Forbidden

You don't have permission to access /zzz_siteguard.php on this server.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛЬБУМИНА - Патент РФ 2140287
Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛЬБУМИНА
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛЬБУМИНА

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛЬБУМИНА

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Изобретение относится к медицине, а именно к производству медицинских биологических препаратов, и может быть использовано при получении альбуминов из неиспользуемых, балластных альбуминсодержащих фракций. Альбумин получают из неиспользуемых альбуминсодержащих осадков экстракцией осадков при рН 7,7-8,8 водой или раствором натрия хлорида в присутствии каприлат-иона в концентрации 0,7-2,0% с дальнейшим разделением смеси белков этиловым спиртом в конечной концентрации 8,0-17,0 об.%. Центрифугируют, концентрируют альбумин из центрифугата ультрафильтрацией, удаляют спирт диафильтрацией и полученный раствор подвергают осветляющей стерилизующей фильтрации. Технический результат: получение альбумина, не содержащего агрегатов, с электрофоретической чистотой более 98%, стабильный при хранении. 2 табл.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2140287
Класс(ы) патента: A61K38/38
Номер заявки: 98116173/14
Дата подачи заявки: 25.08.1998
Дата публикации: 27.10.1999
Заявитель(и): Государственное Унитарное Предприятие "Иммунопрепарат"
Автор(ы): Кудашева Г.Б.; Хакимова Ф.З.; Исрафилов А.Г.; Лютов А.Г.; Еникеева С.А.
Патентообладатель(и): Государственное Унитарное Предприятие "Иммунопрепарат"
Описание изобретения: Изобретение относится к медицине, а именно к производству медицинских биологических препаратов, и может быть использовано при получении альбуминов (A), из неиспользуемых, балластных альбуминсодержащих фракций.
A относится к категории препаратов, назначаемых пациентам по жизненным или неотложным показаниям - при шоке, острых кровопотерях, ожогах, нефротическом синдроме, поражении печени. В структуре маркетинга препаратов крови (1) - на долю A приходится - 45,1%.
Возможности увеличения производства A в настоящее время ограничены сырьевой базой - плазма крови. Поэтому многие фирмы и исследователи заняты как изменениями основного технологического процесса фракционирования плазмы с целью увеличения выхода A, так и поиском дополнительных источников сырья и разработкой специальных технологий применительно к каждому выбранному источнику выделения.
При фракционировании плазмы самым распространенным в мире методом Кона 6 многостадийный процесс осаждений приводит к значительной, до 20%, потере альбумина, который оказывается в балластных фракциях и практически не используется (2, 3). Это вынуждает вести работы по дополнительному выделению A из неутилизируемых в настоящее время альбуминсодержащих фракций плазмы - осадков IV-1, IV-4, IV-1,4 (по Кону, 1946), IV (по Кистлеру и Ничману, 1962), IV - "каприлатного осадка" (4). При этом качественные показатели выделяемого A по молекулярным параметрам, прозрачности, стабильности при хранении и другие должны соответствовать Национальным Фармакопеям, так как частота трансфузионных реакций прямо коррелирует как с увеличением содержания аггрегатов, так и с понижением электрофоретической чистоты (5).
Существует множество методов выделения A, но все они помимо положительных качеств не лишены и недостатков. Этанольные методы дополнительного извлечения A, например, из осадка фракции IV-4 по Кону используют критические концентрации этанола и предусматривают многочисленные стадии осаждения (6), что приводит к "антигенному" эффекту (5). Каприлатно-тепловые методы селективной денатурации балластных белков при выделении A из осадков IV-1, IV по Кону, имеют риск высоких рабочих температур - от 45 до 75oC и предполагают длительное выдерживание в этих условиях - до 3 ч (7), либо осложнены многочисленными дополнительными стадиями (8) - обработкой риванолом, неорганическим сорбентом, катионообменником, что значительно удлиняет производственный процесс, снижает выход и несет возможность денатурации и полимеризации A. Хроматографические способы дополнительного извлечения A, например, из осадка IV по Кону предусматривают одновременное использование трех различных хроматографических сорбентов (9), что также значительно продлевает и усложняет технологический процесс, несет опасность пирогенизации конечного продукта и приводит к удорожанию препарата. Применение миндальной кислоты для очистки осадков (10) не разрешено фармакопеей и нуждается в токсикологической сертификации в России.
Общепризнано, выделение A из плазмы является более легкой процедурой, чем его извлечение из балластных осадков, содержащих денатурированные белки и повышенные концентрации труднорастворимых липопротеинов и гликопротеинов. Поэтому использование в качестве фракционирующего агента одного этанола бывает недостаточным.
С другой стороны дополнительное или совместное с этанолом использование иных фракционирующих агентов - трихлоруксусной кислоты (11) или хлороформа (12) при выделении препаратов A, по мнению некоторых исследователей, остается под вопросом. Поскольку трихлоуксусная кислота (13) и хлороформ (14), энергично связываются с осаждаемым или очищаемым ими A, а указанные вещества являются высокотоксичными соединениями. Следовательно, применение таких A в качестве препаратов проблематично. По мнению тех же авторов, A теряет при обработке хлороформом, трихлоруксусной кислотой свою функциональную активность.
Поэтому более предпочтительным для очистки A одновременное использование этанола и каприлат-иона. Тем более, что более чем 40 летний опыт использования каприлата натрия в качестве стабилизатора A при пастеризации и его присутствие в конечном препарате показало отсутствие побочных эффектов.
Наиболее близким техническим решением предлагаемому способу получения A является метод (15), включающий следующие технологические этапы: проводят экстракцию альбуминсодержащего - осадка при pH 2,0-7,5 водой или раствором натрия хлорида, разделяют смесь белков этиловым спиртом в концентрации 18-35% (по объему) в присутствии каприлат-иона 0,1-0,6% при 0-30oC и pH 2,0-5,0. Отделяют осадок центрифугированием с последующим извлечением альбумина из центрифугата осаждением. Концентрируют и отделяют спирт известными приемами. Препарат подвергают осветляющей и стерилизующей фильтрации.
Данный способ очистки A снижает pH до 2,0-5,0, при котором возможна максимальная очистка от гемпигментов, контаминантных протеаз. Используемая при этом температура - не более 30oC и не менее 0oC, и всего одна стадия осаждения A позволяет отнести указанный метод к наиболее экономичным. Кроме того, каприлатные способы выделения A гарантируют не только инактивацию (16) возможно присутствующих вирусов, но и их удаление (17) из препарата A.
Однако данный "каприлатный" способ был разработан применительно к растворам белков, содержащим относительно высокие концентрации A: непосредственно к плазме или к центрифугатам II+III по Кону, после удаления фракции иммуноглобулинов. A, полученный этим способом из неиспользуемых осадков характеризовался наличием агрегатов, нестабильностью при хранении, более низкой электрофоретической чистотой.
В отличие от плазмы - стандартного источника сырья, существующей в виде раствора и готовой для фракционирования, осадки, содержащие A, необходимо перевести в максимально растворимое состояние на начальной стадии выделения препарата. Поэтому на стадии экстракции балластных осадков, обычно труднорастворимых в стандартных растворах со слабокислым или нейтральным pH - pH 4,8-7,5 (18,19), используют щелочной pH от 9,0 до 12,0 (20), что, помимо более полного растворения осадков, приводит к полимеризации, денатурации и утрате функциональной активности A.
Задачей, на решение которой направлено изобретение, является разработка способа дополнительного получения препарата A из отходов производства - альбуминсодержащих неиспользуемых осадков.
Технический результат заключается в получении препарата A не содержащего агрегатов, с электрофоретической чистотой более 98% и стабильного при хранении. Кроме того, заявляемый способ позволяет получить высокий выход конечного продукта при низкой стоимости препарата.
Сущность метода заключается в следующем.
Альбумин получают из неиспользуемых альбуминсодержащих осадков, экстракцией осадков при pH 7,7-8,8 водой или раствором натрия хлорида в присутствии каприлат-иона в концентрации 0,7-2,0% с дальнейшим разделением смеси белков этиловым спиртом в конечной концентрации 8,0-17,0 об.%. Центрифугируют, концентрируют альбумин из центрифугата ультрафильтрацией, удаляют спирт диафильтрацией и полученный раствор подвергают осветляющей, стерилизующей фильтрации.
В отличие от прототипа, в заявляемом способе экстракцию альбумина из альбуминсодержащих неутилизируемых осадков ведут в присутствии каприлат-иона 0,7-2,0% при pH 7,7-8,8, осаждение примесных и денатурированных белков осуществляют при концентрации этанола 8,0-17,0%, минуя стадию осаждения альбумина концентрируют его ультрафильтрацией и проводят удаление спирта диафильтрацией.
Совокупность отличительных признаков заявляемого способа позволили получить следующие преимущества. Применение каприлат-иона в концентрации 0,7-2,0% на начальной стадии фракционирования в качестве экстрагирующего иона приводит к более полному избирательному растворению неденатурированного A.
Увеличение pH до 7,7-8,8 при экстракции создает оптимальные условия для максимального растворения осадков и увеличивает выход неагрегированного альбумина.
Так как в осадках по сравнению с плазмой содержится повышенное содержание примесей, то сохранение указанной концентрации каприлатиона (0,7-2,0%) на стадии разделения белков этанолом - способствует увеличению электрофоретической чистоты A, а снижение концентрации этилового спирта до 8,0-17,0% - обеспечивает увеличение выхода A и предотвращает агрегацию и повышенную димеризацию.
Вместо проведения концентрирования и удаления спирта из A, подвергнутого осаждению этанолом, т. е. лишенного каприлат-иона с центрифугатом, в предлагаемом способе применяется ультрафильтрация в присутствии каприлат-иона (стабилизатора), что сохраняет мономерность, стабильность A в процессе ультрафильтрации и диафильтрации.
Как видно из представленных данных (табл. 1 в конце описания) использование предлагаемого способа в отличие от способа прототипа позволяет получать препарат A не содержащий агрегаты, с высокой электрофоретической чистотой более 98%, минимальным содержанием димеров - менее 3%, большим содержанием мономеров - более 97%. Сравнение с прототипом наглядно показывает значительное увеличение выхода альбумина с 1 кг различных типов осадков.
Важным для препарата альбумина является не только нативность свежеприготовленного альбумина, но и стабильность его во время хранения. Тест на стабильность - измерение мутности (прозрачности) при прогревании в течение 50 ч при 57oC, рассматривался в качестве аналога условий хранения. Представленные данные по термостабильности в табл. 2 (см. в конце описания) указывают на отсутствие достоверных различий в прозрачности альбумина, полученного согласно заявляемого способа в отличие от способа прототипа.
Достигнутые результаты объясняются применением каприлат-иона на всех стадиях процесса: - начальной - экстракции, разделения смеси белков этанолом, ультрафильтрации, диафильтрации, осветляющей и стерилизующей фильтрации, что обусловлено стабилизацией жирной кислотой или анионным детергентом (каприлатом натрия) открытых гидрофобных участков в молекуле A - гидрофилизацией и увеличением отрицательного заряда молекул альбумина - одноименное отталкивание белковых молекул.
Способ осуществляют следующим образом.
В качестве сырья используются любые альбуминсодержащие неиспользуемые осадки, полученные различными методами. Источниками сырья могут выступать альбумин-содержащие фракции плазмы в виде осадков, например, - IV-1, IV-4, IV-1,4 (по Кону, 1946), IV (по Кистлеру и Ничману, 1962), IV - "каприлатный осадок" (денатурированный осадок белков, образуемый в присутствии каприлата натрия) и другие.
Фракцию осадка разрушают на кусочки и гомогенизируют в пропорции от 4 до 10 л экстрагента на кг пасты в экстрагирующем растворе, с pH 7,7-8,8 и концентрацией хлорид-иона от 0 до 0,2 М, каприлат-иона 0, 7-2, 0%, поддерживая указанный pH во время растворения осадка. Экстракцию ведут при температуре от 0 до 15oC, в течение 12±6 ч. В полученный раствор белков вводят этанол с температурой от минус 40 до 0oC до концентрации 8,0-17,0% (объемных). В качестве источника этанола возможно использование отхода производства - центрифугата A1 или 1 (21), содержащего 24-26% этанола и используемого в технологии получения иммуноглобулинов для удаления остатков альбумина. Затем в смеси устанавливают температуру 0-30oC и pH 2-5. Отделяют осадок центрифугированием с последующим концентрированием альбумина из центрифугата ультрафильтрацией и удалением спирта диафильтрацией на плоскорамниках или полых волокнах или спиральных картриджах с пределом задержания 10-50 КДа при температуре 0-45oC и pH 5,2- 7,6. В полученный раствор альбумина добавляют каприлат натрия до концентрации 0,3% после его количественного определения (22) и подвергают осветляющей и стерилизующей фильтрации.
Определение молекулярных параметров альбумина - содержания полимеров, димеров, мономеров, фрагментов осуществлялось согласно требований Европейской Фармакопеи (23) методом гель-фильтрации на Ультрагеле AсA34 (Serva, ФРГ). Электрофоретическая чистота A определялась на ацетат-целлюлозной пленке согласно Немецкой Фармакопее (24). Тест на стабильность - по измерению мутности при прогревании при 57oC в течение 50 ч (25).
Пример 1. Сырье - 63 кг осадка IV (4), отход производства альбумина из гемолизированного сырья, суспендируют в 630 л дистиллированной воды с pH 8,8, содержащей 0,8% каприлат-иона, при температуре 1oC в течение 12 ч, поддерживая указанный pH 8,8 во время экстракции. В полученный раствор, объемом 680 л вводят этанол с температурой минус 30oC до концентрации 17% (146 л 96% этанола) со скоростью 30 л/ч. Белково-спиртовую смесь подогревают до температуры 16oC и смещают pH до 3,3, перемешивают 15 минут, повышают pH до 4,6 и центрифугируют. Увеличивают pH до 7,3 и концентрируют центрифугат до 7% белка ультрафильтрацией на полых волокнах ВПУ-15000 Да. Удаляют этанол диафильтрацией против 5 объемов дистиллированной воды при температуре 10oC и осуществляют окончательное концентрирование до 12% по содержанию белка. Доводят содержание каприлата натрия до 0,3% путем добавления 10%-ного раствора каприлата, белка до 10%, натрия хлорида до 0,6%, и подвергают осветляющей и стерилизующей фильтрации. Получают 37,93 л 10%-ного раствора альбумина (выход 60,2 г альбумина с 1 кг осадка IV) со следующими характеристиками: молекулярные параметры - агрегаты 0, димеры - 2,29, мономеры - 97,71, фрагменты - 0%; электрофоретическая чистота - 99,5%; прозрачность (E 1 см, 10%) до прогрева при 57oC 50 ч - 0,036, после прогрева - 0,036.
Пример 2. Сырье - 60 кг осадка IV-1 по Кону, отход производства альбумина, суспендируют в 240 л дистиллированной воды с pH 7,7, содержащей 2,0% каприлат-иона, при температуре 10oC в течение 6 ч, поддерживая указанный pH во время экстракции. В полученный раствор, объемом 288 л приливают равный объем центрифугата A1 (21), содержащего 2,0% каприлата натрия, с температурой минус 20oC до концентрации этанола около 12%. Белково-спиртовую смесь подогревают до температуры 18oC и смещают pH до 4,6 и центрифугируют. Увеличивают pH до 5,3 и концентрируют центрифугат до 6% белка ультрафильтрацией на спиральном картридже S40Y30 (Amicon, США) при температуре 4oC. Удаляют этанол диафильтрацией против 4 объемов дистиллированной воды при температуре 8oC и осуществляют окончательное концентрирование до 7% по содержанию белка. Доводят содержание каприлата натрия до 0.3% путем добавления 10%-ного раствора каприлата, белка до 5%, натрия хлорида до 0,8%, pH до 7,0 и подвергают осветляющей и стерилизующей фильтрации. Получают 36,60 л 5%-ного раствора альбумина (выход 30,5 г альбумина с 1 кг осадка IV-1) со следующими характеристиками: молекулярные параметры - агрегаты 0, димеры - 2,26, мономеры - 97,74, фрагменты - 0%; электрофоретическая чистота - 99,4%: прозрачность (E 1 см, 10%) до прогрева при 57oC 50 ч - 0,035, после прогрева - 0, 035.
Пример 3. Сырье - 60 кг осадка IV-4 по Кону, отход производства альбумина, суспендируют в 300 л дистиллированной воды с pH 8,3, содержащей 1,4% каприлат-иона, при температуре 15oC в течение 7 ч, поддерживая указанный pH во время экстракции. В полученный раствор, объемом 348 л, приливают 174 л центрифугата A1 (21), содержащего 1,4% каприлата натрия, с температурой минус 15oC до концентрации этанола около 8%. Белково-спиртовую смесь отепляют до температуры 14oC и смещают pH до 4,4 и центрифугируют. Увеличивают pH до 6,6 и концентрируют центрифугат до 8% белка ультрафильтрацией на плоскорамниках с мембранами УПМ-50000 Да при температуре 4oC. Удаляют этанол диафильтрацией против 6 объемов дистиллированной воды при температуре 6oC и осуществляют окончательное концентрирование до 22% по содержанию белка при температуре 45oC. Доводят содержание каприлата натрия до 0,3% путем добавления 10%-ного раствора каприлата, белка до 20% и подвергают осветляющей и стерилизующей фильтрации. Получают 7,65 л 20%-ного раствора альбумина (выход 25,5 г альбумина с 1 кг осадка IV- 4) со следующими характеристиками: молекулярные параметры - агрегаты 0, димеры - 2,30, мономеры - 97,70, фрагменты - 0%; электрофоретическая чистота - 99,2%; прозрачность (E 1 см, 10%) до прогрева при 57oC 50 ч - 0,034, после прогрева - 0,034.
Предложенная технология переработки неутилизируемых осадков для получения альбумина в присутствии стабилизатора на всех стадиях технологического процесса позволяет получать препарат, не содержащий агрегатов, с высокой электрофоретической чистотой - более 98% и стабильный при хранении.
Источники информации
1) Faure A. Human blood Fractionation. 8th International Biotechnology Symposium, Paris, 1988, 669-678.
2) More J.E., Harvey M.J. Purification Technologies for human plasma albumin. Cold ethanol fractionation. In: Blood separation and plasma fractionation, Ed. J.R. Harris, 1991, Wiley-Liss, Inc., 255-256.
3) Vogelaar E. F. , Brummelhuis H.G.J., Beentjes S.P. and Krunen H.W. Contributions to the optimal use of human blood. Vox sang, 1972, 23, 481-492.
4) Опытно-промышленный регламент производства раствора альбумина 5%, 10%, 20% из гемолизированной плазмы и сыворотки. -М., 1978.
5) Schneider W. , Wolter D., McCarty L.J. Heat-ethanol isolated serum albumin: discussion. Folia Haematol., Leipzig, 1977, 104, 1, 119-120.
6) Типовой комплексный регламент производства белковых препаратов донорской крови. Приложение 17. Дополнительное извлечение альбумина из осадка фракции IV-4. М., 1979, 295.
7) Способ получения альбумина. Патент СССР N 743564, A 61 K 37/02. 25.06.80.
8) Метод получения раствора протеинов, стабильных к температурной обработке. Патент США N 4017470, A 61 K 37/02. 12.04.1977.
9) Eriksson S., Berglof J.H., Hamalainen E., Suomela H. Recovery of human albumin from Cohn fraction IV paste. Separation of plasma proteins. Ed. by J.M. Curling. Plenary lectures and posters presented at the Joint Meeting of the 19th Congress of the International Society of Haematology and the 17th Congress of the International Society of Blood Transfusion, Budapest, August 1-7, 1982. Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sweden, 1983, 90-94.
10) Способ выделения альбумина. АС РФ N 1127525 A, A 61 K 37/02.
11) Способ получения альбумина. АС N 591126, F 61 R 37/02. 30.01.78.
12) Therniault D.G., Taylor J.F. Dimerization of serum albumin on extraction with an organic solvent. Blochem. and Biophys Res. Communs, 1960, 3, 5, 560-565.
13) Scatchard G., Black E.S. J.Phys. Colloid. Chem. 1949, 53, 1, 88-99.
14) Способ очистки сывороточного альбумина. Патент РФ N 2007423 C1, C 07 K 3/12. 15.02.94.
15) Способ получения сывороточного альбумина. АС РФ N 467536, A 61 K 23/02.
16) Lundblad J.L., Sing R.L. Inactivation of lipid-enveloped viruses in proteins by caprylate. Vox Sang, 1991, 60, 75-81.
17) Патент ЧССР N 239715. Способ производства инфузионного раствора сывороточного альбумина. A 61 K 37/02. 13.06.85.
18) Schneider W., Lefevre H., Fiedler H. and McCarty L.J. An alternative method of large scale plasma fractionation for the isolation of serum albumin. Blut, 1975, 30, 121-134.
19) Harvey M. J., Brown R.A., Rott J., Lloyd D., Lane R.S. The purification of albumin by affinity chromatography. Separation of plasma proteins. Ed. by J.M. Curling. Plenary lectures and posters presented at the Joint Meeting of the 19th Congress of the International Society of Haematology and the 17th Congress of the international Society of Blood Transfusion, Budapest, August 1-7, 1982. Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sweden, 1983, 80-88.
20) Способ получения альбумина ветеринарного. Патент РФ N 2055523 C1, A 61 B 10/00. 10.03.96.
21) Типовой комплексный регламент производства белковых препаратов донорской крови. Получение иммуноглобулина. М., 1979, 169.
22) Yu M.W., Finlayson J.S. Quantitative determination of the stabilizers octanolc acid and N-acetyl-DL-tryptophan in human albumin products. J. Pharm. Sci., 1984, 73, 82-86.
23) European Pharmacopoeia (EP), 1995, 255-255-5.
24) Deutsches Arzneibuch 10. Ausgabe 1991 mit 2. Nachtrag 1993 Monographien A-F, Grundlfg. (V. 6. 21).
25) Hao Y.L. A simple method for the preparation of human serum albumin. Vox Sang, 1979, 36, 313-320.
Формула изобретения: Способ получения альбумина из альбуминсодержащих неиспользуемых осадков, включающий экстракцию осадка водой или раствором натрия хлорида, разделение смеси белков этиловым спиртом в присутствии каприлат-иона, центрифугирование, осветляющую и стерилизующую фильтрацию, отличающийся тем, что экстракцию осадков ведут при pH 7,7 - 8,8 в присутствии каприлат-иона в концентрации 0,7 - 2,0%, осаждение примесей ведут при концентрации этанола 8,0 - 17,0 об. %, альбумин из центрифугата концентрируют ультрафильтрацией и удаляют спирт диафильтрацией.