способность к разрушению мембраны €дрышка с тем, чтобы зайти в цитоплазму.
ƒругие вирусы, как, например, покрытые вирусы Sendai, вирус —ѕ»ƒа и некоторые штаммы вируса лейкоза ћолоне€, или непокрытые вирусы SV40 и полиомы, не требуют низкого значени€ pH дл€ проникновени€ в клетку. Ћибо они могут вызывать сли€ние с мембраной непосредственно на поверхности клетки (вирус Sendai, возможно вирус —ѕ»ƒа), либо они способны к осуществлению механизмов по разложению мембраны клетки или прохода через нее. ѕредполагают, что вирусы, которые не завис€т от конкретной величины pH, могут также использовать механизм эндоцитоза. »сходной точкой решени€ проблемы изобретени€ €вл€лось использование механизма, по которому некоторые вирусы проникают в эукариотные клетки с тем, чтобы достичь эффективной передачи комплексов нуклеиновой кислоты в клетку и тем самым повышени€ экспрессии.
¬ рамках данного изобретени€ неожиданно было найдено, что определенные агенты (например, вирусы, компоненты вирусов или другие соединени€), которые про€вл€ют способность определенных вирусов к заходу в эукариотные клети, обеспечивают существенное повышение степени экспрессии нуклеиновой кислоты, вводимой в клетку в качестве части комплекса. –ешение по изобретению €вл€етс€ неожиданным из-за того, что ассортимент комплексов нуклеиновой кислоты, способных к проникновению в клетку, €вл€етс€ очень широким.
“аким образом, данное изобретение относитс€ к трансфекционной композиции дл€ высших эукариотных клеток, включающей комплекс нуклеиновой кислоты и вещество со сродством дл€ нуклеиновой кислоты, при этом она дополнительно содержит эндосомолитический агент в эффективном количестве.
Ёндосомолитический агент представл€ет собой вещество, способное к поглощению клеткой и к переносу в цитоплазму содержащего €дрышек, в которых они наход€тс€ после захода в клетку. “ака€ способность эндосомолитического агента далее обозначаетс€ как "поглотительна€ функци€". Ёта поглотительна€ функци€ включает способность к активному включению клеткой, то есть при помощи завис€щего от рецептора механизма эндоцитоза, либо к пассивному включению клеткой, то есть при помощи жидкой фазы или в качестве компонента комплекса нуклеиновой кислоты, и способность к разрушению €дрышек, котора€ обычно обозначаетс€ как эндосомолиз €дрышка.
—огласно одному варианту изобретени€ в качестве эндосомолитического агента используют вирус или компонент вируса. ƒалее вирус или компонент вируса обозначаетс€ как "свободный" вирус (компонент).
¬ рамках насто€щего изобретени€ исследовалось действие повышающихс€ доз свободного аденовируса на степень передачи посто€нного количества конъюгата-трансферина и полилизина в клетках HeLa с использованием в качестве репортерного гена люциферазы. ѕовышение степени передачи гена путем добавлени€ свободного аденовируса достигло максимума 1 · 104 частиц вируса на клетку, то есть числа, которое соответствует примерному числу рецепторов аденовируса на клетку HeLa. ѕовышение экспрессии люциферазы, котора€ составл€ет до 2000 раз по сравнению с экспрессией, достигаемой одним конъюгатом трансферина и полилизина, обусловлено большей дозой вируса. ƒруга€ сери€ опытов была направлена на вы€вление действи€ ограничени€ количеств комплексов конъюгата и ƒЌ  в присутствии посто€нной дозы свободного аденовируса. Ѕыло найдено, что поглощение клеткой аденовирусов привело к повышению степени передачи гена с помощью трансферина/полилизина в широких пределах количества ƒЌ . ћаксимальна€ интенсивность экспрессии гена, достигаема€ при помощи комплекса коньюгата и ƒЌ , соответствовала интенсивности, достигаемой при 100 раз меньшем количестве ƒЌ  в случае использовани€ аденовируса дл€ повышени€ эффективности трансфекции.
ƒействие эндовирусной инфекции на передачу гена исследовалось с применением как некомплексированной ƒЌ , так и комплексов ƒЌ  и полилизина или конъюгата трансферина и полилизина. ¬ этих экспериментах установлено, что аденовирусна€ инфекци€ не привела к существенному увеличению передачи некомплексированной ƒЌ  во врем€ трансфекции. ¬ противоположность этому, передача ƒЌ  в виде комплекса с полилизином или в виде комплекса с конъюгатом трансферина и полилизина в значительной степени улучшалась аденовирусной инфекции. ћаксимальное действие достигаетс€ в случае применени€ конъюгата трансферина и полилизина. “ак как поликатионна€ часть конъюгата не только служит дл€ св€зывани€ трансферина с ƒЌ , но и вызывает существенные структурные изменени€ внутри ƒЌ , эти эксперименты сначала не позвол€ли установить, €вл€лось ли обнаруженное действие результатом улучшенного жидкостного транспорта конденсированной поликатионом ƒЌ  или улучшенной вирусом доставки св€занного с рецептором комплекса конъюгата и ƒЌ . ѕоэтому проводились опыты по св€зыванию и определению последовательности с тем, чтобы вы€вить причину обнаруженного действи€. —в€зывание комплекса конъюгата трансферина и полилизина и ƒЌ  или комплекса полилизина и ƒЌ  при низкой температуре позвол€ла удаление избыточного комплекса в жидкой фазе перед инфекцией аденовирусом.  огда поступали указанным образом, отдача св€занных с рецептором комплексов конъюгата трансферина и полилизина и ƒЌ  значительно увеличивалась в результате добавлени€ аденовируса. ¬ случае применени€ комплексом полилизина и ƒЌ  такого эффекта не наблюдалось. “аким образом то, что существенно улучшаетс€, это заход ƒЌ  с помощью способствующего рецептором механизма эндоцитоза.
 роме того, проводилс€ анализ специфичной функции аденовируса, который вызывает улучшенный перенос гена при помощи рецептора. —лаба€ термообработка вирионов не мен€ет их способность к св€зыванию с соответствующими клеточными мембранами, но вли€ет на их свойство разрушать €дрышка после поглощени€ клеткой.
“аким образом различные эффекты по св€зыванию вируса и заходу вируса в клетку можно было вы€вл€ть в отдельных экспериментах. ѕри этом было также установлено, что термическа€ инактиваци€ аденовирусов привела к полному уничтожению их способности к улучшению переноса гена при помощи рецептора в качестве посредника. Ёто позвол€ет предполагать, что вызываемое аденовирусами разрушение €дрышек €вл€етс€ частью их механизма захода в клетку, который специфично обуславливает улучшение отдачи гена при помощи конъюгата трансферина или полилизина. “от факт, что штамм дефектного в отношении репликации вируса мог обеспечивать улучшение экспрессии гена, подтверждает предположение о том, что этот феномен обусловлен не функцией репликацией, а поглотительной функцией вириона.
ƒл€ вы€снени€ того, что улучшение экспрессии гена можно приписывать к возможной трансактивации введенного гена вирусом, проводились опыты с применением клеточной линии, котора€ по своей структуре способна к экспрессии гена люциферазы RSV-LTR. ¬ этой клеточной линии аденовирусы не про€вл€ют действи€, тогда как в родительской клеточной линии, в которой ген был введен при помощи конъюгата трансферина и полилизина, наблюдалось существенное повышение экспрессии гена. –езультаты этих опытов показывают, что аденовирус вли€ет на событие, которое имеет место до транскрипции, и что его улучшающее перенос гена действие про€вл€етс€ не на уровне экспрессии гена, а на уровне переноса гена.
¬ рамках данного изобретени€ также проводились исследовани€, направленные на вы€вление действи€ свободного аденовируса на перенос гена при помощи конъюгатов трансферина и полилизина в подобранных клеточных лини€х. Ѕыло найдено, что присутствие рецепторов трансферина на целевой клетке €вл€етс€ необходимым, но недостаточным в каждом случае с тем, чтобы обеспечить перенос гена при помощи конъюгата трансферина и полилизина. ѕредполагают, что специфичные у клетки факторы, относ€щиес€ к результату наход€щихс€ в €дрышке комплексов конъюгата и ƒЌ , представл€ют собой крайне важный определ€ющий фактор дл€ уровн€ передачи гена, достигаемого указанным путем. ¬ этом отношении проводились опыты на подобранных клеточных лини€х, направленные на исследование как переноса гена при помощи конъюгатов трансферина и полилизина, так и улучшение переноса гена при помощи аденовирусов.  летки клеточной линии мукофисцидоза (CFT1) показывали небольшой уровень экспрессии гена люциферазы после обработки комплексами ƒЌ  и конъюгата трансферина и полилизина. Ётот уровень экспрессии существенно повысилс€ в результате обработки адновирусом d1312. ¬ противоположность этому клетки KB, обработанные комплексами ƒЌ  и конъюгата трансферина и полилизина, показывали уровень экспрессии гена люциферазы лишь немного выше уровн€ фона, несмотр€ на присутствие рецептора трансферина. ќднако в результате обработки аденовирусом d1312 сразу же обнаруживалась активность люциферазы в этих клетках. ќбработка аденовирусами клеток HeLa имела подобный эффект, хот€ этот эффект был значительно сильнее в этих клетках. “ак как клетки HeLa и KB обладают примерно тем же числом рецепторов дл€ аденовируса, различие в улучшении переноса гена может быть обусловлено числом рецепторов дл€ трансферина, характерным дл€ каждого типа клеток. ¬ €вную противоположность этим результатам клеточные линии WI-38 и MRC5), которые, как известно, лишь слабо поддерживают аденовирусную инфекцию, показывали в присутствии d1312 лишь незначительное улучшение экспрессии гена после обработки комплексом ƒЌ  и конъюгата. ѕоэтому обработка свободным вирусом, например, аденовирусом, очевидно приводит к улучшению переноса гена при помощи комплексов ƒЌ  и конъюгата в таких случа€х, где перенос гена возможен за счет осуществл€емого в присутствии рецептора в качестве посредника эндоцитоза, как, например, в случае клеток CFT1, а также в некоторых случа€х, где перенос гена этим путем оказываетс€ неэффективным, как, например, в случае клеток HeLa и  ¬. ”ровень достигаемого улучшени€ значительно мен€етс€ среди различных целевых клеток, так что можно предполагать, что этот эффект €вл€етс€ функцией как числа рецепторов вируса, например, рецепторов аденовируса, у определенной клетки, так и числа рецепторов трансферина.
¬ случае применени€ свободного вируса вещество со сродством дл€ нуклеиновой кислоты, предпочтительно органический поликатион, предпочтительно св€зано с фактором, содействующим поглощению клеткой. ќднако в рамках данного изобретени€ было также найдено, что ƒЌ  в виде комплекса с одним веществом со сродством дл€ нуклеиновой кислоты, то есть без содействующего поглощению клеткой фактора, в определенных услови€х может вводитьс€ в клетку в присутствии свободного вируса.  роме того, было найдено, что в случае некоторых клеточных линий комплексы, состо€щие из нуклеиновой кислоты и вещества со сродством дл€ нуклеиновой кислоты, могут вводитьс€ через жидкую фазу при условии достаточно высокой концентрации комплекса. ќпыты, которые проводились в рамках данного изобретени€, показывали, что существенным признаком дл€ поглотительной способности комплексов нуклеиновой кислоты €вл€етс€ их компактность, которую можно приписывать к конденсации нуклеиновой кислоты веществом со сродством дл€ нуклеиновой кислоты. ≈сли вещество со сродством нуклеиновой кислоты имеет достаточную способность к св€зыванию с поверхностью клетки с тем, чтобы проникнуть в клетку вместе с вирусом, а также к сообщению комплексу в основном больной электронейтральности и конденсации нуклеиновой кислоты до компактной структуры, то может отпадать необходимость в улучшении способности к проникновению в клетку за счет ковалентного св€зывани€ содействующего поглощению клеткой фактора с веществом со сродством дл€ нуклеиновой кислоты с тем, чтобы обеспечить перенос комплекса в клетку при помощи эндоцитоза, осуществл€емого в присутствии рецептора в качестве посредника. ћного клеток про€вл€ет относительно большое сродство дл€ определенных веществ со сродством дл€ нуклеиновой кислоты, так что конъюгаты нуклеиновой кислоты и факторы св€зывани€ перенос€тс€ в клетку без потребности в наличии содействующего поглощению клеткой фактора. Ёто €вл€етс€ действительным, например, дл€ гепатоцитов, которые поглощают комплексы ƒЌ  и полилизина.
—огласно предпочтительному варианту изобретени€ в качестве эндосомолитического агента используют вирус, св€занный с веществом со сродством дл€ нуклеиновой кислоты и имеющий способность к заходу в клетку в качестве части комплекса конъюгата и нуклеиновой кислоты и к переносу в цитоплазму содержимого €дрышек, в котором комплекс находитс€ после захода в клетку.
—огласно другому предпочтительному варианту изобретени€ в качестве эндосомолитического агента используют компонент вируса, св€занный с веществом со сродством дл€ нуклеиновой кислоты и имеющий способность к заходу в клетку в качестве части комплекса конъюгата и нуклеиновой кислоты и к переносу в цитоплазму содержимого €дрышек, в которых комплекс находитс€ после захода в клетку. ¬ирусы и компоненты вирусов, которые св€заны с доменом св€зывани€ нуклеиновой кислоты, далее обозначаютс€ как "вирусные конъюгаты" (несмотр€ на тип св€зывани€).
¬ирусные конъюгаты, которые также €вл€ютс€ объектом данного изобретени€, содержат вирус или компоненты вируса в качестве интегральной части функционального конструкта. ќни объедин€ют преимущества векторных систем на основе конъюгатов содействующего поглощению клеткой фактора с преимуществами, которые вирусы внос€т в эти системы.
 роме того, вирусные конъюгаты согласно изобретению имеют то преимущество, что в отличие от известных конъюгатов, которые можно примен€ть дл€ переноса генов при помощи эндоцитоза в присутствии рецепторов в качестве посредника, они обладают специфичным механизмом, обеспечивающим их выделение из системы везикул клетки.
¬екторна€ система, использующа€ вирусные конъюгаты, представл€ет собой качественно новый подход по сравнению с рекомбинантными вирусными векторами, который заключаетс€ в том, что транспортируема€ чужеродна€ ƒЌ  находитс€ на наружной стороне вириона. —ледовательно, вирусные конъюгаты согласно изобретению могут транспортировать в клетку очень большие генные конструкты без каких-либо ограничений в части последовательности.
ѕригодность вируса, который можно примен€ть в качестве свободного или св€занного вируса или части вируса в качестве вирусного компонента в рамках данного изобретени€, определена вышеупом€нутой поглотительной функцией. ѕодход€щими вирусами €вл€ютс€, например, такие вирусы, которые способны к заходу в клетку при помощи эндоцитоза в присутствии рецептора в качестве посредника во врем€ трансфекции клеток комплексом нуклеиновой кислоты и к осуществлению своего выделени€ и тем самым выделени€ нуклеиновой кислоты из €дрышка в цитоплазму. “акими вирусами €вл€ютс€ те вирусы, которые упоминаютс€ в рамках данной за€вки, а также другие вирусы, способные к поглощению определенной клеткой, и те вирусы, которые могут осуществл€ть выделение содержимого €дрышка в цитоплазму.
¬осприимчивость клеточной линии к трансформации вирусом в качестве средства содействи€ заходу конъюгата в качестве "свободного вируса" зависит от присутстви€ и числа рецепторов на поверхности целевой клетки.
¬ число подход€щих вирусов вход€т такие вирусы, которые способны к проникновению в клетку при помощи эндоцитоза в присутствии рецептора в качестве посредника во врем€ трансфекции клеток комплексом нуклеиновой кислоты и к осуществлению своего выделени€ и тем самым выделени€ нуклеиновой кислоты из €дрышка в цитоплазму. Ѕез претензий в части этой теории можно сказать, что в случае применени€ свободного вируса эта активность эндосомолиза могла бы оказать благотворное вли€ние на переносимый в клетку комплекс нуклеиновой кислоты, заключающеес€ в том, что эти комплексы транспортируютс€ вместе с вирусами из €дрышка в цитоплазму, при этом предполагают, что они заход€т в эти €дрышка, что и вирусы. ≈сли комплексы содержат вирус в св€занном виде, то они получают пользу от эндосомолитической активности вируса и транспортируютс€ из €дрышек в цитоплазму. Ётим достигаетс€ сли€ние между €дрышками и лизосомами и таким образом энзиматическа€ деградаци€, котора€ обычно имеет место в этих органеллах клетки.
¬ частности вирусами, которые пригодны дл€ осуществлени€ изобретени€ и поглотительна€ функци€ которых в начале инфекции осуществл€етс€ за счет эндоцитоза в присутствии рецептора в качестве посредника, €вл€ютс€ вирусы без липидного покрыти€, такие, как, например, аденовирус, полиовирус, риновирус, а также вирусы с оболочкой, такие как, например, вирус везикул€рного стоматита, вирус Semliki Forest, вирус гриппа. ѕодход€щими €вл€ютс€ также завис€щие от pH штаммы вируса ћолоне€. ¬ частности, предпочитаютс€ вирусы из группы, включающей аденовирус, подгруппу —, тип 5, вирус Semliki Forest, вирус везикул€рного стоматита, полиовирус, риновирусы и вирус лейкоза ћолоне€.
ѕрименение в рамках данного изобретени€ вирусов –Ќ , которые не имеют обратную транскриптазу, имеет то преимущество, что трансфекци€ в присутствии такого вируса не приводит к образованию вирусной ƒЌ  в трансфектированной клетке. ¬ результате опытов по изобретению было вы€влено, что риновирус HRV2, представитель групп пикорнавируса, про€вл€ет повышенную экспрессию репортерного гена. Ёффективность риновируса про€вл€лась как в свободной форме, так и в виде конъюгатов.
¬ рамках данного изобретени€ под термином "вирус "(при условии, что он поглощаетс€ клеткой и высвобождает содержимое €дрышек, в которые он заходит) понимаютс€ в дополнение к диким типам мутанты, которые в результате одной или больше мутаций потер€ли определенные функции дикого типа (отличные от поглотительной функции), в частности способность к репликации.
ћутанты образуютс€ в процессах обычного мутагенеза за счет мутаций в белковых област€х, которые ответственны за репликационные функции и которые могут дополн€тьс€ упаковочной линией. ¬ случае аденовируса такими мутантами €вл€ютс€ ts-мутанты (термочувствительные мутанты), мутанты ≈1ј и ≈1¬, мутанты, которые показывают мутации в стимулированных MLP генах, и мутанты, которые про€вл€ют мутации в област€х определенных капсидных белков. “акже подход€щими €вл€ютс€ вирусные штаммы, которые имеют соответствующие естественные мутации. —пособность вирусов к репликации можно исследовать известными из литературы методами. “ак, например, на культуры клеток подают суспензии с различными концентраци€ми вируса и число растворенных клеток, которые можно видеть в виде п€тен, регистрируют.
ƒругими вирусами, которые можно примен€ть в рамках данного изобретени€, €вл€ютс€ так называемые дефектные вирусы, то есть вирусы, которые не обладают функцией, требуемой дл€ автономной репликации вируса в одном или больше генах, дл€ которых они требуют наличие вируса-помощника. ѕримерами такого типа вируса €вл€ютс€ дефектные интерферирующие частицы, которые €вл€ютс€ производными инфекционного стандартного вируса, имеют те же структурные белки, что и стандартный вирус, имеют мутации и нуждаютс€ в стандартном вирусе в качестве вируса-помощника дл€ осуществлени€ репликации. ѕримерами такой группы вируса также €вл€ютс€ сателлитные вирусы. ƒругой группой €вл€етс€ класс парвовирусов, которые обозначаютс€ как аденоассоциированные вирусы.
“ак как циклы проникновени€ в клетки многих вирусов полностью не характеризованы, по-видимому, есть и другие вирусы, которые будут про€вл€ть эндосомолитическую активность, требуемую дл€ их пригодности в рамках данного изобретени€. ¬ рамках данного изобретени€ также пригодны живые вакцины или вакцинальные штаммы.
ѕод термином "вирус" понимаютс€ в рамках данного изобретени€ и инактивированные вирусы, например, вирусы, инактивированные химической обработкой, такой, как, например, обработка формальдегидом, облучение ”‘-лучами, химическа€ обработка в сочетании с облучением ”‘-лучами, например, обработка псораленом и облучение ”‘-лучами, облучение γ-лучами, бомбардировка нейтронами. »нактивированные вирусы, например, такие, которые также примен€ютс€ дл€ вакцин, можно получать известными из литературы методами, после чего их можно исследовать на пригодность повышени€ переноса комплексов ƒЌ . ¬ рамках данного изобретени€ проводились опыты, в которых препараты аденовируса инактивировались при помощи стандартной ”‘-стерилизационной лампы или обработкой формальдегидом. ѕри этом неожиданно было найдено, что степень инактивации вирусов намного повышает степень снижени€ переноса гена, который достигаетс€ при добавлении аденовируса к среде трансфекции. ¬ этих опытах примен€лись препараты инактивированного обработкой псораленом и облучением ”‘-лучами биотинированного аденовируса, св€занного с полилизином, св€занным с стрептавидином. Ёти опыты показывали, что инактиваци€ привела к снижению титра вируса, который значительно превышает снижение способности к переносу гена. Ёто €вл€етс€ четким указанием на то, что механизмы, св€занные с нормальной репликацией в активном вирусе, можно разрушать без отрицательного вли€ни€ на эффект, необходимый дл€ переноса гена.
ѕод термином "компоненты вируса" подразумеваютс€ части вирусов, например, белкова€ часть свободного от нуклеиновой кислоты (пустой капсид вируса, который можно получать рекомбинантными способами), белки, получаемые фракционированием, или пептиды, которые имеют эндосомолитические функции интактного вируса. Ёти компоненты вируса можно получать синтетическим путем, либо пептидным синтезом, либо рекомбинантными способами в зависимости от их размеров. ¬ результате опытов в рамках данного изобретени€ было установлено, что белки аденовируса, св€занные через биотин/стрептавидин с полилизином, позвол€ют улучшение переноса гена. ѕримером фрагментов или белков, отличных от аденовируса вирусов, которые €вл€ютс€ существенными дл€ обеспечени€ включени€ клеткой, €вл€етс€ гемагглютинин (HA) вируса гриппа. N-концева€ последовательность подединицы Ќј2 гемагглютинина вируса гриппа €вл€етс€ ответственной дл€ выделени€ вируса из €дрышка. Ѕыло установлено, что пептиды, состо€щие из 20 аминокислот этой последовательности, способны к сли€нию липидных мембран и к их частичному разрушению. ¬ рамках данного изобретени€ с успехом примен€лись аутентичные и модифицированные пептиды вируса гриппа. ƒругим примером €вл€ютс€ белки оболочки ретровирусов, например, gp41 HIV или части таких белков.
ѕрименение вирусов, которые как таковые способны к проникновению в клетки и таким образом действуют в качестве содействующего поглощению клеткой фактора, €вл€етс€ дальнейшим аспектом данного изобретени€.
¬ирусы или компоненты вирусов, которые сами по себе не могут св€затьс€ с клеткой и проникать в нее, предпочтительно используютс€ в качестве вирусных конъюгатов в соответствии с вышеприведенным определением. ¬ результате св€зывани€ с доменом, св€зывающим ƒЌ , например, с поликатионом, вирусу или компоненту вируса сообщаетс€ большое сродство к молекулам ƒЌ , так что он образует комплекс с ними и переноситс€ в клетку в качестве компонента комплекса нуклеиновой кислоты, котора€ также содержит конъюгат содействующего поглощению клеткой фактора и св€зывающий ƒЌ  домен.  роме достигаемого при этом эффекта переноса св€зывание вируса или компонента вируса со св€зывающим нуклеиновую кислоту доменом может также привести к улучшению его эндосомолитических свойств.
ѕутем подбора другого содействующего поглощению клеткой фактора практически люба€ высша€ эукариотна€ клетка может трансфектироватьс€ предлагаемой системой.
¬ результате простого скрининга можно определ€ть, про€вл€ет ли данный вирус или компонент вируса поглотительную функцию и можно ли ее примен€ть дл€ осуществлени€ данного изобретени€. “акой анализ, например, дл€ исследовани€ вируса на его пригодность в качестве свободного вируса, целевые клетки привод€т в контакт с комплексом ƒЌ  в присутствии или отсутствии вируса.  оличество комплекса ƒЌ , которое переноситс€ в цитоплазму, можно затем простым образом определ€ть путем вы€влени€ маркерного генного продукта, например, люциферазы. ≈сли присутствие вируса приводит к тому, что комплекс ƒЌ  поглощаетс€ и вводитс€ в цитоплазму на большем уровне чем без вируса, то это можно приписывать поглотительной функции вируса. “акже возможно сравнивать уровень поглощени€ комплекса ƒЌ  в присутствии исследуемого вируса с другим вирусом, о котором известно подход€ща€ поглотительна€ функци€, например, с подгруппой —, типом 5, аденовируса. “аким опытам можно также подвергать вирусные конъюгаты. ¬ этих опытах можно также исследовать дополнительные параметры, такие, как, например, конъюгаты с различным содействующим поглощению клеткой фактором в различных количествах.  роме того, специалист в данной области может без труда проводить такого вида опыты, в случае необходимости в сочетании с другими опытами, например, с опытами по определению утечки липосома, с тем, чтобы исследовать компоненты вируса и другие компоненты с потенциальной эндосомолитической активностью на их способность к улучшению экспрессии гена.
≈сли примен€ют интактные вирусы, то провод€т опыты, направленные на вы€вление способности вируса к репликации. Ёти опыты предпочтительно провод€т параллельно с предварительными опытами, направленными на вы€вление способности вируса к улучшению переноса гена. »сследование на способность к репликации провод€т известными методами, такими как, например, метод с образованием п€тен, метод по определению цитопатогенного действи€ или метод по определению поздней экспрессии гена в случае цитопатогенных вирусов или вирусов, которые в значительной степени содействуют росту клеток-хоз€ев. ƒл€ других вирусов примен€ют специфичные дл€ данного вируса методы, например, метод по определению гемагглютинации, или химико-физические методы, например с применением электронного микроскопа.
¬ рамках данного изобретени€ в качестве предпочтительных вирусов, в частности таких, которые примен€ютс€ в качестве свободных вирусов, примен€ют вирусы, которые можно получать с высоким титром, которые устойчивы, имеют низкую патогенность в нативном состо€нии и, в случае необходимости позвол€ют упразднение способности к репликации. ¬ частности предпочитаютс€ аденовирусы. ≈сли трансфекции подлежит специфична€ клеточна€ попул€ци€, то можно примен€ть вирусы, которые про€вл€ют специфичную способность к этой попул€ции. ≈сли трансфекции подлежат различного типа клетки, то можно примен€ть вирусы, которые €вл€ютс€ инфекционными дл€ широкого круга клеток.
“ребовани€ к композици€м свободного вируса в основном заключаютс€ в том, что вирус должен иметь наибольшую чистоту и что следует примен€ть стабилизирующий буфер, выбираемый с учетом данного вируса.
¬ любом случае согласно изобретению можно примен€ть только такие вирусы или компоненты вирусов, у которых риск безопасности €вл€етс€ как можно минимальным, в частности риск репликации вируса в целевой клетке и рекомбинации вирусной ƒЌ  с ƒЌ  хоз€ина.
ѕреимущественно использовать механизм проникновени€ в клетки вирусов, инфицирующих животных по-другому, чем людей, дл€ улучшени€ поглощени€ и переноса ƒЌ  в высшие эукариотные клетки, в частности людей, пока вирус про€вл€ет активность по разрушению €дрышка в высших эукариотных клетках. „лены семейства аденовирусов были выделены из птиц, амфибий и р€да других животных. јденовирусы из птиц, амфибий, крупного рогатого скота, собак, мышей, овец, свиней и обезь€н, а также аденовирусы человека можно получать от американской коллекции типовых культур в городе –оквиль в штате ћариленд.
ќдно возможное преимущество применени€ вируса, например, аденовируса, из редкого вида может заключатьс€ в уменьшенной токсичности в целевых клетках (например, от аденовируса куриц или л€гушек нельз€ ожидать репликации или раннего инициировани€ экспрессии гена в клетках млекопитающих), уменьшенной опасности дл€ лица, занимающегос€ получением редкого аденовируса, по сравнению с аденовирусом человека, и уменьшенной интерференции в целевом организме от антител против аденовируса человека или мышей. ќтсутствие интерференции антителами человека или мышей €вл€етс€ особенно важным при применении вирусов в генной терапии на люд€х и мышах.
 рупный аденовирус CELO не про€вл€ет реактивности в отношении антител, которые распознают основную группу эпитопов аденовирусов, инфицирующих клетки млекопитающих.  роме того, аденовирус CELO можно выращивать в оплодотворенных €йцах с получением высокого выхода (0,5 мг/€йцо). ¬ экспериментальной части показываетс€, что конъюгаты CELO и полилизина улучшают перенос ƒЌ  в клетки HeLa, на уровне, который можно сравнивать с уровнем, достигаемым при применении аденовируса d1312 человека. “аким образом, применение конъюгатов CELO дл€ улучшени€ транспорта ƒЌ  можно рассматривать как многообещающий подход в экспериментах по генной терапии на люд€х. ¬ирусы редких видов предпочтительно используютс€ в качестве компонентов вирусных конъюгатов в комбинированных комплексах согласно изобретению.
—в€зывание вируса со св€зывающим нуклеиновую кислоту доменом в вируссодержащих конъюгатах согласно изобретению может быть ковалентным или же нековалентным, например, при помощи биотино- стрептавидинового мостика. ¬озможно также ионное св€зывание в случае вируса с кислыми участками в поверхностных белках, что позвол€ет св€зь с поликатионом.
¬ рамках данного изобретени€ образовались комплексы в услови€х, позвол€ющих ионное взаимодействие между аденовирусом и полилизином до образовани€ комплекса с ƒЌ . ѕри этом также проводились контрольные опыты в услови€х, в которых полилизин сначала нейтрализуют ƒЌ  и поэтому он не может св€зывать аденовирус.  омплексы с ионным св€зыванием аденовируса показывали лучшие результаты.
ѕримерами вирусных компонентов в эндосомолитических конъюгатах согласно изобретению €вл€ютс€ пустые вирусные капсиды и вирусные пептиды. —в€зывание вирусного компонента со св€зывающим нуклеиновую кислоту доменом может быть ковалентным, например, путем химического св€зывани€ вирусного пептида с полилизином, или же нековалентным, например, ионным в случае вирусного компонента с кислотными остатками, которые св€зываютс€ с поликатионом.
—оотношение вируса или компонента вируса и вещества со сродством дл€ нуклеиновой кислоты можно варьировать в широких пределах. ¬ случае конъюгата пептида гемагглютинина гриппа и полилизина перенос гена можно улучшать в большем размере при высоком содержании в конъюгатах вирусного пептида.
 онъюгаты вируса или вирусного компонента и вещества со сродством нуклеиновой кислоты можно получать (также как и конъюгаты содействующего поглощению клеткой фактора и поликатиона) путем св€зывани€ компонентов или же при помощи рекомбинантного метода, если вирусные компоненты и св€зывающий нуклеиновую кислоту домен представл€ют собой полипептиды.
—в€зывание вируса или вирусных белков или пептидов с полиаминами химическими методами можно осуществл€ть известным дл€ св€зывани€ пептидов способом, причем, если требуетс€, отдельные компоненты перед реакцией св€зывани€ снабжают св€зывающими веществами (это меропри€тие необходимо тогда, когда не имеетс€ подход€щей дл€ св€зывани€ функциональной группы, например, меркаптогруппы или спиртовой группы). —в€зывающие вещества €вл€ютс€ бифункциональными соединени€ми, которые сначала вступают в реакцию с функциональными группами отдельных компонентов, после чего осуществл€ют св€зывание модифицированных отдельных компонентов.
—в€зывание можно осуществл€ть с помощью
а) дисульфидных мостиков, которые в восстанавливающих услови€х могут снова расщепл€тьс€ (например, при применении сукцинимидил- пиридилдитиопропионата);
б) в основном стойких в биологических услови€х соединений (например, простых тиоэфиров, реакцией малеимидо-св€зывающих веществ с сульфгидрильными группами св€занного со вторым компонентом св€зывающего вещества);
в) неустойчивых в биологических услови€х мостиков, например, сложноэфирных св€зей, или неустойчивых в слабокислых услови€х ацетальных или кетальных св€зей.
¬ рамках данного изобретени€ эндосомолитические пептиды гемагглютинина Ќј2 гриппа св€зывались с полилизином химическим путем с применением сукцинимидил-пиридилдитиопропионата. Ѕыло установлено, что модификаци€ пептида полилизином приводит к повышению эндосомолитической активности. ќпыты по трансфекции показывали, что эффективность переноса гена в присутствии конъюгата трансферина и полилизина в качестве посредника значительно повышаетс€, если комплекс ƒЌ  кроме трансферина/полилизина содержит еще конъюгаты пептида вируса гриппа и полилизина.
¬ рамках данного изобретени€ аденовирус св€зывалс€ с полилизином самыми различными методами. ќдин метод образовани€ конъюгата вируса и полилизина осуществл€лс€ аналогично образованию конъюгатов трансферина и полилизина (см. ¬агнер и др., Proc. Natl. Acad. Sci., —Ўј 87, 1990, стр. 3410 - 3414) после модификации дефектного аденовируса d1312 с применением гетеробифункционального реагента. Ќесв€занный полилизин удал€лс€ путем центрифугировани€. —в€зывающа€ способность ƒЌ  исследовалась с применением радиоактивно меченой ƒЌ  (при применении клеток  562 было установлено, что в отсутствие хлорокрина значительно больший перенос гена достигаетс€ в присутствии комплексов, состо€щих из ƒЌ , аденовируса, св€занного с полилизином, и трансферина, св€занного с полилизином, чем в присутствии немодифицированного аденовируса, который не св€зан с ƒЌ .  роме того, было найдено, что значительна€ экспресси€ гена имела место уже в присутствии 0,0003 мкг/ƒЌ  в 5·105 клеток HeLa с применением модифицированного полилизином аденовируса).
≈сли вирус или вирусный компонент (или дополнительный, содействующий поглощению клеткой фактор, как, например, в случае трансферина) содержит подход€щие углеводные цепи, их можно св€зывать с веществом, имеющим сродство дл€ нуклеиновой кислоты, через одну или больше углеводных цепей гликопротеина.
ƒругой предпочтительный метод получени€ вирусных конъюгатов согласно изобретению заключаетс€ в энзиматическом св€зывании вируса или вирусного компонента с веществом со сродством дл€ нуклеиновой кислоты, в особенности полиамина, при помощи трансглютаминазы.
 атегори€ трансглютаминаз включает р€д различных ферментов, которые имеютс€, например, в эпидермисе (эпидермальна€ трансглютаминаза), крови (фактор XIII) и в клетках различных тканей (тканева€ трансглютаминаза, например, трансглютаминаз печени).
“рансглютаминазы катализуют образование св€зей ε-(γ-глютамил)лизина в присутствии кальциевых ионов с расщеплением аммиака. ѕредпосылкой €вл€етс€ наличие глютаминов и лизинов в белках, способных к взаимодействию с ферментом.  роме ε-аминогрупп лизина в качестве субстрата можно также примен€ть (поли)амины, такие, как, например, этаноламин, путресцин, спермин и спермидин.
ƒо сих пор еще не €сно, какие факторы €вл€ютс€ ответственными за то, что глютамин или лизин белка или полиамин вступает в реакцию с ферментом. »звестно лишь то, что полиамины можно св€зывать с многочисленными клеточными белками, такими, как, например, цитокератины, тубулин, белками мембраны клеток, поверхностными белками вирусов гриппа при помощи трансглютаминазы.
¬ рамках данного изобретени€ было установлено, что полилизин может св€зыватьс€ с аденовирусами при помощи трансглютаминазы. ѕри этом процесс св€зывани€ можно проводить в присутствии глицерина, что имеет то преимущество, что препарат вируса, например аденовируса, можно подавать непосредственно на св€зывание, так как содержащийс€ в нем буфер включает глицерин. ѕрименение конъюгатов аденовируса и полилизина, имеющихс€ в виде комплекса с плазмидной ƒЌ  и конъюгатами трансферина и полилизина, позвол€ет экспрессию гена, котора€ во много раз превышает действие, достигаемое при применении конъюгатов трансферина и полилизина в присутствии не св€занного с полилизином аденовируса.
ƒругой предпочтительный метод получени€ конъюгатов согласно изобретению заключаетс€ в св€зывании вируса или его компонента с поликатионом через биотиново-белковый мостик, предпочтительно через биотиново-стрептавидиновый мостик.
»звестна€ сильна€ св€зь биотина со стрептавидином или авидином используетс€ дл€ св€зывани€ адиновируса с полилизином путем модификации аденовируса биотином и химического св€зывани€ стрептавидина с полилизином.
 омплексы, состо€щие из ƒЌ  и конъюгата стрептавидина и полилизина, с которыми св€зан модифицированный биотином вирус, и, в случае необходимости не ковалентно св€занного полилизина, про€вл€ют очень высокую эффективность трансфекции, даже при низких концентраци€х ƒЌ . ќсобенно эффективные комплексы образуютс€ за счет того, что модифицированный биотином вирус сначала св€зывают с конъюгатом стрептавидина и полилизина, после чего осуществл€ют св€зывание ƒЌ . —в€зывание с биотином можно также осуществл€ть при помощи авидина.
—в€зь между вирусом или его компонентом и полилизином можно также осуществл€ть следующим образом. ¬ирус биотинилируют, антитела против биотина св€зывают с полилизином и св€зь между биотином и антителом используют дл€ св€зывани€ вируса и полилизина. ѕри этом используют общедоступные стандартные поликлональные или моноклональные антитела против биотина.
—в€зывание вируса с полилизином можно также осуществл€ть за счет св€зывани€ полилизина с лектином, имеющим сродство дл€ поверхностного гликопротеина вируса, при этом процесс св€зывани€ в таком конъюгате осуществл€ют при помощи св€зи между лектином и гликопротеином. ≈сли вирус не имеет подход€щих боковых углеводных цепей, то его можно модифицировать соответствующим образом.
¬ирус можно также св€зывать с веществом со сродством дл€ нуклеиновой кислоты за счет того, что поверхность вируса модифицируют антигеном, чужеродным дл€ вируса (например дигоксигенином, продуктом инофирмы Ѕерингер ћаннхайм, DE, или биотином) и св€зь между модифицированным вирусом и веществом со сродством дл€ нуклеиновой кислоты устанавливают через антитело, св€зывающеес€ с антигеном.  онкретное осуществление процесса образовани€ конъюгатов согласно изобретению зависит от различных критериев. “ак, например, св€зывание при помощи биотина представл€ет собой меньше всего специфичный и поэтому широко примен€емый метод, при этом св€зывание при помощи биотина приводит к образованию очень сильной нековалентной св€зи. Ёнзиматическа€ реакци€ с трансглютаминазой имеет то преимущество, что его можно также проводить в очень малом масштабе.   химическому св€зыванию обычно прибегают тогда, когда необходимо синтезировать большие количества конъюгата. Ётот метод обычно €вл€етс€ и наилучшим дл€ св€зывани€ протеинов или пептидов вируса. ≈сли примен€ть инактивированные вирусы, то инактивацию обычно осуществл€ют до св€зывани€ при условии, что инактиваци€ отрицательно не сказываетс€ на св€зывании.
≈сли вирус, например, аденовирус, или его компонент с эндосомолитической активностью, имеет доступные св€зывающие домены, например кислые домены дл€ св€зывани€ с поликатионом, то св€зывание вируса или его компонента с поликатионом можно также осуществл€ть ионным путем. ¬ этом случае положительные зар€ды поликатиона, который может иметьс€ в виде конъюгата с содействующим поглощению клеткой фактором, частично нейтрализуютс€ кислым доменом вируса или его компонента, а остальные положительные зар€ды нейтрализуютс€ нуклеиновой кислотой.
≈сли вещество со сродством дл€ нуклеиновой кислоты представл€ет собой вещество интеркал€ции, то его модифицируют св€зывающим веществом, подход€щим в процессе св€зывани€ конкретного вируса или его компонента. “ак, например, в случае св€зывани€ при помощи трансглютаминазы его модифицируют спермином или бифункциональной группой, пригодной дл€ осуществлени€ химического св€зывани€, например активной сложноэфирной группой.
—оотношение вируса или его компонента и св€зывающих нуклеиновую кислоту веществ может колебатьс€ в широких пределах. ќбычно его определ€ют эмпирическим путем, например, св€зывани€ определенного количества вируса или его компонента с различным количеством полилизина. ѕри этом оптимальный конъюгат используют дл€ трансфекции.
—огласно другому варианту изобретени€ компонент вируса, например вирусный пептид с эндосомолитической активностью, можно модифицировать с таким расчетом, что его можно непосредственно св€зывать с ƒЌ . ¬ этом случае сам пептид может содержать св€зывающий ƒЌ  домен, получаемый за счет синтеза пептида и включени€ в него, предпочтительно за счет удлинени€, положительно зараженных аминокислот, предпочтительно на C-конце.
—огласно другому варианту изобретени€ эндосомолитический агент представл€ет собой невирусный, в случае необходимости синтетический пептид. ≈сли предлагаема€ система содержит пептид такого типа, то он предпочтительно ионным путем св€зан с веществом со сродством дл€ нуклеиновой кислоты, например с полилизином в случае наличи€ комплексов ƒЌ , содействующего поглощению клеткой фактора и полилизина. ѕри этом включение эндосомолитического пептида в комплекс нуклеиновой кислоты осуществл€ют за счет св€зывани€ с положительно зар€женным св€зывающим нуклеиновую кислоту доменом предпочтительно полилизином, через его кислые аминокислотные остатки.
¬ зависимости от химической структуры пептида, в частности его концевой группы, св€зывание с полилизином можно также осуществл€ть методами, используемыми в рамках данного изобретени€ дл€ св€зывани€ пептидов с полилизином. ≈сли примен€ть естественный пептид, то его можно модифицировать подход€щей концевой аминогруппой с тем, чтобы сделать его пригодным дл€ осуществлени€ св€зывани€.
ƒругой метод включени€ невирусных эндосомолитических пептидов в комплексы нуклеиновой кислоты заключаетс€ в том, что их снабжают последовательност€ми, способными к св€зыванию с ƒЌ . “ака€ последовательность должна находитьс€ в том месте, где она отрицательно не вли€ет на эндосомолитическую активность пептида. ѕоэтому, например, пептиды, N-конец которых ответствен за эту активность, удлин€ют св€зывающими ƒЌ  последовательност€ми на C-конце. “акими последовательност€ми могут быть гомологовые или гетерогенные катионные олигопептиды, например, олиголизиновый хвост, или естественный св€зывающий ƒЌ  домен, например пептид, производимый от гистона. Ёти св€зывающие ƒЌ  последовательности в качестве интегральной части эндосомолитического пептида предпочтительно содержат примерно 10 - 40 аминокислот. Ётот вариант изобретени€ позвол€ет повысить соотношение эндосомолитиеской последовательности и св€зывающей ƒЌ  последовательности по сравнению с конъюгатами пептида с большим содержанием поликатиона с тем, чтобы достичь большей эффективности комплексов.
Ќевирусные эндосомолитические пептиды должны отвечать следующим требовани€м. ¬ отношении эндосомолитической активности утечка липидных мембран, достигаема€ пептидом, предпочтительно должна быть больше при низкой величине pH (5 - 6), чем при величине pH 7.  роме того, разрушенные зоны мембраны должны иметь размер, достаточный дл€ обеспечени€ прохода комплексов ƒЌ  (небольшие поры €вл€ютс€ недостаточными). ƒл€ определени€ того, отвечает ли конкретный пептид этим требовани€м, можно проводить опыты в пробирке за счет того, что пептиды примен€ют в свободном или св€занном виде и/или в включенном в комплексе ƒЌ  виде. ¬ таких опытах с применением липосом, эритроцитов или клеточных культур определ€ют увеличением экспрессии гена. “акие опыты €вл€ютс€ объектом примеров осуществлени€ изобретени€. ќптимальное количество пептида можно определ€ть в рамках предварительных титрований путем анализа эффективности получаемого переноса гена. —ледует учесть, что эффективность различных пептидов и оптимальный состав комплекса завис€т от типа клетки.
–азрушающие мембрану пептиды обычно содержат амфипатические последовательности, а именно гидрофобный участок, который может взаимодействовать с липидной мембраной, и гидрофильный участок стабилизирует водную фазу в сайте разрушени€ мембраны.
¬ природе существуют некоторые примеры разрушающих мембрану пептидов, обычно небольших пептидов или пептидных доменов больших полипептидов. “акие пептиды можно классифицировать в соответствии с их функцией в природном контексте, а именно либо на разрушающие мембрану пептиды (например, пептиды обнаженных вирусов) и/или на вызывающие сли€ние мембран пептиды (например, вирусы с оболочкой). ¬ случае синтетических пептидов дл€ осуществлени€ разрушени€ €дрышек пригодны оба класса пептидных последовательностей. Ѕольшинство естественных пептидов способно к образованию амфипатических α-спиралей.
—пецифичность в отношении величины pH можно получать путем включени€ кислых остатков в гидрофильный участок предполагаемой амфипатической альфа-спирали с таким расчетом, что спираль может образоватьс€ только при кислой величине pH, но не при нейтральной величине pH, при которой отталкивание между отрицательно зараженными кислыми остатками предотвращает образование спирали. Ёто свойство также обнаружено в случае имеющихс€ в природе последовательностей (например у N-конца вируса гриппа Ќј-2).
ѕолностью синтетический амфипатический пептид со способностью к разрушению мембраны в зависимости от величины pH известный. Ётот пептид (в свободном виде) обеспечивает образование только небольших пор в мембранах, которые позвол€ют только высвобождение соединений небольшой величины. ¬ рамках варианта изобретени€, согласно которому используют невирусные, в случае необходимости синтетические, пептиды, обычно осуществл€ют следующие операции. јмфипатическую пептидную последовательность выбирают из группы имеющихс€ естественных или искусственных пептидов, известных специалисту. ¬ случае необходимости включают кислые остатки (Gin, Asp) с тем, чтобы сделать разрушающую мембрану активность пептида более специфичной в отношении величины pH (двойной кислый мутант гемагглютининового пептида гриппа согласно примеру 35, обозначенный р50). ¬ случае необходимости кислые остатки можно также включать с тем, чтобы улучшить способность пептида к св€зыванию с полилизином. “акой св€зывающий с поликатионом домен можно получать за счет включени€ C-концевых кислых удлинений, например, олиго-Glu-хвоста.
ѕригодные дл€ осуществлени€ данного изобретени€ эндосомолитические пептиды можно также получать за счет сли€ни€ имеющихс€ естественных и искусственных последовательностей. ¬ рамках данного изобретени€ проводились опыты с применением различных пептидов, которые производились от синтетического пептида GALA. Ќекоторые производные, которые примен€лись в этих опытах, получались за счет сочетани€ пептида GALA или его модификаций с последовательност€ми пептида гриппа или его модификаций, например с пептидами, обозначенными EALA-Inf и EALA-–50 согласно примеру 35.
ƒлина последовательности пептида может быть критической в отношении стабильности амфипатической спирали. ѕовышение стабильности коротких доменов, которые производ€тс€ от естественных белков, которым не хватает стабилизирующих белковых участков, можно обеспечивать за счет удлинени€ спирали.
Ёндосомолитическую активность пептидов можно повышать за счет образовани€ гомодимеров, гетеродимеров или олигомеров. ¬ результате проведени€ опытов по изобретению вы€вилось, что димер –50 про€вл€ет намного большую активность чем мономер.
 роме того, опыты также показывали действие синтетических пептидов на поглощение ƒЌ  при помощи конъюгатов трансферина и полилизина. ѕри этом синтезировались различные пептиды, которые исследовались на способность к утечке липосом и эритроцитов, а также на их действие на экспрессию люциферазы в клетках TIB 73 и NIH 3“3.
¬ качестве эндосомолитического агента можно также примен€ть непептидное амфипатическое вещество. “ребовани€ к пригодности такого вещества дл€ применени€ в рамках данного изобретени€ €вл€ютс€ в основном теми же самыми, что и в случае амфипатических пептидов, а именно способность включатьс€ в комплекс нуклеиновой кислоты, специфичность в отношении pH и так далее.
ƒругой вариант изобретени€ относитс€ к комплексам, содержащим нуклеиновую кислоту и конъюгат, способный к образованию комплекса с нуклеиновой кислотой, которые служат дл€ переноса нуклеиновой кислоты в высшие эукариотные клетки.  омплексы характеризуютс€ тем, что конъюгат состоит из вещества со сродством дл€ нуклеиновой кислоты и эндосомолитического агента, св€занного с веществом со сродством дл€ нуклеиновой кислоты, причем эндосомолитический агент способен к включению в клетку в качестве части комплекса конъюгата и нуклеиновой кислоты и к высвобождению содержимого €дрышек, в которых комплекс находитс€ после захода в клетку, в цитоплазму.
¬ рамках данного изобретени€ предпочтительно примен€ют такие комплексы, в которых нуклеинова€ кислота св€зана с веществом со сродством дл€ нуклеиновой кислоты так, что комплексы €вл€ютс€ в основном электронейтральными. —огласно предпочтительному варианту изобретени€ в качестве эндосомолитического агента используют вирус или его компонент, ковалентно св€занный с поликатионом.
»спользуемые в рамках данного изобретени€ эндосомолитические конъюгаты также охватывают (дополнительно к конъюгатам, в которых эндосомолитические агенты ионным путем св€заны со св€зывающим ƒЌ  доменом) эндосомолитические агенты, которые непосредственно св€зываютс€ с ƒЌ , например через их основное удлинение, хот€ такого рода "конъюгат", строго говор€, не получаетс€ за счет сопр€жени€ св€зи, то есть за счет св€зывани€ двух соединений друг с другом. ‘ункци€ такого типа эндосомолитических агентов в качестве компонента предлагаемой системы €вл€етс€ независимой от того, синтезированы ли они путем сопр€жени€ эндосомолитического агента и св€зывающего ƒЌ  домена или содержитс€ ли первоначально в нем св€зывающий ƒЌ  домен.
—огласно другому предпочтительному варианту изобретени€ кроме эндосомолитического конъюгата комплексы содержат другой конъюгат, в котором вещество со сродством дл€ нуклеиновой кислоты, в случае эндосомолитического конъюгата поликатиона обычно тот же поликатион, что и в конъюгате, сопр€гают с содействующим поглощению клеткой фактором, про€вл€ющим сродство дл€ целевой клетки. Ётот вариант изобретени€ используют, в частности, тогда, когда целева€ клетка не имеет или же имеет лишь немногие рецепторы дл€ вируса, примен€емого в качестве части эндосомолитического конъюгата. Ётот вариант изобретени€ употребл€етс€ и тогда, когда используют компонент вируса, например имеющийс€ в природе, возможно модифицированный пептид, невирусный, в случае необходимости синтетический эндосомолитический пептид или вирус несвойственного вида, которые не обладают способностью к проникновению в клетки, которые подлежат трансфекции. ѕрисутствие дополнительного конъюгата содействующего поглощению клеткой фактора и св€зывающего фактора приводит к улучшению характеристики эндосомолитических конъюгатов за счет того, что они образуют комплексы с нуклеиновой кислотой вместе со вторым конъюгатом и перенос€тс€ в клетку в качестве части результирующего комплекса, который в нижеследующем обозначаетс€ как "комбинационный комплекс" или "тройной комплекс". ѕредполагаетс€, что комбинационные комплексы поглощаютс€ клетками либо за счет св€зывани€ с поверхностным рецептором, специфичным дл€ дополнительного содействующего поглощению клеткой фактора или, например, в случае применени€ вируса или его компонента, за счет св€зывани€ с рецептором вируса или же за счет св€зывани€ с обоими рецепторами, причем поглощение имеет место в результате эндоцитоза, вызываемого рецептором.  огда эндосомолитические агенты высвобождаютс€ из €дрышек, ƒЌ , котора€ содержитс€ в комплексах, также выдел€етс€ в цитоплазму, при этом она избегает лизосомальной деградации.
¬ опытах, которые проводились в соответствии с данным изобретением, почти все клетки HeLa поддались трансфекции свободным аденовирусом. ¬ случае гепатоцитов эффективность можно было еще далее улучшать за счет использовани€ тройных комплексов ƒЌ , в которых репортерна€ ƒЌ  имеетс€ в виде комплекса с конъюгатами полилизина и трансферина и св€зана с аденовирусом. ¬ этом случае обеспечиваетс€ наличие эндосомолитического вируса и комплекса лиганда и рецептора в €дрышке. ѕри этом почти во всех клетках указанного типа, например BNL. -CL2 и HepG2, имеет место трансфекци€. ¬ этом случае имеющиес€ на поверхности клетки рецепторы как дл€ вируса, так и дл€ трансферина, могут захватывать тройные комплексы ƒЌ . ќднако также возможно, что тройные комплексы ƒЌ  могут проникать в клетку исключительно за счет действи€ совокупности клеточного лиганда и рецептора. “ака€ возможность исследовалась в опытах, в которых содержащие трансферин тройные комплексы ƒЌ  проникали в клетки  562 в основном через рецептор трансферина, нежели через рецептор аденовируса.
Ќеожиданным образом было вы€влено, что тройные комплексы переносили ƒЌ  в клетку даже в случае очень низких концентраций ƒЌ . “ак, например, в случае 30 пг ƒЌ /3 · 105 клеток получаетс€ 1,8 · 104 световых единиц (получаемых в результате экспрессии плазмиды, кодирующей люциферазу). “ака€ концентраци€ означает 60 молекул ƒЌ  и 1 бл€шкообразующую единицу вируса на клетку. —ледовательно, данное изобретение обеспечивает эффективную трансформацию высших эукариотных клеток очень малыми количествами ƒЌ .
ѕрисутствие вирусов, их компонентов или невирусных эндосомолитических агентов в комплексах ƒЌ  в качестве компонентов эндосомолитических конъюгатов имеет следующие преимущества.
1. Ўирока€ применимость технологии переноса генов с применением комплексов нуклеиновой кислоты, так как сам эндосомолитический агент, в частности в случае использовани€ вируса или его компонента, может представл€ть собой содействующий поглощению клеткой фактор или же может также переводитьс€ в комплекс с ƒЌ  и с другим содействующим поглощению клеткой фактором, например, трансферином, асиалофетуином. “аким путем возможно использование положительного эффекта вирусов даже в случае таких клеток, которые не имеют рецептора данного вируса.
2. ”лучшение эффективности переноса генов, так как св€зывание эндосомолитических конъюгатов с ƒЌ  обеспечивает то, что они вместе проникают в клетки. —огласованный процесс поглощени€ и высвобождени€ вирусов и ƒЌ  также позвол€ет снизить количества ƒЌ  и вирусов, необходимые дл€ эффективного переноса генов, что €вл€етс€ крайне важным при применении предлагаемой системы в живом организме.
ѕод термином "содействующий поглощению клеткой фактор" в рамках данного изобретени€ понимаютс€ лиганды или их фрагменты, которые после св€зывани€ с клеткой проникают в нее в результате эндоцитоза, предпочтительно вызываемого рецептором, или же факторы, св€зывание и проникновение которых осуществл€ют путем сли€ни€ с элементами клеточной мембраны.
ѕодход€щими содействующими поглощению клеткой факторами €вл€ютс€ лиганды трансферин, кональбумин, асиалогликопротеины (такие, как, например, асиалотрансферин, асиалорозомуцоид и асиалофетуин), лектины, вещества, которые содержат галактозу и проникают в клетки при помощи рецептора асиалогликопротеина, маннозилированные гликопротеины, лизосомальные энзимы, LDL, модифицированный LDL, липопротеины, которые проникают в клетки при помощи рецепторов (apo B100/LDL), вирусные протеины, такие, как, например протеин gp120 —ѕ»ƒа, антитела или их фрагменты против поверхностных антигенов клетки, как, например, анти-CD4, анти-CD7, цитокины, такие, как, например интерлейкин-1, интерлейкин-2, фактор опухолевого некроза, интерферон, стимулирующий колонии фактор, факторы роста, такие, как, например инсулин, фактор роста эпидермиса, выдел€ющийс€ из тромбоцитов фактор роста, фактор β трансформирующего роста, фактор роста нервов, подобный инсулину фактор I роста, пролан Ѕ, пролан ј, гормон роста, пролактин, глюкагон, тироидные гормоны, α-2-макроглобулинова€ протеаза и "бесплечевые" токсины. ƒругими примерами €вл€ютс€ иммуноглобулины или их фрагменты в качестве лигандов дл€ рецептора Fc или же антитела против иммуноглобулинов, которые св€зываютс€ с поверхностными иммуноглобулинами. Ћиганды могут быть естественного или синтетического происхождени€.
¬ нижеследующем привод€тс€ основные требовани€, предъ€вл€емые к пригодности вышеприведенных факторов в рамках данного изобретени€.
а) ќни могут поглощатьс€ клеткой, в которую следует перенести нуклеиновую кислоту, причем их способность к проникновению не ухудшаетс€ или же лишь в незначительной степени ухудшаетс€ в случае сопр€жени€ со св€зывающим фактором.
б) ќни способны к переносу нуклеиновой кислоты в клетку путем метода "ношени€ на спине" по любому пути, который они выбирают.
Ќижеследующа€ экспериментальна€ часть иллюстрирует широкие возможности применени€ содействующего поглощению клеткой фактора или дополнительного содействующего поглощени€ клеткой фактора в рамках осуществлени€ данного изобретени€ на примере конъюгатов трансферина и полилизина, комплексов асиалофетуина или галактозы и конъюгатов трансферина и полилизина, конъюгатов агглютинина пшеничного зачатка, комплексов конъюгата трансферина и полилизина и специфичного в отношении “-клеток белка gp120, комплексов конъюгатов трансферина и полилизина и анти-—D7, также на примере комплексов полилизина и ƒЌ , которые не содержат содействующего поглощению клеткой фактора.  роме того, возможность осуществлени€ изобретени€ при применении вирусных конъюгатов иллюстрируетс€ на примере комплексов ƒЌ  и сопр€женного с полилизином вируса или его компонента, которые не содержат конъюгата дополнительного содействующего поглощению клеткой фактора и св€зывающего фактора.
¬озможность или необходимость применени€ содействующего поглощению клеткой фактора в случае применени€ в качестве эндосомолитического агента свободного вируса или же дополнительного содействующего поглощению клеткой фактора в случае применени€ в качестве эндосомолитического агента вируса или компонента вируса или невирусного пептида, €вл€ющегос€ частью эндосомолитического конъюгата, дл€ обеспечени€ или улучшени€ процесса поглощени€ клеткой комплексов нуклеиновой кислоты можно вы€вл€ть за счет проведени€ соответствующих предварительных опытов. ¬ этих опытах осуществл€ют параллельные трансфекции комплексами нуклеиновой кислоты, в одном случае без (дополнительного) содействующего поглощению клеткой фактора, например в случае комплексов нуклеиновой кислоты и вирусного конъюгата, а в другом случае примен€ют комплексы нуклеиновой кислоты с другим конъюгатом, состо€щим из дополнительного содействующего поглощению клеткой фактора, дл€ которого целевые клетки имеют соответствующий рецептор, и вещества со сродством дл€ нуклеиновой кислоты.
ѕрименение содействующего поглощению клеткой фактора или дополнительного содействующего поглощению клеткой фактора (в случае применени€ комбинационного комплекса) определ€етс€, в частности, целевой клеткой, например, специфичными дл€ данной клетки поверхностными антигенами или рецепторами, которые таким образом позвол€ют желаемый перенос нуклеиновой кислоты в данную клетку.
ѕригодными в рамках данного изобретени€ веществами со сродством дл€ нуклеиновой кислоты €вл€ютс€, например, гомологовые органические поликатионы, такие, как, например полилизин, полиаргинин, полиорнитин, гетерогенные поликатионы, имеющие по меньшей мере две аминокислоты с различным положительным зар€дом, при этом они могут также иметь различную длину цепи, а также непептидные синтетические поликатионы, такие, как, например полиэтиленимин. ƒругими пригодными веществами со сродством дл€ нуклеиновой кислоты €вл€ютс€ естественные св€зывающие ƒЌ  белки поликатионной природы, такие, как, например гистоны, протамины или их аналоги или фрагменты, а также спермин или спермидин.
ƒлина поликатиона не €вл€етс€ критической при условии, что комплексы €вл€ютс€ в основном электронейтральными. ѕолилизин имеет предпочтительную длину цепи, составл€ющую примерно 20 - 1000 лизиновых мономеров. ќднако дл€ данной длины ƒЌ  не существует критической длины поликатиона. “ак, например, если ƒЌ  состоит из 6000 пар оснований (далее "п.о.") и 12000 отрицательных зар€дов, то на моль ƒЌ  примен€ют следующие количества поликатиона:
60 моль полилизина с мол€рным весом 200
30 моль полилизина с мол€рным весом 400
120 моль полилизина с мол€рным весом 100, и так далее.
Ћюбой специалист может подобрать поликатион с подход€щей длиной и в подход€щем мольном количестве за счет проведени€ стандартных опытов с учетом вышесказанного.
ƒругими подход€щими веществами со сродством дл€ нуклеиновой кислоты в качестве компонента конъюгатов €вл€ютс€ про€вл€ющие интеркал€цию вещества, такие, как, например этидиевые димеры, акридин, или же про€вл€ющие интеркол€цию пептиды, содержащие триптофан и/или тирозин и/или фенилаланин.
ƒл€ составлени€ качественного состава комплексов нуклеиновой кислоты обычно сначала определ€ют нуклеиновую кислоту, котора€ подлежит переносу в клетку. ¬ первую очередь нуклеиновую кислоту выбирают с учетом биологического действи€, которое должно про€вл€тьс€ в клетке, а в случае использовани€ изобретени€ дл€ генной терапии, - с учетом гена или участка гена, который подлежит экспрессии, например дл€ замены дефектного гена, или же с учетом последовательности гена, котора€ подлежит торможению. Ќуклеиновые кислоты, которые должны переноситьс€ в клетку, могут быть ƒЌ  или –Ќ , так как при этом не существует ограничение в отношении нуклеотидной последовательности.
≈сли примен€ть опухолевые клетки в качестве раковой вакцины, то подлежаща€ введению в клетку ƒЌ  предпочтительно кодирует модулирующее иммунную систему вещество, например, цитокин, как интерлейкин (далее: "»Ћ")-2, »Ћ-4, γ-интерферон (далее: "»‘") α-фактор опухолевого некроза (далее: "‘ќЌ"). ¬озможно также примен€ть комбинации кодирующих цитокин ƒЌ , например »Ћ-2 и γ-»‘. ƒругим полезным геном, который можно вводить в опухолевые клетки, может €вл€тьс€ устойчивый ко многим лекарственным средствам ген (далее: "mdr").
“акже возможно вводить в клетку две или больше различные последовательности нуклеиновой кислоты, например плазмидсодержащие кƒЌ , кодирующие два различных белка с управлением подход€щими регул€торными последовательност€ми, или два различных плазмидных конструкта, которые содержат различные кƒЌ .
“ерапевтически активные ингибирующие нуклеиновые кислоты, которые перенос€тс€ в клетки с тем, чтобы тормозить специфичные генные последовательности, могут представл€ть собой генные конструкты, которые служат дл€ транскрипции анти-м–Ќ  или рибозимов.  роме того, возможно также введение в клетку олигонуклеотидов, например анти-м-олигонуклеотидов. јнти-м-олигонуклеотиды включают предпочтительно по меньшей мере 15 нуклеотадов. ќлигонуклеотиды могут также представл€ть собой мультимеры. ≈сли включению в клетку подлежат рибозимы, то они предпочтительно примен€ютс€ в качестве компонента генного конструкта, включающего стабилизирующие генные элементы, например элементы гена т-–Ќ .
 роме молекул нуклеиновой кислоты, которые тормоз€т гены, например вирусные гены, можно также примен€ть гены, про€вл€ющие различный образ тормоз€щего действи€. ¬ качестве примеров можно назвать гены, кодирующие вирусные белки, которые имеют так называемые транс-доминантные мутации.
¬ результате экспрессии генов в клетке получаютс€ белки, которые доминируют соответствующий белок такого типа и, таким образом, защищают клетки, которые приобретают "клеточную иммунность" путем торможени€ вирусной репликации.
ѕодход€щими €вл€ютс€ транс-доминантные мутации вирусных белков, которые требуютс€ дл€ репликации и экспрессии, например Gag-, Tat- и Rev-мутанты. ѕоследние показывали торможение репликации ретровируса —ѕ»ƒа. ƒругой механизм достижени€ внутриклеточной иммунности заключаетс€ в экспрессии молекул –Ќ , включающих сайт св€зывани€ существенного вирусного белка, например, так называемые приманки TAR.
ѕримерами генов, которые можно примен€ть при соматической терапии и которые можно переносить в клетки в качестве компонента генных конструктов, €вл€ютс€ фактор VIII (гемофили€ ј), фактор IX (гемофили€ Ѕ), деаминаза аденозина, α-1 антитрипсин (эмфиземии легких) или регул€торный ген трансмембранной проводимости муковисцидоза.
¬еличина нуклеиновых кислот может колебатьс€ в широких пределах. “ак, например, генные конструкты размером примерно 0,15 кило пар оснований (далее: "к.п.о.") (в случае гена т-–Ќ , включающего рибозим) до примерно 50 к. п.о. или больше можно с успехом переносить в клетки при помощи предлагаемой системы. Ќебольшие молекулы нуклеиновой кислоты можно примен€ть в качестве олигонуклеотидов. ¬ св€зи с этим следует отметить, что применение предлагаемой системы не ограничено ни в отношении последовательности генов, ни в отношении их размера.
ѕосле выбора нуклеиновой кислоты подбирают вещество со сродством дл€ нуклеиновой кислоты, предпочтительно органическое поликатионное вещество, с тем, чтобы обеспечить образование комплекса нуклеиновой кислоты, при этом получаемый комплекс должен быть предпочтительно в основном электронейтральным. ≈сли комплексы включают конъюгат дополнительного содействующего поглощению клеткой фактора и вещества со сродством дл€ нуклеиновой кислоты, то поликатионный компонент обоих конъюгатов подбирают с учетом вопроса электронейтральности.
»звестно, что оптимальный перенос нуклеиновой кислоты в клетку может достигатьс€ тогда, когда соотношение конъюгата и нуклеиновой кислоты выбирают с таким расчетом, что комплексы содействующего поглощению клеткой фактора и поликатиона/нуклеиновой кислоты €вл€ютс€ в основном электронейтральными. Ѕыло найдено, что количество поглощаемой клеткой нуклеиновой кислоты не снижаетс€, если некоторое количество конъюгата трансферина и поликатиона замен€ют на не-ковалентно св€занный поликатион. Ќаоборот, в некоторых случа€х можно даже существенно повысить поглощение ƒЌ . Ѕыло обнаружено, что ƒЌ  комплексов имеетс€ в виде тороидальных структур диаметром 80-100 нм. “аким образом количество поликатиона подбирают с учетом электронейтральности и достижени€ компактной структуры. ѕри этом количество поликатиона, получаемое в результате осуществлени€ зар€дки нуклеиновой кислоты с учетом обеспечени€ электронейтральности, обычно также обеспечивают компактную структуру ƒЌ .
“аким образом согласно другому варианту изобретени€ комплексы также включают св€зывающие нуклеиновую кислоту вещества в не-ковалентно св€занном виде, которые могут быть идентичны или отличны от св€зывающего фактора. ≈сли эндосомолитический агент представл€ет собой свободный вирус, то комплексы включают конъюгат нуклеиновой кислоты и содействующего поглощению клеткой фактора. ¬ случае применени€ эндосомолитического конъюгата, например, вирусного конъюгата, нуклеинова€ кислота переводитс€ в комплекс с этим конъюгатом, в случае необходимости в сочетании с конъюгатом дополнительного содействующего поглощению клеткой фактора. ¬ид и количество не-ковалентно св€занного "свободного" вещества со сродством дл€ нуклеиновой кислоты также определ€етс€ конъюгатом или конъюгатами, в частности с учетом св€зывающего фактора в конъюгате. “ак, например, если св€зывающий фактор представл€ет собой вещество, которое не обладает или же обладает лишь ограниченной способностью к конденсации ƒЌ , то в цел€х достижени€ высокой степени поглощени€ клеткой комплексов целесообразно примен€ть вещества со сродством дл€ ƒЌ , которое в значительной степени обладает этим свойством. Ќо если же сам св€зывающий фактор представл€ет собой конденсирующее нуклеиновую кислоту вещество и позвол€ет получить компактную структуру нуклеиновой кислоты, достаточную дл€ обеспечени€ эффективного поглощени€ клеткой, то целесообразно примен€ть вещество со сродством дл€ нуклеиновой кислоты, которое обеспечивает усиление экспрессии благодар€ другим механизмам.
ѕодход€щими "свободными" веществами со сродством дл€ нуклеиновой кислоты согласно изобретению €вл€ютс€, например, соединени€, способные к конденсации нуклеиновой кислоты и/или защите их от нежелательной деградации в клетках, в частности вышеупом€нутые вещества поликатионного типа. ƒругими подход€щими веществами €вл€ютс€ такие вещества, которые в результате св€зывани€ с нуклеиновой кислотой улучшают ее доступность дл€ экспрессионной системы клетки, благодар€ чему улучшаетс€ ее транскрипци€/экспресси€. ѕримером такого вещества €вл€етс€ хромозомальный не-гистонный белок HMG1, который обладает способностью к сообщению ƒЌ  компактной структуры и к содействию экспрессии в клетках.
ѕри определении мол€рного соотношени€ эндосомолитического агента и/или содействующего поглощению клеткой фактора и вещества со сродством дл€ нуклеиновой кислоты или нуклеиновых кислот следует учесть, что имеет место комплексообразование нуклеиновой кислоты, образующийс€ комплекс может св€затьс€ с клеткой и поглощатьс€ ею и что он выдел€етс€ из €дрышек либо с помощью эндосомолитического агента либо самим собой.
—оотношение содействующего поглощению клеткой фактора, св€зывающего фактора и нуклеиновой кислоты зависит, в частности, от размера молекул поликатиона и числа распределени€ положительно зараженных групп. ѕоэтому эти критерии должны согласоватьс€ с размером и структурой переносимой нуклеиновой кислотой. ћол€рное соотношение содействующего поглощению клеткой фактора и вещества со сродством нуклеиновой кислоты предпочтительно составл€ет примерно 10 : 1 - 1 : 10.
ѕосле конструкции и синтеза конъюгатов и определени€ оптимального в отношении эффективной трансфекции соотношени€ конъюгата и ƒЌ  количество конъюгата, которое можно замен€ть свободным веществом со сродством нуклеиновой кислоты, можно определ€ть путем титровани€. ≈сли поликатионы примен€ют как в качестве св€зывающего фактора, так и в качестве свободного вещества со сродством дл€ нуклеиновой кислоты, то поликатионы могут быть идентичными или же различными.
ѕри получении предлагаемой системы, включающей конъюгаты вируса, целесообразно поступать следующим образом. —начала подбирают генный конструкт, который подлежит переносу в клетку, и вирус или его компонент, пригодный дл€ данной трансфекции. «атем вирус или его компонент св€зывают с поликатионом и перевод€т в комплекс с генным конструктом. »сход€ из определенного количества конъюгата вируса можно осуществл€ть титрование путем обработки целевых клеток этим (посто€нным) количеством конъюгата и уменьшени€ концентрации ƒЌ , или наоборот. “аким образом определ€ют оптимальное соотношение ƒЌ  и конъюгата вируса. ≈сли примен€ть дополнительный содействующий поглощению клеткой фактор, то оптимальное соотношение конъюгата вируса и конъюгата содействующего поглощению клеткой фактора можно определить путем титровани€ с применением определенного количества ƒЌ .
 омплексы можно получать путем смешивани€ нуклеиновой кислоты, конъюгата вируса и, в случае необходимости, конъюгата содействующего поглощению клеткой фактора и св€зывающего фактора, а также не-ковалентно св€занного вещества со сродством дл€ нуклеиновой кислоты. ѕри этом все компоненты могут иметьс€ в виде разбавленных растворов. ≈сли поликатионы примен€ют в качестве св€зывающего фактора и одновременно в качестве "свободных" поликатионов, то целесообразно сначала получать смесь конъюгатов со "свободными" поликатионами и затем объедин€ть эту смесь с ƒЌ . ќптимальное соотношение ƒЌ  и конъюгата или конъюгатов и поликатионов определ€ют путем многократного титровани€, при этом осуществл€ют серию процессов трансфекции с применением посто€нного количества ƒЌ  и повышающихс€ количеств смеси конъюгата или конъюгатов и поликатиона. ќптимальное соотношение конъюгата или конъюгатов и поликатионов в смеси можно определ€ть, например, путем сравнивани€ оптимальных составов смесей, примен€емых в процессах многократного титровани€.
 омплексы ƒЌ  можно получать при физиологических концентраци€х солей. ƒруга€ возможность заключаетс€ в применении высоких концентраций солей (примерно 2ћ NaCl) и последующем доведении до физиологических условий путем медленного разбавлени€ или диализа.
Ќаиболее целесообразна последовательность смешени€ компонентов нуклеиновой кислоты, конъюгата или конъюгатов и, в случае необходимости, не-ковалентно св€занного вещества со сродством дл€ нуклеиновой кислоты предварительно определ€ют в рамках серии соответствующих опытов. ¬ некоторых случа€х может быть целесообразным предварительное образование комплекса нуклеиновой кислоты и конъюгата или конъюгатов с последующим добавлением "свободного" вещества со сродством дл€ нуклеиновой кислоты, например, поликатиона, например, в случае конъюгатов трансферина и димерного этиди€ и полилизина.
—огласно предпочтительному варианту данного изобретени€ в качестве содействующего поглощению клеткой фактора и дополнительного содействующего поглощению клеткой фактора примен€ют трансферин, а в качестве св€зывающего фактора - поликатион. ѕод термином "трансферин" понимаютс€ естественный и синтетический трансферины, а также модификации трансферина, которые св€зываютс€ с рецептором и перенос€тс€ в клетку.
Ќуклеинова€ кислота поглощаетс€ в виде комплексов, в которых конъюгаты содействующего поглощению клеткой фактора и поликатионы имеютс€ в виде комплекса с нуклеиновой кислотой. ≈сли комплексы еще включают не-ковалентно св€занное вещество со сродством дл€ нуклеиновой кислоты, то этим веществом €вл€етс€ предпочтительно поликатион. Ётот второй поликатион идентичен или же отличен от поликатиона, содержащегос€ в конъюгате или в обоих конъюгатах.
¬ случае "комбинационных комплексов " нуклеинова€ кислота поглощаетс€ клеткой в виде комплекса, в котором конъюгаты содействующего поглощению клеткой фактора и эндосомолитические конъюгаты комплексированы с нуклеиновой кислотой.  онъюгаты содействующего поглощению клеткой фактора и поликатиона, которые примен€ют вместе со свободным вирусом или же вместе с вирусными конъюгатами в комбинационных комплексах, можно получать химическим методом или же рекомбинантным методом в случае применени€ полипептида в качестве поликатиона.
¬ рамках данного изобретени€, предпочтительно примен€ют конъюгаты, в которых гликопротеин, например, трансферин, и св€зывающий фактор, св€занный друг с другом по меньшей мере через одну углеводную цепь гликопротеина. ¬ отличие от получаемых традиционными методами св€зывани€ конъюгатов получаемые данным методом конъюгаты свободны от модификаций, происход€щих от примен€емого св€зывающего агента. ¬ случае применени€ гликопротеинов, по меньшей мере с одной углеводной группой, пригодной дл€ св€зывани€, например, трансферина, получаемые конъюгаты также имеют то преимущество, что их места св€зывани€ с гликопротеинами и св€зывающим фактором точно определены.
 оличество примен€емого эндосомолитического агента и его концентраци€ завис€т от целевой трансфекции. ÷елесообразно примен€ть минимальное количество вируса или вирусного конъюгата, которое необходимо дл€ обеспечени€ поглощени€ клеткой вируса или вирусного конъюгата и комплекса нуклеиновой кислоты и высвобождени€ из €дрышек.  оличество вируса или вирусного конъюгата следует согласовать с данным типом клетки, причем в первую очередь следует учесть эффективность вируса дл€ данного типа клетки. ƒругим критерием €вл€етс€ примен€емый конъюгат содействующего поглощению клеткой фактора и св€зывающего фактора, в частности в отношении содействующего поглощению клеткой фактора, дл€ которого целева€ клетка имеет определенное число рецепторов.  роме того, количество вируса или вирусного конъюгата зависит от количества переносимой ƒЌ . ќбычно небольшое количество вируса достаточно дл€ обеспечени€ устойчивой трансфекции, дл€ которой требуетс€ лишь небольшое количество ƒЌ . ¬ противоположность этому в случае осуществлени€ временной трансфекции, требующей большего количества ƒЌ , вирус должен примен€тьс€ в большем количестве. ¬ определенных случа€х целесообразно проводить предварительные эксперименты с применением предназначенных дл€ трансфекции целевых клеток, в случае необходимости в виде смешанной попул€ции, и предназначенной дл€ трансфекции векторной системы с тем, чтобы определить оптимальную концентрацию вируса путем титровани€. ѕри этом в качестве ƒЌ  целесообразно примен€ть генный конструкт, который по размеру в основном совпадает с тем веществом, предназначенным дл€ данного конкретного случа€, и содержит репортерный ген дл€ более простого определени€ эффективности переноса гена. ѕодход€щими репортерными генами дл€ осуществлени€ таких опытов €вл€ютс€ люцифераза и β-галактосидаза.
ѕри осуществлении данного изобретени€ предпочитаетс€ одновременное применение комплекса нуклеиновой кислоты и эндосомолитического агента. Ќо вполне возможно и их последовательное применение. ¬ случае раздельного применени€ последовательность не €вл€етс€ критической при условии, что меропри€ти€ провод€т друг за другом с соблюдением только короткого промежутка времени, чтобы обеспечить эффективный одновременный контакт компонентов.
≈сли примен€ть свободный вирус в виде отдельного препарата, то одновременна€ дача препарата свободного вируса и комплексов может обеспечиватьс€ за счет того, что препараты вируса €вл€ютс€ частью среды трансфекции, содержащей комплекс нуклеиновой кислоты. ¬ случае одновременной аппликации свободного вируса комплексы нуклеиновой кислоты и препарат вируса предварительно смешивают друг с другом. —огласно предпочтительному варианту данного изобретени€ эндосомолитический агент €вл€етс€ компонентом комбинационного комплекса.
¬ определенных случа€х может быть целесообразным применение лизосоматропного вещества дополнительно к эндосомолитическому агенту, например, если эндосомолитический агент представл€ет собой эндосомолитический конъюгат пептидов или ретровирус, эндосомолитическа€ активность которых не зависит от кислой величины pH. »звестно, что лизосомотропные вещества тормоз€т активность протеаз и нуклеаз и поэтому могут тормозить деграцию нуклеиновых кислот. “акими веществами €вл€ютс€, например, хлорохин, моненсин, нигерицин и метиламин. Ѕыло найдено, что моненсин позвол€ет повысить экспрессию репортерного гена в случае применени€ ретровируса ћолоне€. ѕрисутствие хлорохина приводит к экспрессии репортерного гена, завезенного переносом ƒЌ  в присутствии трансферина, почти 100%-но в клетках  562.  летки BNL.CL2 или гепатоциты HepG2 не реагируют на воздействие хлорохина, они могут трансфецироватьс€ до уровн€ 5 -10% в случае использовани€ эндосомолитических свойств дефектного повторной репликацией или химически инактивированного свободного аденовируса. ƒанное изобретение позвол€ет усилить преимущества биологических векторов. ¬ результате распределени€ рецепторов получаетс€ тропизм дл€ содействующего поглощению клеткой фактора и вируса. —огласование этих двух компонентов с примен€емой попул€цией клеток позвол€ет достичь более высокой селективности, что, в частности, имеет важное значение при применении изобретени€ дл€ терапевтических целей.
ƒругим объектом данного изобретени€ €вл€ютс€ фармацевтические композиции, которые содержат в качестве активного вещества комплекс терапевтически активной нуклеиновой кислоты, предпочтительно в качестве частей генного конструкта, эндосомолитический агент (в случае необходимости в виде конъюгата) и, в случае необходимости, конъюгат содействующего поглощению клеткой фактора. ѕри этом можно примен€ть любой инертный фармацевтический приемлемый носитель, такой как, например, солевой раствор, который может содержать фосфатный буфер, или же любой носитель, в котором комплексы ƒЌ  €вл€ютс€ растворимыми в требуемой степени. —пособ приготовлени€ фармацевтической композиции широко известен.
ƒанное изобретение обеспечивает максимальную гибкость при его осуществлении, например, при его применении в виде фармацевтической композиции. ѕредлагаема€ система может иметьс€ в виде лиофилизата или же содержатьс€ в подход€щем буфере в глубоко замороженном состо€нии. ≈е можно также примен€ть в качестве готового к применению реагента в растворе, предпочтительно в охлажденном виде. Ќеобходимые дл€ трансфекции компоненты, то есть ƒЌ , эндосомолитический агент, в случае необходимости в виде конъюгата или в готовом к образованию конъюгата с соответствующим партнером, св€зывающее ƒЌ  вещество, в случае необходимости в виде конъюгата с содействующим поглощению клеткой фактором, в случае необходимости свободный поликатион, могут содержатьс€ в подход€щей буферной системе или же могут представл€ть собой градиенты трансфекционного комплекта. ≈сли трансфекционный комплект примен€ют в качестве модульной системы, то он может содержать различные ƒЌ , например, ƒЌ , кодирующие различные антигены, и/или различные конъюгаты содействующего поглощению клеткой фактора. –ешение вопроса применени€ компонентов в виде готового к применению препарата или же их смешение непосредственно перед применением зависит, между прочим, от устойчивости комплексов, котора€ может заранее определ€тьс€ известными методами. —огласно предпочтительному варианту изобретени€ в качестве ингредиента комплекта может примен€тьс€ полученный с помощью трансглютаминазы конъюгат аденовируса и полилизина, который €вл€етс€ устойчивым при хранении. —огласно другому предпочтительному варианту изобретени€ биотинилированный аденовирус и стрептавидин/полилизин смешивают друг с другом перед применением.
ѕредлагаемую систему можно апплицировать системно, предпочтительно внутривенным путем, в качестве частей фармацевтической композиции. ÷елевыми органами, на которые направлена данна€ аппликаци€, могут быть печень, селезенка, легкие, костный мозг и опухоли. ѕримером местной аппликации €вл€етс€ легочна€ ткань (применение предлагаемой системы в качестве частей фармацевтической композиции, представл€ющей собой жидкость дл€ инстил€ции или аэрозоль дл€ ингал€ции).  роме того фармацевтические композиции можно также апплицировать путем непосредственного впрыскивани€ в печень, мышечную ткань, опухоль или же путем местной дачи в желудочно-кишечный тракт. ƒругим методом дачи фармацевтической композиции €вл€етс€ введение через дренажную систему желчи. Ётот метод обеспечивает непосредственный доступ к мембранам гепатоцитов на канальцах желчи, чем избегаетс€ взаимодействи€ композиции с компонентами крови.
»звестно, что миобласты (незрелые мышечные клетки) способны к транспорту генов в мышечные волокна мышей. “ак как миобласты могут выдел€ть генный продукт в кровь, этот подход может получать более широкое применение, чем обработка генетических дефектов мышечных клеток, как, например, дефекта, выраженного мышечной дистрофией. —ледовательно, соответственно подготовленные миобласты можно примен€ть дл€ выделени€ генных продуктов, которые либо действуют в крови, либо транспортируютс€ кровью. Ёксперименты в соответствии с данным изобретением показывали, что культуры миобластов и мышечных трубочек, даже первичные, можно подвергать высокоэффективной трансфекции. Ќаиболее пригодна€ среда трансфекции содержала комбинационные комплексы биотинилированного аденовируса, трансферина/полилизина и стрептавидина/полилизина.  роме репортерных генов люциферазы и β-галактозидазы в мышечных клетках экспрессировалс€ фактор VIII.  роме того, куриный аденовирус CELO примен€лс€ в комбинационных комплексах, содержащих агглютинин пшеничного зачатка в качестве дополнительного содействующего поглощению клеткой фактора.
“ерапевтическое применение может также осуществл€тьс€ ex vivo, причем обработанные клетки, например, клетки костного мозга, гепатоциты или миобласты, возвращаютс€ в тело. ƒругое применение ex vivo предлагаемой системы сводитс€ к аппликации так называемых "раковых вакцин". ѕринцип этого терапевтического подхода заключаетс€ в выделении опухолевых клеток из пациента и трансфекции клеток ƒЌ , кодирующей цитокин. —ледующий прием может заключатьс€ в инактивации клеток, например, путем облучени€, которое проводитс€ с таким расчетом, что клетки больше не обладают способностью к репликации, но все еще способны к экспрессии цитокина. «атем генетически модифицированные клетки в качестве вакцины дают пациенту, из которого клетки были изолированы. ¬ зоне сайта вакцинации выдел€емые цитокины активируют иммунную систему, например, за счет активации цитотоксичных “-клеток. Ёти активированные клетки способны к про€влению своего действи€ в других част€х тела и к воздействию на необработанные опухолевые клетки. “аким образом риск повторного образовани€ опухоли и образовани€ метастазов снижаетс€.
¬ экспериментах согласно данному изобретению первичные меланомные клетки успешно подвергались трансфекции репортерным геном, который содержалс€ в комбинационных комплексах св€занного с полилизином аденовируса и трансферина/полилизина.
ƒанное изобретение может также использоватьс€ дл€ определени€ иммунореакции хоз€ина на заданный антиген. “акие испытани€ основаны на переносе гена в экспрессирующие антиген клетки. —пецифичные в отношении антигена цитотоксичные “-лимфоциты (далее: "÷“Ћ"), которые разрушают инфицированные клетки, играют важную роль в защите хоз€ина от вирусных инфекций или опухолей. ¬заимодействие между “-клеткой и представл€ющей антиген клеткой (далее "ѕј ") ограничено лимфоцитными антигенами человека (далее: "Ћј„"), которые €вл€ютс€ молекулами большой тканевой совместимости. ƒл€ осуществлени€ исследовани€ степени разрушени€ ÷“Ћ экспрессирующих антиген клеток в рамках опыта in vitro необходимо представл€ть антиген ÷“Ћ в правильном контексте Ћј„. “акое исследование можно осуществл€ть следующим образом. ѕј  подвергают трансфекции конструктом ƒЌ , содержащим последовательность, кодирующую антиген. Ёпитропы антигена будут св€зыватьс€ с ћЌ— класса I и будут иметьс€ на поверхности клетки в качестве мишени дл€ специфичной в отношении ÷“Ћ реакции. ѕосле инкубации вместе с пробой сыворотки пациента, завис€щей от присутстви€ специфичных ÷“Ћ, ѕј  будет подвергатьс€ лизису. ѕри этом лизис измер€ют за счет определени€ выделени€, например, радиоактивного хрома, который включилс€ в ѕј  перед добавлением к сыворотке.
»ндуцированные Ѕ-лимфопластоидные клеточные линии можно примен€ть дл€ экспрессии генов антигена путем трансфекции рекомбинантными вирусами вакцинии. ќднако клетки, которые эффективно экспрессируют антиген в течение примерно одного дн€, умирают в результате литического эффекта вакцинии. Ёти трудности можно преодолеть при применении предлагаемой системы дл€ введени€ кодирующих антиген конструктов ƒЌ , например, конструктов, кодирующих антигены —ѕ»ƒа или опухолевые антигены, в фибробласты с тем, чтобы сообщить им способность к экспрессии антигена. ѕервичные фибробласты можно легко получать путем биопсии, легко выращивать и поддаютс€ высокоэффективной трансфекции (со степенью примерно 50 - 70%) предлагаемой системой. “акие анализы полезны дл€ идентификации распознаваемых клетками-килерами эпитопов в отношении вакцин.  роме того, они могут преимущественно примен€тьс€ дл€ определени€ ограниченной Ћј„ иммунной реакции индивидуума на заданный антиген.
»зобретение может использоватьс€ дл€ производства рекомбинантных белков, так как почти во всех клетках достигаетс€ высока€ степень экспрессии переносимых генов. ѕри этом в отношении последовательностей и молекул€рного веса переносимой ƒЌ  существуют лишь некоторые ограничени€ или же ограничений вообще не существует. »меетс€ широкий спектр различного рода клеток, которые поддаютс€ трансфекции предлагаемыми конструктами ƒЌ . “ак, например, клетки почти любого типа можно примен€ть дл€ производства рекомбинантных белков с высокой биологической активностью.
ѕеренос гена в клетки можно осуществл€ть тем же образом, что и показано дл€ люциферазы и α-интерферона, то есть практически любой генный конструкт, который обеспечивает получение желаемого белкового продукта, может транспортироватьс€ указанным образом. ∆елаемый белковый продукт можно выдел€ть из трансфецированной клеточной культуры (либо надосадочной жидкости культуры либо подход€щего продукта ее гомогенизации) через 24 часа или же через одну неделю после трансфекции. ¬ыделение возможно также по истечении более продолжительного периода после трансфекции.
»спользование предлагаемой системы дл€ производства рекомбинантных белков имеет следующие преимущества.
1. Ѕлагодар€ высокой эффективности трансфекции (более 90% трансфецированных клеток способны к экспрессии соответствующего гена на высоком уровне), предварительный отбор положительно трансфецированных клеток не требуетс€ и, кроме того, нет необходимости в подборе устойчивых клеточных линий. Ќебольша€ клеточна€ культура может быть достаточной дл€ производства белка в необходимом количестве.
2. Ѕольшие генные конструкты могут транспортироватьс€. ƒо сих пор с успехом переносились в клетки конструкты размером до 48 к.п.о.
3. Ёкспресси€ гена может осуществл€тьс€ в клетках, которые обеспечивают подход€щие посттрансл€ционные переработку и модификацию (например, завис€щее от витамина ј карбоксилирование факторов свертывани€ крови или специфичного дл€ данного типа клетки гликозилировани€).
4. ¬озможен более широкий подбор типов целевых клеток дл€ экспрессии гена.
»зобретение далее описываетс€ с помощью нижеследующих примеров, которые представлены в цел€х иллюстрации, а не какого-то ни было ограничени€ его объема. ¬ этих примерах используют следующие материалы и методы, если иного не указано.
ѕолучение комплексов ƒЌ  и конъюгата трансферина и полилизина
а)  онъюгаты трансферина и полилизина человека
–аствор 280 мг (3,5 мкмоль) человеческого, свободного от железа трансферина в 6 мл 30 мћ буфера ацетата натри€ с pH 5 охлаждают до температуры 0oC и добавл€ют 750 мкл 30 мћ буфера ацетата натри€ с pH 5, содержащего 11 мг (51 мкмоль) периодата натри€. —месь оставл€ют сто€ть в темноте на лед€ной бане в течение 90 минут. ¬ цел€х удалени€ низкомолекул€рных продуктов осуществл€ют гель-фильтрацию на йоните Sephadex G-25. ѕолучают раствор, содержащий примерно 250 мг окисленного трансферина (определение при помощи нингидрина). (ƒл€ доказательства окисленной формы, содержащей альдегиды и дающей цветную реакцию при окрашивании анисовым альдегидом, смесь капл€ми подают на тонкую слоистую пластину силикагел€, сушат, пластины погружают в смесь п-анисового альдегида, серной кислоты и этанола в соотношении 1 : 1 : 18, сушат и нагревают). –аствор модифицированного трансферина быстро добавл€ют (в течение 10 - 15 минут) к раствору, содержащему 1,5 мкмоль меченого флуоресцеином поли(L)лизина со средней длиной 190 лизиновых мономеров, в 4,5 мл 100 мћ ацетата натри€ с pH 5. pH раствора довод€т до 7,5 путем добавлени€ 1 ћ буфера бикарбоната натри€. — промежутком одного часа к смеси добавл€ют 4 раза 28,5 мг (450 мкмоль) цианоборгидрида натри€.
„ерез 17 часов добавл€ют 2 мл 5 ћ хлористого натри€ с тем, чтобы довести раствор до общей концентрации 0,75 ћ. –еакционную смесь подают на катионообменную колонку марки Mono S HR 10/10 фирмы ‘армаци€, Ўвеци€, после чего элюируют солевым градиентом 0,75 ћ-2,5 ћ хлористого натри€, имеющим посто€нное содержание 25 мћ HEPES, pH 7,3. ¬ысока€ солева€ концентраци€ при подаче на колонку и в начале осуществлени€ градиентной элюации €вл€етс€ существенным дл€ получени€ конъюгатов. Ќекоторые количества трансферина (примерно 30%) со слабой флуоресценцией элюируют в начале процесса. ќсновное количество меченого флуоресценцией конъюгата элюируют при солевой концентрации 1,35 -1,9 ћ и его собирают в виде 3 фракций. ѕосле двух серий диализа с применением 2 л 25 мћ буфера HEPES, pH 7,3, эти фракции (в пор€дке их элюации) дают фракцию ј, содержащую 45 мг (0,56 мкмоль) трансферина, модифицированного 366 нмоль полилизина (далее этот конъюгат обозначаетс€ "TfpL190A"), фракцию Ѕ, содержащую 72 мг (0,90 мкмоль) трансферина, модифицированного 557 нмоль полилизина (далее этот конъюгат обозначаетс€ "TfpL190B) и фракцию ¬, содержащую 7 мг (85 нмоль) трансферина, модифицированного 225 нмоль полилизина (далее этот конъюгат обозначаетс€ "TfpL190C"). ≈сли конъюгаты сразу же не подаютс€ на дальнейшее применение, то их замораживают в атмосфере жидкого азота и хран€т при температуре -20oC в свободной от железа форме. ѕеред введением железа пробы (0,5 - 1 мг) довод€т до физиологической солевой концентрации (150 мћ) добавлением хлористого натри€. ¬ключение железа осуществл€етс€ за счет добавлени€ 4 мкл 10 мћ цитратного буфера железа (III) (содержащего 200 мћ цитрата; pH буфера доведен до 7,8 добавлением бикарбоната натри€) на мг содержащегос€ в конъюгате трансферина. ∆елезосодержащие конъюгаты подраздел€ют на небольшие аликвоты перед их применением дл€ образовани€ комплекса с ƒЌ , мгновенно замораживают в атмосфере жидкого азота или в сухой атмосфере льда и этанола и хран€т при температуре -20oC (этот подход оправдал себ€, так как найдено было, что повтор€ющиес€ процессы оттаивани€ и замораживани€ привод€т к потере активности конъюгатов).
б)  онъюгаты мышиного трансферина и полилизина
ѕримен€ют подобный метод, что и в случае трансферина человека, при этом св€зывание осуществл€ют при помощи боковых углеводных цепей. ѕримен€ют 4,1 мг (51 нмоль) мышиного трансферина и 2,1 мг (34 нмоль) полилизина с молекул€рным весом 290 (далее: "pL 290"). ѕолучают конъюгаты, состо€щие из 15,5 нмоль мышиного трансферина и 13 нмоль pL 290.
ѕлазмидна€ ƒЌ 
а) ƒЌ  pRSVL.
ѕолучение плазмидной ƒЌ  pRSVL (содержащей ген люциферазы Photinus pyralis под контролем вируса Rous Sarcoma LTR) осуществл€ют известными приемами с применением тритона ’. ƒалее используют равновесное центрифугирование в градиенте плотности с применением хлорида цези€ и бромида этиди€, обесцвечивание буганолом-1 и диализ с применением 10 мћ буфера Tris/HCl (pH 7,5, 1 мћ Ёƒ“ ). ќбразование комплекса осуществл€ют за счет смешени€ 6 мкг плазмидной ƒЌ  в 350 мкл буфера HBS (150 мћ хлористого натри€, 20 мћ HEPES, pH 7,3) с 12 мкг конъюгата трансферина и полилизина в 150 мкл буфера HBS.  омплексообразование осуществл€ют за 30 минут до добавлени€ комплекса к клеткам.
б) ƒЌ  pCMVL
ѕлазмиду pCMVL (репортерный генный конструкт, содержащий ген люциферазы Photinus pyralis под контролем промотора цитомегаловируса) получают за счет удалени€ вставки BamHI из плазмиды pSTCX556, обработки плазмиды фрагментом  ленова и введени€ обработанного HindIII/Ssp1 и фрагментом  ленова фрагмента из плазмиды pRSVL, содержащего последовательность, кодирующую люциферазу. ƒЌ  получают аналогично получению ƒЌ  pRSVL.
ѕолучение препарата вируса
а) ѕрепараты аденовируса
»спользуют штамм d1312 аденовируса, имеющий делецию в зоне Ela. –епликацию вируса осуществл€ют в Ela-транс-комплементирующей клеточной линии 293 с последующей очисткой известным приемом. ќчищенный вирус подают в предназначенный дл€ хранени€ буфер (100 мћ Tris, pH 8,0, 100 мћ хлористого натри€, 0,1% альбумина сыворотки крупного рогатого скота (далее: "ј——"), 50% глицерина) или в буфер HBS с содержанием 40% глицерина и аликвоты хран€т при температуре -70oC.  онцентрацию вирионов определ€ют ”‘-спектрофотометрическим анализом экстрагированной геномной вирусной ƒЌ  (формула: одна единица оптической плотности соответствует 1012 вирусным частицам на мл).
б) ѕрепарат ретровируса
–етровирус ћолоне€ N2 мышиного лейкоза упаковывают в экотропную упаковочную линию. Ќадосадочные жидкости, получаемые от экспрессирующих вирус клеток, собирают, мгновенно замораживают в атмосфере жидкого азота и хран€т при температуре -20oC. ѕримен€емый в примерах надосадочные жидкости имеют титр примерно 106 колониеобразующих единиц на мл (далее: "кое/мл"), который определ€лс€ путем образовани€ устойчивых к неомицину колоний с применением клеток NIH3T3. Ќадосадочные жидкости пропускают через мембрану марки FILTRON, наход€щуюс€ в перемешиваемом аппарате дл€ концентрации клеток под давлением азота. ѕри этом 10-30 мл надосадочной жидкости обычно сгущают в 10 раз.
 летки и среда
 летки HeLa культивируют в среде DMEM, дополненной 5% инактивированной термообработкой тел€чьей эмбриональной сыворотки (далее: "“Ё—"), 100 единицами/мл пенициллина, 100 мкг на мл стрептомицина и 2 мћ глутамина.  летки WI-38, MRC-5 и KB культивируют в среде ≈ћ≈ћ (модифицированной »глем основной среде), дополненной 10% инактивированной термообработкой “Ё—, антибиотиками, содержащимис€ в среде DMEM, 10 мћ заменимых аминокислот и 2 мћ глутамина. Ёпительную клеточную линию дыхательного муковисцитоза CFT1 культивируют в среде F12-7’. ƒл€ осуществлени€ переноса генов клетки культивируют в снабженных €чейками диаметром 6 см чашках до достижени€ степени выращивани€ 5 · 105 клеток. —реду удал€ют и добавл€ют 1 мл среды DMEM или ≈ћ≈ћ/2% “Ё—. «атем добавл€ют комплексы конъюгата и ƒЌ  с последующей немедленной подачей аденовируса d1312 (0,05 - 3,2 · 104 частиц в клетку) или сравнимого объема буфера (1 - 80 мкл). „ашки возвращают на инкубацию при температуре 37oC в присутствии 5% двуокиси углерода в течение одного часа, после чего добавл€ют 3 мл полной среды. ѕосле дополнительной 24-часовой инкубации осуществл€ют сбор клеток с тем, чтобы определить экспрессию гена люциферазы. ¬ случае клеток CFT1 осуществл€ют культивацию в среде F12-7’ в течение 4 часов без трансферина человека перед осуществлением переноса гена.
ѕолученные от американской коллекции ј“—— клетки имеют следующие регистрационные номера: клетки HeLa: CCL 2; клетки  562: CCL 243; клетки HepG2: Ќ¬ 8065; клетки TIB-73: TIB 73 (BNL CL.2); клетки NIH3T3: CRL 1658; клетки 293: CRL 1573; клетки KB: CCL 17; клетки WI-38: CCL 75; клетки MRC 5: CCL 171.  летки Ќ9 с регистрационным номером 87 получены от американской организации AIDS Research and Reference Reagent Program, U.S. Department of Health and Human Services.
ѕервичные лимфоциты получают путем подачи 25 мл пробы пуповинной крови в подопытной трубке, содержащей Ёƒ“ . ѕод аликвотами размещают нижний слой 4,5 мл продукта ‘иколл-гипак фирмы ‘армаци€, Ўвеци€, и центрифугируют при 2500 об/мин в течение 15 минут.  оричневатый слой между верхним слоем плазмы и прозрачным слоем ‘иколла удал€ют (примерно 10 мл). ƒобавл€ют 40 мл среды IMDM плюс 10% “Ё—, пробу центрифугируют при 1200 об/мин в течение 15 минут и клеточный материал суспендируют в 50 мл свежей среды IMDM плюс 10% “Ё— (плотность клеток составл€ет примерно 2 · 106 клеток/мл). ƒобавл€ют 250 мкл аликвота фитогемагглютинина, культуру инкубируют при температуре 37oC в течение 48 часов в присутствии 5% двуокиси углерода и добавл€ют рекомбинантный интерлейкин-2 (концентраци€: 20 единиц на мл).  летки разбавл€ют в отношении 1 : 3 средой IMDM плюс 20% “Ё—, содержащей 2 единицы интерлейкина-2 на мл. јликвоты клеток подвергают глубокому замораживанию в атмосфере жидкого азота в присутствии 5% метилсульфоксида. ѕеред применением клетки выращивают в среде IMDM, содержащей 20% “Ё— и 2 единицы интерлейкина-2 на мл.
ƒл€ осуществлени€ последующего процесса св€зывани€ клетки HeLa уравновешивают при температуре 4oC в 1 мл среды DMEM, дополненной 2% “Ё—.  омплексы конъюгата и ƒЌ  добавл€ют тем же образом, что и в других случа€х, и чашки инкубируют при температуре 4oC в течение 2 часов. «атем чашки интенсивно промывают холодной как лед средой DMEM, содержащей 2% “Ё—, после чего добавл€ют 2 мл этой среды. ƒобавл€ют аденовирус d1312 или буфер, клеткам дают медленно нагреватьс€, после чего их подают на 24-часовую инкубацию. ѕосле инкубации осуществл€ют сбор клеток и исследование на экспрессию гена люциферазы.
ќпределение активности люциферазы
ѕриготовление клеточных экстрактов, стандартизацию содержани€ белка и определение активности люциферазы осуществл€ют широкоизвестными методами.
ѕример 1. ќпределение действи€ аденовируса на перенос гена с применением конъюгатов трансферина и полилизина. —начала исследуют действие повышающихс€ доз вируса на способность определенного количества комплекса конъюгата и ƒЌ  к осуществлению переноса гена. ¬ цел€х образовани€ комплекса 6 мкг плазмиды pRSVL смешивают с 12 мкг конъюгата человеческого трансферина и полилизина (далее: "hTfpL 190¬").  омплекс конъюгата и ƒЌ , а также различные количества аденовируса d1312 (0,05 - 3,2 · 104 вирусных частиц на клетку) добавл€ют к клеткам HeLa. –езультаты данного опыта представлены на фиг. 1. јктивность люциферазы выражаетс€ в световых единицах 50 мкг общего клеточного белка. —огласно данному анализу повышающиес€ количества добавл€емого аденовируса привод€т к соответствующему улучшению переноса гена. Ќа фиг. представлены средние значени€ 2 - 4 отдельных опытов. Ѕалки указывают стандартное отклонение.
ѕример 2. ƒействие, достигаемое в зависимости от количества комплекса конъюгата и ƒЌ .  омплексы конъюгата ƒЌ  в виде полученных тем же образом, что и в примере 1 логарифмических разбавленных препаратов добавл€ют к клеткам HeLa вместе с посто€нным количеством аденовируса d1312 (1 · 104 вирусных частиц на клетку) или же без него. јктивность люциферазы определ€ют тем же образом, что и в примере 1. –езультаты опыта представлены на фиг. 2.
ѕример 3. ”лучшение переноса гена, достигаемое конъюгатом трансферина и полилизина в присутствии аденовируса, имеет место через вызываемый рецептором эндоцитоз.
а) ƒействие аденовируса на перенос имеющейс€ в виде комплекса ƒЌ 
ƒл€ осуществлени€ трансфекции используют следующие компоненты. 6 мкг ƒЌ  pRSVL без конъюгата трансферина и полилизина (DNA); 6 мкг ƒЌ  pRSVL и 6 мкг несопр€женного полилизина с молекул€рным весом 270 (DNA + pL); 6 мкг ƒЌ  pRSVL и 12 мкг конъюгата трансферина и полилизина с молекул€рным весом 190, примен€емого в предыдущих примерах (DNA + hTfpL190B). ”казанные материалы добавл€ют к клеткам HeLa вместе с аденовирусом d1312 в концентрации 1 · 104 вирусных частиц на клетку (d1312) или без него. ѕолучение клеточных экстрактов, стандартизаци€ общего клеточного белка и определение активности люциферазы осуществл€ют вышеуказанным образом. –езультаты опыта представлены на фиг. 3а.
б) ƒействие аденовируса на перенос св€занной с рецептором ƒЌ 
 омплексы конъюгата и ƒЌ  (DNA + hTfpll90B) или комплексы полилизина и ƒЌ  (DNA + pL) св€зывают с клетками HeLa за счет инкубации при температуре 4oC. Ќесв€занный комплекс удал€ют перед добавлением аденовируса d1312 в концентрации 1 · 104 вирусных частиц на клетку (d1312) или сравнимого количества буфера. «атем осуществл€ют инкубацию при температуре «7oC, направленную на обеспечение включени€ клеткой св€занного комплекса ƒЌ  и аденовируса. јктивность люциферазы определ€ют вышеуказанным образом. –езультаты представлены на фиг. 3b.
в) ƒействие аденовируса на перенос гена с применением конъюгатов трансферина и полилизина
 омплексы конъюгата и ƒЌ , содержащие 6 мкг ƒЌ  pRSVL и 12 мкг конъюгата трансферина и полилизина (DNA + hTfpL190B) добавл€ют к клеткам HeLa вместе с аденовирусом в концентрации 1 · 104 вирусных частиц на клетку (d1312) или инактивированным термообработкой аденовирусом д1312 в сравнимой концентрации (д1312 h. i.). »нактивацию термообработкой осуществл€ют путем инкубации при температуре 45oC в течение 30 минут. јктивность люциферазы определ€ют вышеуказанным образом. –езультаты опыта представлены на фиг. 3с.
ѕример 4. ƒействие аденовируса на перенос гена при применении конъюгатов трансферина и полилизина в выбранных клеточных лини€х,  омплексы конъюгата и ƒЌ  (6 мкг pRSVL + 12 мкг hTfpL190B) добавл€ют к клеткам клеточных линий CFT1, KB, HeLa, W138 и MRC5 вместе с аденовирусом d1312 в концентрации 1 · 104 вирусных частиц на клетку или же без него. Ёффективность переноса гена дл€ каждой клеточной линии определ€ют описанным выше образом за счет определени€ активности люциферазы. –езультаты опыта представлены на фиг. 4.
ѕример 5. ”лучшение экспрессии гена люциферазы на уровне переноса гена (а не на уровне трансактивации).  леточную линию, обозначенную  562 10/6, котора€ конституционально экспрессирует люциферазу, приготовл€ют за счет трансфекции плазмидой, содержащей фрагмент гена люциферазы RSV (Apa1/Pvu1-фрагмент плазмиды pRSVL), который клонирован в сайт CIaI локуса pUC μ. Ёту плазмиду перевод€т в комплекс с конъюгатом трансферина и полилизина и полученным комплексом трансфецируют клетки  562. “ак как плазмида локуса pUC μ содержит устойчивый к неомицину ген, возможно подобрать экспрессирующие люциферазу клоны с учетом устойчивости к неомицину. ƒл€ осуществлени€ дальнейших опытов подбирают клон  562 10/6.
јликвоты родительской клеточной линии  562 (в 200 мкл среды RPMI 1640, содержащей 2% “Ё—; 500000 клеток на пробу) обрабатывают либо 13 мкг TfpL и 6 мкг pRSVL или же 4 мкг pL 90 и 6 мкг pRSVL, которые примен€ют в среде 500 мкл буфера HBS. ѕосле добавлени€ аденовируса d1312 в указанной на фиг. 5 концентрации клетки выдерживают при температуре 37oC в течение 90 минут, после чего добавл€ют 2 мл среды RPMI, содержащей 10% “Ё—. »нкубацию продолжают еще при температуре 37oC в течение дальнейших 24 часов, после чего клетки подготовл€ют к определению активности люциферазы. Ѕыло обнаружено, что инкубаци€ в присутствии аденовируса приводит к значительному повышению активности люциферазы (см. фиг. 5ј). Ёто относитс€ как к комплексам TfpL (2000 световых единиц против 25000 световых единиц), так и к комплексам pL90 (0 против 1,9 · 106 световых единиц). Ёто свидетельствует о том, что клеточна€ лини€  562 обладает способностью к включению комплексов pRSVL и полилизина и что данный эффект в значительной степени усиливаетс€ присутствием аденовируса, что видно по экспрессии люциферазы.
јналогичные опыты провод€т с применением клеток  561 10/6, которые конституционально экспрессируют ген люциферазы RSVL. ѕри этом примен€ют подобные количества аденовируса d1312. јликвоты 500000 клеток (в 200 мкл среды RPMI, содержащей 2% “Ё—) инкубируют при температуре 37oC в течение 90 минут в присутствии аденовируса d1312 в указанной на фиг. 5¬ концентрации. ѕотом, также как и в случае родительской клеточной линии, добавл€ют среду RPMI, содержащую 10% “Ё—, инкубацию продолжают в течение дальнейших 24 часов, после чего определ€ют активность люциферазы.  ак видно на фиг. 5¬, обработка этих клеток аденовирусом не приводит к заметному действию на активность люциферазы, т. е. результаты контрольных опытов того же пор€дка, что и результаты опытов, которые провод€т в присутствии вируса.
ѕример 6. “рансфекци€ клеток печени конъюгатами асиалофетуина и полилизина (далее: "AfpL") или конъюгатами тетра-галактозного пептида и полилизина (далее: gal 4pL) в присутствии аденовируса. а) ѕолучение лактосилированного пептида. 3,5 мг (1,82 мкмоль) разветвленного пептида Lys-(N-Lys)Lys- Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Cys, содержащего дитиопиридиновую группу дл€ —ув, обрабатывают раствором 7,85 мг лактозы в 40 мкл 10 мћ водного раствора ацетата натри€ с pH 5 при температуре 37oC.   раствору добавл€ют 4 аликвота 0,6 мг (10 мкмоль) цианоборгидрида натри€ с соблюдением промежутка времени примерно 10 часов. ѕо истечении всего 64 часов при температуре 37oC добавл€ют 0,5 мл буфера HEPES с pH 7,3 и 15 мг дитиотреитола. ¬ результате фракционировани€ гель-фильтрацией (—ефадекс G-10, 12 х 130 мм, элюент: 20 мћ хлористого натри€) в атмосфере аргона получают 3,6 мл раствора лактозилированного пептида в свободной меркапто-форме (1,74 мкмоль согласно анализу Ёльманна; выход: 84%). ѕробы модифицированного пептида показывают цветную реакцию с анисовым альдегидом, но с нингидридом цветной реакции не имеет место. Ёто €вление согласуетс€ с предположением о том, что все 4 N-концевые аминогруппы лактозилированы.  онъюгат тетра-галактозного пептида и полилизина представлен на фиг. 6.
б) ѕолучение модифицированного 3-дитиопиридинпропионатом полилизина
»нтенсивно размешива€, 400 мкл 15 мћ этанольного раствора сукцинимидилгиопиридинпропионата (6,0 мкмоль) добавл€ют к прошедшему гель-фильтрацию раствору 0,60 мкмоль поли-L-лизина в виде гидробромида со средней длиной 290 лизиновых мономеров (далее: "pL290") в 1,2 мл 100 мћ буфера HEPES с pH 7,9. „ерез час добавл€ют 500 мкл 1 ћ ацетата натри€ с pH 5 после гель- фильтрации на —ефадексе √-25 с применением 100 мћ ацетата натри€. –аствор содержит 0,56 мкмоль pL2990 с 5,77 мкмоль св€зывающего вещества на основе дитиопиридина.
в) —опр€жение пептида с полилизином
 онъюгаты получают путем смешивани€ 1,5 мкмоль полученного на стадии а) лактолизированного пептида в 3 мл 20 мћ хлористого натри€ с 0,146 мкл полученного на стадии б) модифицированного pL290 в 620 мкл 100 мћ буфера ацетата натри€ в атмосфере аргона. ѕосле добавлени€ 100 мкл 2 ћ буфера HEPES с pH 7,9 реакционную смесь оставл€ют сто€ть при комнатной температуре в течение 18 часов. ƒобавлением хлористого натри€ концентрацию соли довод€т до 0,66 ћ и конъюгаты выдел€ют путем катионообменной хроматографии на колонке HR 5/5 фирмы ‘армаци€, Ўвеци€, на ионите марки Mono S. ќсуществл€ют градиентную элюацию с применением буфера ј: 50 мћ HEPES с pH 7,3 и буфера ¬: 50 мћ HEPES плюс 3 ћ хлористого натри€. Ёлюируемые при концентраци€х соли примерно 1,2 ћ - 1,8 ћ фракции собирают и объедин€ют в две конъюгатные фракции, обозначаемые ga14pL1 и ga14pL2. ¬ результате диализа с применением 25 мћ буфера HEPES с pH 7,3 получают конъюгат gal4pLI, содержащий 24 нмоль модифицированного pL290, и конъюгат ga14pL2, содержащий 24,5 нмоль модифицированного pL290.
г) ѕолучение конъюгатов асиалофетуина
 онъюгаты получают практически тем же образом, что и конъюгаты трансферина. —в€зывание асиалофетуина с полилизином осуществл€ют через дисульфидные мостики после модификации сукцинимидилпиридил-дитиопропионатом. –аствор 100 мг (2,2 мкмоль) асиалофетуина в 2 мл 100 мћ буфера HEPES с pH 7,9 подвергают гель-фильтрации на колонке —ефадекс √-25.   получаемому раствору в количестве 4 мл, интенсивно размешива€, добавл€ют 330 мкл 15 мћ метанольного раствора сукцинимидилпиридил-дитиопропионата (5,0 мкмоль). „ерез час при комнатной температуре осуществл€ют очистку за счет гель-фильтрации на —ефадексе √-25. ѕри этом получают 5 мл раствора 1,4 мкмоль асиалофетуина, модифицированного 2,5 мкмоль св€зывающего вещества на основе дитиопиридина.
 онъюгаты получают путем смешивани€ 1,4 мкмоль асиалофетуина в 5 мл 100 мћ буфера HEPES с pH 7,9 с 0,33 мкмоль модифицированного pL190 (содержащего 1,07 мкмоль меркаптопропионатных групп; поступают тем же образом, что и дл€ получени€ конъюгатов трансферина) в 6,5 мл 200 мћ буфера HEPES с pH 7,6 в атмосфере аргона. –еакционную смесь оставл€ют сто€ть при комнатной температуре в течение 24 часов.  онъюгаты выдел€ют из реакционной смеси путем катионообменной хроматографии на колонке марки HR 10/10 с применением ионита Mono S. ќсуществл€ют градиентную элювию с применением буфера ј: 50 мћ HEPES с pH 7,9 и буфера ¬: 50 мћ HEPES плюс 3 ћ хлорида натри€. ƒо нагрузки колонки добавл€ют еще хлористый натрий до достижени€ конечной концентрации 0,6 ћ. ÷елевую фракцию элюируют при концентрации соли примерно 1,5 ћ. ¬ результате диализа с применением буфера HBS получают конъюгаты, содержащие 0,52 мкмоль асиалофетуина, модифицированного 0,24 мкмоль pL190.
д) “рансфекци€ клеток HepG2 комплексами ƒЌ  pRSVL
 летки HepG2 выращивают в среде DMEM, содержащей 10% “Ё—, 100 единиц пенициллина/мл, 100 мкг/мл стрептомицина и 2 мћ глутамина в колбах марки “25. “рансфекции осуществл€ют при плотности 400000 клеток на колбу. ѕеред трансфекции клетки промывают 4 мл свежей среды, содержащей 10% “Ё—. Ќепосредственно перед трансфекцией добавл€ют 7-хлор-4-[(4-дитиламино-1-метилбутил)-амино] -хинолина (далее: "хлорохин") в количестве, обеспечивающем конечную концентрацию в клеточной суспензии (плюс раствор ƒЌ ), равную 100 мкћ. 10 мкг ƒЌ  pRSVL в 330 мкл буфера HBS смешивают с указанными на фиг. 7 количеством конъюгата трансферина и полилизина с молекул€рным весом 190 (TfpL), конъюгата асиалофетуина и полилизина с молекул€рным весом 90 (AfpL), полилизина с молекул€рным весом 290 (pL) и конъюгата тетра-галактозного пептида и полилизина (ga14pL), которые примен€ют в 170 мкл буфера HBS. ¬ рамках конкурентных опытов примен€ют 240 мкг асиалофетуина [(gal)4pL + Af] или 30 мкг лактозилированного пептида [(gal)4pL + (gal)4], которые добавл€ют по истечении 30 минут. —месь добавл€ют к клеткам, которые инкубируют при температуре 37oC в течение 4 часов, после чего среду трансфекции замен€ют на 4 мл свежей среды DMEM, содержащей 10% “Ё—. ѕо истечении 24 часов клетки собирают дл€ осуществлени€ анализа активности люциферазы. Ќа фиг. 7 представлена обща€ активность люциферазы в трансфецированных клетках. ѕо результатам опытов видно, что pL и TfpL показывают незначительную активность люциферазы, (gal)4pL дает почти ту же активность, что и AfpL, а (gal)4 и Af, соответственно, выступают в качестве конкурента в процессе св€зывани€ с асиалогликопротеином и поэтому их эффект незначителен.
е) “рансфекци€ клеток HepG2 комплексами ƒЌ  pCMVL
 летки HepG2 выращивают в чашках описанным на стадии г) образом до плотности 300000 клеток на чашку. ѕеред трансфекцией клетки промывают 1 мл свежей среды, содержащей 2% “Ё—. 6 мкг ƒЌ  pCMVL в буфере HBS смешивают с указанными на фиг. 8 количествами конъюгата трансферина и полилизина с молекул€рным весом 190 (TfpL), конъюгата асиалофетуина и полилизина (AfpL), полилизина с молекул€рным весом 290 (pLys290), конъюгата (gal)4pL1 и (gal)4pL2, которые содержатс€ в 170 мкл HBS. ѕо истечении 30 минут к каждому комплексу конъюгата и ƒЌ  добавл€ют 1 мл среды DMEM, содержащей 2% “Ё—, и 50 мкл раствора аденовируса d1312C. ¬ рамках конкурентных экспериментов добавл€ют 30 мкг лактозилированного пептида (gal)4pL [(gal)4pL1 + (gal)4] или [(gal)4pL2 + (gal)4]. —месь добавл€ют к клеткам, которые подвергают инкубации при температуре 37oC в течение 2 часов, после чего добавл€ют 1,5 мл среды, содержащей 10% “Ё—. ѕо истечении 24 часов клетки собирают дл€ осуществлени€ анализа активности люциферазы. ѕредставленные на фиг. 8 значени€ представл€ют собой общую активность люциферазы в трансфецированных клетках. ¬идно, что pLys290 про€вл€ют определенный эффект, (gal)4pL обеспечивают получение усиленного эффекта, а добавление (gal)4, который выступает в качестве конкурента в процессе св€зывани€ с рецептором асиалогликопротеина, приводит к уменьшению эффекта до величины, достигаемой полилизином.
ж) “рансфекци€ клеток TIB 73 комплексами ƒЌ  pCMVL
 летки, выделенные из эмбриональной мышиной печени клеточной линии ј“—— “1¬73 (BNL CL.2) выращивают при температуре 37oC в содержащей 0,4% глюкозы среде DMEM, дополненной 10% инактивированной термообработкой “Ё—, содержащей 100 единиц/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 2 мћ глутамина, в присутствии 5% двуокиси углерода. “рансфекции осуществл€ют при плотности 300000 клеток на чашку. ѕеред трансфекцией клетки промывают 1 мл свежей среды, содержащей 2% “Ё—.
6 мкг ƒЌ  pCMVL в 300 мкл HBS смешивают с указанными на фиг. 9 количествами конъюгата мышиного трансферина и полилизина с молекул€рным весом 290 (mTfpL), конъюгата асиалофетуина и полилизина (AfpL), полилизина с молекул€рным весом 290 (pLys290), конъюгата (gal)4pL1 и конъюгата (gal)4pL2, которые примен€ют в среде 170 мл HBS. ѕо истечении 30 минут к каждому комплексу конъюгата и ƒЌ  добавл€ют 1 мл среды DMEM, содержащей 2% “Ё—, и 50 мкл раствора аденовируса d1312. —месь добавл€ют к клеткам, которые подвергают инкубации при температуре 37oC в течение 2 часов, после чего добавл€ют 1,5 мл среды, содержащей 10% “Ё—. „ерез два часа среду трансфекции замен€ют на 4 мл свежей среды. ѕо истечении 24 часов клетки собирают дл€ осуществлени€ анализа активности люциферазы. Ќа фиг. 9¬ представлена обща€ активность люциферазы в трансфецированных клетках.
ѕровод€т сравнительные опыты, в которых трансфекцию осуществл€ют без аденовируса в присутствии хлорохина. ѕри этом процесс тоже осуществл€ют при плотности 300000 клеток на чашку. ѕеред трансфекцией клетки промывают 1 мл свежей среды, содержащей 2% “Ё—. Ќепосредственно перед трансфекцией хлорохин добавл€ют в количестве, обеспечивающем конечную концентрацию в клеточной суспензии (плюс раствор ƒЌ ), равную 100 мкмоль. 6 мкг ƒЌ  pCMVL в 330 мкл HBS смешивают с указанным на фиг. 9¬ количеством mTfpL, AfpL, pLys290, (gal)4pL1 и (gal)4pL2, которые примен€ют в среде 170 мкл HBS. ѕо истечении 30 минут комплексы ƒЌ  добавл€ют к клеткам, которые подвергают инкубации при температуре 37oC в течение 2 часов, после чего добавл€ют 1,5 мл среды, содержащей 10% “Ё— и 100 мкмоль хлорохина. „ерез два часа среду трансфекции замен€ют на 4 мл свежей среды. ѕо истечении 24 часов клетки собирают дл€ осуществлени€ анализа активности люциферазы. –езультаты опытов представлены на фиг. 9ј.
ѕример 7. ¬ведение ƒЌ  в клетки “
а) ѕолучение конъюгатов антиCD7 и полилизина с молекул€рным весом 190
–аствор 1,3 мг антитела антиCD7 в 50 мћ буфера HEPES с pH 7,9 смешивают с 49 мкл 1 мћ этанольного раствора сукцинимидилпиридил- дитиопропионата. „ерез час при комнатной температуре смесь подвергают гель-фильтрации на колонке сефадекс G-25 с применением в качестве элюента 50 мћ буфера HEPES с pH 7,9.
ѕри этом получают 1,19 мг (7,5 нмоль) антиCD7, модифицированного 33 нмоль пиридилдитиопропионатных групп. ѕоли-(L)-лизин с молекул€рным весом 190, меченый флуоресцирующим агентом, аналогично модифицируют сукцинимидилпиридил- дитиопропионатом и перевод€т в форму, модифицированную свободными меркапто-группами, за счет обработки дитиотреитолом с последующей гель-фильтрацией. –аствор 11 нмоль полилизина с молекул€рным весом 190, модифицированного 35 нмоль меркапто-групп, в 0,2 мл 30 мћ буфера ацетата натри€ смешивают с модифицированным антиCD7 в 0,5 мл 300 мћ буфера HEPES с pH 7,9 в услови€х исключени€ кислорода и смесь оставл€ют сто€ть в течение ночи при комнатной температуре. –еакционную смесь довод€т до концентрации примерно 0,6 ћ путем добавлени€ 5 ћ хлористого натри€. ¬ыделение конъюгатов осуществл€ют путем ионообменной хроматографии на йоните Mono S (элюент: 50 мћ буфера HEPES с pH 7,3, солевой градиент: 0,6-3 ћ хлористого натри€). ѕосле диализа с применением 10 мћ буфера HEPES с pH 7,3 получают конъюгат, состо€щий из 0,51 мг (3,2 нмоль) антитела антиCD7, модифицированного 6,2 нмоль полилизина с молекул€рным весом 190.
б) ѕолучение конъюгатов gp120 и полилизина с молекул€рным весом 190.
—в€зывание осуществл€ют через тиоэфирные группы после модификации N-окси-сукцинимидным эфиром 6-малеимидокапроновой кислоты. ѕроцесс осуществл€ют следующим образом.
–аствор 2 мг рекомбинантного gp120 в 0,45 мл 100 мћ буфера HEPES с pH 7,9 смешивают с 17 мкл 10 мћ раствора N-оксисукцинимидного эфира 6-малеимидокапроновой кислоты в диметилформамиде. „ерез час при комнатной температуре осуществл€ют гель-фильтрацию на колонке —ефадекс √-25 с применением в качестве элюента 100 мћ буфера HEPES с pH 7,9. ѕолучают 1,2 мл целевого раствора, который в услови€х исключени€ кислорода немедленно подвергают реакции с раствором 9,3 нмоль полилизина с молекул€рным весом 190, меченого флуоресцирующим агентом и модифицированного 30 нмоль меркапто- групп в 90 мкл 30 мћ ацетата натри€ с pH 5,0. –еакционную смесь оставл€ют сто€ть в течение ночи при комнатной температуре, после чего ее концентрацию довод€т примерно до 0,6 ћ путем добавлени€ 5 ћ хлористого натри€.  онъюгаты выдел€ют путем ионообменной хроматографии на колонке Mono S с применением в качестве элюента 50 мћ HEPES с pH 7,3 (солевой градиент: 0,6 - 3 ћ хлористого натри€). ѕосле фракционировани€ и диализа с применением 25 мћ буфера HEPES с pH 7,3 получают конъюгаты ј, Ѕ и ¬ следующего состава.  онъюгат ј состоит из 0,40 мг gp120, модифицированного 1,9 нмоль полилизина 190, конъюгат Ѕ - 0,25 мг gp120, модифицированного 2,5 нмоль полилизина 190, а конъюгат ¬ - 0,1 мг gp120, модифицированного 1,6 нмоль полилизина 190.
ƒЌ  pCMVL в количестве 6 мкг на пробу перевод€т в комплекс с полилизном 190 или его конъюгатами в 500 мкл HBS. ѕолученные комплексы полилизина и ƒЌ  добавл€ют к клеткам Ќ9 (106 клеток в 5 мл среды RPMI, содержащей 2% ƒ≈—) или к первичным лимфоцитам человека (3 · 106 клеток в среде IMDM, содержащей 2% ƒ≈—). „ерез 5 минут добавл€ют аденовирус d1312 в указанном на фиг.10 количестве.  летки инкубируют при температуре 37oC в течение 90 минут, после чего 15 мл среды RPMI (в случае клеток Ќ9) или IMDM (в случае первичных лимфоцитов) и 20% ƒ≈— добавл€ют к каждой пробе.  летки инкубируют при температуре 37oC в течение лишь 24 часов, после чего собирают дл€ осуществлени€ анализа активности люциферазы. –езультаты опытов представлены на фиг. 10 A (в случае клеток Ќ9) и фиг. 10 ¬ (в случае первичных лимфоцитов). Ќа фиг. 10 ј видно, что конъюгат анти-CD7 (следы 7-9) и конъюгат gp120 (следы 10-12) показывают наилучшие результаты в отношении переноса гена, достигаемого аденовирусом, тогда как конъюгат gp120 про€вл€ет €вную экспрессию гена люциферазы даже в отсутствие аденовируса. —ледует еще отметить, что только конъюгат gp120 про€вл€ет способность к введению ƒЌ  в первичные лимфоциты при условии наличи€ аденовируса (см. фиг. 10 Ѕ, следы 7,8).
ѕример 8. »нактиваци€ аденовирусов
а) »нактиваци€ ”‘-облучением.
ѕолученный выше указанным образом препарат аденовируса d1312 подают в снабженную €чейками диаметром 2 см чашку (300 мкл на €чейку). Ќа рассто€нии 8 см от чашки устанавливают две ”‘ лампы марки G15 “8 инофирмы ‘илипс. ¬ирус подвергают облучению ультрафиолетовыми лучами в течение указанного на рис. 11ј времени. јликвоты каждого препарата исследуют на титр вируса и определ€ют способность к улучшению переноса гена в клетки гена при применении конъюгатов полилизина и трансферина.  ультивацию клеток и трансфекцию осуществл€ют в основном описанным выше образом. ѕримен€емые дл€ трансфекции компоненты представлены на фиг.11ј. ¬ 500 мкл буфера HBS получают комплексы ƒЌ  pCMVL и 12 мкг TfpL, которые добавл€ют к 3 · 105 клеток HeLa в 1 мл среды DMEM, содержащей 2% “Ё—. „ерез 5 минут к каждой культуре добавл€ют 54 мкл каждого препарата вируса и культуру инкубируют при температуре 37oC в течение 60-120 часов. ѕотом к каждой культуре добавл€ют 5 мл аликвота среды DMEM, содержащей 10% “Ё—, инкубацию продолжают при температуре 37oC в течение 24 часов, после чего осуществл€ют сбор культур на исследование активности люциферазы.  оличество 54 мкл необлученного вируса не входит в пределы насыщени€, то есть опыт чувствителен к количеству вируса, которое превышает указанное по крайней мере в 3 раза. –езультаты, полученные дл€ экспрессии люциферазы, представлены на фиг. 11 Ѕ (темные пр€моугольники). “итр вируса каждого препарата определ€ют с применением Ela-комплиментирующей клеточной линии 293. ¬ среде DMEM, содержащей 2% “Ё—, приготовл€ют р€д разбавленных групп облученного и необлученного вируса. ѕараллельно в 200 мкл среды DMEM, содержащей 2% “Ё—, приготовл€ют пробы 5 · 104 клеток 293 (с применением чашки с €чейками диаметром 2 см). јликвот 5 мкл каждой разбавленной пробы подают в каждую €чейку. — целью достижени€ св€зывани€ вируса с клетками осуществл€ют инкубацию при температуре 37oC в течение 90 минут, после чего в каждую €чейку подают 2 мл среды DMEM, содержащей 10% “Ё—. „ерез 48 часов культуры исследуют на степень заболевани€ клеток. –азбавленна€ проба вируса с менее 50% клеток в культуре, показывающа€ значительную степень заболевани€ через 48 часов, указывает на относительное количество инфекционного вируса в каждом препарате. ѕолученные результаты представлены на фиг. 11 Ѕ (открытые пр€моугольники). –езультаты опыта данного примера показывают, что вызываемое ”‘-облучением снижение титра вируса на 4 log св€зано только с 20-кратным уменьшением степени переноса гена люциферазы. “аким образом решающие дл€ инфективности вируса механизмы можно упраздн€ть без существенного отрицательного вли€ни€ на способность вируса к улучшению переноса гена. Ѕыло обнаружено, что в малых дозах вируса обеспечиваемое вирусом улучшение переноса гена немного падает (см. фиг. 11ј, следы 3-6), и что этот эффект про€вл€етс€ €рче при высоких концентраци€х (см. следы 7 -10).
б) »нактиваци€ аденовирусов формальдегидом.
2 мл препарата аденовируса пропускают через колонку сефадекс √-25 емкостью 10 мл, которую предварительно уравновешивают при помощи 150 мћ хлористого натри€, 25 мћ буфера HEPES с pH 7,9 и 10% глицерина. јликвоты прошедшего гель-фильтрацию препарата вируса инкубируют на льду в течение 20 часов в присутствии 0,01%, 0,1% и 1% формальдегида.  роме того, провод€т контрольный опыт без применени€ формальдегида. ƒобавл€ют буфер трис с pH 7,4 до установлени€ концентрации 100 мћ, после чего пробы подвергают двухстадийному диализу, причем на первой стадии работают с 1 л 150 мћ хлористого натри€, 50 мћ трис с pH 7,4 и 50% глицерина в течение двух часов, а на второй стадии диализ осуществл€ют в течение ночи с применением 2 · 1 л 150 мћ хлористого натри€, 20 мћ HEPES с pH 7,9 и 50% глицерина. «атем аликвоты вируса исследуют на титр с применением клеток 293. «атем определ€ют действие обработанного формальдегидом вируса на перенос гена в клетки HeLa (300000) за счет измерени€ активности люциферазы указанным выше образом. ќбработка вируса формальдегидом в количестве 0,01% и 0,1% приводит к небольшому снижению активности по переносу гена (примерно 10-кратное уменьшение при 0,1%). ’от€ обработка 1% формальдегида вызывает существенную потерю активности по переносу гена, 90 мкл вируса все еще про€вл€ют способность к экспрессии гена, соответствующей 104 световым единицам. Ќаблюдаемое при обработке 0,1% формальдегида снижение титра вируса до 105 бл€шкообразующих единиц св€зано с уменьшением активности люциферазы только на 10%. –езультаты данного опыта представлены на фиг.12 ј.
в) »нактиваци€ аденовирусов длинноволновым ”‘-облучением и обработкой 8-метокси-псораленом (псорален = 7Ќ-фуро[3,3- g][1]бензопиран-7-он).
јликвоты очищенного вируса добавл€ют к 0,33 мкг/мкл 8-метокси-псоралена в диметилсульфоксиде и на льду подвергают воздействию источника ”‘ света длиной 365 нм, размещенного на рассто€нии 4 см от проб. ќблучение осуществл€ют в течение 15 - 30 минут. «атем пробы вируса пропускают через колонку сефадекс √-25, которую предварительно уравновешивают при помощи буфера HBS и 40% глицерина. «атем вирусные препараты исследуют на их способность к улучшению переноса комплекса pCMVL и конъюгата hTfpL в клетки HeLa путем определени€ световых единиц активности люциферазы, а также на их способность к репликации в клетках 293 за счет определени€ титра. –езультаты опыта представлены на фиг.12 ¬.
¬ нижеследующих примерах, которые иллюстрируют улучшение поглощени€ клеткой комплексов ƒЌ  и конъюгата трансферина и полилизина в присутствии ретровирусов, используют следующие материалы и методы.
 онъюгаты трансферина и полилизина с молекул€рным весом 190 и комплексы конъюгата и ƒЌ  получают описанным выше образом.  летки NIH3T3 выращивают в среде DMEM с добавкой 10% “Ё—, 100 единиц/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 2 мћ глутамина.  летки выращивают в количестве 5 - 7 · 105 на каждую пробу за 18-24 часов до трансфекции. Ќепосредственно перед трансфекцией клетки подают в свежую среду, после чего последовательно добавл€ют: 100 мкмоль (если ничего другого не указано) хлорохина, комплекс ƒЌ  и конъюгата полилизина и трансферина и препарат ретровируса. «атем клетки инкубируют при температуре 37oC в течение 4 часов, после чего среду замен€ют и через 24 часа клетки собирают. ѕолучение экстрактов осуществл€ют трем€ циклами замораживани€ и оттаивани€. ѕосле стандартизации в отношении содержани€ белка аликвоты экстрактов исследуют на активность люциферазы указанным выше образом.
ѕример 9. “рансфекци€ клеток NIH3T3 вирусом ћолонеа
106 клеток NIH3T3 подвергают трансфекции комплексом ƒЌ  и конъюгата TfpL в присутствии 100 мкмоль хлорохина или же без применени€ последнего. –езультаты опыта представлены на рис.13. Ѕыло найдено, что без применени€ хлорохина величины по активности люциферазы достигают только фонового уровн€ (след 1), тогда как в присутствии хлорохина можно определ€ть высокую экспрессию репортерного гена pRSVL (см. след 2). ѕовышающиес€ количества вируса лейкоза ћолонеа (обозначенного RVS на рис.13), которые добавл€ют к клеткам одновременно с указанным комплексом, привод€т к дальнейшему улучшению экспрессии гена люциферазы.
ѕример 10. ¬ли€ние вируса ћолонеа на перенос гена в случае трансфекции клеток NIH3“3 комплексом ƒЌ  и конъюгата трансферина и полилизина. »спользуемые в примере 9 препараты вируса представл€ют собой сырую, не фракционированную надосадочную жидкость экспрессирующих ретровирус клеток. ƒл€ подтверждени€ того, что достигаемое в присутствии препарата вируса улучшение переноса ƒЌ  можно действительно приписывать вирусу, надосадочную жидкость подвергают очистке диализом и концентрацией на фактор 10. ≈сли ретровирус ответствен за улучшение, то удерживаема€ мембраной активность (несмотр€ на любую инактивацию крайне неустойчивого ретровируса во врем€ концентрации) должна превышать активность первоначальной надосадочной жидкости примерно в 10 раз.  ак и в предыдущем примере клетки NIH3T3 в количестве 106 подвергают трансфекции в услови€х, представленных на фиг. 14. Ќа фиг. 14 видно, что улучшающее перенос гена действие свойственно продукту удержани€ мембраной (примен€ют 20 - 600 мкл, следы 3 - 6).  роме того, было найдено, что 200 и 600 мкл 10-кратно концентрированного препарата про€вл€ют примерно половину активности 2 и 6 мл первоначального, то есть неконцентрированного препарата ретровируса (следы 7, 8). ќсуществл€ют еще параллельные опыты с применением клеток   562 человека, которые не имеют рецептора дл€ экотропного мышиного ретровируса.  ак и следовало ожидать, при этом улучшение экспрессии гена не наблюдаетс€.
ѕример 11. ¬заимодействие между трансферином и его рецептором играет роль в переносе гена, которому содействует вирус ћолонеа
–етровирус исследуют на способность к переносу в клетку плазмидной ƒЌ  в виде комплекса с одним полилизином с тем, чтобы вы€снить вопрос о приписании переноса комплекса pRSVL и конъюгата TfpL в клетки к неспецифичной св€зи полилизина с ретровирусом, а также дальше изучать механизм захода в клетку.  оличество примен€емого полилизина соответствует оптимальному количеству, которое обеспечивает полную конденсацию плазмидной ƒЌ . ќпыты, результаты которых представлены на фиг. 15, показывают, что в отсутствие хлорохина репортерный ген не экспрессируетс€ ни при применении комплексов pRSVL и конъюгата TfpL, ни при применении комплекса pRSVL и полилизина (см. следы 1, 2). ќднако в присутствии ретровируса репортерна€ ƒЌ , которую примен€ют в виде комплекса с конъюгатом TfpL, экспрессируетс€, тогда как при применении комплекса ƒЌ  и полилизина экспрессии не наблюдаетс€ (см. следы 3, 4 по сравнению со следами 5, 6).  роме того, данные опыты показывают, что присутствие избыточного свободного трансферина приводит к снижению переноса ƒЌ , достигаемого ретровирусом (см. следы 7, 8). Ёти результаты подкрепл€ют предположение о том, что взаимодействие между трансферином и его рецептором играет существенную роль в улучшении поглощени€ ƒЌ , обеспечиваемого ретровирусом.
ѕример 12. ¬ли€ние pH на обеспечиваемый ретровирусами перенос гена. ќпыты данного примера направлены на исследование вли€ни€ pH на способность ретровирусов к улучшению переноса гена. ¬ этих опытах трансфекцию осуществл€ют вышеуказанным образом. ѕримен€ют два общеизвестных ингибитора снижени€ pH €дрышка, то есть монензин и хлористый аммоний. –езультаты опытов представлены на фиг. 16. »сследование действи€ обоих веществ на перенос комплекса ƒЌ  и конъюгата TfpL показывает, что в функциональном отношении ни одно из обоих веществ не может заменить хлорохин. ќднако при более высоких концентраци€х хлористого аммони€ наблюдаетс€ небольшое улучшение экспрессии гена люциферазы (см. следы 1 - 5). ќдин ретровирус показывает небольшое улучшение переноса ƒЌ , что и наблюдаетс€ в предыдущих примерах (см. след 6). –езкое улучшение наблюдаетс€ при применении ретровируса в присутствии 1 мкмоль монензина (см. след 7). ћенее сильное действие наблюдаетс€ при более высокой концентрации монензина (см. след 8), а также в присутствии хлористого аммони€ (см. следы 9, 10).
ѕример 13. ”лучшение переноса гена, достигаемое конъюгатами трансферина в присутствии N-концевого эндосомолитического пептида гемагглютинина Ќј2 гриппа
а) —интез пептида
ѕептид с последовательностью:
Gly-Leu-Phe-Glu-Ala-Ile-Ala-Gly-Phe-Ile-Glu-Asn-Gly-Trp-Glu- Gly-Met-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly-Cys синтезируют известными приемами с применением флуоренилметоксикарбонила. ¬ качестве защитных групп боковой цепи примен€ют третичный бутил (дл€ Cys, Glu и Asp) и тритил дл€ Asn. ѕосле реакции осуществл€ют анализ степени св€зывани€ с применением нингидрина. ѕри этом устанавливают степень > 98% на каждой стадии. Ќачина€ с аминокислоты 19 осуществл€ют двойное сочетание. N-концевые флуоренилметоксикарбонильные группы удал€ют с части пептидной смолы путем обработки 20%-ным пиперидином в N-метилпирролидине. «атем защищенные флуоренилметоксикарбонилом фракции и не защищенные фракции промывают дихлорметаном и сушат в высоком вакууме. ѕолучают 294 мг свободной от флуоренилметоксикарбонильных групп пептидной смолы и 367 мг защищенной флуоренилметоксикарбонильными группами пептидной смолы. 111 мг свободной от флуоренилметоксикарбонилльных групп пептидной смолы расщепл€ют путем обработки смесью, состо€щей из 10 мл трифторуксусной кислоты, 0,75 г фенола, 300 мкл этандитиола, 250 мкл этилметилсульфида и 500 мкл воды, в течение 90 минут. ѕептид отдел€ют от смолы путем фильтрации. —молу промывают дихлорметаном и добавл€ют к фильтрату, который сгущают до объема примерно 2 мл, после чего, размешива€, его капл€ми добавл€ют к 40 мл простого диэтилового эфира. ќсадок пептида удал€ют центрифугированием и эфирную надосадочную жидкость удал€ют. ќсадок промывают три раза 40 мл простого диэтилового эфира и сушат в высоком вакууме. ѕолучают 58 мг сырого продукта, который раствор€ют в 3,5 мл 20 мћ бикарбоната аммони€, содержащего 300 мкл 25%-го аммиака/л. –аствор подвергают гель-фильтрации на колонке сефадекс √-25 с применением того же буфера. «атем элюат подают на колонку марки Mono Q размером 100 х 14 мм, в которой процесс осуществл€ют в следующих услови€х. √радиент: 0 - 10 минут: 100% ј, 10-100 минут: 0-100% Ѕ, при этом ј = 20 мћ бикарбоната аммони€ + 300 мкл 25% аммиака/л, аЅ=ј+3ћ хлористого натри€. »змер€ют при 280 нм, а детекци€ флуоресценции “rp при 354 нм. —корость подачи: 1 мл/мин. ѕродукт элюируют 1 ћ хлористым натрием. ќсновную фракцию колонки далее очищают путем обратнофазной жидкостной хроматографии, которую осуществл€ют под давлением в колонке размером 250 х 10 мм марки BIORAD-Hi-Pore RP 304. ѕри этом соблюдают следующие услови€. √радиент: 50-100% буфера ј в течение 12,5 мин, 12,5 - 25 мин: 100% Ѕ; при этом ј = 20 мћ бикарбоната аммони€ + 300 мкл 25% аммиака/л, а Ѕ = ј в 98%-ном метаноле. —корость подачи: 3 мл/мин. »змер€ют при 237 нм. ѕродукт элюируют при 100% Ѕ.
÷елевые фракции упаривают, повторно раствор€ют в буфере ј и затем лиофилизуют. ѕолучают 8,4 мг очищенного жидкостной хроматографией под давлением продукта в цистеин-защищенной форме. Ётот пептид обозначаетс€ –16. ¬ цел€х получени€ –16 в свободной меркапто-форме, защищенное третичным бутилом вещество подвергают обработке смесью тиоанизола, этандиэтиола, трифторуксусной кислоты и трифторметансульфокислоты в соотношении 2 : 1 : 40 : 3 (трифторметансульфокислоту добавл€ют в качестве последнего компонента) при комнатной температуре в течение 30 минут. ѕептид выдел€ют путем осаждени€ простым диэтиловым эфиром и последующей гель-фильтрации на —ефадексе √-25 с применением вышеупом€нутого буфера ј в атмосфере аргона.
б) —в€зывание пептида гриппа с полилизином
б1) Ќепосредственное св€зывание при помощи сукцинимидилпиридилдитиопропионата
19,8 мг гидробромида полилизина с молекул€рным весом 300 подвергают гель-фильтрации на колонке марки —ефадекс √-25 с применением раствора ацетата натри€ с pH 5, направленной на удаление низкомолекул€рных фракций. —огласно данным анализа с применением нингидрина после гель-фильтрации концентраци€ полилизина составл€ет 3,16 мг/мл. ƒобавлением 1 ћ гидроокиси натри€ pH раствора довод€т до 7-8.   2,5 мл раствора полилизина (содержание полилизина 7,9 мг = 0,13 мкмоль) добавл€ют 0,64 мкмоль сукцинимидилпиридилдитиопропионата в виде 40 мћ раствора в абсолютном этаноле. “аким образом мольное соотношение сукцинимидилпиридилдитиопропионата и полилизина составл€ет 5:1. —меси дают реагироватьс€ в течение ночи, после чего ее подвергают гель- фильтрации на колонке марки —ефадекс G-25 с применением 20 мћ бикарбоната аммони€ с pH 8,2. ѕосле восстановлени€ аликвота фильтрата дитиотреитолом определ€ют содержание тиопиридона. —огласно данным этого анализа реакци€ протекала полностью. 0,3 мкмоль модифицированного пиридилдитиопропионатом полилизина (в расчете на мкмоль пиридилдитиопропионата) подвергают взаимодействию с 0,35 мкмоль пептида в тиольной форме. Ѕелый осадок, который получаетс€ при смешивании пептида и полилизина, раствор€ют в 2 ћ гидрохлорида гуанидини€. –еакционную смесь оставл€ют сто€ть в течение ночи, после чего осуществл€ют фотометрическое определение содержани€ тиопиридона в реакционной смеси. ƒанные этого анализа подтверждают полноту реакции. «атем смесь два раза диализуют с применением 2 л 20 мћ буфера HEPES, содержащего 0,5 ћ гидрохлорида гуанидини€. ѕолучаемый раствор подают на колонку марки Mono S размером 0,7 х 6 см. ѕри этом соблюдают следующие услови€. √радиент: 0 - 20 мин: 100% ј, 20-140 мин: 0-100% Ѕ, причем ј означает 20 мћ HEPES с pH 7,3/0,5 ћ гидрохлорида гуанидини€, а ¬ - 20 мћ HEPES с pH 7,3 плюс 3 ћ гидрохлорида гуанидини€. —корость подачи: 0,3 мл/мин. ƒетекци€ при 280 нм, детекци€ флуоресценции при 354 нм, а возбуждение при 280 нм. ÷елевую фракцию элюируют 1,5 ћ гидрохлорида гуанидини€ с последующим диализом с применением 2 л HBS. —огласно последующему определению концентрации полилизина с применением нингидрина его концентраци€ составл€ет примерно 1,14 мг/мл.  оличество пептида в растворе конъюгата рассчитывают с учетом его абсорбции при 280 нм. ѕо этим данным мол€рное соотношение пептида и полилизина составл€ет 4 : 1.
б2) —в€зывание при помощи св€зывающего вещества на основе полиэтиленгликол€
14,6 мг гидробромида полилизина с молекул€рным весом 300 подвергают гель-фильтрации аналогично стадии б1). —огласно данным опыта с применением нингидрина концентраци€ полилизина после гель- фильтрации составл€ет 4,93 мг/мл. ƒобавлением 1 ћ гидроокиси натри€ pH раствора довод€т до 7-8.   2,7 мл раствора полилизина (содержание полилизина 13,3 мг = 0,22 мкмоль) добавл€ют 4,33 мкмоль пиридилдитиопропионата в виде 30 мћ раствора в абсолютном этаноле. “аким образом мол€рное соотношение пиридилдитиопропионата и полилизина составл€ет 20:1. „ерез 90 минут реакционную смесь подвергают гель-фильтрации на колонке —ефадекс √-25 с применением 0,1 ћ ацетата натри€ и 3ћ гидрохлорида гуанидини€. ѕосле восстановлени€ аликвота фильтрата дитиотреитолом определ€ют содержание тиопиридона. —огласно данному анализу целева€ фракци€ содержит 3,62 мкмоль пиридилдитиопропионата. ћодифицированный пиридилдитиопропионатом полилизин подвергают восстановлению примен€емым в количестве 79 мг дитиотреитолом в течение 2 часов. –аствор снова фильтруют на колонке √-25 в указанных услови€х. —огласно данным метода Ёльмана концентраци€ тиола составл€ет 3,15 мкмоль в 2,224 мл.
17,6 мг (5 мкмоль) полиоксиэтилен-бис(6-аминогексила) раствор€ют в 500 мкл 20 мћ бикарбоната натри€ и 3 ћ гидрохлорида гуанидини€ с pH 7-8, после чего подвергают взаимодействию с 13,8 мг N-оксисукцинимидного эфира ε -малеимидо-капроновой кислоты (= 44,6 мкмоль), растворенного в 300 мкл диметилформамида. ѕо истечении 30 минут раствор подвергают гель-фильтрации на колонке √-25 с применением 20 мћ бикарбоната натри€ и 3 ћ гидрохлорида гуанидини€. —огласно данным фотометрического определени€ малеимидо-группы при 300 нм концентраци€ прореагировавшего полиоксиэтилен-бис(6- аминогексила) составл€ет 6,36 мкмоль в 2 мл раствора.   1,05 мл этого раствора (соответствует 3,34 мкмоль указанного эфира) капл€ми добавл€ют 1,39 мкмоль пептида в тиольной форме в 2,5 мл 20 мћ бикарбоната натри€ и 3 ћ гидрохлорида гуанидини€. ѕри этом смесь интенсивно размешивают в атмосфере аргона. ѕо истечении 15 минут свободные тиольные группы не могут больше обнаруживатьс€.
–аствор восстановленного меркапто-модифицированного полилизина довод€т до pH 7-8 путем добавлени€ 1 ћ гидроокиси натри€. 1,37 мл этого раствора, интенсивно размешива€, добавл€ют к вышеуказанной реакционной смеси. “аким образом мол€рное соотношение пептида-SH, N-оксисукцинимидного эфира ε-малеимидо-капроновой кислоты и полилизина-SH составл€ет 1 : 2,4 : 1,4 (из расчета на указанный эфир и SH). —вободные тиольные группы не могут больше обнаруживатьс€ через 150 минут. –еакционную смесь подвергают диализу в течение ночи с применением 2 л 20 мћ HEPES с pH 7,3 плюс 0,6 ћ хлористого натри€, после чего подают на колонку марки Mono S. ѕроцесс осуществл€ют в следующих услови€х. √радиент: 1 мл водной фазы (10 мћ HEPES с pH 7,3; 100 мћ натриевой соли флуоресцеин-2,7-бис-метилениминодиуксусной кислоты (далее: кальцеин); 150 мћ хлористого натри€) тщательно промывают эфирной фазой и обрабатывают ультразвуком при температуре 0oC в течение 5 минут. „ерез 30 минут на льду материал еще раз обрабатывают ультразвуком в течение дальнейших 10 минут. ѕолучаемую устойчивую эмульсию медленно упаривают. ѕосле удалени€ диэтилового эфира при 100 мбар добавл€ют 0,75 мл вышеупом€нутой водной фазы. ќстаток диэтилового эфира удал€ют путем дополнительного упаривани€ при давлении 50 мбар в течение 30 минут. ѕолучают 1,7 мл остатка, который подвергают центрифугированию при 500 об/мин. 1,0 мл продукта центрифугировани€ пропускают через микропористую поликарбонатную мембрану величиной пор 0,1 мкм с получением 0,7 мл раствора липосом. Ћипосомы отдел€ют от невключенного материала путем гель-фильтрации (—ефадекс √-50 медиум фирмы ‘армаци€, Ўвеци€; 23 мл объема гел€, 10 мћ HEPES с pH 7,3/150 мћ хлористого натри€). —обирают 6 фракций объемом 500 мкл. Ћипидный фосфор определ€ют при 2 мћ.
г) ќпределение выделени€ из липосом содержимого
¬ыделение из липосом содержимого определ€ют за счет того, что измер€ют высвобождение заключенного кальцеина и получаемого разбавлени€, которое прекращает гашение флуоресценции. ‘луоресценцию кальцеина определ€ют при помощи спектрального флуорометра типа Kontron SMF 25 (возбуждение при 490 нм, эмисси€ при 515 нм). ƒл€ этой цели 100 мкл аликвотов вышеуказанного раствора липосом разбавл€ют 100 раз 0,1 ћ ацетата натри€/50 мћ хлористого натри€ или 10 мћ Ќ≈PES/150 мћ хлористого натри€ с соответствующей величиной pH (4,3, 4,5, 5,0, 6,0, 7,3).   получаемому раствору объемом 1 мл добавл€ют 2,5 мкл пептида в защищенной третичным бутилом форме (1 мкг/мкл раствора в HBS) при одновременном смешивании в атмосфере аргона (конечна€ концентраци€: 400 нћ пептида). ‘луоресценцию кальцеина определ€ют в разные моменты после добавлени€ пептида. «начени€ дл€ обеспечени€ 100%-ного выделени€ определ€ют путем добавлени€ 2 мкл тритона X-100. “акие же приемы примен€ют дл€ определени€ флуоресценции кальцеина после добавлени€ к раствору липосом конъюгатов пептида и полилизина. ѕри этом к 1 мл раствора липосом добавл€ют 2,5 мкг конъюгата (1 мкг/мкл концентрации в пересчете на количество одного полилизина). ѕри этом конечна€ концентраци€ составл€ет 20 нм модифицированного пептида. јналогичным образом анализу подвергают 2,5 мкг конъюгата пептида и полилизина после инкубации вместе с 5 мкг ƒЌ  в течение 15 минут. Ѕыло найдено, что пептид вызывает выделение из липосом содержимого только в кислой области pH (см. фиг. 17).  онъюгат пептида €вл€етс€ активным при значительно более низкой величине pH, хот€ даже при нейтральной величине pH наблюдают значительную активность, котора€ далее увеличиваетс€ по мере снижени€ величины pH.  омплекс конъюгата и ƒЌ  вызывает упразднение активности при нейтральной величине pH, тогда, как при кислой величине pH наблюдаетс€ заметна€ активность. Ќа фиг. 17 пептид обозначен Influ.
д) “рансфекци€ клеток  562
 летки  562 выращивают в виде суспензии в среде RPMI 1640 (плюс 2 г бикарбоната натри€/л, 10% “Ё—, 100 единиц/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 2 мћ глутамина) до достижени€ плотности 500000 клеток/мл. «а 12 до 20 часов до трансфекции клетки подают в свежую среду, содержащую 50 мкћ десферриоксамина, 30-амино-3.14.25-триокси-3.9.14.20.25- пентаазатриаконтан-2.10.13.21.24-пентаона (в цел€х повышени€ числа рецепторов трансферина). ¬ день трансфекции клетки собирают, суспендируют в свежей среде, содержащей 10% “Ё— и 50 мкм десферриоксамина (250000 клеток на мл) и порци€ми по 2 мл подают в чашку, снабженную 24 €чейками. 6 мкг ƒЌ  pCMVL в 160 мкл HBS смешивают с указанным на фиг. 18 количеством конъюгата TfpL или с pL300 в 160 мкл HBS, через 15 минут добавл€ют указанные количества конъюгата пептида гриппа и полилизина (P16pL) и через дальнейшие 15 минут смесь добавл€ют к клеткам  562, которые инкубируют при температуре 37oC в течение 24 часов, после чего осуществл€ют их сбор дл€ определени€ активности люциферазы описанным в предыдущих примерах образом. ѕредставленные на фиг. 18 значени€ представл€ют собой общую активность люциферазы трансфецированных клеток.
е) “рансфекци€ клеток HeLa
 летки HeLa культивируют в чашках диаметром 6 см описанным выше образом. “рансфекцию осуществл€ют при плотности 300000 клеток на чашку. ѕеред трансфекцией клетки инкубируют в 1 мл свежей среды, содержащей 2% “Ё—. 6 мкг ƒЌ  pCMVL в 160 мкл HBS смешивают с указанным на фиг. 19 количеством конъюгата TfpL или полилизином с молекул€рным весом 300 (pL300) или же смесью конъюгата pL300 в 160 мкл HBS. „ерез 15 минут добавл€ют указанные количества конъюгата пептида гриппа и pL (P16pL) и через дальнейшие 15 минут смесь добавл€ют к клеткам, которые инкубируют при температуре 37oC в течение 2 часов, после чего добавл€ют 2,5 мл свежей среды, содержащей 10% “Ё—.  летки инкубируют при температуре 37oC в течение 24 часов, после чего осуществл€ют их сбор дл€ определени€ активности люциферазы описанным в предыдущих примерах образом. ѕредставленные на фиг. 19 значени€ представл€ют собой общую активность люциферазы трансфецированных клеток.
ѕример 14. ”лучшение переноса гена, достигаемое конъюгатами трансферина с помощью второго N-концевого эндосомолитического пептида гемаглютинина Ќј2 гриппа
а) —интез конъюгата пептида гриппа и полилизина
ѕептид последовательностью Gly-Leu-Phe-Gly-Ala-Ile-Ala-Gly- Phe-Ile-Glu-Asn-Gly-Trp-Glu-Gly-Met-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly-Cys (обозначенный P41) синтезируют известным методом. —в€зывание пептида гриппа с полилизином (pL300) осуществл€ют тем же образом, что и в примере 13, b1), т.е. при помощи сукцинимидил- пиридилдитиопропионата. ѕри этом получают конъюгаты (P41pL), в которых мольное соотношение пептида и полилизина составл€ет 4 : 1.
б) “рансфекци€ клеток HeLa
 летки HeLa выращивают в среде DMEM, содержащей 5% “Ё—, 100 единиц/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 2 мћ глутамина, что осуществл€ют в чашках диаметром 6 см. “рансфекцию осуществл€ют при плотности 300000 клеток на чашку. ѕеред трансфекцией клетки инкубируют в 165 мл свежей среды, содержащей 2% “Ё—. 6 мкг ƒЌ  pCMVL в 160 мкл HBS (150 мћ хлористого натри€, 20 мћ HEPES с pH 7,3) смешивают с 6 мкг конъюгата TfpL190B в 160 мкл HBS, через 15 минут добавл€ют 10 мкг конъюгата P41pL или, в качестве сравнени€, 18 мкг конъюгата P16pL (см. пример 13). ”казанные количества обоих пептидсодержащих конъюгатов €вл€ютс€ оптимальными дл€ достижени€ улучшени€ переноса гена. „ерез дальнейшие 15 минут смесь добавл€ют к клеткам, которые инкубируют при температуре 37oC в течение 4 часов, после чего добавл€ют 2 мл среды, содержащей 18% “Ё—. ѕо истечении 24 часов клетки собирают дл€ определени€ активности люциферазы. ѕредставленные на фиг. 20 значени€ представл€ют собой общую активность люциферазы трансфецированных клеток. —равнение результатов, получаемых при применении обоих пептидсодержащих конъюгатов, показывает, что конъюгат P41pL обеспечивает улучшение переноса гена, которое в 3,5 раз превышает результат, достигаемый другим пептидсодержащим конъюгатом.
в) “рансфекци€ клеток BNL CL.2 конъюгатами пептида вируса гриппа и полилизина
 летки BNL CL.2 выращивают аналогично примеру 6. ѕептид –41 подвергают сопр€жению с полилизином с молекул€рным весом 300 при мол€рном соотношении 1 : 1, 3 : 1 и 8: 1, соответственно.  омплексы 6 мкг ƒЌ  pCMVL и 20 мкг конъюгатов добавл€ют к клеткам. ¬ качестве сравнени€ используют 20 мкг полилизина с молекул€рным весом 300 (pL300) или 20 мкг конъюгата –16 по примеру 13.  летки инкубируют при температуре 37oC в течение 4 часов, после чего добавл€ют 2 мл среды, содержащей 18 % “Ё—. ѕо истечении 24 часов клетки собирают дл€ определени€ активности люциферазы. –езультаты опыта представлены на фиг. 20¬. —одержание пептида в конъюгатах коррелирует с улучшением экспрессии гена. —огласно результатам анализа по выделению содержимого из липосом (см. фиг. 20—), который осуществл€ют описанным в примере 13 образом, активность конъюгатов (при pH 5, что эквивалентно 2,5 мкг полилизина) увеличиваетс€ по мере повышени€ содержани€ пептида. Ќа фиг. 20 C пептид –41 обозначен "influ2".
ѕример 15. “рансфекци€ клеток HeLa β-галактозидазным репортерным ген-конструктом и доказательство экспрессии β галактозидазы in situ
а) ¬ыращивание и трансфекци€ клеток
 летки HeLa аналогично предыдущим примерам выращивают в среде DMEM, содержащей 5% “Ё—, пенициллин, стрептомицин и глутамин, причем процесс осуществл€ют в чашках диаметром 3 см. ѕлотность: 3 · 104 клеток на чашку.
6 мкг β-галактозидазного репортерного ген-конструкта (далее: pCMV-β-gal) в 160 мкл HBS перевод€т в комплекс с 12 мкг TfpL190B в 160 мкл HBS путем инкубации при комнатной температуре в течение 30 минут.  роме того, 6 мкг pCMV- β -gal в 160 мкл HBS инкубируют с 6 мкг TfpL190B в 80 мкл HBS при комнатной температуре в течение 15 минут. «атем добавл€ют 12 мкг конъюгата пептида гриппа (P16pL) по примеру 13 в 80 мкл HBS и смесь инкубируют в течение 15 минут. ѕолученные комплексы ƒЌ  и поликатиона смешивают с 1 мл среды DMEM, содержащей 2% “Ё—, антибиотики и глутамин, описанным выше образом. — целью вы€влени€ действи€ хлорохина и аденовируса на успех трансфекции, провод€т дополнительные опыты с применением хлорохина в конечной концентрации 100 мкћ и раствора штамма аденовируса d1312 в конечной концентрации 50 мкл, который добавл€ют к среде, содержащей комплексы ƒЌ  и поликатиона.
ѕеред трансфекцией первоначальную питательную среду удал€ют и к клеткам добавл€ют 1 мл среды, содержащей комплексы ƒЌ  и хлорохин или аденовирус, или же 1 мл среды, котора€ содержит только комплексы ƒЌ . ѕосле двухчасовой инкубации при температуре 37oC к клеткам добавл€ют 1 мл среды DMEM, содержащей 10% “Ё—, антибиотики и глутамин, и процесс инкубации продолжают в течение дальнейших 2 часов. «атем всю среду удал€ют и клетки культивируют в 3 мл свежей среды DMEM, содержащей 10% “Ё—, антибиотики и глутамин.
б) ќпределение экспресс β-галактозидазы
„ерез 48 часов после трансфекции среду удал€ют, клетки промывают фосфатсодержащим солевым раствором (далее: буфер PBS) и подвергают взаимодействию с 0,5% глутарьдиальдегида в буфере PBS при комнатной температуре в течение 5 минут. «атем непрореагировавший диальдегид удал€ют и клетки промывают буфером PBS, после чего осуществл€ют инкубацию вместе с окрашивающим раствором (10 мћ фосфатного буфера с pH 7,0, 150 мћ хлористого натри€, 1 мћ хлористого магни€, 3,3 мћ K4Fe(CN)6 · 3H2O, 3,3 мћ K3Fe(CN)6 и 0,2% 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-галактопиранозида) при температуре 37oC в течение 20 минут до 3 часов. «атем крышки чашек промывают буфером PBS, водой и 96%-ным этанолом. ѕосле сушки осуществл€ют анализ с применением микроскопа марки јксиофот фирмы ÷айсс. Ќа фиг. 21 представлены снимки микроскопических увеличений (112 раз). ј: клетки HeLa, трансфецированные комплексом 6 мкг pCMV-β gal и 12 мкг TfpL190B. –еакцию окрашивани€ осуществл€ют в течение 3 часов. Ќа фиг. видно, что только небольшое число клеток (55 клеток; группа окрашенных клеток указана стрелкой) экспрессирует ген β-галактозидазы. ¬: клетки HeLa, трансфецированные комплексом 6 мкг pCMV-β-gal, 6 мкг TfpL190B и 12 мкг P16pL. –еакцию окрашивани€ осуществл€ют также в течение 3 часов. Ќебольшое число клеток (250) экспрессирует ген β-галактозидазы. ќднако реакци€ клеток сильнее чем в случае ј. —: клетки HeLa, трансфецированные комплексом 6 мкг pCMV- β- gal, 6 мкг TfpL190B и 12 мкг P16pL в присутствии 100 мкћ хлорохина. ѕри этом реакцию окрашивани€ также осуществл€ют в течение 3 часов. Ѕольшое число клеток про€вл€ет значительную положительную реакцию (более 1000 клеток). D:  летки HeLa, трансфецированные комплексом 6 мкг pCMV-β-gal и 12 мкг TfpL190B в присутствии аденовируса d1312. ѕри этом реакцию окрашивани€ осуществл€ют в течение 20 минут. ѕочти все клетки (более 90%) про€вл€ют положительную реакцию. E: Ќе-трансфецированные клетки HeLa (контрольный опыт дл€ определени€ специфичности реакции β-галактозидазы). ѕри этом реакцию окрашивани€ осуществл€ют в течение 3 часов.
ѕример 16. “рансфекци€ клеток HeLa козмидой размером 48 к.п.о. в присутствии аденовируса
а) ѕолучение козмиды, содержащей последовательность, кодирующую люциферазу
‘рагмент SalI размером 3,0 к.п.о., содержащий кодирующую люциферазу P. pyralis последовательность под контролем промотора RSV, выдел€ют из плазмиды p220RSVLuc α и легируют в сайт SAlI козмидного клона —1-7ај1 с тем, чтобы образовать конкатамеры.  озмидный клон —1-7ај1 включает фрагмент Sau3A геномной ƒЌ  человека с размером 37 к.п.о. (частичное переваривание), который не кодирует определенные гены и клонирован в сайт BamHI козмидного вектора pWE15. ѕродукты легировани€ упаковывают in vitro, аликвот получаемых фаговых частиц подают на инфекцию в ≈. coli NM544 и подают на пластинки марки LB amp. –екомбинантные продукты подвергают скринингу путем гибридизации колоний с применением в качестве пробы гибридизации фрагмента SalI размером 3,0 к.п. о. , меченого 32P. –€д положительных продуктов обнаруживают путем рестрикционного картировани€.  озмидный конструкт (CosLuc), включающий одиночную копию вставки SalI, выращивают и очищают на градиенте хлористого цези€ (общий размер: 48 к.п.о.).
Ќебольшую контрольную козмиду pWELuc размером 12 к.п.о. получают путем переваривани€ CosLuc с помощью NotI, повторного легировани€, трансформации бактерий и выделени€ клона, содержащего целевую плазмиду. ѕолучают молекулу ƒЌ  размером 12 к.п.о., котора€ недостаточна вставкой ƒЌ  человека и частью полилинкера CosLuc. ѕлазмида pSPNeoLuc размером 8 к.п.о. представл€ет собой описанную в примере 5 плазмиду, котора€ содержит фрагмент гена люциферазы RSV (Apa1/Pvu1-фрагмент pRSVL, клонированный в сайт Cla1 локуса pUC μ).
б) ¬ведение козмиды в клетки HeLa
Ќа клетки HeLa (3 · 104 клеток на чашку диаметром 6 см) подают 1 мл среды DMEM + 2% “Ё— и их инкубируют вместе с полученными вышеописанным образом комплексами ƒЌ  и конъюгата трансферина и полилизина (TfpL), содержащими указанные на фиг. 22ј количества hTfpL, свободного полилизина (pL) и ƒЌ . —реда инкубации дополнительно еще включает либо 100 мкћ хлорохина (см. следы 1, 2), либо 10 мкл аденовируса d1312, содержащего 5 · 1011 частиц на мл (следы 3-12). ѕосле двухчасовой инкубации при температуре 37oC добавл€ют 4 мл среды DMEM + 10% “Ё—. „ерез 24 часа клетки собирают дл€ определени€ активности люциферазы. –езультаты опыта представлены на фиг. 22ј.
в) ¬ведение козмиды в нейробластомные клетки
Ќа клетки нейробластомной клеточной линии Gl-ME-N (1 · 106 клеток на чашку диаметром 6 см) подают 1 мл среды DMEM + 2% “Ё—, после чего их инкубируют вместе с комплексами ƒЌ  и конъюгата TfpL, содержащими указанные на рис. 22¬ количество hTfpL, свободного полилизина pL и ƒЌ .  роме того, среда инкубации дополнительно еще содержит либо 100 мкћ хлорохина (следы 3, 4), либо 10 мкл аденовируса d1312, содержащего 5 · 1011 частиц на мл (следы 5, 6). ѕосле двухчасовой инкубации при температуре 37oC добавл€ют 4 мл среды DMEM, содержащей 10% “Ё—. ѕо истечении 24 часов клетки собирают дл€ определени€ активности люциферазы. –езультаты опыта представлены на рис. 22¬.
ѕример 17. ѕеренос гена с помощью конъюгата химически св€занных аденовируса и полилизина
а) ѕолучение конъюгата аденовируса и полилизина путем химического св€зывани€.
2,35 мл прошедшего гель-фильтрацию (с применением колонки сефадекс √-25) раствора аденовируса d1312 (примерно 1011 частиц) в 150 мћ хлористого натри€ /25 мћ HEPES, pH 7,9+10% глицерина смешивают с 10 мкл (10 нмоль) 1 мћ раствора сукцинимидилпиридилдитиопропионата. „ерез 3,5 часа при комнатной температуре модифицированный вирус отдел€ют от избыточного реагента путем гель-фильтрации, осуществл€емой вышеуказанным образом. „ерез 2,5 мл раствора пропускают аргон и в услови€х исключени€ кислорода в атмосфере аргона подвергают взаимодействию с 42 мкл раствора 1 нмоль меченого изотиоцианатом флуоресциина полилизина, модифицированного 2,3 нмоль меркаптопропионатных групп. „ерез 18 часов при комнатной температуре половину раствора перевод€т в пробирку, на него подают 1 мл раствора хлористого цези€ (плотность 1,33 г/мл) и центрифугируют при 35000 об./мин в течение двух часов при комнатной температуре. ¬ирус собирают в качестве 200 мкл фракции хлористого цези€ и разбавл€ют до 1 мл буфером HBS, содержащим 50% глицерина. 300 мкл раствора модифицированного вируса исследуют на способность к св€зыванию ƒЌ  следующим образом. –аствор вируса разбавл€ют 1 мл буфера HBS и смешивают с 100 мкл раствора 15 нг ƒЌ  pRSVL, меченой 35S. ¬ качестве контрольного опыта примен€ют немодифицированный вирус d1312 в том же количестве. „ерез 30 минут пробы перевод€т в пробирки, на них подают 1мл раствора хлористого цези€ (плотность 1,33/мл) и центрифугируют при 35000 об./мин в течение двух часов при комнатной температуре. √радиент подраздел€ют на 5 фракций: фракци€ 1 = 1 мл; фракци€ 2 = 0,6 мл; фракции 3-5 = по 200 мкл. ќпредел€ют радиоактивность фракции объемом 200 мл. ѕолученные данные представлены на фиг. 23. ¬ирус, содержащий фракции 3-5, в частности фракци€ 3, про€вл€ет значительно более высокую радиоактивность, чем контрольна€ проба. Ёто можно приписывать специфичной св€зи модифицированного полилизином аденовируса с меченой ƒЌ , а в присутствии хлористого цези€, может быть, вызывает частичную диссоциацию комплекса.
б) “рансфекци€ клеток  562
 летки  562 (ј“—— CCL 243) выращивают в виде суспензии в среде RPMI 1640 (содержащей 2 г/л бикарбоната натри€, 10% “Ё—, 100 единиц/мл пенициллина, 100 мкл/мкл стрептомицина и 2 мћ глутамина) до плотности 500000 клеток/мл. «а 12 до 20 часов до трансфекции клетки подают в свежую среду, содержащую 50 мкћ десферриоксима (служащего дл€ повышени€ числа рецепторов трансферина). ¬ день трансфекции клетки собирают, суспендируют в свежей среде, содержащей 10% “Ё— и 50 мкћ десферриоксима (250000 клеток/мл) и порции по 2 мл подают в снабженную 24 €чейками чашку. 6, 0,6 и 0,06 мкг, соответственно, ƒЌ  pCMVL в 100 мкл HBS смешивают с 50 мкл модифицированного полилизином аденовируса (на фиг. 24: "pLadeno") или с соответствующим количеством (37 мкл) контрольного аденовируса d1312. ѕо истечении 20 минут добавл€ют 12, 1,2 и 0,12 мкг, соответственно, конъюгата TfpL190B в 150 мкл HBS. ѕо истечении дальнейших 20 минут смесь добавл€ют к клеткам  562, которые инкубируют при температуре 37oC в течение 24 часов, после чего их собирают дл€ определени€ активности люциферазы описанным в предыдущих примерах образом. Ќа фиг. 24 представлена обща€ активность люциферазы трансфецированных клеток.
в) “рансфекци€ клеток HeLa
ќдин из методов исследовани€ активности конъюгата вируса и полилизина заключаетс€ в определении способности конъюгата к переносу минимальных количеств ƒЌ  (менее 0,1 мкг). ѕовышенна€ способность к переносу ƒЌ  ожидаетс€ в том случае, если аденовирус непосредственно св€зан с конденсируемой полилизином ƒЌ , так как содействующие поглощению клеткой факторы (трансферин и аденовирус (или его белок) непосредственно св€зываютс€ с переносимой ƒЌ . ƒл€ проверки этого предположени€ поступают следующим образом. ѕосто€нное количество конъюгата полилизина и аденовируса (2,5 мкл, примерно 5 · 107 вирусных частиц) перевод€т в комплекс с различными количествами (3 мкг - 0,0003 мкг) репортерной плазмиды в 475 мкл HBS. ѕосле 15-минутной инкубации при комнатной температуре к каждой пробе добавл€ют конъюгат трансферина и полилизина в количестве, соответствующем массе ƒЌ  (такое количество конъюгата TfpL обеспечивает полную "упаковку" (электронейтральность) 50% плазмидной ƒЌ  и одновременно предоставл€ет еще место св€зывани€ конъюгату вируса и полилизина. ѕосле добавлени€ конъюгата TfpL смеси инкубируют в течение 15 минут, после чего каждую смесь подают в чашку диаметром 6 см, содержащую 300000 клеток HeLa в 1 мл среды DMEM/2% “Ё—.  летки инкубируют при температуре 37oC в течение 90 минут, после чего добавл€ют 4 мл среды DMEM/10% “Ё—. ¬ параллельных опытах эквивалентное количество ƒЌ  перевод€т в комплекс с двукратным массовым избытком конъюгата TfpL (это количество обеспечивает полную конденсацию ƒЌ ) и примен€ют дл€ осуществлени€ переноса гена в клетках HeLa (в одном случае в присутствии 25 мл несв€занного с полилизином аденовируса d1312, в другом случае - без последнего). ѕо истечении 24 часов клетки собирают, приготовл€ют экстракты и аликвоты исследуют на активность люциферазы. –езультаты опытов представлены на фиг. 25, где видно, что в отсутствие аденовируса активность люциферазы на может определ€тьс€ в количестве ƒЌ  менее 0,3 мкг.  ак св€занный с полилизином аденовирус, так и несв€занный с ним аденовирус про€вл€ют хорошее действие в случае больших количеств ƒЌ  (3 мкг и 0,3 мкг). ќднако в случае несв€занного с полилизином аденовируса наблюдаетс€ примерно 100-кратное снижение активности при 0,03 мкг ƒЌ , а в случае применени€ ƒЌ  в количестве менее 0,03 мкг активность ничтожна. ¬ противоположность этому св€занный с полилизином аденовирус сохран€ет свою способность к переносу гена как при 0,003, так и при 0,0003 мкг ƒЌ . Ёто количество ƒЌ  соответствует примерно 150 молекул ƒЌ  на клетку и примерно одной вирусной частице на клетку.
ѕример 18. ѕеренос гена с помощью энзиматически св€занных с полилизином аденовирусов
а) –еакци€ с ферментом
2 мл препарата аденовируса (штамм d1312; 5 · 1010 бл€шкообразующих единиц/мл) подвергают гель-фильтрации в колонке —ефадекс √-25, которую предварительно уравновешивают с помощью 25 мл реакционного буфера (0,1 ћ Tris-Ќ—1; pH 8,0, 2 мћ дитиотреитола, 30% глицерина). Ёлюацию осуществл€ют 3,5 мл реакционного буфера. ѕодвергаема€ энзиматическому св€зыванию реакционна€ смесь состоит из 1150 мкл вируссодержащего элюата, 0,5 нмоль выделенной из печени морской свинки трансглутаминазы (далее: "TG"), 2 нмоль или 20 нмоль полилизина с молекул€рным весом 290, 10 мћ хлористого кальци€ и реакционного буфера до конечного объема 1500 мкл. –еакцию осуществл€ют при температуре 37oC в течение 1 часа, после чего ее прекращают путем добавлени€ 30 мкл 0,5 ћ Ёƒ“” . ¬ цел€х определени€ специфичности св€зывани€ приготовл€ют те же реакционные смеси, но без трансглутаминазы. Ќесв€занный полилизин отдел€ют от вирусов путем центрифугировани€ в градиенте хлористого цези€ (плотностью 1,33 г/мл; 170000 · g, 2 часа). ¬ируссодержащую фракцию собирают, смешивают с одинаковым объемом глицерина, замораживают в среде жидкого азота и хран€т при температуре -70oC.
б) јнализ св€зывани€ полилизина с аденовирусом
¬ышеупом€нутую реакцию осуществл€ют с применением полилизина, меченого 125J. ѕосле центрифугировани€ в градиенте хлористого цези€ вируссодержащую фракцию отвод€т и раздел€ют с помощью другого градиента хлористого цези€. √радиент фракционируют и в каждой фракции определ€ют радиоактивность с применением сцинтилл€ционного счетчика. –езультаты опыта представлены на фиг. 26, где видно, что в случае содержащей TG реакционной смеси (d1312/TG-pL) радиоактивный полилизин накапливаетс€ в вируссодержащей фракции. ¬ случае контрольной смеси, т. е. реакционной смеси без содержани€ TG (d1312/pL), накоплени€ радиоактивного полилизина в вируссодержащей фракции не наблюдаетс€.
в) »сследование фракций, содержащих модифицированный полилизином аденовирус, их вли€ние на эффективность трансфекции
1)  летки и среда
5 · 105 клеток (мышиные гепатоциты; ј“—— N: TIB 73) в среде DMEM, содержащей 10% инактивированной термообработкой “Ё—, 2 мћ глутамина, 100 единиц/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, выращивают в чашках диаметром 6 см.
2) ќбразование состо€щего из вируса, ƒЌ  и трансферина комплекса
50 мкл модифицированной полилизином вируссодержащей фракции смешивают с 6 мкг плазмидной ƒЌ  pCMVL в 10 мкл HBS и смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 20 минут. «атем к смеси добавл€ют 8 мкг конъюгата мышиного трансферина и полилизина с молекул€рным весом 290 (mTflpL 290¬), после чего инкубацию продолжают в течение дальнейших 20 минут.
3) “рансфекци€ мышиных гепатоцитов
—осто€щий из модифицированного вируса, ƒЌ  и трансферина комплекс смешивают с 1,5 мл среды DMEM, содержащей 2% “Ё—, 2 мћ глутамина и антибиотики, и добавл€ют к клеткам после предварительной замены на свежую среду. ѕосле двухчасовой инкубации при температуре 37oC к клеткам добавл€ют 2 мл среды DMEM, содержащей 10% “Ё—, глутамин и антибиотики. ѕосле культивации в течение дальнейших 2 часов всю среду удал€ют и к клеткам добавл€ют 4 мл свежей среды DMEM, содержащей 10% “Ё—, глутамин и антибиотики.
4) ќпределение экспрессии люциферазы
„ерез 24 часа после трансфекции клетки собирают и определ€ют активность люциферазы указанным выше образом.  ак видно на фиг. 27 вирусный препарат, содержащий обработанный TG и 20 нмоль полилизина (d1312/TG-20 нмоль pL) аденовирус, про€вл€ет наибольшую экспрессию (153 540 000 световых единиц). ¬ирусный препарат, содержащий аденовирус, обработанный TG и 2 нмоль полилизина (d1312 /TG-2 нмоль pL), про€вл€ет несколько меньшую активность (57 880 000 световых единиц).  онтрольна€ фракци€, котора€ содержит только обработанный 20 нмоль полилизина аденовируса, про€вл€ет примерно на фактор 500 меньшую активность. ¬ качестве сравнени€ примен€ют комплексы, которые содержат аденовирус, который не обработан ни TG, ни полилизином. ѕри этом активность люциферазы составл€ет 4 403 000 световых единиц.
5) Ёффективность трансфекции, достигаема€ с помощью модифицированного полилизином аденовируса по сравнению с немодифицированным аденовирусом, можно повышать в частности небольшими количествами ƒЌ 
“рансфекцию осуществл€ют описанным на стадии 3) образом с применением 50 мкл фракции аденовируса d1312/TG-20 нмоль pL и 6 мкг pCMVL/8 мкг TfpL, 0,6 мкг pCMVL/0,8 мкг mTfpL или 0,06 мкг pCMVL/0,08 мкг mTfpL дл€ образовани€ комплекса. ¬ качестве сравнени€ осуществл€ют трансфекцию с применением 6 мкг, 0,6 мкг и 0,06 мкг, соответственно, комплекса pCMVL/mTfpL и немодифицированного аденовируса d1312. –езультаты опыта представлены на фиг. 28. ¬идно, что содержащие модифицированный полилизином аденовирус комплексы про€вл€ют высокую экспрессию даже в случае небольших количеств ƒЌ , тогда как экспресси€ резко снижаетс€ при применении комплекса, содержащего немодифицированный аденовирус.
ѕример 19. ѕеренос гена при помощи конъюгатов, в которых св€зь между аденовирусом и полилизином осуществлена при помощи биотиново- стрептавидинового мостика
а) Ѕиотинилирование аденовируса d1312
2,4 мл прошедшего гель-фильтрацию в колонке —ефадекс √-25 раствора аденовируса d1312 (примерно 1011 частиц) в 150 мћ хлористого натри€/5 мћ HEPES, pH 7,9 /10% глицерина смешивают с 10 мкл (10 нмоль) 1 мћ раствора биотина марки NHS-LC. ѕо истечении 3 часов при комнатной температуре модифицированный биотином вирус отдел€ют от избыточного реагента при помощи гель-фильтрации, осуществл€емой описанным выше образом.   раствору добавл€ют глицерин в количестве, обеспечивающем его концентрацию в растворе 40% и раствор общим объемом 3,2 мл хран€т при -25oC. ‘акт биотинилировани€ вируса исследуют путем накапывани€ раствора различной степени разбавлени€ на целлюлозно-нитратную мембрану, после чего осуществл€ют сушку при температуре 80oC в течение 2 часов в вакуумной сушилке, блокировку альбумином сыворотки крупного рогатого скота, инкубацию с сопр€женной со стрептавидином щелочной фосфатазой, промывку и одночасовую инкубацию вместе с про€вл€ющим раствором тетразолевой соли нитросинего и толуидиновой соли 5-бром-4-хлор-3- индолилфосфата. ѕри этом имеет место положительна€ цветна€ реакци€, что свидетельствует о состо€вшемс€ биотинилировании.
б) ѕолучение конъюгатов стрептавидина и полилизина
79 нмоль (4,7 мг) стрептавидина в 1 мл 200 мћ буфера HEPES с pH 7,9 и 300 мћ хлористого натри€ обрабатывают 15 мћ этанольным раствором сукцинимидилпиридилдитиопропионата (236 нмоль). ѕо истечении 90 минут при комнатной температуре модифицированный белок подвергают гель-фильтрации в колонке —ефадекс √-25. ѕри этом получают 75 нмоль стрептавидина, модифицированного 196 нмоль указанного дитиопиридина. ћодифицированный белок подвергаетс€ взаимодействию с 75 нмоль модифицированного 190 нмоль 3-меркаптопропионата полилизина со средней длиной лизиновых мономеров 290 в 2,6 мл 100 мћ буфера HEPES с pH 7,9, содержащего 150 мћ хлористого натри€.  онъюгаты выдел€ют путем катионообменной хроматографии в колонке Mono S HR5 (градиент: 20-100% буфера, состо€щего из 50 мћ HEPES pH 7,9 плюс 3 ћ хлористого натри€). ÷елевую фракцию элюируют при концентрации соли между 1,2 ћ и 1,7 ћ. ¬ результате диализа с применением буфера HBS (20 mM HEPES с pH 7,3, 150 мћ хлористого натри€) получают конъюгат, состо€щий из 45 нмоль стрептавидина и 53 нмоль полилизина.
в) “рансфекци€ клеток HeLa
 летки HeLa выращивают в чашках диаметром 6 см указанным в примере 13 образом. “рансфекцию осуществл€ют при плотности 300000 клеток на чашку. ѕеред трансфекцией клетки инкубируют в 1 мл свежей среды, содержащей 2% “Ё—.
6 мкг ƒЌ  pCMVL в 100 мкл HBS смешивают с 0,8 мкг модифицированного стрептавидином полилизина в 170 мкл HBS. ѕо истечении 20 минут добавл€ют 3 мкг полилизина с молекул€рным весом 300 в 170 мкл HBS. ѕо истечении дальнейших 20 минут добавл€ют 65 мкл биотинилированного аденовируса или, в качестве контрол€, соответствующее количество аденовируса d1312 (30 мкл, т.е. количество, в котором вирус примен€ют дл€ осуществлени€ модификации). ѕолучаемые при этом смеси ("биотин.AdV/комплекс ј" и "AdV (контроль)"; см. фиг. 29) оставл€ют сто€ть в течение дальнейших 20 минут.
 роме того, 50 мкл биотинилированного аденовируса смешивают с 0,8 мкг модифицированного стрептавидином полилизина в 50 мкл HBS, через 20 минут добавл€ют 6 мкг ƒЌ  pCMVL в 170 мкл HBS и через дальнейшие 20 минут добавл€ют еще 3 мкг полилизина с молекул€рным весом 300 в 200 мкл HBS. ѕолучаемый комплекс обозначаетс€ "биотинAdV/комплекс Ѕ".
0,6 мкг ƒЌ  pCMVL в 67 мкл HBS смешивают с 0,3 мкг модифицированного стрептавидином полилизина в 33 мкл HBS. ѕо истечении 20 минут добавл€ют 65 мкл биотинилированного аденовируса или, в качестве контрол€, соответствующее количество аденовируса d1312 (30 мкл, т.е. количество, в котором вирус примен€ют дл€ осуществлени€ модификации). ѕолучаемые комплексы ("биотин. AdV/комплекс ј" или "AdV (контроль)"; см. фиг. 29) оставл€ют сто€ть в течение дальнейших 20 минут, после чего комплексы разбавл€ют HBS до 500 мкл.  роме того, получают еще другой комплекс за счет смешени€ 50 мкл биотинилированного аденовируса с 0,3 мкг модифицированного стрептавидином полилизина в 50 мкл HBS и последующего добавлени€ через 20 минут 0,6 мкг ƒЌ  pCMVL в 50 мкл HBS. ѕолучаемый комплекс ("Ѕиотин.AdV/комплекс Ѕ") оставл€ют сто€ть в течение дальнейших 20 минут, после чего его разбавл€ют HBS до 500 мкл.
”казанные комплексы добавл€ют к клеткам, которые инкубируют при температуре 37oC в течение 2 часов, после чего добавл€ют 2,5 мкл свежей среды, содержащей 10% “Ё—.  летки инкубируют еще в течение 24 часов при 37oC, после чего их собирают на определение активности люциферазы описанным выше образом. –езультаты опыта представлены на рис. 29, показывающем общую активность люциферазы трансфецированных клеток.
ѕараллельно осуществл€ют трансфекцию клеток HeLa с применением в качестве вирусного компонента конъюгата биотинилированного вируса, инактивированного обработкой ”‘-лучами и псораленом. »нактивацию осуществл€ют следующим образом. ѕробы по 200 мкл биотинилированного вируса подают в снабженную двум€ €чейками пластинку диаметром 1,6 см.   каждой пробе добавл€ют 2 мкл (33 мг/мл) 8-метоксипсоралена в диметилсульфоксиде, пластинки подают на лед и подвергают облучению ”‘-светом с помощью лампы UVP TL-33, размещенной на рассто€нии 4 см, в течение 10 минут при 365 нм. ѕосле облучени€ обе пробы объедин€ют и подвергают гель-фильтрации в колонке √50, которую предварительно уравновешивают 40%-ным раствором глицерина в HBS. јликвоты 75 мкл перевод€т в комплекс с 0,8 мкг модифицированного стрептавидином полилизина и полученные таким образом комплексы примен€ют дл€ трансфекции клеток HeLa описанным выше образом.
¬ результате цитопатического анализа устанавливают, что инактиваци€ приводит к снижению титра вируса на фактор более 104, тогда как способность к переносу гена уменьшаетс€ на менее 50% при высоких концентраци€х и на фактор 5 при низких концентраци€х.
г) “рансфекци€ клеток  562
 летки  562 в виде суспензии выращивают в среде RPMI 1640, содержащей 2 г/л бикарбоната натри€, 10% “Ё—, 100 единиц/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 2 мћ глутамина, до достижени€ плотности 500000 клеток/мл. «а 16 часов до трансфекции клетки подают в свежую среду, содержащую 50 мкмоль десферриоксима. ¬ утро трансфекции клетки собирают, повторно суспендируют в свежей среде, содержащей 10% “Ё— (плюс 50 мкћ десферриоксима) при плотности 250000 клеток/мл и подают в снабженную 24 €чейками чашку (2 мл на €чейку).
ѕолучают 3 различных комплекса ƒЌ : а) –аствор 6 мкг ƒЌ  pCMVL в 160 мкл HBS (150 mM хлористого натри€, 20 мћ HEPES с pH 7,3) смешивают с 12 мкг конъюгата TfpL190B в 160 мкл HBS, через 30 минут добавл€ют 20 мкл аденовируса d1312 и получаемую смесь добавл€ют к клеткам  562. б) –аствор 800 нг модифицированного стрептавидином полилизина (StpL) в 160 мкл HBS смешивают с 20 мкл биотинилированного аденовируса, полученного на вышеописанной стадии а), через 30 минут добавл€ют раствор 6 мкг ƒЌ  pCMVL в 160 мкл HBS и через дальнейшие 30 минут раствор смешивают с 10 мкг конъюгата TfpL190B в 160 мкл HBS. ѕо истечении 30 минут смесь добавл€ют к клеткам. в) Ётот комплекс получают аналогично пункту б) с той разницей, что вместо конъюгата TfpL190B добавл€ют раствор 3,5 мкг поли(L)лизина с молекул€рным весом 290 (pL290).  летки инкубируют при температуре 37oC в течение 24 часов, после чего их собирают на определение активности люциферазы. –езультаты опытов представлены на фиг. 30, показывающем общую активность люциферазы трансфецированных клеток.
ѕример 20. ѕеренос гена в первичные клетки костного мозга
а) ¬ыделение первичных клеток костного мозга
ѕервичные клетки костного мозга отбирают из мышей при помощи снабженного инъекционной иглой (диаметром 0,4 -0,5 мм) шприца емкостью 1 мл, вводимого в изолированные бедренную и большеберцовую кость. ќтбор осуществл€ют с применением среды IMDM, содержащей 10% “Ё—, 5 · 10-5 ћ β-меркаптоэтанола, 1% интерлейкина 3 и антибиотики. ќтобранные клетки промывают указанной средой за счет центрифугировани€ при 100 · g в течение 8 минут. «атем клетки повторно суспендируют в указанной среде при концентрации 107/мл и культивируют в пробирках марки “25. ѕо истечении 4 часов непроросшие клетки перевод€т в другие пробирки марки “25, в которых культивируют в течение ночи в присутствии 50 мкћ десферриоксима.
б) ќбразование комплекса, состо€щего из аденовируса, ƒЌ  и трансферина
50 мкл биотинилированного аденовируса инкубируют вместе с 400 нг модифицированного стрептавидином полилизина в 20 мкл HBS в течение 20 минут. «атем добавл€ют 20 мкл буфера HBS, содержащего 6 мкг ƒЌ  pCMVL. ѕосле 20-минутной инкубации добавл€ют 7 мкг конъюгата мышиного трансферина и полилизина (mTfpL) в 160 мкл HBS, после чего смесь инкубируют в течение дальнейших 20 минут.
в) “рансфекци€
 летки костного мозга отдел€ют от питательной среды путем центрифугировани€ при 100 · g в течение 8 минут. ѕолученные клетки повторно суспендируют в 3 мл указанной среды, содержащей 2% “Ё— и 250 мкл состо€щего из аденовируса, ƒЌ  и трансферина комплекса, после чего смесь культивируют в пробирках марки “25 при температуре 37oC в течение 3 часов. ѕотом добавл€ют 3 мл указанной среды, содержащей 10% “Ё—. ѕо истечении дальнейших 2 часов добавл€ют еще 6 мл указанной среды.
г) ќпределение экспрессии люциферазы
ѕосле 48-часовой трансфекции клетки костного мозга собирают и подвергают анализу экспрессии люциферазы описанным выше образом. ѕри этом устанавливают, что трансфекци€ приводит к экспрессии активности люциферазы, соответствующей 310 · 103 световых единиц/100 мкг общего клеточного белка.
ѕример 21. “рансфекци€ нейробластомных клеток козмидой размером 48 к.п. о. в присутствии аденовируса
а) ѕолучение козмиды, включающей последовательность, кодирующую люциферазу
‘рагмент Sal I размером 3,0 к.п.о., включающий кодирующую люциферазу последовательность из P. pyralis под контролем промотора RSV, легируют в единственный сайт Sal I козмидного клона —1-7ај1 с получением конкатамера (—1-7ај1 включает Sau 3ј-фрагмент размером 37 к.п.о. человеческой геномной ƒЌ  (частичное переваривание), не кодирующий определенных генов, клонированный в сайт Bam HI козмидного вектора pWE15). ѕродукт легировани€ упаковывают in vitro и аликвот получаемых фаговых частиц инфицируют штамм ≈. coli NM544, который подают на пластинки марки LB amp. ѕолучаемые рекомбинантные продукты подвергают скринингу путем гибридизации колоний с применением в качестве зонда фрагмента Sal I размером 3,0 к.п.о., меченого 32P. –€д положительных продуктов подвергают анализу путем рестрикционного картировани€.  озмидный конструкт (CosLuc), включающий одну единственную копию вставки Sal I, выращивают и очищают на градиенте хлористого цези€ (общий размер: 48 к.п.о.).
ѕолучают небольшую контрольную плазмиду pWELuc размером 12 к.п.о. путем переваривани€ указанного козмидного конструкта с помощью Not I, повторного легировани€, трансформации бактерий и выделени€ клона, включающего целевую плазмиду. ѕолучают молекулу ƒЌ  размером 12 к.п.о., в которой отсутствуют вставка человеческой ƒЌ  и часть полилинкера козмидного конструкта CosLuc.
б) ¬ведение козмиды в нейробластомные клетки
Ќа клетки нейробластомной линии Gl-ME-N (1 · 106 клеток на чашку диаметром 6 см) подают слой 1 мл среды DMEM, содержащей 2% “Ё—, после чего клетки инкубируют вместе с описанными выше комплексами ƒЌ  и TfpL комплексами, содержащими указанные количества hTfpL, свободного полилизина и ƒЌ . ѕодвергаемые инкубации смеси содержат еще либо 100 мкћ хлорохина (см. следы 3, 4) либо 10 мкл аденовируса d1312, включающего 5 · 1011 частиц/мл (см. следы 5, 6). ќбе последние пробы (обозначенные как StpL/биотин.), включающие 15 мкл биотинилированного аденовируса d1312 (1 · 1011 частиц), инкубируют вместе с 0,8 мкг полученного в примере 19, модифицированного стрептавидином полилизина в 150 мкл HBS в течение 30 минут. «атем добавл€ют 6 мкг ƒЌ  в 150 мкл HBS, инкубируют при комнатной температуре в течение 30 минут и добавл€ют 150 мкл буфера HBS, содержащего 6 мкг hTfpL и 1 мкг свободного полилизина. ѕосле дополнительной инкубации при комнатной температуре в течение 30 минут смесь добавл€ют к клеткам, которые инкубируют при температуре 37oC в течение 2 часов, после чего к каждой пробе добавл€ют 4 мл среды DMEM, содержащей 10% “Ё—. „ерез 24 часа клетки собирают дл€ определени€ активности люциферазы. –езультаты опыта представлены на фиг. 31.
ѕример 22. ѕеренос гена в первичные клетки эпителиальных дыхательных путей с применением конъюгатов согласно изобретению. Ќаправленные на вы€вление пригодности употреблени€ переноса генов с применением конъюгатов согласно изобретению дл€ генетической поправки муковисцидоза исследовани€ показали, что иммортализованные клеточные линии из эпители€ дыхательных путей человека про€вл€ют чувствительность к такому методу осуществлени€ переноса генов. ƒл€ исключени€ того, что этот дефект €вл€етс€ результатом вызываемых иммортализацией изменений эпители€ дыхательных путей, первичные клетки эпители€ дыхательных путей (далее: клетки 1o ј≈) подвергают воздействию конъюгатов трансферина и полилизина.  летки 1o AE выдел€ют из назального полипа человека известными приемами. ѕри этом ткань последовательно промывают стерильным солевым раствором и средой MEM, содержащей 50 единиц/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина и 40 мкг/мл гентамицина и перевод€т в лабораторию при 4oC. ’р€щ и избыточную подслизистую ткань очищают и эпителиальные слои инкубируют в содержащем протеазу (тип 14 фирмы «игма, ƒ≈; 0,1 мг/дл) растворе в среде MEM при температуре 4oC в течение 16 до 48 часов. ƒобавл€ют 10% “Ё— дл€ нейтрализации протеазы, после чего смесь слабо размешивают. ѕолучаемую суспензию фильтруют через найлоновую сетку величиной €чеек 10 мкм с тем, чтобы удалить инородные вещества, и фильтрат подвергают центрифугированию при 150 · g в течение 5 минут, после чего промывают в среде F12, содержащей 10% “Ё—. «атем клетки 1oAE обрабатывают конъюгатами трансферина и полилизина (hTfpL), содержащими в качестве репортерного гена кодирующую люциферазу плазмиду (pRSVL). ¬ этом опыте первичные клетки не про€вл€ют ту чувствительность к действию этого вектора, котора€ про€вл€етс€ соответствующими иммортализованными клеточными лини€ми (1o ј≈: фон = 429 ± 41; + hTfpL = 543 ± ед. люциферазы), что, веро€тно, свидетельствует об относительно небольшом числе рецепторов трансферина на клетках 1o AE.
¬ цел€х исследовани€ альтернативного целевого рецептора на клетках 1o AE конструируют конъюгаты, которые включают в качестве лиганда некомпетентный к репликации аденовирус (bAdpL; см. пример 19 а) и 19 б) дл€ получени€ биотинилированного аденовируса и конъюгатов стрептавидина и полилизина; кодирующую люциферазу плазмиду примен€ют в качестве репортерного гена).  летки 1o AE человека, обработанные этим конъюгатом, про€вл€ют степень экспрессии репортерного гена, котора€ значительно превышает фон (+ bAdpL = 2 585 753 ± 453 585 ед. люциферазы).  роме того, клетки 1o AE другого происхождени€ также про€вл€ют высокую степень чувствительности к переносу гена этим методом (из мышей = 3 230 244 ± 343 153; из обезь€н = 53 498 880 ± 869 481 ед. люциферазы). “аким образом способность к осуществлению переноса гена в клетки 1o AE подтверждает потенциальную пригодность этого подхода по осуществлению непосредственной доставки генов in vivo.
ѕример 23. ѕеренос генов в гепатоциты с применением предлагаемых конъюгатов
а) “рансфекци€ клеток
 летки мышиной эмбриональной гепатоцитной клеточной линии BNL CL.2 (ј“—— TIB 73) выращивают описанным в примере 6 образом.  летки HeLa и гепатоциты выращивают в пластмассовых чашках ѕетри диаметром 6 см. “рансфекцию осуществл€ют при плотности клеток примерно 3 · 105/чашку. ѕеред трансфекцией стандартную питательную среду замен€ют на 1 мл свежей среды, содержащей 2% “Ё—.
б) ќбразование двойного комплекса
Ѕиотинилированный аденовирус (примерно 109 бл€шкообразующих единиц; см. пример 19 а) и 19 б)) подвергают взаимодействию с 800 нг модифицированного стрептавидином полилизина в 50 мкл HBS. ѕо истечении 30 минут при комнатной температуре добавл€ют 6 мкг ƒЌ  pCMVL в 170 мкл HBS, инкубируют в течение 30 минут и добавл€ют 3 мкг полилизина с молекул€рным весом 300 в 200 мкл HBS. ѕо истечении дальнейших 30 минут раствор примен€ют дл€ осуществлени€ трансфекции.
в) ќбразование тройного комплекса
“ройной комплекс ƒЌ , содержащий аденовирус и трансферин, получают следующим образом. Ѕиотинилированный аденовирус (примерно 109 вирусных частиц) смешивают с 800 нг модифицированного стрептавидином полилизина. ѕо истечении 30 минут при комнатной температуре раствор смешивают с 6 мкг плазмидной ƒЌ  в 170 мл HBS, инкубируют в течение 30 минут, после чего добавл€ют 10 мкг конъюгата полилизина и трансферина TfpL 190¬ в 200 мкл HBS. ѕо истечении дальнейших 30 минут раствор примен€ют дл€ осуществлени€ трансфекции.
г) ќпределение β-галактозидазы
 летки BNL CL. 2 засеивают на покровных стеклах и через 24 часа клетки трансфецируют репортерным геном pCMV-β-gal. „ерез 48 часов определ€ют содержание β-галактозидазы.
ѕримен€емые дл€ переноса двойные комплексы. Ѕиотинилированный аденовирус объедин€ют с модифицированным стрептавидином полилизином. јльтернативно аденовирус ковалентно св€зывают с полилизином при помощи трансглутаминазы.  онъюгат аденовируса и полилизина добавл€ют к ƒЌ  в услови€х, обеспечивающих образование комплекса между ƒЌ  и полилизином. ѕри этом нейтрализуетс€ определенна€ часть (примерно 1/4) отрицательных зар€дов ƒЌ . «атем рассчитанное количество полилизина добавл€ют с тем, чтобы нейтрализовать остаток отрицательных зар€дов.  омплексы, состо€щие из ƒЌ , св€занные с конъюгатом аденовируса и полилизина и с полилизином, далее обозначаютс€ как двойные комплексы переноса.
¬ основном существуют два пути получени€ двойных комплексов переноса. ƒЌ  можно сначала св€зывать со стрептавидинилированным полилизином и затем с биотинилированным аденовирусом, или же аденовирус сначала св€зывают с полилизином и затем перевод€т в комплекс ƒЌ . ѕоследний метод дает намного лучшие результаты, в частности при низкой концентрации ƒЌ . ѕоэтому этот подход представл€ет собой предпочтительный метод получени€ двойного и тройного комплексов.
“ройные комплексы переноса, содержащие трансферин.  онъюгаты аденовируса и полилизина добавл€ют к ƒЌ  в услови€х, обеспечивающих образование комплекса и нейтрализацию части (примерно 1/4) отрицательных зар€дов ƒЌ . «атем к комплексу добавл€ют рассчитанное количество конъюгата трансферина и полилизина с тем, чтобы нейтрализовать остаток отрицательных зар€дов ƒЌ .  омплексы, состо€щие из ƒЌ , конъюгатов аденовируса и полилизина и трансферина и полилизина, далее обозначаютс€ как тройные комплексы. ¬ принципе такой тройной комплекс должен обладать способностью к включению клеткой в результате св€зывани€ с клеточными рецепторами аденовируса или рецепторами трансферина.
—в€зь между конденсатами ƒЌ  и аденовирусом существенно улучшает экспрессию репортерного гена люциферазы. ‘изическую св€зь между аденовирусным штаммом d1312 и полилизином можно осуществл€ть либо за счет инкубации обоих компонентов вместе с трансглутаминазой, либо за счет биотинилировани€ аденовируса и стрептавидинилировани€ полилизина. Ёффект такого св€зывани€ на эффективность трансфекции четко показан на фиг. 32, где представлены результаты инкубации гепатоцитов вместе с комплексами ƒЌ  и конъюгата трансферина и полилизина (TfpL) в присутствии хлорохина или в присутствии аденовируса (AdV + TfpL). “рансферинова€ инфекци€, т.е. способствуема€ трансферином трансфекци€, в присутствии свободного аденовируса улучшаетс€ так, что приводит к типичному усилению высвобождени€ комплексов ƒЌ  и конъюгата трансферина и полилизина в клетки. ¬ случае комплексов pLAdV/TpfL аденовирус сопр€жают с полилизином при помощи трансглутаминазы и затем подвергают взаимодействию с ƒЌ , что приводит к нейтрализации части отрицательных зар€дов ƒЌ . ѕотом добавл€ют конъюгат трансферина и полилизина дл€ нейтрализации остатка отрицательных зар€дов. “аким путем синтезируют тройной комплекс ƒЌ  и конъюгатов аденовируса и полилизина и трансферина и полилизина. ¬идно, что при этом можно достигать чрезвычайно высокой степени экспрессии люциферазы, т.е. 1,5 · 109 световых единиц люциферазы (примерно 5000 световых единиц на клетку). ¬ случае комплексов AdV + pL + TfpL аденовирус смешивают с полилизином тем же образом, что и в случае обработки трансглутаминазой. — целью вы€снени€ специфичности способствуемого трансглутаминазой св€зывани€ полилизина с вирусом, процесс осуществл€ют в отсутствие фермента. «атем препарат вируса перевод€т в комплекс с тем же количеством ƒЌ  и TfpL, что и в комплексах pLAdV/TfpL. ¬ этом случае трансфекци€ €вл€етс€ умеренной также как и в случае содержащих AdV и TfpL комплексов, так как в обоих экспериментах взаимное размещение вируса, трансферина и ƒЌ  представл€ет собой случайный процесс, тогда, как в случае содержащих pLAdV и TfpL комплексов включение клеткой обеспечиваетс€ физическим св€зыванием вируса с ƒЌ  в тройном комплексе. ѕри этом достигаетс€ высока€ степень трансфериновой инфекции.
“рансфекци€ клеток  562 показывает эндосомолитические свойства аденовируса. „еловеческа€ эритролейкозна€ клеточна€ лини€  562 содержит примерно 150000 рецепторов трансферина.  ак уже указывалось выше, в присутствии хлорохина эти клетки можно подвергать высокоэффективной трансфериновой инфекции в результате обработки комплексами репортерной ƒЌ  и конъюгата полилизина и трансферина даже в отсутствие аденовируса (TfpL, фиг. 33). “е же самые комплексы с добавленным свободным аденовирусом (AdV/TfpL), но в отсутствие хлорохина, обеспечивают лишь относительно небольшую степень экспрессии репортерного гена, предположительно из-за того, что клетки  562, также как и другие клетки крови, имеют низкое число рецепторов аденовируса. ≈сли же аденовирус св€зывают с полилизином через биотиново-стрептавидиновый мостик и репортерную ƒЌ  полностью конденсируют добавлением соответствующего количества полилизина дл€ получени€ тройного комплекса (pLAdV/pL), то степень поддерживаемой аденовирусом трансфекции €вл€етс€ средней. ѕредполагаетс€, что небольшое число рецепторов аденовируса на клетках  562 используетс€ эффективным образом. ќднако если св€занную с аденовирусом и полилизином репортерную ƒЌ  полностью конденсируют и нейтрализуют добавлением конъюгата трансферина и полилизина дл€ получени€ тройного комплекса pLAdV/TfpL и имеютс€ многочисленные клеточные рецепторы трансферина, то благодар€ эффективному св€зыванию трансферина и эндосомолитическим свойствам вируса эффективность трансфекции увеличиваетс€ по меньшей мере на 2 пор€дка (см. фиг. 33).
“ройные комплексы ƒЌ  обеспечивают экспрессию репортерного гена почти во всех гепатоцитах. Ёффективность предлагаемых комплексов ƒЌ  также исследуют на мышиных гепатоцитах (BNL CL.2) за счет определени€ процента их трансфекции. ѕри этом в качестве репортерного гена примен€ют ген β-галактозидазы под контролем промотора CMV. ѕосле фиксации клеток определ€ют активность β-галактозидазы.
Ќа фиг. 34 представлены результаты анализа активности β-галактозидазы в случае мышиных гепатоцитов после ј) трансфериновой инфекции в присутствии хлорохина, ¬) трансфериновой инфекции в присутствии свободного аденовируса d1312 и —) трансфекции тройным комплексом, состо€щим из аденовируса d1312, полилизина, трансферина и репортерной ƒЌ . ѕосле обычной трансфериновой инфекции репортерного ƒЌ  в отсутствие аденовируса только несколько клеток про€вл€ют экспрессию репортерного гена. ѕроцентна€ трансфекци€ составл€ет менее 0,1%. ≈сли добавл€ть хлорохин, то процент трансфекции повышаетс€ примерно до 0,2% (см. фиг. 34ј). ¬ случае присутстви€ свободного аденовируса 5-10% клеток экспримируют репортерный ген (см. фиг. 34¬), тогда как тройные комплексы, включающие модифицированные трансглутаминазой вирусы, обеспечивают экспрессию почти во всех клетках (см. фиг. 34—). “ак как тройной комплекс можно примен€ть в высоко-разбавленном виде, токсичный эффект, который наблюдаетс€ в случае высоких доз свободного (инактивированного) аденовируса, обычно не имеет место. Ќо следует отметить, что в случае применени€ тройного комплекса в высокой концентрации, обеспечивающей вовлечение в процесс 100% клеток, подобный токсичный эффект начинает про€вл€тьс€. “оксичные эффекты могут €вл€тьс€ результатом остаточной активности вирусного гена, эндосомолитических свойств добавл€емого вируса или же могут просто €вл€тьс€ причиной очень высокого уровн€ экспрессии трансфецированного гена.
Ёкспресси€ трансфецированного репортерного гена €вл€етс€ временным €влением, но продолжаетс€ недел€ми в недел€щихс€ гепатоцитах. ѕолучают тройные комплексы (pLAdV/TfpL), включающие модифицированный полилизином аденовирус d1312 и модифицированный аденовирус d1312, инактивированный обработкой псораленом. јналогично опыту по фиг. 34¬ 2/3 сливающейс€ клеточной культуры гепатоцитов трансфецируют репортерным геном люциферазы CMVL и активность люциферазы определ€ют в разные моменты.  ак видно на фиг. 35, активность люциферазы €вл€етс€ максимальной через три дн€, то есть в момент сли€ни€ клеточной культуры и прекращени€ делени€ клеток. Ёкспресси€ репортерного гена продолжаетс€ в недел€щихс€ клетках по меньшей мере в течение 6 недель без необходимости отбора дл€ обеспечени€ жизнеде€тельности гена, в частности тогда, когда инактивированный обработкой псораленом аденовирус примен€етс€ дл€ образовани€ тройного комплекса.
ѕример 24. ѕрименение куриного аденовируса CELO дл€ улучшени€ переноса ƒЌ  в клетки человека.
2 мл куриного аденовируса CELO (штамм Phelps, серотип FAV-1,7) подвергают гель-фильтрации в колонке PD-10, которую предварительно уравновешивают буфером 20 мћ HEPES с pH 7,3 и буфером 150 мћ хлористого натри€, содержащим 10% глицерина. 2 мл получаемого элюата подвергают взаимодействию с 20 мкл 1 мћ биотина марки NHS-LC при комнатной температуре в течение 3 часов. ѕолучаемый биотинилированный вирус подвергают диализу с применением 3 х 300 мл буфера HBS, содержащего 40 % глицерина, при температуре 4oC, после чего аликвоты вируса хран€т при температуре -70oC.  летки HeLa (5 · 105 клеток на чашку диаметром 6 см) в 2 мл среды DMEM, содержащей 2% “Ё—, инкубируют с 6 мкг плазмиды pCMVL, имеющейс€ в виде комплекса с полилизином (pL) или конъюгатом трансферина и полилизина (TfpL) в 500 мкл буфера HBS (комплекс предварительно инкубируют при комнатной температуре в течение 30 минут). «атем пробы добавл€ют к клеткам при температуре 37oC в присутствии вируса, вз€того в количестве, указанном на рис. 36. ¬ случае проб, содержащих биотинилированный вирус CELO, указанное количество вируса предварительно инкубируют вместе с указанным количеством модифицированного стрептавидином полилизина (StpL) в 200 мкл буфера HBS при комнатной температуре в течение 30 минут, после чего добавл€ют 6 мкг плазмиды pCLus в 100 мкл HBS. ѕосле 30-минутной инкубации при комнатной температуре указанное количество содержащего TfpL комплекса добавл€ют к клеткам при температуре 37oC. „ерез 2 часа к клеткам добавл€ют 5 мл среды DMEM, содержащей 10% “Ё—, а по истечении 24 часов клетки собирают и подают на определение активности люциферазы. –езультаты опыта представлены на фиг. 36.
 ак видно на фиг. 36, вирус CELO в свободном виде улучшает доставку ƒЌ  в клетки HeLa (см. следы 1 - 6). ќднако если вирус CELO модифицируют биотином и включают в комплекс вместе с стрептавидином, либо вместе с конъюгатом трансферина и полилизина, либо без него, то вирус обеспечивает улучшение доставки ƒЌ  в такой степени, которую можно сравнивать с тем случаем, когда примен€ют аденовирус d1312 человека. ƒанна€ лини€ клеток HeLa имеет большую емкость св€зывани€ включающих полилизин и ƒЌ  комплексов в отсутствие трансферина (ср. активность люциферазы проб 1 и 4 на фиг. 36). “аким образом включение вируса CELO в комплекс полилизина и ƒЌ  €вл€етс€ достаточным дл€ "пуска" поглощени€ вируса.
ѕример 25. “рансфекци€ миобластов
а) “рансфекци€ миобластов и миотрубочек включающими ƒЌ , трансферин и полилизин комплексами в присутствии свободного аденовируса и в присутствии биотинилированного и стрептавидинилированного аденовируса.
ћиобласты C2Cl2 (N ј“——: CRL 1772) и миобласты G8 (No ј“——: CRL 1456) выращивают в имеющей высокую концентрацию глюкозы среде DMEM, содержащей 10% “Ё—. ћиобластовые культуры подвергают трансфекции с подачей примерно 5 · 105 клеток на чашку диаметром 6 см.  ультуры миотрубочек получают за счет подачи миобластов в чашки диаметром 6 см (примерно 5 x105 клеток на чашку) и замены среды на имеющую высокую концентрацию глюкозы среду DMEM, содержащую 2% лошадиной сыворотки, при достижении сли€ни€ клеток. “рансфекцию миотрубочек осуществл€ют через 5 - 7 дней. »спользуемые дл€ трансфекции комплексы получают описанным в примере 19 образом с применением указанных на фиг. 37 количеств TfpL, StpL и биотинилированного аденовируса d1312. „ерез 20 часов после трансфекции клетки собирают дл€ определени€ активности люциферазы. –езультаты опыта представлены на фиг. 37, где активность люциферазы дл€ всей пробы указана в световых единицах. ¬идно, что как миобласты, так и миотрубочки можно трансфецировать с высокой эффективностью. ѕосле дифференциации в миотрубочки наблюдаетс€ снижение эффективности трансфекции на менее 1 log (в случае C2Cl2) или же значительного уменьшени€ не наблюдаетс€ (в случае G8). ¬ случае линии G8 участие в образовании миотрубочек имеет место с более низкой частотой, за что частично может быть ответственным отсутствие определ€емого уменьшени€ эффективности в дифференцированной культуре. ¬ случае данной клетки взаимодействие между трансферином и его рецептором в переносе ƒЌ  не €вл€етс€ решающим. ¬о всех 4 клеточных препаратах наблюдаетс€ лишь слаба€ доставка ƒЌ  при применении комплексов TfpL и ƒЌ  в присутствии свободного аденовируса d1312 (см. следы 1, 4, 7, 10). Ёффективность трансфекции повышаетс€ в присутствии биотинилированного аденовируса, модифицированного стрептавидином (см. следы 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11, 12). Ёффективность доставки, достигаема€ при применении комбинационного комплекса, включающего только вирус, pL и StpL, повышаетс€ менее чем на 1 log по сравнению с комплексами, которые включают только конъюгат трансферина и полилизина (TfpL) (ср., например, след 2 (без трансферина) со следом 3 (в присутствии трансферина)). ѕо поводу незначительной трансфекции в случае применени€ свободного вируса и высокой трансфекции в случае применени€ включающих св€занный вирус комплексов либо в присутствии, либо в отсутствие конъюгата трансферина и полилизина предполагаетс€, что аденовирус служит в качестве лиганда в этих клетках, а в случае отсутстви€ св€зывани€ свободный вирус может проникать в клетки, однако комплекс ƒЌ  и конъюгата трансферина и полилизина не проникает эффективно (в данном примере в качестве ƒЌ  примен€ют pCMVL).
б) √истохимический анализ частоты трансфекции в миотрубочках
јналогично стадии а) подготовл€ют культуры миотрубочек —2—l2 (5 · 105 клеток высеивают в чашки диаметром 6 см в качестве миобластов, которые потом дифференцируют в миотрубочки). 6 мкг ƒЌ  pCMV β-gal перевод€т в комплекс с 8 мкг TfpL в среде 500 мкл буфера HBS и добавл€ют к клеткам в присутствии 18 мкл аденовируса d1312 (1 · 1012 вирусов на мл) в 2 мл среды DMEM, содержащей 2% “Ё—.  роме того, 6 мкг ƒЌ  pCMVLacZ перевод€т в комплекс с 7 мкг TfpL и 800 нг StpL, включающего 18 мкл биотинилированного аденовируса d1312 (1 · 1012 вирусов на мл) в 500 мкл буфера HBS и добавл€ют к клеткам в 2 мл среды DMEM, содержащей 2% “Ё—. ѕосле 24-часовой инкубации клетки окрашивают описанным в примере 15 образом с тем, чтобы определить активность β-галактозидазы. –езультаты окрашенных проб согласуютс€ с результатами трансфекции с применением в качестве репортерного гена люциферазы (см. пункт а). ¬ случае применени€ свободного вируса наблюдаетс€ лишь очень низка€ экспресси€ гена в культурах миотрубочек, тогда как св€зывание вируса с ƒЌ  приводит к высокому уровню экспрессии гена. ѕрисутствие окрашенных в синий цвет канальцев указывает на успешный перенос гена в эти дифференцированные клетки в присутствии свободного аденовируса.
в) ѕеренос ƒЌ  в первичные мышиные миобласты и миотрубочки
ќсновные скелетные мышцы обеих задних ног мыши-самца породы —57¬1/6 в возрасте 4 недель стерильно изолируют в буфере PBS и разрезают на куски примерно 5 мм. “кань суспендируют в 20 мл буфера PBS, оставл€ют сто€ть в течение примерно 2 минут и надосадочную жидкость аспирируют. ”казанные операции повтор€ют 3 раза. «атем ткань смешиваетс€ с 3,5 мл буфера PBS, содержащего 0,5 мл трипсина /Ёƒ“” , 0,5 мл 1%-ной по весу коллагеназы и 0,5 мл 1%-ного ј—— (фракци€ V, в 4 мћ хлористого кальци€) и смесь подвергают инкубации при температуре 37oC в течение 30 минут с частым незначительным размешиванием. ѕосле 30-минутной инкубации оставшиес€ ткани дают осаждатьс€, надосадочную жидкость удал€ют и смешивают с 5 мл среды DMEM, включающей 20% “Ё—. »нкубацию с протеазой повтор€ют 3 - 4 раза до полной дисперсии ткани. ѕолучаемую суспензию клеток фильтруют и центрифугируют при 500 g в течение 15 минут. ѕродукт центрифугировани€ повторно суспендируют в 10 мл среды DMEM, содержащей 20% “Ё—, и фибропласты удал€ют за счет высеивани€ клеток на непокрытые чашки диаметром 15 см в течение 60 минут. Ќесв€занные клетки тщательно удал€ют и высеивают на 5 покрытых ламинином чашек ѕетри диаметром 10 см, кажда€ из которых содержит 15 мл среды DMEM, содержащей 20% “Ё—. ѕосле достижени€ сли€ни€ (примерно через одну неделю) клетки обрабатывают трипсином и снова высеивают на покрытые ламинином чашки ѕетри диаметром 6 см в количестве примерно 1 · 106 клеток на чашку. ƒл€ получени€ культур миотрубочек примерно через 5 дней (когда достигнуто сли€ние клеток) среду замен€ют на среду DMEM, содержащую 2% лошадиной сыворотки, и через одну неделю осуществл€ют процесс трансфекции.  ультуры миобластов подвергают трансфекции в чашках диаметром 6 см примерно при 80%-ном сли€нии.
ѕокрытые ламинином чашки приготовл€ют следующим образом. ¬ чашки подают 0,025 мг/мл полилизина с молекул€рным весом 30000 - 70000 в стерильной воде при комнатной температуре в течение 30 минут. «атем чашки промывают 3 раза стерильной водой и сушат воздухом. «атем чашки покрывают ламинином, подаваемым в воде в количестве 8 мкг/мл, при комнатной температуре в течение ночи, после чего чашки промывают 3 раза стерильной водой перед высеиванием клеток.
ѕримен€емые дл€ трансфекции комплексы ƒЌ  получают за счет разбавлени€ указанного на фиг. 38 количества биотинилированного аденовируса d1312, инактивированного обработкой псораленом и ультрафиолетовыми лучами (полученным описанным в примере 19 образом; на фиг.: "инакт. AdV") в 150 мкл буфера HBS и добавлени€ 1 мкг StpL в 150 мкл буфера HBS с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 30 минут. «атем к каждой пробе добавл€ют 100 мкл буфера HBS, содержащего 6 мкг pCMVL, с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 30 минут. ¬ конце концов к каждой пробе добавл€ют 7 мкг TfpL в 100 мкл буфера HBS, инкубируют при комнатной температуре в течение 30 минут и добавл€ют к культурам миобластов и миотрубочек в чашках диаметром 6 см, содержащих 2 мл среды DMEM, содержащей 2% “Ё—. ѕосле одночасовой инкубации среду замен€ют на 5 мл среды DMEM, содержащей 20% “Ё— (в случае миобластов), или на 5 мл среды DMEM, содержащей 2% лошадиной сыворотки (в случае миотрубочек). „ерез 48 часов осуществл€ют сбор клеток дл€ определени€ активности люциферазы. –езультаты опыта представлены на фиг. 38.
ѕример 26. ”лучшение переноса вируса CELO в миобласты с применением пектина в качестве лиганда
а) —опоставительный анализ аденовируса d1312 и вируса CELO в клетках HeLa и миобластах C2Cl2
—осто€щие либо из клеток HeLa либо из миобластов C2Cl2 пробы (5 · 105 клеток на чашку диаметром 6 см) подвергают трансфекции 6 мкг ƒЌ  pCMVL в виде комплекса с 1 мкг StpL/7 мкг TfpL и 5 мкл биотинилированного аденовируса d1312 (см. пример 19; 1 · 1012 частиц/мл) или 18 мкл биотинилированного вируса CELO (см. пример 24; 0,3 · 1012 частиц на мл). ѕосле 20-часовой инкубации клетки собирают дл€ определени€ активности люциферазы. –езультаты опыта представлены на фиг. 39.
“рансфекци€ в клетках HeLa может осуществл€тьс€ со сравнимой эффективностью как при применении состо€щих из аденовируса d1312 человека, StpL, TfpL и ƒЌ  комплексов, которые проникают в клетки либо при помощи рецептора аденовируса, либо при помощи рецептора трансферина, так и состо€щих из вируса CELO, StpL, TfpL и ƒЌ  комплексов, которые могут проникать в клетки при помощи рецептора трансферина. ѕеренос ƒЌ  в миобласты C2Cl2 может эффективно осуществл€тьс€ при применении включающих аденовирус d1312 комплексов, тогда как включающие вирус CELO комплексы €вл€ютс€ менее эффективными в этих клетках. –езультаты опытов по предыдущим примерам свидетельствуют о том, что рецептор трансферина играет лишь незначительную роль в процессе переноса комбинационного комплекса в эти клетки. ѕредполагаетс€, что рецептор аденовируса представл€ет собой основной сайт проникновени€. Ќезначительна€ активность вируса CELO в миобластах может представл€ть собой результат плохого св€зывани€ как вируса CELO, так и трансферина с миобластами C2Cl2.
б) ”лучшение трансфекции миобластов C2Cl2 вирусом CELO при применении агглютинина пшеничного зачатка в качестве лиганда
¬виду малоэффективного переноса в опыте по пункту а) трансферин замен€ют на новый лиганд, получаемый следующим образом.
Ѕиотинилированный вирус CELO (3 · 109 клеток) и 1 мкг биотинилированного агглютинина пшеничного зачатка (далее: "јѕ«") в 150 мкл буфера HBS смешивают с раствором 0,8 мкг StpL в 150 мкл буфера HBS и смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 30 минут. 6 мкг ƒЌ  pCMVL в 100 мкл буфера HBS добавл€ют к раствору вируса, јѕ« и StpL в 300 мкл HBS с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 30 минут. «атем к смеси добавл€ют 7 мкг TfpL в 100 мкл буфера HBS, после чего снова инкубируют при комнатной температуре в течение 30 минут. ѕолучаемые комплексы добавл€ют к миобластам C2Cl2 (5 · 105 клеток на чашку диаметром 6 см) в 2 мл среды DMEM, содержащей 2% “Ё—. „ерез час к клеткам добавл€ют 5 мл среды DMEM, содержащей 10% “Ё—, и по истечении 20 часов осуществл€ют сбор клеток дл€ определени€ активности люциферазы (в световых единицах). –езультаты опыта представлены на фиг. 40. Ќа этой фиг. видно, что в отсутствие вируса перенос ƒЌ  €вл€етс€ очень незначительным как в присутствии јѕ«, так и в его отсутствие (см. следы 1, 6). ѕеренос незначительной эффективности достигаетс€ при применении св€занного вируса CELO (см. след 2). Ќо 16-кратное повышение эффективности переноса достигаетс€ в случае включени€ в комплекс јѕ«. ”величение содержани€ јѕ« в комплексы (от 1 мкг до 5 мкг) приводит к незначительному снижению эффективности переноса (ср. следы 3 и 4), тогда как в результате увеличени€ содержани€ StpL в комплексе (от 1 мкг до 2 мкг) наблюдаетс€ незначительное повышение эффективности переноса (ср. следы 3 и 5). “аким образом, результаты данного опыта свидетельствуют о том, что јѕ« в качестве лиганда обеспечивает повышение эффективности переноса ƒЌ  в клетки C2Cl2 при помощи вируса CELO.
г) Ёкспресси€ гена полного фактора VIII в миобластах и миотрубочках C2Cl2
ѕолучение миобластов и миотрубочек C2Cl2 осуществл€ют описанным выше образом. “рансфекцию осуществл€ют с применением 6 мкг плазмиды, кодирующей кƒЌ  полного фактора VIII человека, в виде комплекса с 5 или 15 мкл биотинилированного аденовируса d1312, 0,5 или 1 мкг StpL и 7 или 6 мкг TfpL.  омплексы вируса и ƒЌ  добавл€ют к клеткам в среде DMEM, содержащей 2% “Ё—. ѕосле 4-часовой инкубации при температуре 37oC к каждой чашке добавл€ют 3 мл свежей среды DMEM, содержащей 10% “Ё—. ѕо истечении 18 часов осуществл€ют сбор клеток дл€ определени€ присутстви€ фактора VIII. ѕредставленные на фиг. 41 результаты указаны как милли-единицы за 24 часа на 1 · 106 клеток.
ѕрименение белка аденовируса дл€ переноса ƒЌ . јденовирус wt300 выращивают в клетках HeLa, очищают и биотинилируют описанным выше дл€ аденовируса d1312 образом. 1,2 мл вируса подвергают диализу с применением 3 х 300 мл 5мћ среды MES, содержащей 1 мћ Ёƒ“” , pH 6,25, при температуре 4oC в течение 18 часов. «атем осуществл€ют центрифугирование при 27 g в течение 30 минут с применением ротора типа SW60. Ќадосадочную жидкость осторожно удал€ют и остаток повторно суспендируют в буфере HBS, содержащем 40% глицерина.   надосадочной жидкости добавл€ют 20 мћ буфера HEPES с pH 7,4 и 150 мћ хлористого натри€ и как осадок (содержащий сердцевину вируса и основную массу гексонового капсида, на фиг. 42 обозначены как "серд."), так и фракции надосадочной жидкости (содержащие оболочки, обозначенные на фиг. 42 как "обол.") примен€ют дл€ определени€ активности переноса ƒЌ  в мышиных фибропластах Mov13 и клетках HeLa.
ќбразование включающего ƒЌ  комплекса осуществл€ют следующим образом. ”казанные на фиг. 42 количества каждой фракции, то есть разрушенный вирус перед центрифугированием и интактный вирус (выраженные как мкг белка согласно методу Ѕрэдфорда), разбавл€ют 300 мкл буфера HBS. «атем добавл€ют 3 мкг модифицированного стрептавидином полилизина в 50 мкл буфера HBS с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 30 минут. 6 мкг ƒЌ  pCMVL разбавл€ют 100 мкл буфера HBS и добавл€ют к первому раствору с последующей инкубацией в течение 30 минут. ¬ заключение добавл€ют 2 мкг TfpL в 100 мкл HBS с последующей инкубацией в течение дальнейших 30 минут. ƒл€ получени€ проб, содержащих только TfpL, 8 мкг TfpL в 170 мкл HBS смешивают с 6 мкг pCMVL в 330 мкл HBS при комнатной температуре в течение 30 минут. ”казанные количества белка вируса разбавл€ют 300 мкл HBS, после чего добавл€ют к включающим TfpL и ƒЌ  комплексам. ¬се пробы добавл€ют к 5 · 105 клеток HeLa или фибропластов Mov13, наход€щихс€ в чашках диаметром 6 см, содержащих 2 мл среды DMEM, содержащей 10% “Ё—, после чего пробы оставл€ют сто€ть в течение одного часа. «атем добавл€ют 5 мл свежей среды, содержащей 10% “Ё—, и через 20 часов осуществл€ют сбор клеток дл€ определени€ активности люциферазы в световых единицах. –езультаты опыта представлены на фиг. 42, где график ј относитс€ к опыту с применением клеток HeLa, а график ¬ - к опыту с применением фибропластов Mov13.
 ак видно на фиг. 42, при обоих типах клеток наблюдаетс€ завис€щее от дозы повышение активности переноса ƒЌ  в случае содержащей оболочку фракции (см. пробы 4-6 на обоих графиках). ≈сли же такое количество белка биотинилированного вируса включено в комплексы из TfpL и ƒЌ , которые не содержат модифицированного стрептавидином полилизина, то наблюдаетс€ степень переноса ƒЌ , близка€ к фоновому уровню (см. пробу 3 на обоих графиках).
ѕример 28. ”лучшенный перенос гена при применении тройных комплексов ƒЌ , включающих конъюгат галактозного лиганда и полилизина
а) “ройные комплексы, включающие конъюгат пептида гриппа
Ѕыло обнаружено, что в присутствии сопр€женного с полилизином пептида, включающего последовательности, производ€щиес€ от N-конца подединицей Ќј-2 гемагглютинина вируса гриппа, в комплексах ƒЌ  и конъюгата трансферина и полилизина приводит к значительному улучшению переноса гена, обеспечиваемого трансферином/полилизином (см. примеры 13, 14). ѕодобные комбинационные комплексы ƒЌ , включающие конъюгат полилизина и лиганда галактозы, а также модифицированного полилизином пептида гриппа (далее: "InflupL"; полученного описанным в примерах 6, 13 образом) получают путем добавлени€ конъюгата лиганда и полилизина к плазмидной ƒЌ  pCMVL с тем, чтобы нейтрализовать половину зар€да ƒЌ . ќстаток зар€да используют дл€ нагрузки комплексов конъюгатом полилизина и пептида гриппа. ƒобавление этих комплексов ƒЌ , включающих синтетический лиганд (gal)4, к гепатоцитам BNL CL.2 (трансфекцию осуществл€ют описанным в примере 6 ж) образом приводит к экспрессии гена люциферазы, котора€ значительно превышает экспрессию, получаемую с помощью трансферина в качестве лиганда (см. фиг. 43). Ёкспресси€ превышает больше чем в 500 раз экспрессию, обнаруживаемую в контрольных опытах с применением комплексов ƒЌ , которые содержат то же самое количество полилизина, но не содержат пептида гриппа (см. также фиг. 43). ƒостигаема€ комбинационными комплексами ƒЌ  активность также примерно в 30 раз больше активности, достигаемой комплексами ƒЌ  и (gal)4pL в присутствии хлорохина.
б) “ройные комплексы, включающие конъюгат аденовируса
 омплексы получают следующим образом. 2 мкл, 6 мкл и 18 мкл, соответственно, биотинилированного аденовируса d1312 (полученного как в примере 19) в количестве 1012 частиц на мл в 50 мкл HBS смешивают с 100 нг, 160 нг и 480 нг, соответственно, модифицированного стрептавидином полилизина в 100 мкл буфера HBS с последующей инкубацией в течение 30 минут. «атем добавл€ют раствор 6 мкг pCMVL в 200 мкл HBS и, через дальнейшие 30 минут, раствор 3,8 мкг (gal)4pL (полученного как в примере 6) или 7 мкг TfpL в 150 мкл HBS.
–астворы каждого комплекса ƒЌ  добавл€ют к 300000 клеткам (ј“—— “I¬73, ј“—— “I¬74, ј“—— “I¬75, ј“—— “I¬76), которые выращивают в чашках диаметром 6 см, содержащих среду DMEM, имеющую высокое содержание глюкозы и 2% “Ё—. ƒалее работают описанным выше образом. ƒанные по экспрессии гена (через 24 часа) представлены на фиг. 44.
ѕример 29. ѕеренос ƒЌ  с помощью конъюгата трансферина и полилизина в присутствии свободного и сопр€женного риновируса
а) ѕрепараты риновируса HRV-2
400 мкл раствора риновируса (примерно 30 мкг) в буфере HBS (150 мћ хлористого натри€ и 5 мћ HEPES, pH 7,9), содержащем 10% глицерина, обрабатывают 10 нмоль биотина марки NHS-LC. ѕосле инкубации при комнатной температуре в течение 3 часов вирус отдел€ют от невключенного биотина путем экстенсивного диализа с помощью буфера HBS, содержащего 40% глицерина, при температуре 4oC. ѕолучаемый путем выращивани€ в присутствии акридинового оранжевого (на фиг. 45 обозначенного как "акрид.") светочувствительный риновирус подвергают инактивации известным образом.
б) ѕолучение комплексов ƒЌ  и проведение трансфекции
1)  омплексы ƒЌ  и конъюгата трансферина и полилизина получают за счет смешивани€ раствора 6 мкг плазмидной ƒЌ  pCMVL в 330 мкл буфера HBS (150 мћ хлористого натри€, 20 мћ HEPES, pH 7,3) с раствором 8 мкг TfpL290 в 170 мкл HBS.  омплексы ƒЌ  смешивают с 1,5 мл среды DMEM, содержащей 2% “Ё—, и с 0,14 мкг - 3,5 мкг риновируса HRV-2 или инактивированного риновируса HRV-2. —меси добавл€ют к клеткам NIH 3“3 (300000 клеток на чашку диаметром 6 см). „ерез 4 часа среду замен€ют на 4 мл свежей среды DMEM, содержащей 10% “Ё—. „ерез 24 часа клетки собирают дл€ определени€ активности люциферазы описанным выше образом. –езультаты опыта представлены на фиг. 45ј.
2)  омбинационные комплексы ƒЌ , включающие конъюгат трансферина и полилизина и конъюгат риновируса и полилизина, получают следующим образом. –аствор 3,5 мкг биотинилированного риновируса HRV-2 в 100 мкл HBS смешивают с 1 мкг модифицированного стрептавидином полилизина в 100 мкл HBS. „ерез 30 минут при комнатной температуре раствор смешивают с 6 мкг плазмидной ƒЌ  в 150 мкл HBS, инкубируют при комнатной температуре в течение дальнейших 30 минут и затем смешивают с 6 мкг TfpL290 в 150 мкл HBS. јналогично получают другие комплексы, указанные на фиг. 45¬.  омплексы ƒЌ  смешивают с 1,5 мл среды DMEM, содержащей 2% “Ё—, и смесь добавл€ют к клеткам NIH 3“3 (300000 клеток на чашку диаметром 6 см). ƒалее поступают аналогично пункту 1). –езультаты опыта представлены на фиг. 45¬.
ѕример 30. “рансфекци€ клеток HeLa комбинационными комплексами, включающими св€занный ионным путем аденовирус.
—начала 30 мкл аденовируса d1312 (примерно 109 бл€шкообразующих единиц) смешивают с 1 мкг полилизина с молекул€рным весом 450, имеющего среднюю длину мономерных звеньев 450, в 170 мкл HBS. „ерез 30 минут при комнатной температуре к смеси добавл€ют 6 мкг ƒЌ  pCMVL в 170 мкл HBS. ѕосле инкубации в течение дальнейших 30 минут комплексы смешивают с 9 мкг TfpL190 в 170 мкл HBS. јликвот получаемого комплекса (10% = 50 мкл раствора 600 нг ƒЌ  или 1% = 5 мкл раствора 60 нг ƒЌ ) разбавл€ют 1,5 мл среды DMEM, содержащей 2% “Ё—, после чего добавл€ют к 300000 клеткам HeLa. „ерез 4 часа добавл€ют 2 мл среды DMEM, содержащей 20% “Ё—. „ерез 24 часа после трансфекции осуществл€ют сбор клеток дл€ определени€ активности люциферазы описанным выше образом. јктивность люциферазы общего экстракта составл€ет 29 115 000 световых единиц (в случае 600 нг ƒЌ ) или же 1090 000 световых единиц (в случае 60 нг ƒЌ ).
 онтрольный опыт.
6 мкг ƒЌ  pCMVL в 170 мкл HBS смешивают с 1 мкг полилизина с молекул€рным весом 450 (имеющего среднюю длину мономерных звеньев 450) в 170 мкл HBS и через 30 минут при комнатной температуре добавл€ют 9 мкг конъюгата TfpL190 в 170 мкл HBS. ѕосле 30-минутной инкубации комплексы смешивают с 30 мкл аденовируса d1312 (примерно 109 бл€шкообразующих единиц). јликвот получаемого комплекса (10 % = 50 мкл раствора 600 нг ƒЌ , или 1% = 5 мкл раствора 60 нг ƒЌ ) разбавл€ют 1,5 мл среды DMEM, содержащей 2% “Ё—, и добавл€ют к 300000 клеткам HeLa. „ерез 4 часа добавл€ют 2 мл среды DMEM, содержащей 20% “Ё—. —бор клеток осуществл€ют через 24 часа после трансфекции. ќпределение активности люциферазы осуществл€ют описанным выше образом. ќбща€ активность люциферазы составл€ет 405 000 световых единиц (в случае 600 нг ƒЌ ) и 200 световых единиц, соответственно, в случае 60 нг ƒЌ .
ѕример 31. ћестное введение включающего ƒЌ , аденовирус и конъюгат трансферина и полилизина комплекса в печень крысы.
а) Ќепосредственное впрыскивание
 омплексы получают описанным в примере 19 образом. ќни содержат 200 мкл биотинилированного аденовируса d1312, 6,4 мкг модифицированного стрептавидином полилизина, 48 мкг ƒЌ  pCMVL и 48 мкг конъюгата TfpL290.  омплекс содержитс€ в 200000 мкл HBS.  рысу-самца породы "Sprague-Dawley" весом 240 г анестезируют авертином, после чего осуществл€ют гревосечение 4 см. –аствор комплекса впрыскивают в левую долю печени. «атем рану закрывают. „ерез 48 часов после впрыскивани€ комплекса крысу умерщвл€ют и определ€ют экспрессию люциферазы. ¬ зоне впрыскивани€ определ€ют 5615 световых единиц/мг белка продукта гомогенизации печени. ќбща€ активность люциферазы на сайте впрыскивани€ составл€ет 370 600 световых единиц.
б) ¬ведение комплексов в печень через желчную дренажную систему
 омплексы получают следующим образом. 200 мкл биотинилированного аденовируса d1312 в 200 мкл HBS и 6,4 мкг модифицированного стрептавидином полилизина в 400 мкл HBS подвергают инкубации при комнатной температуре в течение 30 минут, после чего добавл€ют 48 мкг ƒЌ  pCMVL в 800 мкл HBS. ѕосле 30-минутной инкубации добавл€ют еще 48 мкг конъюгата TfpL в 900 мкл HBS.  рысы-самцы породы "Spraque-Dawley" весом 250 г анестезируют авертином, после чего брюшную полость открывают путем срединого разреза.  ишку перемещают на левую сторону корпуса и в желчный проток ввод€т иглу 27 G, подключенную к трубе и шприцу объемом 1 мл. ¬прыскивание комплексов осуществл€ют в течение 4 минут, после чего иглу вывод€т из желчного протока и место инъекции, а также рану закрывают. „ерез 30 часов крыс умерщвл€ют и из различных долей печени отбирают пробы на определение экспрессии гена люциферазы. ѕикова€ активность люциферазы составл€ет 19 000 световых единиц/мг белка, а рассчитанна€ обща€ экспресси€ в печени составл€ет 2,7 · 106 световых единиц.
ѕример 32. ћестное введение включающего ƒЌ , аденовирус и конъюгат трансферина и полилизина комплекса в пережатую мышиную хвостовую вену.  омплексы получают описанным в примере 19 образом. ќни включают 45 мкл биотинилированного аденовируса d1312, 0,8 мкг модифицированного стрептавидином полилизина, 6 мкг ƒЌ  pCMVL и 24 мкг конъюгата TfpL290. –аствор комплексов в 150 мкл HBS впрыскивают в хвостовую вену мыши-самца породы —3Ќ/Ќе (в возрасте 2 мес€цев) после предварительной анестезии авертином. Ќепосредственно после впрыскивани€ хвостовую вену пережимают на 20 минут на проксимальном и дистальном концах так, чтобы раствор комплекса находилс€ в той части хвостовой вены, в которую он впрыскивалс€, и не мог промыватьс€ кровью. „ерез 48 часов после впрыскивани€ мышь умерщвл€ют и хвостовую вену приготовл€ют к определению экспрессии люциферазы. ќна составл€ет 2600 световых единиц/3 см хвостовой вены.
ѕример 33. “рансфекци€ первичных клеток меланомы человека, ѕервичные клетки меланомы выдел€ют из меланомы, котора€ хирургическим путем удал€лась из пациента, за счет механического разрушени€ опухоли в среде RPM1 1640, содержащей 5% “Ё—, 2 мћ глютамина и антибиотики, и последующего прессовани€ ткани через стальное сито. ќпухолевые клетки промывают несколько раз путем центрифугировани€ и последующего повторного суспендировани€ и потом культивируют в колбах марки “25. „ерез 24 часа после выделени€ опухолевые клетки трансфецируют комбинационными комплексами, включающими 3 мкл, 9 мкл или 27 мкл биотинилированного аденовируса d1312 (1 · 1012 вирусных частиц/мл), 0,5 мкг модифицированного стрептавидином полилизина, 6 мкг ƒЌ  pCMVL и 7 мкг конъюгата TfpL290, примен€емым в виде раствора в 500 мкл HBS. „ерез 36 часов после трансфекции клетки собирают и определ€ют экспрессию люциферазы. –езультаты опыта представлены на фиг. 46.
ѕример 34. “рансфекци€ первичных фибробластов человека.  ожную ткань подают в чашку петри диаметром 6 см, содержащую среду DMEM, 2 мћ глютамина, 20% “Ё— и антибиотики. “кань тщательно режут на маленькие куски при помощи хирургического ножа и культивируют в присутствии 3 мл среды в течение 5 дней. «атем клетки промывают свежей средой DMEM, содержащей 2 мћ глютамина, 10% “Ё— и антибиотики, и культивируют в течение дальнейших 7 дней, после чего клетки обрабатывают трипсином и перевод€т на дальнейшее культивирование в новые чашки петри.  огда клетки €вл€ютс€ почти сливающимис€, они снова подвергаютс€ обработке трипсином и хран€т в замороженном состо€нии. ѕеред трансфекцией клетки размораживают и высеивают в чашки петри диаметром 6 см, в которых их культивируют в среде DMEM, содержащей 2 мћ глютамина, 10% “Ё— и антибиотики. —лужащие дл€ трансфекции комплексы получают следующим образом. 3 мкл, 10 мкл, 20 мкл и 30 мкл, соответственно, биотинилированного аденовируса d1312 и 0,1 мкг, 0,3 мкг, 0,5 мкг и 0,8 мкг, соответственно, модифицированного стрептавидином полилизина в 150 мкл HBS инкубируют в течение 30 минут при комнатной температуре. «атем добавл€ют 6 мкг плазмиды pCMY-β-gal в 170 мкл HBS и смесь инкубируют в течение дальнейших 30 минут. «атем добавл€ют конъюгат TfpL в 170 мкг HBS в следующих количествах: 7,8 мкг в случае комплекса, включающего 3 мкл аденовируса d1312, 7 мкг в случае комплекса, включающего 10 мкл аденовируса d1312, и 6 мкг в случае комплексов, включающих 20 мкл и 30 мкл аденовируса d1312. ѕосле 30-минутной инкубации комплексы добавл€ют к клеткам в 2 мл среды DMEM, содержащей 2 мћ глютамина, 2% “Ё— и антибиотики, и клетки инкубируют при температуре 37oC в течение 4 часов, после чего среду удал€ют и культивирование продолжают при температуре 37oC с применением среды DMEM, содержащей 2 мћ глютамина, 10% “Ё— и антибиотики. ѕо истечении 48 часов вышеуказанным образом определ€ют экспрессию β-галактозидазы.
¬ случае трансфекции комплексом, включающим 3 мкл аденовируса d1312, 14% клеток продуцируют β-галактозидазу. ¬ случае комплекса, включающего 10 мкл аденовируса d1312, получают 32% положительных клеток, в случае комплекса, включающего 20 мкл аденовируса d1312, - 39% положительных клеток, а в случае комплекса, включающего 30 мкл аденовируса d1312, - 64% положительных клеток.
ѕример 35. ѕеренос гена с применением невирусных эндосомолитических агентов.
а) —интез разрушающих мембрану пептидов
1) —интез пептида
—интез осуществл€ют при помощи автоматического аппарата типа ј¬I431ј путем твердофазного метода с применением 0,97 ммоль/г пара- алкоксибензиловой смолы в качестве твердой основы и защищенных 9- флуоренметоксикарбонилом аминокислот. јминокислоту с карбоксильной группой на конце св€зывают со смолой через симметричный ангидрид. ѕоследующие аминокислоты св€зывают с помощью 1-оксибензотриазол- дициклогексилкарбодиимида. ѕримен€ют следующие защищающие боковую цепь группы: (Trt)Asn, (Trt)Cys [(треть.-бутил)Cys в случае пептидов EALA и GLF], (треть.-бутил)Glu, (Trt)His, (треть.- бутил)Ser.
EALA: Trp Glu Ala Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala
Glu Ala Leu Ala Glu His Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala
Gly Gly Ser Cys
GLF Gly Leu Phe Gly Ala Leu Ala Glu Ala Leu
Ala Glu Ala Leu Ala Glu His Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys
GLF-II Gly Leu Phe Gly Ala Leu Ala Glu Ala Leu
Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cys
GLF-delta Gly Leu Phe Glu Leu Ala Glu Ala Leu Ala
Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala
Gly Gly Ser Cys
EALA-lnf Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu
Asn Gly Trp Glu Gly Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly
Gly Ser Cys
EALA-P50 Gly Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile Glu
Asn Gly Trp Glu Gly Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala
Gly Gly Ser Cys
P50 Gly Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile Glu
Asn Gly Trp Glu Gly Met Ile Asp Gly Gly Gly Cys
ѕептиды отдел€ют от резины и защищающие боковую цепь группы [за исключением (треть.-бутил) Cys] удал€ют за счет обработки нагруженной 100 мг пептида основы, вз€той в количестве 3 мл смесью фенола, этандитиола, тионизола, воды и трифтор-уксусной кислоты в объемном соотношении 0,75:0,25:0,5:0,5:10 при комнатной температуре в течение 90 минут. —ырые пептиды осаждают в простом диэтиловом эфире и промывают два раза. «ащищенные трет.- бутилмеркаптогруппой пептиды EALA и GLF раствор€ют в небольшом объеме 1ћ бикарбоната триэтиламмони€ с pH 8, разбавл€ют до объема 100 мћ бикарбоната триэтиламмони€ и далее очищают путем обратнофазной жидкостной хроматографии под давлением на колонке Ќуклеосил 500-5—4 с применением в качестве градиента 0,1% трифторуксусной кислоты и ацетонитрила. ќба пептида элюируют примерно при 50% ацетонитрила. —вободную форму Cys-SH пептидов получают за счет сн€ти€ защитных групп Trt аналогично вышеуказанному методу. ѕолучают 5 мг сырых пептидов, которые раствор€ют в 100 мкл раствора 100 мћ бикарбоната триэтиламмони€ с pH 8, содержащего 1 мкл β-меркаптоэтанола, и очищают путем гель-фильтрации на колонке —ефадекс √-25 (100 мћ бикарбоната триэтиламмони€, 0,5 мћ Ёƒ“” ) и сушки замораживанием или же ионнообменной хроматографии на колонке Mono Q (20 мћ HEPES, pH 7,3, градиент: 0-3 ћ хлористого натри€; пептид элюируют при 1,5 ћ NaCl).
2) ћодификаци€ N-(оксиэтил)малеинимидом
ѕосле получени€ свободной меркаптоформы в результате гель- фильтрации на колонке —ефадекс √-25 (20 мћ HEPES, pH 7,3, 0,5 мћ Ёƒ“” ) C-концевую меркаптогруппу пептидов GLF-delta, GLF-II, EALA- Inf, EALA-P50 и –50 блокируют путем взаимодействи€ с вз€тым в 1,3-10-кратном мол€рном избытке N-(оксиэтил)-малеинимидом при комнатной температуре в течение одного часа. »збыточный малеинимид удал€ют путем гель-фильтрации на колонке —ефадекс √-25 (100 мћ бикарбоната триэтиламмони€, pH 8) и после сушки замораживанием получают пептиды GLF-delta-mal, GLF-II-mal, EALA-Inf-mal, EALA-P50- mal, –50-mal в виде триэтиламмониевой соли.
3) ћодификаци€ 2,2'-дитиобиспирид ином
ѕептиды со свободной меркаптогруппой подвергают взаимодействию с 10 эквивалентами 2,2'-дитиобиспиридина в среде буфера 20 мћ HEPES с pH 7,9, содержащего 0,5 мћ Ёƒ“” , при комнатной температуре в течение ночи. »збыточный реагент удал€ют путем гель-фильтрации на колонке —ефадекс √-25 (100 мћ бикарбоната триэтиламмони€ с pH 8) или ионообменной хроматографии на колонке Mono Q (20 мћ HEPES, pH 7,3, градиент: 0-3 ћ хлористого натри€; пептид элюируют при 1,5 ћ NaCl). ѕолучают (2-пиридилтио)-Cys-пептиды GLF-delta-SSPy, GLF-H- SSPy, EALA-Inf-SSPy, EALA-P50-SSPy и P50-SSPy.
4) ƒимеризаци€ пептидов
√омодимерный –50 (–50 dim) получают путем взаимодействи€ эквимол€рных количеств –50-Cys-(2-пиридилтио) и P50-Cys-SH в среде 20 мћ HEPES, pH 7,3 при комнатной температуре в течение 3 дней. –еакционную смесь раздел€ют на колонке Mono Q HR-5/5 (20 мћ HEPES, pH 7,3, градиент: 0,09 - 3 ћ хлористого натри€; димерный –50 элюируют при 1,1 ћ NaCl). √етеродимерный GLF-SS- –50 получают аналогичным образом путем взаимодействи€ пептида –50 в свободной меркаптоформе с модифицированным пиридилтио-группой пептидом GLF.
б) ќпределение лизиса липосом
—пособность синтетических пептидов к разрушению липосом исследуют за счет определени€ выделени€ флуоресцентного красител€ из липосом, нагруженных самогас€щей концентрацией кальцеина. Ћипосомы получают из €ичного фосфатидилхолина путем обратнофазного упаривани€ из водной фазы, содержащей 100 мћ кальцеина, 375 мћ натриевых ионов, 50 мћ хлористого натри€, имеющего pH 7,3, и последующего пропускани€ через поликарбонатный фильтр с величиной пор 100 нм. «атем липосомы очищают путем гель-фильтрации на колонке —ефадекс √-25 с применением изо-осмотического буфера (200 мћ хлористого натри€, 25 мћ HEPES, pH 7,3). ƒл€ определени€ лизиса при разных значени€х pH основной раствор липосом (6 мкл/мл) разбавл€ют буфером, содержащим 400 мћ хлористого натри€ и 40 мћ цитрата натри€. јликвот 100 мкл добавл€ют к 80 мкл имеющего разную степень разведени€ водного раствора пептида в снабженной 96 €чейками пластинке микротитратора (конечна€ концентраци€ липида: 25 мкмоль) и после 30-минутной инкубации при комнатной температуре определ€ют флуоресценцию кальцеина при 600 нм (возбуждение при 490 нм). 100%-ный лизис получают за счет добавлени€ 1 мкл 10%-ного раствора тритона X-100. ≈диницы лизиса рассчитывают как реципрокное значение концентрации пептида, при которой устанавливают 50% лизиса (то есть объем (мкл) раствора липосом, который подвергают 50%-ному лизису на мкг пептида). «начени€ ниже 20 единиц €вл€ютс€ результатом экстрапол€ции. –езультаты опыта представлены на фиг. 47, где видно, что пептиды GLF и EALA про€вл€ют наивысшую специфичную в отношении pH активность.
в) ќпределение гемолиза
—вежие эритроциты человека промывают несколько раз буфером HBS и повторно суспендируют в содержащем 300 мћ хлористого натри€ и 30 мћ цитрата натри€ буфере при концентрации 6,6 · 107 /мл. јликвот 75 мкл добавл€ют к 75 мкл имеющего разную степень разведени€ водного раствора пептида в снабженной 96 €чейками пластинке микротитратора и инкубируют при температуре 37oC в течение одного часа при посто€нном взбалтывании. ѕосле удалени€ нерастворившихс€ эритроцитов путем центрифугировани€ при 1000 об./мин в течение 5 минут получают 100 мкл надосадочной жидкости, которую подают в новую пластинку микротитратора, после чего определ€ют абсорбцию гемоглобина при 450 нм (коррекци€ фона при 750 нм). 100%-ный лизис определ€ют путем добавлени€ 1 мкл 10%-ного раствора тритона X-100 перед центрифугированием. ≈диницы гемолизиса рассчитывают как реципрокные значени€ концентрации пептида, при которой обнаруживают 50%-ный лизис (то есть объем (мкл) раствора эритроцитов, который подвергают 50%-ному лизису на мкг пептида). «начени€ ниже 3 единиц гемолиза €вл€ютс€ результатом экстрапол€ции. –езультаты опыта представлены на фиг. 48, где видно, что пептиды –50 dim и EALA-–50 mal про€вл€ют наивысшую, специфичную в отношении pH активность по лизису клеток и/или высвобождению больших молекул, таких, как, например, гемоглобин. ћономерные –50 mal и –50 SS-Py про€вл€ют низкую активность. ћелиттин про€вл€ет наивысшую активность, котора€, однако, не €вл€етс€ специфичной в отношении кислых величин pH.
г) ѕолучение включающих ƒЌ  комбинационных комплексов
6 мкг ƒЌ  pCMVL в 150 мкл HBS смешивают с 4 мкг конъюгата TfpL290 в 150 мкл HBS и через 30 минут при комнатной температуре добавл€ют 4 - 20 мкг поли(L)-лизина с молекул€рным весом 290 в 100 мкл HBS. ѕо истечении дальнейшей 30-минутной инкубации при комнатной температуре добавл€ют 0,3 - 30 мкг пептида в 100 мкл HBS, после чего инкубируют еще в течение 30 минут. ќптимальное количество эндосомолитического агента предварительно определ€ют с учетом результатов анализа эффективности переноса гена (см. таблицу, показывающую перенос гена в клетки BNL CL.2). ќдновременное добавление полилизина (pL) и эндосомолитического агента, а также применение большего объема комбинационного комплекса (конечный объем: 1,5 мл) привод€т к сравнимой или лучшей эффективности трансфекции. ¬ данном опыте также установлено, что непептидные амфипатические вещества дезоксихолева€ кислота и олеинова€ кислота могут также улучшить перенос ƒЌ .
г) “рансфекци€ клеток
ѕрилипшие клеточные линии (гепатоциты BNL CL.2 и клетки NIH 3“3, соответственно) выращивают в чашках ѕетри диаметром 6 см за 1-2 дней до трансфекции (среда: DMEM с 10 % “Ё—; 300000 клеток на чашку). —реду удал€ют и добавл€ют 1,5 мл среды DMEM, содержащей 2% “Ё—, и 500 мкл комплекса. јльтернативно примен€ют 0,5 мл среды DMEM, содержащей 6% “Ё—, и 1,5 мл комплекса. ѕосле 4-часовой инкубации добавл€ют 2 мл среды DMEM, содержащей 18% “Ё—. јльтернативно среду трансфекции можно также замен€ть на 4 мл среды DMEM, содержащей 10% “Ё—. „ерез 24 часа после трансфекции осуществл€ют сбор клеток на определение активности люциферазы в световых единицах. –езультаты трансфекции гепатоцитов BNL CL.2 представлены на фиг. 49, показывающей общую активность люциферазы в трансфецированных клетках. ѕри этом примен€емые в опыте согласно фиг. 49ј. комплексы получают следующим образом. 6 мкг ƒЌ  pCMVL в 250 мкл HBS смешивают с 4 мкг конъюгата TfpL290 в 250 мкл HBS и через 30 минут при комнатной температуре добавл€ют 20 мкг поли(L)лизина с молекул€рным весом 290 в 750 мкл HBS. ѕосле дальнейшей инкубации в течение 30 минут при комнатной температуре добавл€ют указанные количества пептидов в 250 мкл HBS. ѕосле дальнейшей 30-минутной инкубации получаемые комплексы смешивают с 0,5 мл среды DMEM, содержащей 6% “Ё—, и добавл€ют к 450 000 клеткам.
ѕримен€емые комплексы ƒЌ  в опыте согласно фиг. 49¬ получают следующим образом. 6 мкг ƒЌ  pCMVL в 500 мкл HBS смешивают с 4 мкг конъюгата TfpL290 в 250 мкл HBS и раствор оставл€ют сто€ть при комнатной температуре в течение 30 минут. –аствор 20 мкг поли(L)лизина с молекул€рным весом 290 в 500 мкл HBS смешивают с указанными количествами пептидов в 250 мкл HBS и сразу же добавл€ют к смеси конъюгата TfpL и ƒЌ . ѕосле 30-минутной инкубации при комнатной температуре комплексы смешивают с 0,5 мл среды DMEM, содержащей 6% “Ё—, и добавл€ют к 450 000 клеткам. „ерез 24 часа после трансфекции осуществл€ют сбор клеток и определение активности люциферазы описанным выше образом.
–езультаты опытов с применением клеток NIH3T3 представлены на фиг. 50. ѕримен€емые в опытах согласно фиг. 50ј. и ¬. комплексы получают тем же образом, что и комплексы дл€ осуществлени€ опытов по фиг. 49ј. и ¬. Ќа фиг. 49 и 50 видно, что комплексы, включающие –50 dim, про€вл€ют наибольшую активность.
ѕример 36. ѕеренос гена с применением синтетического невирусного пептида с олигилизиновым удлинением на C-конце
ѕептид последовательностью Met Ala Gln Asp Ile Ile Ser Thr Ile Gly Asp Leu Val Lys Tip Ile Ile Asp Thr Val Asn Lys Phe Thr Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys синтезируют и очищают известными приемами. Ётот пептид производитс€ от δ-токсина Staphylococcus aureus последовательностью Met Ala Gln Asp Ile Ile Ser Thr Ile Gly Asp Leu Val Lys Trp Ile Ile Asp Thr Val Asn Lys Phe Thr Lys Lys. Ётот пептид обладает способностью к разрушению мембран при кислых значени€х pH, если он удлинен на дополнительные 10 лизиновых остатков.
6 мкг ƒЌ  pCMVL в 170 мкл HBS смешивают с 4 мкг конъюгата TfpL290 в 170 мкл HBS. „ерез 30 минут при комнатной температуре добавл€ют примерно 3 мкг пептида в 170 мкл HBS. ѕосле 30-минутной инкубации получаемый комплекс смешивают с 1,5 мл среды DMEM, содержащей 2% “Ё—, и добавл€ют к 450 000 гепатоцитам BNL CL.2. ѕо истечении 2 часов добавл€ют 2 мл среды DMEM, содержащей 20% “Ё—. „ерез 24 часа после трансфекции осуществл€ют сбор клеток дл€ определени€ активности люциферазы описанным выше образом. ¬ общем экстракте она составл€ет 481000 световых единиц.
ѕример 37. “рансфекци€ гепатоцитов в присутствии мелиттиновых пептидов, имеющих олиголизиновый хвост на C-конце.
ѕептиды последовательностей (от N-конца до C-конца): Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys (данный пептид далее обозначаетс€ как mel 1) и Gly Ile Gly Ala Val Leu Glu Val Leu Glu Thr Gly Leu Pro Ala Leu Ile Ser Trp lle Lys Arg Lys AArg Gln Gln Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys (кислый мутант, который далее обозначаетс€ как mel 2) синтезируют и очищают известными приемами.
6 мкг ƒЌ  pCMVL в 170 мкл HBS смешивают с 4 мкг конъюгата TfpL290 в 170 мкл HBS и оставл€ют сто€ть при комнатной температуре в течение 30 минут. «атем добавл€ют примерно 3 мкг пептида mel 1 или 5 мкг пептида mel 2 в 170 мкл HBS и после дальнейшей 30-минутной инкубации получаемый комплекс смешивают с 1,5 мл среды DMEM, содержащей 2% “Ё—, и добавл€ют к 450 000 клеткам BNL CL.2, которые предварительно выращивают описанным в примере 36 образом. ѕо истечении 4 часов добавл€ют 2 мл среды DMEM, содержащей 20% “Ё—. „ерез 24 часа после трансфекции осуществл€ют сбор клеток и определение активности люциферазы описанным выше образом. ¬ общем экстракте активность люциферазы составл€ет 9200 световых единиц (в случае пептида mel 1) и 9400 световых единиц (в случае пептида mel 2), соответственно.
ѕример 38. Ёкспресси€ альфа-интерферона в клетках HeLa.
5 · 105 клеток HeLa на чашку ѕетри диаметром 6 см подвергают трансфекции плазмидой pAD-CMV1-IFN, кодирующей интерферон альфа2с человека под контролем усилител€/промотора CMV (см. за€вку ƒ≈ 40 21 917 A; pADCMVI- IFN получают путем клонировани€ вставки Hindlll-XbaI/IFN- α 2c в pAD-CMV1). ѕробы по 6 мкг ƒЌ  в 330 мкл HBS смешивают с 8 мкг конъюгата TfpL в 330 мкл HBS и смесь оставл€ют сто€ть при комнатной температуре в течение 30 минут. ѕробы 6 - 10 содержат только 4 мкг конъюгата TfpL. ѕосле первой 30-минутной инкубации аликвот 20 мкг P16pL в 160 мкл HBS добавл€ют к пробам 6 и 7, а к пробам 8, 9 и 10 добавл€ют аликвот 20 мкг полилизина с молекул€рным весом 290. ѕосле дополнительной 30-минутной инкубации добавл€ют аликвоты 160 мкл буфера HBS, содержащего 10 мкл (в случае пробы 8) или 50 мкл (в случае проб 9, 10) свободного –16 (синтез –16 и –16р1 описан в примере 13). ѕосле дополнительной 30-минутной инкубации пробы добавл€ют к клеткам HeLa в 2 мл среды DMEM, содержащей 2% “Ё— в присутствии следующих дополнительных веществ. ѕробы 2, 7 и 10 содержат 100 мкмоль хлорохина ("хл." на фиг. 51), пробы 3, 4 - соответственно 5 и 15 мкл аденовируса d1312 (1 · 1012 частиц/мл; "AdV" на фиг. 51), проба 5 - 15 мкл инактивированного псораленом аденовируса d1312 ("инак. ѕ— AdV" на фиг. 51). ѕробы 11, 12 и 13, содержащие только аликвоты вируса по пробам 3, 4 и 5, служат в качестве контрол€. „ерез два часа после трансфекции к клеткам добавл€ют 5 мл свежей среды DMEM, содержащей 10% “Ё—. „ерез 48 часов после трансфекции среду замен€ют на 2 мл свежей среды DMEM, содержащей 10% “Ё—. „ерез 72 часа после трансфекции осуществл€ют сбор клеток дл€ определени€ содержани€ интерферона с применением иммуноферментного твердофазного анализа. –езультаты опытов, то есть содержание интерферона в нг/мл, представлены на фиг. 51, где видно, что конъюгат TfpL про€вл€ет очень низкую активность по переносу интерферонового гена в эти клетки, что совпадает с результатами, достигнутыми при применении генов люциферазы и β-галактозидазы. ѕрисутствие хлорохина приводит к получению обнаруживаемого сигнала (примерно 7 нг/мл; см. пробу 2). јденовирус d1312 стимулирует перенос ƒЌ  в зависимости от примен€емой дозы (см. пробы 3 и 4). ќбработка клеток сравнимыми количествами вируса в отсутствие включающего ƒЌ  комплекса не приводит к получению обнаруживаемого сигнала интерферона (см. пробы 11, 12). ¬ результате трансфекции эндосомолитическим пептидом –16 по примеру 13 в виде конъюгата (см. пробы 6, 7) или же в качестве вещества, св€занного ионным путем с поверхностью комплекса ƒЌ  и конъюгата TfpL (см. пробы 8, 9 и 10), достигают обнаруживаемого уровн€ производства интерферона, который можно повышать при применении конъюгата этого пептида в присутствии хлорохина (см. пробу 7).
ѕример 39. ѕеренос гена в ¬-лимфобластомные клетки.
 онъюгаты человеческого иммуноглобулина √ или анти- человеческого иммуноглобулина √ и полилизина получают нижеописанным методом, причем сопр€жение осуществл€ют известными приемами путем введени€ дисульфидных мостиков после предварительной модификации сукцинимидилпиридилдитио-пропионатом.
а) ѕолучение конъюгатов анти-человеческого иммуноглобулина √ и полилизина, содержащего 300 лизиновых остатков (далее: полилизин 300)
  раствору 2 мг анти-человеческого иммуноглобулина √ козы в буфере HBS, состо€щего из 150 ћ хлористого натри€ и 20 мћ буфера HEPES и имеющего значение pH, равное 7,8, добавл€ют 14 мкл 5 мћ этанольного раствора сукцинимидилпиридилтио-пропионата. —месь оставл€ют сто€ть при комнатной температуре в течение 10 часов, после чего подвергают гель-фильтрации на ионите —ефадекс √-25 с применением в качестве элюента 100 мћ буфера HEPES, имеющего значение pH, равное 7,3. ѕолучают 1,3 мг анти-человеческого иммуноглобулина √, модифицированного 30 нмоль пиридилдитиопропионатных остатков. јналогичным методом осуществл€ют модификацию полилизина 300 сукцинимидилпиридилтио-пропионатом, и обработкой дитиотреитолом и последующей гель-фильтрацией перевод€т в форму, модифицированную свободными меркапто-группами. –аствор 12 нмоль полилизина 300, модифицированного 29 нмоль меркапто-групп, в 0,3 мл буфера HBS с исключением кислорода смешивают с вышеупом€нутым модифицированным анти-человеческим иммуноглобулином √, и полученную смесь оставл€ют сто€ть при комнатной температуре в течение ночи. «атем добавлением 5 ћ хлористого натри€ содержание хлористого натри€ в реакционной смеси довод€т до 0,6 ћ. ¬ыделение конъюгатов осуществл€ют путем ионообменной хроматографии на йоните марки Mono S HR 5/5 фирмы Pharmacia, Ўвеци€. ¬ результате диализа с применением 25 мћ буфера HEPES, pH 7,3, получают соответствующие конъюгаты, состо€щие из 0,33 мг анти-человеческого иммуноглобулина √, модифицированного 4 нмоль полилизина 300, причем мольное соотношение анти-человеческого иммуноглобулина √ и полилизина 300 составл€ет 1 : 2.
б) ѕолучение конъюгатов человеческого иммуноглобулина √ и полилизина 300
  раствору 19,5 мг (122 нмоль) антител I-4506 фирмы Sigma, DE, в 2 мл буфера HBS добавл€ют 39 мкл 1 мћ этанольного раствора сукцинимидилпиридилтио-пропионата. —месь оставл€ют сто€ть при комнатной температуре в течение 2,5 часов, после чего подвергают гель-фильтрации на йоните —ефадекс √-25 с применением в качестве элюента 100 мћ буфера HEPES с pH 7,9, в результате чего получают 19 мг (119 нмоль) человеческого иммуноглобулина √, модифицированного 252 нмоль пиридилдитиопропионатных остатков. јналогичным методом осуществл€ют модификацию полилизина 300 сукцинимидилпиридилтио- пропионатом, и обработкой дитиотреитолом с последующей гель- фильтрацией перевод€т в форму, модифицированную свободными меркапто-группами. –аствор 119 нмоль полилизина 300, модифицированного 282 нмоль меркапто-групп, в 1 мл буфера HBS с исключением кислорода смешивают с вышеупом€нутым модифицированным анти-человеческим иммуноглобулином √, и получаемую смесь оставл€ют сто€ть при комнатной температуре в течение ночи. «атем добавлением 5 ћ хлористого натри€ содержание хлористого натри€ в реакционной смеси довод€т примерно до 0,6 ћ. ¬ыделение конъюгатов осуществл€ют путем ионообменной хроматографии на йоните марки Mono S фирмы Pharmacia, Ўвеци€, причем в качестве элюента примен€ют 50 мћ буфера HEPES, pH 7,3 с солевым градиентом 0,6 ћ - 3 ћ хлористого натри€. ¬ результате диализа с применением буфера HEPES, pH 7,3, получают соответствующие конъюгаты, состо€щие из 9 мг (57 нмоль) антитела, модифицированного 90 нмоль полилизина 300. ѕри этом мольное соотношение антитела и полилизина 300 составл€ет 1 : 1,6.
в) ќбразование комплексов и трансфекци€
 омплексы получают следующим образом: 30 мкл биотинилированного аденовируса d1312 (1012 частиц на мл) в 50 мкл буфера HEPES смешивают с 800 нг модифицированного стрептавидином полилизина в 100 мкл буфера HBS. ѕосле инкубации в течение 30 минут добавл€ют раствор 9 мкг ƒЌ  pCMVL в 200 мкл буфера HBS. ≈ще раз инкубируют в течение 30 минут, после чего добавл€ют раствор 5,1 мкг полилизина 450 (pL), 10,2 мкг конъюгата TfpL, 12 мкг конъюгата человеческого иммуноглобулина √ и полилизина или 10 мкг конъюгата анти-человеческого иммуноглобулина √ и полилизина в 150 мкл буфера HBS.  омплексы ƒЌ  добавл€ют к 106 ¬-лимфобластомных клеток (клетки получают из периферийных моно€дерных клеток крови человека в результате иммортализации вирусом Ёпштейна и Ѕарра, выращиваемых в снабженной 24 €чейками чашке в 1 мл среды RPMI 1640 с 2% “Ё—). ƒальнейшую обработку клеток и опыты по определению активности люциферазы осуществл€ют описанным выше образом. ѕолученные данные по экспрессии гена (активность люциферазы в световых единицах) приведены на фиг. 52.
ѕример 40. “рансфекци€ комбинированными комплексами конъюгата аденовируса и полилизина, и конъюгата липопротеина низкой плотности и полилизина.
а) ѕолучение конъюгатов липопротеина низкой плотности и полилизина.
  раствору 10 мг (14,3 нмоль) липопротеина низкой плотности (условное сокращение на фиг. 53: LDL, продукт L-2139 с молекул€рным весом 3500000 фирмы Sigma, DE, диаметр частиц примерно 26 нм) в 2 мл буфера HBS добавл€ют 143 мкл 10 мћ этанольного раствора сукцинимидилпиридилтио-пропионата (1,43 мкмоль), и получаемую смесь оставл€ют сто€ть при комнатной температуре в течение 2 часов. ¬ результате гель-фильтрации на ионите —ефадекс √-25 (колонка размером 14 х 140 мм) с использованием в качестве элюента буфера HBS получают 3,2 мл раствора примерно 10 мг липопротеина низкой плотности, модифицированного 0,70 мкмоль пиридилдитиопропионатных остатков.   данному раствору добавл€ют 1,2 мл 5 ћ хлористого натри€ с тем, чтобы предотвратить образование осадка, которое иначе произошло бы при последующем добавлении полилизина. ѕолилизин 300 вышеописанным образом модифицируют сукцинимидилпиридилтио- пропионатом, и путем обработки дитиотреитолом и последующей гель- фильтрации перевод€т в форму, модифицированную меркапто-группами. –аствор модифицированного липопротеина низкой плотности в атмосфере аргона смешивают с раствором 0,33 мкмоль полилизина 300, модифицированного 0,76 мкмоль меркапто-групп, в 4 мл 2 ћ хлористого натри€ и 0,5 ћ буфера HEPES, pH 7,9, затем реакционную смесь оставл€ют сто€ть при комнатной температуре в течение 48 часов. ѕолучаемый реакционный раствор разбавл€ют добавлением стерильной воды до объема 32 мл (после чего концентраци€ хлористого натри€ составл€ет примерно 0,5 ћ), и его очищают путем ионообменной хроматографии на колонке Biorad Macroprep S, 10 х 100 мм, с использованием в качестве элюента 20 мћ буфера HEPES с градиентом 0,2- 3 ћ хлористого натри€. ‘ракции продукта получают при концентрации соли, составл€ющей 1,8 - 2,2 ћ, и их собирают. ¬ результате диализа с применением буфера HBS получают конъюгаты, состо€щие из 2,35 мг (3,4 нмоль) липопротеина низкой плотности, модифицированного 190 нмоль полилизина, что соответствует 7,5 мг свободной основной формы полилизина. “аким образом липопротеин низкой плотности модифицирован 55 полилизиновых остатков.
б) ѕолучение комплексов и трансфекци€
18 мкл биотинилированного аденовируса d1312/16 разбавл€ют добавлением буфера HBS до объема 100 мкл.  роме того, к 1,2 мкг полилизина, модифицированного стрептавидином, добавл€ют буфер HBS до объема 100 мкл, и смешивают с указанным аденовирусом. ѕо истечении 30 минут добавл€ют 150 мкл буфера HBS, содержащего 6 мкг ƒЌ  pCMVL. ѕо истечении дальнейших 30 минут добавл€ют 300 мкл буфера HBS, содержащего 4 мкг конъюгата LDLpL (с содержанием полилизина, составл€ющим 20 мкг). ѕолучаемый раствор размешивают с 1,5 мл DMEM (10 % “Ё—) и прибавл€ют к 3 · 105 первичных клеток меланома, получаемых по примеру 33 и обозначаемых Ќћћ1 и Ќћћ4, наход€щихс€ в инкубационной чашке диаметром 6 мм. ƒальнейшие операции по выращиванию клеток и определение активности люциферазы осуществл€ют описанным в примере 33 образом. ƒанные по экспрессии гена приведены на фиг. 53; часть ј) фиг. показывает результаты, получаемые в опытах с клетками меланома Ќћћ1. ¬се опыты осуществл€ют с конъюгатами AdpL, не приведенными на данной фиг. ¬ части Ѕ) фиг. показаны результаты, получаемые в опытах с применением клеток меланома Ќћћ4. » в этом случае все опыты осуществл€ют с конъюгатами AdpL, которые приведены, однако, лишь отдельно в последнем столбце ("d1312/16" относитс€ к особенному препарату вируса). ¬ опыте, результаты которого приведены во втором столбце, примен€ют липопротеин низкой плотности в 25-кратном избытке, что из-за конкуренции относительно рецептора липопротеина низкой плотности приводит к уменьшению эффективности переноса гена.
ѕример 41. ѕеренос гена в эпителиальные клетки дыхательных путей крыс in vivo с помощью комбинированных комплексов
а) ѕолучение комбинированных комплексов ƒЌ  и конъюгатов TfpL и AdVpL
ѕутем сочетани€ 8 мкг конъюгата человеческого трансферина и полилизина (hTfpL) в 150 мкл буфера HBS, содержащего 150 ћм хлористого натри€ и 20 мћ буфера HEPES, pH 7,3, с 6 мкг ƒЌ  pCMVL в 350 мкл буфера HBS получают комплексы ƒЌ  и указанного конъюгата, которые инкубируют при комнатной температуре в течение 30 минут. јналогично описанному в примере 19в) методу получают конъюгаты аде- новируса и полилизина, причем используют аденовирус, инактивированный обработкой псораленом и ”‘-лучами.  омбинированные комплексы ƒЌ  и конъюгатов hTfpL и AdVpL получают согласно методу, описанному в примере 23в).
б) ¬ведение комплексов по внутритрахеальному пути в живой организм
ƒл€ осуществлени€ данного опыта используют крысы породы Sigmodon hispidus (т.н. "Cotton Rat"), которые представл€ют собой пригодные животные дл€ исследовани€ аденовирусных заболеваний легких у человека. ∆ивотные анестезируют метоксифлураном. Ќа брюшной стороне горла выполн€ют вертикальный разрез, после чего трахею препарируют. «атем крысы укладывают на бок под углом 45o, и 250 -300 мкл комплексов, содержащих 3 мкг ƒЌ , впрыскивают непосредственно в трахею. ѕо истечении после инъекции промежутков, указанных на фиг. 54, животных умерщвл€ют дачей двуокиси углерода, и трахею и св€занные с ней легкие удал€ют после предварительной промывки in situ холодным фосфатсодержащим раствором поваренной соли. ƒл€ определени€ активности люциферазы ткань легких гомогенизируют в среде буфера, получаемые экстракцией лизаты подвергают стандартизации относительно общего содержани€ протеина, и экспрессию гена люциферазы измер€ют вышеописанным образом. ”казанные световые единицы относ€тс€ к 1,250 мкг общего протеина, получаемого из лизатов легких. ќпыты осуществл€ют по 3-4 раза, результаты представл€ют собой средние значени€ ± среднее отклонение.
‘ормула изобретени€: 1. “рансфекционна€ композици€ дл€ высших эукариотных клеток, включающа€ комплекс нуклеиновой кислоты и вещества со сродством дл€ нуклеиновой кислоты, отличающа€с€ тем, что она дополнительно содержит эндосомолитический агент в эффективном количестве.
2. “рансфекционна€ композици€ дл€ высших эукариотных клеток по п.1, отличающа€с€ тем, что вещество со сродством дл€ нуклеиновой кислоты св€зано с содействующим поглощению клеткой фактором.
3. “рансфекционна€ композици€ дл€ высших эукариотных клеток по п.1, отличающа€с€ тем, что эндосомолитический агент представл€ет собой вирус или компонент вируса.
4. “рансфекционна€ композици€ дл€ высших эукариотных клеток по п.1, отличающа€с€ тем, что эндосомолитический агент включает св€зывающий нуклеиновую кислоту домен.
5. “рансфекционна€ композици€ дл€ высших эукариотных клеток по п.1, отличающа€с€ тем, что эндосомолитический агент представл€ет собой компонент комплекса нуклеиновой кислоты и вещества со сродством дл€ нуклеиновой кислоты.
6. “рансфекционна€ композици€ дл€ высших эукариотных клеток по п.5, отличающа€с€ тем, что комплекс включает содействующий поглощению клеткой фактор.
7. “рансфекционна€ композици€ дл€ высших эукариотных клеток по п.6, отличающа€с€ тем, что содействующий поглощению клеткой фактор св€зан с веществом со сродством дл€ нуклеиновой кислоты.
8. “рансфекционна€ композици€ дл€ высших эукариотных клеток по п.5, отличающа€с€ тем, что эндосомолитический агент ковалентно св€зан с веществом со сродством дл€ нуклеиновой кислоты.
9. “рансфекционна€ композици€ дл€ высших эукариотных клеток по п.5, отличающа€с€ тем, что эндосомолитический агент нековалентно св€зан с веществом со сродством дл€ нуклеиновой кислоты.
10. “рансфекционна€ композици€ дл€ высших эукариотных клеток по п.9, отличающа€с€ тем, что эндосомолитический агент св€зан с веществом со сродством дл€ нуклеиновой кислоты через биотиново-стрептавидиновый мостик.
11. “рансфекционна€ композици€ дл€ высших эукариотных клеток по п.9, отличающа€с€ тем, что эндосомолитический агент ионным путем св€зан с веществом со сродством дл€ нуклеиновой кислоты.
12. “рансфекционна€ композици€ дл€ высших эукариотных клеток по п.4, отличающа€с€ тем, что эндосомолитический агент св€зан с нуклеиновой кислотой непосредственно через св€зывающий нуклеиновую кислоту домен.
13. “рансфекционна€ композици€ дл€ высших эукариотных клеток по п.3, отличающа€с€ тем, что в качестве эндосомолитического агента содержит вирус, который €вл€етс€ инфекционным дл€ индивидуума, отличного от человека.
14. “рансфекционна€ композици€ дл€ высших эукариотных клеток по п.3, отличающа€с€ тем, что в качестве эндосомолитического агента содержит аденовирус.
15. “рансфекционна€ композици€ дл€ высших эукариотных клеток по п.14, отличающа€с€ тем, что аденовирус €вл€етс€ птичьим.
16. “рансфекционна€ композици€ дл€ высших эукариотных клеток по п.15, отличающа€с€ тем, что аденовирус €вл€етс€ куриным аденовирусом CELO.
17. “рансфекционна€ композици€ дл€ высших эукариотных клеток по п.14, отличающа€с€ тем, что аденовирус €вл€етс€ мутантом.
18. “рансфекционна€ композици€ дл€ высших эукариотных клеток по п.17, отличающа€с€ тем, что аденовирус €вл€етс€ неспособным к репликации мутантом.
19. “рансфекционна€ композици€ дл€ высших эукариотных клеток по п.18, отличающа€с€ тем, что аденовирус имеет по крайней мере одну мутацию и/или делицию в зоне ≈1ј.
20. “рансфекционна€ композици€ дл€ высших эукариотных клеток по п.14, отличающа€с€ тем, что аденовирус €вл€етс€ инактивированным.
21. “рансфекционна€ композици€ дл€ высших эукариотных клеток по п.20, отличающа€с€ тем, что аденовирус €вл€етс€ инактивированным коротковолновыми ”‘-лучами.
22. “рансфекционна€ композици€ дл€ высших эукариотных клеток по п.20, отличающа€с€ тем, что аденовирус €вл€етс€ инактивированным обработкой ”‘-лучами и псораленом.
23. “рансфекционна€ композици€ дл€ высших эукариотных клеток по п.20, отличающа€с€ тем, что аденовирус €вл€етс€ инактивированным формальдегидом.
24. “рансфекционна€ композици€ дл€ высших эукариотных клеток по п.3, отличающа€с€ тем, что в качестве эндосомолитического агента содержит по крайней мере один протеин аденовируса.
25. “рансфекционна€ композици€ дл€ высших эукариотных клеток по п.3, отличающа€с€ тем, что в качестве эндосомолитического агента содержит пикорнавирус.
26. “рансфекционна€ композици€ дл€ высших эукариотных клеток по п.25, отличающа€с€ тем, что в качестве пикорнавируса содержит риновирус.
27. “рансфекционна€ композици€ дл€ высших эукариотных клеток по п.26, отличающа€с€ тем, что риновирус €вл€етс€ инактивированным.
28. “рансфекционна€ композици€ дл€ высших эукариотных клеток по п.3, отличающа€с€ тем, что в качестве эндосомолитического агента содержит эндосомолитический вирусный пептид, который может быть модифицирован.
29. “рансфекционна€ композици€ дл€ высших эукариотных клеток по п.28, отличающа€с€ тем, что эндосомолитический вирусный пептид представл€ет собой пептид гемагглютинина Ќј2 гриппа.
30. “рансфекционна€ композици€ дл€ высших эукариотных клеток по п.29, отличающа€с€ тем, что пептид имеет последовательность Gly-Leu-Phe-Clu-Ala-Ile-Gly-Phe-Ile-Glu-Asn-Gly-Trp-Glu-Gly-Met-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly-Cys.
31. “рансфекционна€ композици€ дл€ высших эукариотных клеток по п.29, отличающа€с€ тем, что пептид имеет последовательность Gly-Leu-Phe-Gly-Ala-Ile-Ala-Gly-Phe-Ile-Glu-Asn-Gly-Trp-Glu-Gly-Met-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly-Cys.
32. “рансфекционна€ композици€ дл€ высших эукариотных клеток по п.1, отличающа€с€ тем, что эндосомолитический пептид представл€ет собой невирусный естественный или синтетический пептид, обладающий способностью к модифицированию.
33. “рансфекционна€ композици€ дл€ высших эукариотных клеток по п.28 или 32, отличающа€с€ тем, что пептид имеет св€зывающий нуклеиновую кислоту домен.
34. “рансфекционна€ композици€ дл€ высших эукариотных клеток по п.2 или 6, отличающа€с€ тем, что содействующим поглощению клеткой фактором €вл€етс€ трансферин.
35. “рансфекционна€ композици€ дл€ высших эукариотных клеток по п.2 или 6, отличающа€с€ тем, что содействующим поглощению клеткой фактором €вл€етс€ лиганд дл€ гепатоцитов.
36. “рансфекционна€ композици€ дл€ высших эукариотных клеток по п.2 или 6, отличающа€с€ тем, что содействующим поглощению клеткой фактором €вл€етс€ лиганд дл€ рецептора азиалогликопротеина.
37. “рансфекционна€ композици€ дл€ высших эукариотных клеток по п.2 или 6, отличающа€с€ тем, что содействующим поглощению клеткой фактором €вл€етс€ тетра-галактозированный полилизин.
38.  омплекс нуклеиновой кислоты, пригодный в качестве компонента трансфекционной композиции по любому из пп.4-37, отличающийс€ тем, что он включает по крайней мере одну нуклеиновую кислоту, подлежащую экспрессии в клетке, эндосомолитический агент, который первоначально имеет св€зывающий нуклеиновую кислоту домен или св€зан с веществом со сродством дл€ нуклеиновой кислоты.
39.  омплекс по п.38, отличающийс€ тем, что он дополнительно содержит содействующий поглощению клеткой фактор, св€занный с веществом со сродством дл€ нуклеиновой кислоты.
40.  омплекс по п.38, отличающийс€ тем, что нуклеинова€ кислота €вл€етс€ терапевтической активной.
41.  омплекс по п.40, отличающийс€ тем, что нуклеинова€ кислота включает по меньшей мере одну молекулу ƒЌ , активную в терапии генами.
42.  омплекс по п.41, отличающийс€ тем, что молекула ƒЌ  кодирует цитокин.
43.  омплекс по п.40, отличающийс€ тем, что нуклеинова€ кислота имеет нуклеотидную последовательность, позвол€ющую транскрипцию молекулы –Ќ , ингибирующей функции клетки.
44.  омплекс по п.38, отличающийс€ тем, что вещество со сродством дл€ нуклеиновой кислоты представл€ет собой органический поликатион.
45.  омплекс по п.44, отличающийс€ тем, что поликатионом €вл€етс€ полилизин.
46.  омплекс по п.38 или 39, отличающийс€ тем, что эндосомолитический агент и содействующий поглощению клеткой фактор св€заны с тем же веществом со сродством дл€ нуклеиновой кислоты.
47.  омплекс по п.46, отличающийс€ тем, что эндосомолитический агент и содействующий поглощению клеткой фактор св€заны с полилизином.
48.  омплекс по п.47, отличающийс€ тем, что он дополнительно включает нековалентно св€занный полилизин.
49.  онъюгат, пригодный в качестве компонента комплекса по любому из пп. 38-48, отличающийс€ тем, что он включает эндосомолитический агент, св€занный с веществом со сродством дл€ нуклеиновой кислоты.
50.  онъюгат по п.49, отличающийс€ тем, что эндосомолитический агент ковалентно св€зан с веществом со сродством дл€ нуклеиновой кислоты.
51.  онъюгат по п.49, отличающийс€ тем, что эндосомолитический агент нековалентно св€зан с веществом со сродством дл€ нуклеиновой кислоты.
52.  онъюгат по п. 51, отличающийс€ тем, что эндосомолитический агент св€зан с веществом через биотиново-стрептавидиновый мостик.
53.  онъюгат по п.51, отличающийс€ тем, что эндосомолитический агент ионным путем св€зан с веществом.
54.  онъюгат по п. 49, отличающийс€ тем, что эндосомолитический агент представл€ет собой вирус или компонент вируса.
55.  онъюгат по п.54, отличающийс€ тем, что вирус €вл€етс€ инфекционным дл€ индивидуума, отличного от человека.
56.  онъюгат по п.54, отличающийс€ тем, что вирусом €вл€етс€ аденовирус.
57.  онъюгат по п.54, отличающийс€ тем, что аденовирус €вл€етс€ птичьим.
58.  онъюгат по п.57, отличающийс€ тем, что аденовирус €вл€етс€ куриным аденовирусом CELO.
59.  онъюгат по п.56, отличающийс€ тем, что аденовирус представл€ет собой мутант.
60.  онъюгат по п.59, отличающийс€ тем, что аденовирус представл€ет собой неспособный к репликации мутант.
61.  онъюгат по п.60, отличающийс€ тем, что аденовирус имеет по меньшей мере одну мутацию и/или делецию в зоне ≈1ј.
62.  онъюгат по п.56, отличающийс€ тем, что аденовирус €вл€етс€ инактивированным.
63.  онъюгат по п.62, отличающийс€ тем, что аденовирус €вл€етс€ инактивированным коротковолновыми ”‘-лучами.
64.  онъюгат по п.62, отличающийс€ тем, что аденовирус €вл€етс€ инактивированным обработкой ультрафиолетовым светом и псораленом.
65.  онъюгат по п.62, отличающийс€ тем, что аденовирус €вл€етс€ инактивированным формальдегидом.
66.  онъюгат по п.54, отличающийс€ тем, что компонент вируса представл€ет собой протеин аденовируса.
67.  онъюгат по п.54, отличающийс€ тем, что вирус представл€ет собой пикорнавирус.
68.  онъюгат по п.67, отличающийс€ тем, что в качестве пикорнавируса содержит риновирус.
69.  онъюгат по п. 49, отличающийс€ тем, что эндосомолитический агент представл€ет собой эндосомолитический вирусный пептид, который может быть модифицирован.
70.  онъюгат по п.69, отличающийс€ тем, что эндосомолитический вирусный пептид представл€ет собой пептид гемагглютинина Ќј2 гриппа.
71.  онъюгат по п. 70, отличающийс€ тем, что пептид имеет последовательность Gly-Leu-Clu-Ala-Ile-Gly-Phe-Ile-Glu-Asn-Gly-Trp-Glu-Gly-Met-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly-Cys.
72.  онъюгат по п.70, отличающийс€ тем, что пептид имеет последовательность Gly-Leu-Phe-Gly-Ala-Ile-Ala-Gly-Phe-Ile-Glu-Asn-Gly-Trp-Glu-Gly-Met-Ile-Asp-Gly-Gly-Gly-Cys.
73.  онъюгат по п. 49, отличающийс€ тем, что эндосомолитический агент представл€ет собой невирусный естественный или синтетический пептид, обладающий способностью к модифицированию.
74. Ёндосомолитический пептид, пригодный в качестве компонента трансфекционной композиции по п.33, отличающийс€ тем, что включает эндосомолитический домен и св€зывающий нуклеиновую кислоту домен.
75. Ёндосомолитический пептид по п.74, отличающийс€ тем, что св€зывающий нуклеиновую кислоту домен представл€ет собой хвост олиголизина.
ѕриоритет по пунктам:
30.09.91 - по пп. 5; 8-10; 22, 39, 46-48, 50-52, 54, 56, 59-64, 69-71 (за€вка 07/767788);
30.09.91 - по пп.2, 3, 6, 7, 14, 17-21, 23, 28-30, 34, 36, 40, 41, 43-45, 65, 66, 67 (за€вка 07/768039);
07.04.92 - по пп.13, 15, 16, 37, 55, 57, 58, 72;
02.09.92 - по пп.1, 4, 11, 12, 24, 25-27, 31-33, 35, 38, 42, 49, 53, 68, 73-75.