√лавна€ страница  |  ќписание сайта  |   онтакты
ћ”“јЌ“Ќџ… Ў“јћћ Ѕј “≈–»… BACILLUS THURINGIENSIS SUBSP, TENEBRIONIS DSM 5480 - ѕ–ќƒ”÷≈Ќ“ ƒ≈Ћ№“ј-ЁЌƒќ“ќ —»Ќј, —ѕќ—ќЅ ѕќЋ”„≈Ќ»я ѕ–≈ѕј–ј“ј Ќј ќ—Ќќ¬≈ ƒ≈Ћ№“ј-ЁЌƒќ“ќ —»Ќј, ѕ≈—“»÷»ƒЌјя  ќћѕќ«»÷»я, —ќƒ≈–∆јўјя ƒ≈Ћ№“ј-ЁЌƒќ“ќ —»Ќ, —ѕќ—ќЅ Ѕќ–№Ѕџ — ¬–≈ƒЌџћ» —≈Ћ№— ќ’ќ«я…—“¬≈ЌЌџћ» Ќј—≈ ќћџћ», —ѕќ—ќЅ ѕќЋ”„≈Ќ»я ћ”“јЌ“Ќџ’ Ў“јћћќ¬ Ѕј “≈–»… BACILLUS THURINGIENSIS SUBSP, TENEBRIONIS - ѕ–ќƒ”÷≈Ќ“ќ¬ ƒ≈Ћ№“ј- ЁЌƒќ“ќ —»Ќј
ћ”“јЌ“Ќџ… Ў“јћћ Ѕј “≈–»… BACILLUS THURINGIENSIS SUBSP, TENEBRIONIS DSM 5480 - ѕ–ќƒ”÷≈Ќ“ ƒ≈Ћ№“ј-ЁЌƒќ“ќ —»Ќј, —ѕќ—ќЅ ѕќЋ”„≈Ќ»я ѕ–≈ѕј–ј“ј Ќј ќ—Ќќ¬≈ ƒ≈Ћ№“ј-ЁЌƒќ“ќ —»Ќј, ѕ≈—“»÷»ƒЌјя  ќћѕќ«»÷»я, —ќƒ≈–∆јўјя ƒ≈Ћ№“ј-ЁЌƒќ“ќ —»Ќ, —ѕќ—ќЅ Ѕќ–№Ѕџ — ¬–≈ƒЌџћ» —≈Ћ№— ќ’ќ«я…—“¬≈ЌЌџћ» Ќј—≈ ќћџћ», —ѕќ—ќЅ ѕќЋ”„≈Ќ»я ћ”“јЌ“Ќџ’ Ў“јћћќ¬ Ѕј “≈–»… BACILLUS THURINGIENSIS SUBSP, TENEBRIONIS - ѕ–ќƒ”÷≈Ќ“ќ¬ ƒ≈Ћ№“ј- ЁЌƒќ“ќ —»Ќј

ћ”“јЌ“Ќџ… Ў“јћћ Ѕј “≈–»… BACILLUS THURINGIENSIS SUBSP, TENEBRIONIS DSM 5480 - ѕ–ќƒ”÷≈Ќ“ ƒ≈Ћ№“ј-ЁЌƒќ“ќ —»Ќј, —ѕќ—ќЅ ѕќЋ”„≈Ќ»я ѕ–≈ѕј–ј“ј Ќј ќ—Ќќ¬≈ ƒ≈Ћ№“ј-ЁЌƒќ“ќ —»Ќј, ѕ≈—“»÷»ƒЌјя  ќћѕќ«»÷»я, —ќƒ≈–∆јўјя ƒ≈Ћ№“ј-ЁЌƒќ“ќ —»Ќ, —ѕќ—ќЅ Ѕќ–№Ѕџ — ¬–≈ƒЌџћ» —≈Ћ№— ќ’ќ«я…—“¬≈ЌЌџћ» Ќј—≈ ќћџћ», —ѕќ—ќЅ ѕќЋ”„≈Ќ»я ћ”“јЌ“Ќџ’ Ў“јћћќ¬ Ѕј “≈–»… BACILLUS THURINGIENSIS SUBSP, TENEBRIONIS - ѕ–ќƒ”÷≈Ќ“ќ¬ ƒ≈Ћ№“ј- ЁЌƒќ“ќ —»Ќј

ѕатент –оссийской ‘едерации
—уть изобретени€: »зобретение относитс€ к биотехнологии, в частности к средствам биологической борьбы с вредными насекомыми. ѕолучен новый штамм бактерий Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis DSM 5480, продуцирующий 3282-4169 ¬““ US/г дельта-эндотоксина. Ўтамм получают путем облучени€ γ-излучением родительского штамма Bacillus thuringiensis DSM 2830, выращивани€ на среде, способствующей получению аспорогенных или олигоспорогенных мутантов, с последующим отбором полученных полупрозрачных колоний и пересевом их на среду, не содержащую летучих компонентов. ¬новь полученные клетки выдерживают при 90oC в течение часа, затем их инкубируют при 30o— до получени€ аспорогенных колоний. »з них отбирают бактерии, засевают в производственную среду. «атем отбирают бактерии, продуцирующие максимальное количество дельта-эндотоксина. Ќа основе полученного дельта-эндотоксина готов€т композиции дл€ борьбы с сельскохоз€йственными вредител€ми. »зобретение позвол€ет увеличить выход дельта-эндотоксина в 2-3 раза по сравнению с родительским штаммом и повысить эффективность в борьбе с сельскохоз€йственными насекомыми. 6 с. и 9 з.п. ф-лы, 8 табл.
ѕоиск по сайту

1. — помощью поисковых систем

   — помощью Google:    

2. Ёкспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. ѕо номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Ќомер патента: 2138950
 ласс(ы) патента: A01N63/00, C12N15/01, C12N1/20, C12N1/20, C12R1:07
Ќомер за€вки: 5052261/13
ƒата подачи за€вки: 16.11.1990
ƒата публикации: 10.10.1999
«а€витель(и): Ёбботт Ћабораториз (US)
јвтор(ы): ’анне √уртлер (DK); јнетте Ўоусбо ѕетерсен (DK)
ѕатентообладатель(и): Ёбботт Ћабораториз (US)
ќписание изобретени€:  оммерческие препараты Bacillus thuringiensis широко используютс€ во всем мире как биологическое средство борьбы с вредными насекомыми. ƒостоинствами этих бактериальных инсектицидов €вл€етс€ их высока€ селективность по отношению к очень узкому кругу насекомых-мишеней и биологическа€ разлагаемость.
 оммерческие препараты Bacillus thuringiensis могут использоватьс€ вплоть до сбора урожа€, не оказыва€ при этом вредного действи€. Bacillus thuringiensis представл€ют собой палочкообразные аэробные спорообразующие бактерии, уникальна€ особенность которых состоит в том, что в процессе спорул€ции они продуцируют одно или более включений, так называемых параспоральных кристаллов. Ёти кристаллы состо€т из высокомолекул€рных белков, называемых дельта-эндотоксинами. Ёти дельта-эндотоксины €вл€ютс€ активным компонентом выпускаемых коммерческих препаратов Bacillus thuringiensis.
»дентифицировано большое количество штаммов Bacillus thuringiensis с различным спектром насекомых хоз€ев. ѕо своим флагелл€рным антигенам они раздел€ютс€ на различные подвиды. ќсобый интерес представл€ют подвиды Bacillus thuringiensis kurstaki и aizawai, israelensis и tenebrionis, использующиес€ дл€ контрол€ соответственно чешуекрылых, двукрылых и жесткокрылых вредных насекомых.
¬первые сообщение о выделении токсичных по отношению к жесткокрылым Bacillus thuringiensis было опубликовано в 1983 году (A.Krieg и др., Z. and Ent. 96, 500 - 508, европейский патент EP 0149162 A2).
Ётот изол€т под названием Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis был депонирован в Ќемецкой коллекции микроорганизмов под номером DSM 2803. Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis был выделен в 1982 году из мертвой куколки мучного черв€ Tenebrio molitor (Tenebrionidae, Coleoptera). Ётот штамм продуцирует в каждой клетке одну спору и один или более инсектицидных параспоральных кристаллов, имеющих форму плоских пластин с кромкой длиной примерно 0,8 - 1,5 мкм. ќн относитс€ к серотипу H8a, 8b и прототипу C Bacillus thuringiensis (Krieg и др. , System. Appl. Microbiol. 9, 138-141, 1987, патент —Ўј 4766203, 1988).
ќн токсичен только по отношению к некоторым питающимс€ листь€ми личинками жуков (chrysomelidae), но не оказывает действи€ на гусениц (Lepidoptera), комаров (Diptera) и других насекомых.
Ѕыло показано, что Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis позвол€ет эффективно контролировать личинок колорадского жука. ѕосле поглощени€ кристаллов и спор, продуцируемых Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, или выделенных кристаллов личинки и до некоторой степени взрослые особи колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata) перестают есть. Ћичинки на стадии развити€ L1-L3 погибают в течение 1 - 3 дней (Schnetter и др., в Fundamental & applied aspects of invertebrate pathology, под редакцией R.A.Samson и др., Proceeding of the 4th Int. colloguium of Invertebrate Pathology, стр. 555, 1986).
Ќедавно было обнаружено, что помимо кристаллов, активных по отношению к жесткокрылым, Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis продуцирует и другие параспоральные кристаллы, палочкообразной, сфероидальной или пластинчатой формы (A. M. Huger и A.Krieg, J. Appl. Ent. 108, 490-497, 1989). јктивность этих вторых кристаллов пока не изучена.
Ќа основе Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis были разработаны четыре коммерческих продукта дл€ контрол€ жесткокрылых вредных насекомых: NOVOPOR® (фирма Novo Nordis k A/s). TRIDENT® (фирма Sandor), Di Terra® (фирма Abbott Laboratories Inc.) и Foil® (фирма Ecogen).
¬ 1986 году было опубликовано сообщение о выделении другого токсичного дл€ жесткокрылых насекомых штамма Bacillus thuringiensis (Hernnstadt и др., Bio/Technology, т. 4, 305-308, 1986, патент —Ўј 4764372, 1988). Ётот штамм под названием "Bacillus thuringiensis subsp. sorn diego", M7, депонирован в Northern Regional Researeh Laborotory, —Ўј под номером NRRL B-15939. Ќа его основе фирмой Mycogen Corp. выпущен коммерческий продукт.
—равнительные исследовани€ Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, DSM 2803, и Bacillus thuringiensis subsp. san diego", NRRL-B15939, включавшие фенотипическую характеристику вегетативных клеток, характеристику токсического параспорального кристалла и анализ плазмида ƒЌ , показали однако, что "Bacillus thuringiensis subsp. san diego" фактически идентичен ранее выделенному штамму DSM 2803, Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis (Krieg и др. , J. Appl. Ent. 104, 417-424, 1987).  роме того, нуклеотидные последовательности и производные аминокислотные последовательности активных по отношению к жесткокрылым дельта-эндотоксинных генов Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis и "Bacillus thuringiensis suhsp. san diego" также идентичны.
¬ тех же самых услови€х вышеупом€нутые кристаллы второго типа "Bacillus thuringiensis suhsp. san diego" (A.M. Huoger & A. Krieg, J. Appl. Ent 108. 490-497, 1989).
—огласно H. de Barjac & E. Frachon (Entomophaga 35 (2), 233-240, 1990) изол€т "Sandiego" аналогичен "tenebrionis", и поэтому нет оснований рассматривать их как различные подвиды.
¬озможность использовани€ штаммов Bacillus thuringiensis дл€ контрол€ жесткокрылых вредных насекомых зависит от эффективности и экономичности способа получени€ активных по отношению к жесткокрылым токсинов и активности получаемого продукта. ѕоследн€€ в свою очередь зависит от количества дельта-эндотоксинов, которые могут быть получены путем ферментации активных по отношению к жесткокрылым штаммов Bacillus thuringiensis.
B. thurihgiensis уже давно используютс€ дл€ получени€ инсектицидов. ќднако, хот€ предпочтительным было бы использование мутантов B. thuringiensis с более высоким выходом дельта-эндотоксинов, однако такие мутанты не были описаны. ћутанты, продуцирующие дельта-эндотоксины с более высоким выходом, позволили бы разработать более экономичные и эффективные способы получени€ токсинов B. thuringiensis и дали бы возможность получать продукты B. thuringiensis такой же стоимости, но с более высокой активностью. ѕоследнее, в свою очередь, было бы целесообразно и дл€ потребител€ с точки зрени€ хранени€ и использовани€ меньших количеств пестицидных композиций дл€ обработки определенных площадей.  роме того, в этом случае потребителю понадобитс€ меньшее количество контейнеров дл€ хранени€ таких композиций, что ослабит воздействие их на окружающую среду.
¬ литературе отсутствует описание усовершенствовани€ способов получени€ дельта-эндотоксинов с помощью Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis путем мутации.
ќдна из проблем использовани€ дл€ контрол€ личинок жуков в частности B. thuringiensis subsp. tehebrinis св€зана со сравнительно низкой активностью этих композиций, что требует применени€ довольно больших количеств их дл€ обработки определенных площадей, а именно 5 - 10 л/га по сравнению с 1 - 2 л/га большинства других продуктов B. thuringiensis и других инсектицидов.
ќтсюда следует необходимость получени€ продуктов с более высокой активностью.
ќдним из путей решени€ этой проблемы €вл€етс€ получение более концентрированных препаратов. Ёто однако привело бы к удорожанию их производства, которое не компенсировалось бы экономией при хранении и транспортировке.
Ѕолее из€щным решением было бы создание мутантов существующих штаммов B. thuringiensis, способных продуцировать значительно большие количества дельта-эндотоксинов на клетку.
 раткое описание сущности изобретени€.
Ќасто€щее изобретение, таким образом, относитс€ к вариантным или мутантным штаммам Bacillus thuringiensis, способным продуцировать значительно большие количества токсинов, чем родительский штамм.
Ќасто€щее изобретение относитс€ также к таким обладающим высокой продуцирующей способностью варианты или мутантам B. thuringiensis, относ€щимс€ к подвидам tenebrionis.
ѕредметом насто€щего изобретени€ €вл€ютс€ также использование таких вариантов или мутантов штаммов Bacillus thuringiensis дл€ получени€ пестицидных продуктов и пестицидные композиции, включающие в качестве активного компонента дельта-эндотоксины, продуцированные вариантом или мутантом штаммов Bacullus thuringiensis в соответствии с изобретением.
ѕредметом насто€щего изобретени€ далее €вл€етс€ способ контрол€ вредных насекомых путем обработки за€вл€емыми композици€ми площадей с подлежащими контролю вредными насекомыми, чувствительными к содержащимис€ в композици€х дельта-токсинам.
ѕредметом насто€щего изобретени€ €вл€ютс€, кроме того, способы селекции или мутации и селекции штаммов B. thuringiensis дл€ получени€ их вариантов или мутантов, способных продуцировать значительно большие количества дельта-эндотоксинов, чем их родительский штамм.
ƒепонирование микроорганизмов
¬ цел€х подробного описани€ насто€щего изобретени€ мутант Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, продуцирующий большие количества дельта-эндотоксина, был депонирован в Ќемецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур GmbH, Mascheroderueglb, D-3300 Braunschulig, ‘едеративна€ –еспублика √ермани€. Ёто было сделано в цел€х патентовани€ на указанную ниже дату. DSM, будучи международным депозитарием в соответствии с Ѕудапештским договором, обеспечивает посто€нство депонированных микроорганизмов в соответствии с параграфом 9 указанного договора.
ƒата депонировани€ - 10 августа 1989 года
–егистрационный номер депозитора - NB 176-1
ќбозначение в DSM - DSM 5480
ћутант DSM 5480 был получен путем мутации штамма Basillus thuringiensis subsp. tehibrionis DSM 5526, который также был депонирован в соответствии с Ѕудапештским договором в нижеуказанный срок под нижеуказанным номером.
ƒата депонировани€ - 14 сент€бр€ 1989 года
–егистрационный номер депозитора - NB 125
ќбозначение в DSM - DSM 5526
ѕодробное описание изобретени€
ѕредметом насто€щего изобретени€ €вл€ютс€ варианты или мутанты Bacillus thuringiensis, продуцирующие активные дельта-эндотоксины в значительно больших количествах по сравнению с их родительским штаммом.
ѕод выражением "в значительно больших количествах" в данном описании имеетс€ в виду по меньшей мере в два или большее число раз больших количествах.
» в случае вышеуказанного предмета изобретени€ в его общем аспекте, и в случае более конкретных его аспектов, о которых будет сказано ниже, дельта-эндотоксины, продуцируемые мутантом B. thuringiensis, активны по отношению к тем же вредным насекомым, что и дельта-эндотоксины, продуцируемые их родительским штаммом, а именно к чешуекрылым (мутанты штаммов B. thuringiensis subsp. kurstaki и subsp. aizawai), двукрылым (мутанты штамма B. thuringiensis subsp. inraelensis) или жесткокрылым (мутанты штамма B. thuringiensis subsp. tenebrionis).
ќдним из предметов насто€щего изобретени€ €вл€етс€ штамм B. thuringiensis, относ€щийс€ к подвиду tenibrionis. ѕродуцируемый им дельта-эндотоксин обладает активностью по отношению к жесткокрылым.
¬ этом плане по предпочтительному варианту осуществлени€ изобретени€ вариант или мутант штамма B. thuringiensis subsp. tenebrionis способны продуцировать более чем в три раза большее количество дельта-эндотоксина по сравнению со штаммом DSM 2803.
¬ соответствии с другими вариантами осуществлени€ насто€щее изобретени€ включает варианты или мутанты штаммов B. thuringiensis subsp. tenebrionis, способные продуцировать параспоральный кристалл с длиной кромки 2 или более мкм.
—огласно другому варианту осуществлени€ насто€щее изобретение включает варианты или мутанты штаммов B. thuringiensis subsp. tenebrionis с частотой спорул€ции в 10-100 или даже в 106 раз меньше частоты спорул€ции родительского штамма DSM 2803.
¬ частности, насто€щее изобретение относитс€ к депонированному штамму B. thuringiensis subsp. tenebrionsis DSM 5480.
¬ процессе работы над насто€щим изобретением был выделен мутант штамма B. thuringiensis subsp. tenebrionsis (DSM 5480), продуцирующий в два с лишним раза большее количество дельта-эндотоксина, чем его родительский штамм (DSM 5526). ƒанные фазоконтрастной микроскопии, сканирующей электронной микроскопии и просвечивающей электронной микроскопии свидетельствуют о том, что высока€ продуцирующа€ способность этого мутанта св€зана с изменени€ми регул€ции продуцировани€ дельта-эндотоксина по сравнению со спорул€цией, следствием чего €вл€етс€ продуцирование кристаллов белка более чем в п€ть раз крупных, чем кристаллы, продуцируемые известными штаммами Bacillus thuringiensis, активными по отношению к жесткокрылым. ѕо-видимому, в данном случае пропадает тесна€ св€зь между образованием кристаллов и спорул€цией, и мутант продуцирует большие количества дельта-эндотоксина до начала спорул€ции.
—огласно одному из аспектов насто€щего изобретени€ предметом его €вл€етс€ использование за€вл€емых вариантов или мутантом штаммов дл€ получени€ инсектицидных препаратов на основе B.thuringiеnsis. ¬ соответствии с предлагаемым способом вариант или мутант штамма B. thuringiensis выращивают в подход€щей культуральной среде, включающей источники углерода, азота и другие компоненты, известные специалисту в данной области, в течение определенного времени, после чего из среды извлекают образующиес€ дельта-эндотоксины.
¬ соответствии с другим аспектом насто€щего изобретени€ полученные вышеописанным образом дельта-эндотоксины B. thuringiensis используют в качестве активного компонента пестицидных композиций.
¬ таких композици€х дельта-эндотоксины в соответствии с насто€щим изобретением могут использоватьс€ как сами по себе, так и в комбинации с другими обладающими биоцидной активностью продуктами.
Ќасто€щее изобретение относитс€ далее к таким пестицидным композици€м или препаратам, включающим дельта-эндотоксин в соответствии с насто€щим изобретением в смеси с приемлемыми с точки зрени€ сельского хоз€йства разбавител€ми или носител€ми.
ѕредметом насто€щего изобретени€, кроме того, €вл€ютс€ такие пестицидные композиции или препараты, включающие дельта-эндотоксин B. thuringiensis, в жидкой форме с активностью не менее 15000 BTTU/г, что соответствует концентрации инсектицидного по отношению к жесткокрылым кристаллического белка как минимум 3 весов.%, или в твердой форме с активностью не менее 50000 BTTU/г, что соответствует концентрации инсектицидного по отношению к жесткокрылым кристаллического белка как минимум 10 весов.%.
ѕредметом насто€щего изобретени€, в частности, €вл€ютс€ пестицидные композиции на основе DSM 5480, имеющие по меньшей мере вдвое большую активность по сравнению с пестицидными композици€ми на основе DSM 2803 или других активных по отношению к жесткокрылым штаммов Btt.
 омпозиции в соответствии с насто€щим изобретением могут быть получены в любой форме, используемой при получении агрохимикатов, например, в форме суспензии, дисперсии, водной эмульсии, порошка дл€ опыливани€, диспергируемого порошка, концентрата эмульсии или гранул€та.  роме того, они могут выпускатьс€ в виде препаратов, готовых дл€ непосредственного употреблени€, или в виде концентратов или первичных композиций, которые перед употреблением необходимо разбавл€ть определенным количеством воды или другого разбавител€.
 онцентраци€ обладающих инсектицидной активностью дельта-эндотоксинов B. thuringiensis в композици€х в соответствии с насто€щим изобретением при использовании их индивидуально или в комбинации с другими пестицидами дл€ обработки растений предпочтительно находитс€ в пределах от примерно 0,5 до примерно 25, наиболее предпочтительно 1-15 весов.%.
ѕредметом насто€щего изобретени€ €вл€етс€ также способ контрол€ вредных насекомых, по которому зараженные такими насекомыми площади обрабатывают пестицидной композицией в соответствии с изобретением.
”казанными вредными насекомыми, в частности, €вл€ютс€ насекомые, относ€щиес€ к группе чешуекрылых, двукрылых и жесткокрылых, предпочтительно к жесткокрылым, таким как колорадский жук.
ѕо предпочтительному варианту осуществлени€ изобретени€ контроль вредных насекомых может осуществл€тьс€ путем обработки площадей жидкими (из расчета 1,14 л/0,4 га) или твердыми (из расчета 227 г/0,.4 га) пестицидными композици€ми.
јктивные препараты или композиции B. thuringiensis в соответствии с насто€щим изобретением могут использоватьс€ непосредственно дл€ обработки растений, например, путем опрыскивани€ или опыливани€, в момент по€влени€ на них вредных насекомых. ѕредпочтительным способом обработки €вл€етс€ опрыскивание.  ак правило, желательно производить обработку на ранних стади€х развити€ личинок, так как в это врем€ ущерб, наносимый растени€ми, €вл€етс€ минимальным.
ѕо одному из способов мутации штаммов Bacillus thuringiensis и селекции мутантов, способных продуцировать значительно большие количества дельта-эндотоксинов, чем их родительские штаммы, родительский штамм;
I) обрабатывают мутагеном;
II) обработанные мутанты выращивают на среде, подход€щей дл€ селекции аспорогенных и/или олигоспорогенных штаммов;
III) отбирают полупрозрачные колонии и выращивают их в среде, не летучей при нагревании; и
IV) отбирают истинно аспорогенные штаммы, подверга€ колонии термообработке.
ѕо предпочтительному варианту этого способа отобранные таким образом колонии выращивают в обычной производственной питательной среде и окончательно отбирают штаммы, способные продуцировать большие количества дельта-эндотоксина.
Ќа стадии (I) указанного способа в качестве мутагена можно использовать любой подход€щий химический мутаген, например N-метил-N-нитро-N-нитрозогуанидин или этилметансульфонат. ѕо другому варианту родительский штамм может быть подвергнут электромагнитному облучению, например γ-, рентгеновскому или ”‘-облучению.
Ќа стадии (II) подход€щей средой может быть модифицированна€ питательна€ спорул€ционна€ среда, включающа€ фосфат (NSMP-среда), описанна€ Johnson'om и др. в "Spores VI" под ред. P. Gerhardt'a и др., стр. 248-254, 1975.
Ќа стадии (IV) предлагаемого способа в качестве подход€щей среды можно использовать среду NSMP с добавкой MgCl2 и Gelrite, Kelco.
ѕо другому варианту обеспечивающие высокие выхода варианты или мутанты в соответствии с насто€щим изобретением могут быть получены путем выращивани€ родительского штамма в жидкой среде и отбора спонтанных мутантов или вариантов после распылени€ культуральной жидкости на агарной среде, пригодной дл€ селекции аспорогенных и/или олигоспорогенных мутантов.
¬ качестве других методов выделени€, обеспечивающих высокий выход вариантов или мутантов в соответствии с насто€щим изобретением можно упом€нуть отделение массы таких мутантов непосредственно путем центрифугировани€ или с помощью других средств, используемых дл€ разделени€ масс.
ѕример 1
¬ыдел€ли мутант B. thuringiensis subsp. tenebrionis, обеспечивающий получение дельта-эндотоксина в два с лишним раза большем количестве. ‘азоконтрастна€ микроскопи€, сканирующа€ электронна€ микроскопи€ и просвечивающа€ электронна€ микроскопи€ свидетельствует о том, что высока€ продуцирующа€ способность этого мутанта св€зана с изменени€ми регул€ции продуцировани€ дельта-эндотоксина по сравнению со спорул€цией, что приводит к продуцированию кристаллов белка в п€ть с лишним раз более крупных, чем кристаллы, продуцируемые известными активными по отношению к жесткокрылым штаммами Bacillus thuringiensis. ѕо-видимому, в этом случае исчезает тесна€ взаимосв€зь между образованием кристаллов и спорул€цией, и мутант продуцирует большие количества дельта-эндотоксина до спорул€ции.
ѕолучение обладающего высокой продуцирующей способностью мутанта
—поры штамма DSM 5526 B. thuringiensis subsp. tenebrionis облучали γ-излучением дозой 7 к√и. ќблученные споры распредел€ли на агаровых пластинках NSMP (модифицированна€ питательна€ спорул€ционна€ среда, включающа€ фосфат, описанна€ Johnson'om и др. в "Spore VI", под ред. P. Gerhardt'a и др., стр. 248-254, 1975) - среде, подход€щей дл€ отделени€ аспорогенных и/или олигоспорогенных мутантов.
ѕластинки агара NSMP инкубировали при 30oC в течение 2 - 3 дней, отбирали полупрозрачные колонии и переносили их на гельритовые пластины NSMP (среда NSMP с добавкой 0,57 г/л MgCl2 и 20 г/л Gelrite, Kelco).
√ельритовые пластины NSMP инкубировали в течение часа при 90oC и затем в течение 1 - 2 дней при 30oC.
ќтбирали хорошо развивающиес€ в этих услови€х на гельритовых пластинах NSMP мутанты. “аким образом удавалось отсеивать все аспорогенные мутанты, так как они переставали размножатьс€ после термообработки.
ќтобранные мутанты выращивали во встр€хиваемых колбах с производственной питательной средой.  оличество продуцируемого дельта-эндотоксина определ€ли иммунологическими методами, описание которых приведено ниже.
ќтбирали только мутанты, продуцирующие значительно большие количества дельта-эндотоксина, чем родительский штамм.
ћорфологию выделенных мутантов на твердой среде и в жидких средах изучали с помощью фазоконтрастной микроскопии (х 2500) и сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии. ѕодсчитывали количество образующихс€ спор и кристаллов и определ€ли размер кристаллов белка.
»з полученных мутантов был выделен один (DSM 5480), отличающийс€ исключительной способностью продуцировать дельта-эндотоксин.
 оличество дельта-эндотоксина, продуцируемого мутантом DSM 5480, сравнивали с количеством дельта-эндотоксина, продуцируемого DSM 2803, исходным изол€том Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, штаммом DSM 5526 Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, используемым дл€ получени€ NOVODOR®, штаммом NB178 Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, выделенным из продукта фирмы Sandoz TRIDENT® 1989 на основе Bacillus thuringiensis tenebrionis, штаммом NB 198, выделенным из продукта фирмы Sandoz TRIDENT® 1990 на основе B. thuringiensis subsp. tenebrionis, штаммом NRRL-B-115939 "Bacillus thuringiensis subsp. san diego" и штаммом NB 197, выделенным из продукта фирмы Mycogen Mo-ONE® от 1990 на основе B. thuringiensis subsp. san diego".  ак видно из таблицы 1 примера 2, мутант повышенной эффективности в отношении выхода в соответствии с насто€щим изобретением продуцирует в 2 - 3,5 раза большее количество дельта-эндотоксина, чем известные активные по отношению к жесткокрылым штаммам Bacillus thuringiensis.
ѕример 2
¬ данном примере сравнивались количества дельта-эндотоксина, продуцируемого мутантом DSM 5480 Bacullus thuringiensis subspecies tenebrionis и штаммами Bacullus thuringiensis subspecies tenebrionis DSM 2803 (исходный изол€т Bacullus thuringiensis subsp. tenebrionis), DSM 5526 (производственный штамм фирмы Novo-Nordisk) и NB 178 и NB 198 (производственные штаммы фирмы Sandoz), а также Bacullus thuringiensis subsp. san diego, штаммами NRRL-B 15939 и NB 197 (производственные штаммы фирмы Mycogen) в производственной среде.  аждый из перечисленных штаммов выращивали в течение 17 часов при 30oC на кос€чках агара следующего состава (в г/л дистиллированной воды):
пептон, Difco - 5 г
м€сной экстракт, Difco - 3 г
агар, Difco - 20 г
pH - 7,0
5 мл суспензии клеток каждого штамма переносили затем в baffle-донные колбы Ёрленмейера на 500 мл со 100 мл производственной питательной среды. ѕроизводственна€ питательна€ среда имела следующий состав (количества компонентов указаны в г на л водопроводной воды):
соева€ мука - 50 г
гидролизованный крахмал - 40 г
KHPPO4 - 1,77 г
K2HPO4 - 4,53 г
pH - 7,0
»нокулированное содержимое колб инкубировали при 30oC при встр€хивании (250 об. /мин). ѕосле инкубации в течение 96 часов культуральную жидкость анализировали на содержание дельта-эндотоксина иммуногологическими методами.
 оличество дельта-эндотоксина, продуцируемого тем или иным штаммом, определ€ли с помощью ракетного иммуноэлектрофореза по Ћауреллу (RIE) и фотометрического иммуноанализа (RIA), с использованием антител по отношению к очищенным кристаллам белка из Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis.
ќтбирали по 400 мг культуральной жидкости из каждого опыта, добавл€ли к отобранным пробам по 7 мл тринатрийфосфатного буфера (0,125 ћ, pH 12) и встр€хивали суспензии в течение часа дл€ солюбилизации дельта-эндотоксионных белков.
ѕробы затем центрифугировали при 3500 об. /мин в течение 15 минут и анализировали надосадочную жидкость на содержание дельта-эндотоксина с помощью ракетного иммуноэлектрофореза по Ћауреллу в сыворотку по отношению к очищенным кристаллам белка B. thuringiensis subsp. tenebrionis. ƒл€ определени€ количества дельта-эндотоксина использовали стандарты с известным содержанием кристаллов белка.
 онцентрацию кристаллического белка также определ€ли с помощью фотометрического иммуноанализа.  ристаллические белки раствор€ли в щелочном растворе. –астворенные белки осаждали их антителами. —корость реакции определ€ли турбодиметрически. ƒл€ определени€ количества дельта-эндотоксина использовали стандарты с известным содержанием кристаллического белка.
»спользуемые в ходе анализа дл€ получени€ антител кристаллические антигены получали из кристаллов, выделенных из B. thuringiensis subsp. tenebrionis.
ѕоликлональные антитела индуцировали путем инъекции кроликам подкожно раз в две недели 0,25 мл кристаллического антигена.
ѕолученные результаты приведены в нижеследующих таблицах 1a и 1b. ¬ыхода дельта-эндотоксина выражали в BTTU/г (единицы на г культуральной жидкости, определенные с помощью ракетного иммуноэлектрофореза по Ћауреллу (RIE) или фотометрического иммуноанализа (RIA)). ¬еличина, полученна€ дл€ чистого кристаллического белка B. thuringiensis subsp. tenebrionis, равна 50000 BTTU/г. ¬еличины, приведенные в таблице 1a (см. в конце описани€), представл€ют собой средние из 6 - 7, а в таблице 1b - из 3 независимых опытов по ферментации.
»з таблиц Ia и Ib видно, что DSM 5480 продуцирует в три с лишним раза больше дельта-эндотоксина, чем родительский штамм Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis (DSM 2803) и "Bacillus thuringiensis subsp. san diego" штамм NRRL-B 15939) и в два с лишним раза больше, чем используемые в насто€щее врем€ дл€ получени€ коммерческих продуктов штаммы Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis.
‘азоконтрастна€ микроскопи€, сканирующа€ электронна€ микроскопи€ и просвечивающа€ электронна€ микроскопи€ Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, мутанта DSM 5480, показали, что кристаллы белка, продуцируемые этим мутантом, намного крупнее соответствующих кристаллов белка, продуцируемых штаммами Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis DSM 2803, DSM 5526, NB 178 и NB 198, а также штаммами "Bacillus thuringiensis subsp. san diego" NRRL-B 15939 и NB 197.
 ультуральную жидкость мутанта Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis DSM 5480 испытывали на активность по отношению к личинкам колорадского жука. Ѕольшее количество дельта-эндотоксина, продуцированного мутантом DSM 5480 (это было установлено с помощью иммунологических методов) отражалось на биологической активности по отношению к личинкам колорадского жука.
ѕример 3
¬ данном примере сравнивались процессы спорул€ции и образовани€ параспоральных кристаллов под действием штаммов B. thuringiensis subsp. tenebrionis DSM 2803, DSM 5526, NB 178 и NB 198 и мутанта DSM 5480, а также штаммов "B. thuringiensis subsp. san diego" NRRL-B 15939 и NB 197 на твердой и в жидкой средах.
 аждый из перечисленных штаммов выращивали в течение 2 дней при 30oC на агаровых пластинах следующего состава (в г на л дистиллированной воды):
пептон, Difco - 5 г
м€сной экстракт, Difco - 3 г
агар, Difco - 20 г
pH - 7,0
 аждый из перечисленных штаммов выращивали также в жидкой среде. ¬се штаммы выращивали на агаровых кос€чках в течение 17 часов при 30oC. ѕо 5 мл суспензии клеток каждого из штаммов переносили затем в baffle-донные колбы Ёрленмейера на 500 мл со 100 мл питательной среды.
ѕитательна€ среда имела следующий состав (в г на л водопроводной воды):
∆идка€ среда
дрожжевой экстракт - 5 г
триптон - 5 г
глюкоза - 1 г
KH2PO4 - 0,8 г
pH - 7,0
»нокулированное содержание колб инкубировали при 30oC в течение 96 часов при встр€хивании (250 об./мин).
ћорфологию штаммов на твердой среде и в жидкой среде изучали ежедневно с помощью фазоконтрастной микроскопии (х 2500). ѕодсчитыва€ количество спор и кристаллов, а также определ€ли размер параспоральных кристаллов. ќтдельные пробы изучали, кроме того, с помощью сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии.
¬се штаммы B. thuringiensis subsp. tenebrionis (DSM 2803, DSM 5526, NB 178 и NB 198) и "B. thuringiensis subsp. san diego" (NRRL-B 15939 и NB 197) хорошо спорулировались в обеих средах. ѕеред лизисом кажда€ клетка содержала спору и параспоральный кристалл.   моменту лизиса клетки длина кристаллов находилась в пределах от 0,4 до 0,9 - 1,1 мкм. —редн€€ длина кристаллов равн€лась 0,6 - 0,7 мкм.
ћутант DSM 5480 продуцировал лишь небольшое количество спор (< 106 спор/мл) на твердой среде и в вышеуказанной жидкой среде. ѕеред лизисом в большинстве клеток находилс€ огромный кристалл, но не было спор. –азмер кристаллов белка находилс€ в пределах от 0,4 - 0,7 до 5,0 мкм. ¬ среднем длина кристалла составл€ла 2,2 - 2,3 мкм.
”льтраструктурный анализ клеток, выращенных в этих средах, выполненный с помощью просвечивающей электронной микроскопии, показал, что процесс спорул€ции в мутанте началс€, но не закончилс€ к моменту лизиса клеток. ¬ различных клетках процесс спорул€ции дошел до разных стадий. ¬ клетках, в которых процесс спорул€ции достиг лишь стадии 11 (образование предспоры Septum), кристаллы белка заполнили весь объем клеток.
¬ производственной питательной среде (пример 2) указанный мутант продуцировал большее количество спор (107 - 108 спор/мл). ¬ этой среде частота спорул€ции мутанта в 10 - 100 раз меньше, чем в случае родительского штамма.
“аким образом, мутант сохран€л свою способность продуцировать нормальные споры. ќднако частота спорул€ции, по всей видимости, сильно зависит от состава питательной среды.
–азмеры кристаллов белка, продуцируемых отдельными штаммами, приведены в таблицах IIa и IIb (см. в конце описани€).
»з таблиц IIa и IIb видно, что мутант DSM 5480 продуцирует значительно более крупные кристаллы белка, чем любой из известных штаммов B.t., активных по отношению к жесткокрылым.
»з полученных данных следует, что регул€ци€ продуцировани€ дельта-эндоксина в отношении спорул€ции претерпела изменение в мутанте.
ѕо-видимому, мутант продуцирует кристаллы белка до развити€ спор, благодар€ чему клетки оказываютс€ в состо€нии продуцировать дельта-эндотоксин в течение более длительного времени. ¬ результате к моменту лизиса клеток продуцируютс€ значительно более крупные кристаллы, чем в случае родительского штамма.
¬ зависимости от наличи€ в питательной среде тех или иных питательных веществ и размера кристаллов белка к моменту спорул€ции нормальные споры начинают развиватьс€ до лизиса клеток.
ѕример 4
¬ данном примере мутант Btt DSM 5480 с высокой продуцирующей способностью использовалс€ дл€ получени€ высокоактивных продуктов дл€ контрол€ личинок колорадского жука.
‘ерментацию DSM 5480 осуществл€ли в описанной в примере 2 производственной питательной среде в аэрируемом промышленном фенментере с перемешивающим устройством. „ерез 96 часов культуральную жидкость отдел€ли путем центрифугировани€ в непрерывной центрифуге.
 онцентрированную расслоившуюс€ эмульсию, содержащую активные кристаллы белка, стабилизировали путем добавлени€ микробных консервирующих добавок и pH ее устанавливали равным 5,0.
„асть этой эмульсии высушивали в распылительной сушилке и затем использовали дл€ получени€ смачивающегос€ порошка. ќставшуюс€ часть эмульсии непосредственно использовали дл€ получени€ двух водных текучих концентратов (FC).
—мачивающийс€ порошок имел состав, приведенный в таблице Ў. —остав обеих жидких текучих композиций приведен в таблице IV (см. в конце описани€).
ѕоверхностно-активные вещества были выбраны из большого числа суспензий вспомогательных добавок и смачивателей, обычно использующихс€ при получении пестицидов дл€ сельского хоз€йства.
¬ качестве антислеживающего агента использовали гидрофильный диоксид кремни€, а инертный носитель был выбран из числа обычно использующихс€ инертных наполнителей, таких как бентониты, неорганические соли и глины.
¬ качестве консервирующих добавок в FC использовали добавки, примен€ющиес€ в пищевой и косметической промышленности. ¬ качестве регул€тора pH использовали неорганическую кислоту.
ѕример 5
ƒл€ проверки биологической активности мутанта Btt DSM 5480 с высокой продуцирующей способностью по отношению к основному вредному насекомому, личинкам колорадского жука, были проведены полевые испытани€. ƒл€ сравнени€ использовали два коммерческих продукта: Triden® и M-one®. ¬ качестве культуры, на которой проводились испытани€, использовали картофель.
–астени€ картофел€ трижды опрыскивали испытуемым препаратом: 20 июл€, 27 июл€ и 3 августа (второе поколение личинок). ¬ конце описани€ (табл. IVa) приведены используемые препараты и дозировки.
—редний % контрол€ личинок колорадского жука по сравнению с необработанными контрольными растени€ми приведен в таблице V. Ќеобработанные контрольные растени€ были очень сильно поражены колорадским жуком: 370 личинок на 20 растений I-го и 904 личинки на 20 растений 8-го августа.
ѕриведенные результаты убедительно свидетельствует о том, что препараты, полученные на основе мутанта DSM 5480 с высокой продуцирующей способностью обладают высокой эффективностью в отношении контрол€ личинок колорадского жука при полевых испытани€х.  ристаллы белка, продуцируемые штаммом с высокой продуцирующей способностью, про€вл€ют 100%-ную активность при использовании их в виде NOVODOR®FC при расходе 1,71 л, а также дают хорошие результаты при использовании их в виде TRIDENT'а при расходе 4,56 л и M-one' а при расходе 2,28 л.
‘ормула изобретени€: 1. ћутантный штамм бактерий Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis DSM 5480 - продуцент дельта-эндотоксина.
2. —пособ получени€ препарата на основе дельта-эндотоксина путем выращивани€ штамма бактерий Bacillus thuringiensis на питательной среде, содержащий источники углерода, азота и минеральные соли с последующим выделением продукта, содержащего дельта-эндотоксин, отличающийс€ тем, что из бактерий Bacillus thuringiensis используют штамм Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis DSM 5480.
3. —пособ по п.2, отличающийс€ тем, что продукт выдел€ют в индивидуальном виде или в комбинации с клетками бактерий и/или со спорами и смешивают его с наполнителем, приемлемым дл€ сельского хоз€йства.
4. ѕестицидна€ композици€, содержаща€ дельта-эндотоксин, отличающа€с€ тем, что она содержит дельта-эндотоксин, полученный из штамма бактерий Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis DSM 5480.
5. ѕестицидна€ композици€ по п.4, отличающа€с€ тем, что она дополнительно содержит разбавитель или носитель, приемлемый дл€ сельского хоз€йства.
6. ∆идка€ пестицидна€ композици€, отличающа€с€ тем, что она содержит разбавитель и дельта-эндотоксин, полученный на основе штамма Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis DSM 5480, с активностью не менее 15000 ед/г, что соответствует концентрации в препарате эндотоксина, активного по отношению к жесткокрылым насекомым, не менее 3,0 вес.%.
7. ∆идка€ пестицидна€ композици€ по п.6, отличающа€с€ тем, что она дополнительно содержит поверхностно-активное вещество.
8. “верда€ пестицидна€ композици€, содержаща€ дельта-эндотоксин и носитель, отличающа€с€ тем, что она содержит дельта-эндотоксин, полученный на основе штамма бактерий Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis DSM 5480, с активностью 50000 ед/г, что соответствует концентрации в препарате эндотоксина, активного по отношению к жесткокрылым насекомым не менее 10 вес.%.
9. “верда€ пестицидна€ композици€ по п.8, отличающа€с€ тем, что она дополнительно содержит поверхностно-активное вещество.
10. —пособ борьбы с вредными сельскохоз€йственными насекомыми путем обработки растений препаратом, содержащим дельта-эндотоксин, отличающийс€ тем, что используют препарат, содержащий дельта-эндотоксин, полученный на основе штамма бактерий Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis DSM 5480.
11. —пособ получени€ мутантных штаммов бактерий Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis продуцентов дельта-эндотоксина, отличающийс€ тем, что родительский штамм Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis обрабатывают мутагеном, обработанные мутанты выращивают на среде, способствующей получению аспорогенных и/или олигоспорогенных мутантов, из полученных колоний отбирают полупрозрачные колонии и из них бактерии пересеивают на твердую питательную среду, не содержащую летучие компоненты, выдерживают при температуре 90oC в течение часа, а затем инкубируют при температуре 30oC до получени€ аспорогенных колоний, из них отбирают клетки бактерий, засеивают на производственную питательную среду и отбирают штаммы, продуцирующие наибольшее количество дельта-эндотоксина.
12. —пособ по п.11, отличающийс€ тем, что в качестве мутагена используют ультрафиолетовые излучени€.
13. —пособ по п.11, отличающийс€ тем, что в качестве питательной среды, способствующей получению аспорогенных и/или олигоспорогенных мутантов, используют спорул€ционную среду, содержащую фосфат.
14. —пособ по пп. 11-13, отличающийс€ тем, что в качестве питательной среды дл€ пересева клеток бактерий используют среду NSMP, дополнительно содержащую 0,57 г/л MgCl2 и 20 г/л гельрита Kelco.
15. —пособ по пп.11-14, отличающийс€ тем, что в качестве родительского штамма используют штамм Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis DSM 2803.
ѕриоритет по пунктам:
17.11.89 - по пп.1, 2, 4, 5, 10-15 и п.3, исключа€ признак, касающийс€ выделение эндотоксина в комбинации с клетками и/или спорами;
12.12.89 - по пп.6-9 и п.3 - признак, касающийс€ выделени€ эндотоксина в комбинации с клетками или спорами.