Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЫВОРОТКИ ДЛЯ СЕРОДИАГНОСТИКИ ЯЩУРА ТИПА A
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЫВОРОТКИ ДЛЯ СЕРОДИАГНОСТИКИ ЯЩУРА ТИПА A

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЫВОРОТКИ ДЛЯ СЕРОДИАГНОСТИКИ ЯЩУРА ТИПА A

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Изобретение предназначено для серодиагностики ящура типа А. Для получения сыворотки используют морских свинок или кроликов. Предварительно животных-доноров заражают адаптированным к ним вирусом. Затем подвергают гипериммунизации. Вводят препарат, содержащий антигенный материал из штамма 1707 "Армения-98" и адъювант. Периодичность и количество доз устанавливают достаточными для образования в крови животных-доноров специфических антител. Вирус для гипериммунизации выращивают в суспензионной культуре клеток ВНК-21. Полученный вирус очищают, концентрируют и инактивируют. Для гипериммунизации животных-доноров используют антиген с активностью в РСК не менее 1 : 16. В качестве адъюванта используют сапонин, его аналоги или масляные адъюванты. Через 10 дней после гипериммунизации животных-доноров обескровливают и получают сыворотку крови. Изобретение повышает активность и специфичность препарата. 1 з.п. ф-лы, 4 табл., 2 ил.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2140290
Класс(ы) патента: A61K39/42, C07K16/08, C12N7/00, G01N33/569
Номер заявки: 99105414/13
Дата подачи заявки: 15.03.1999
Дата публикации: 27.10.1999
Заявитель(и): Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных
Автор(ы): Захаров В.М.; Спирин В.К.; Гриценко А.И.; Маслова Н.С.; Кошецян Т.Ф.
Патентообладатель(и): Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных
Описание изобретения: Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к ветеринарной иммунологии, и может быть использовано в производстве диагностических сывороток для определения типовой и штаммоспецифической принадлежности вируса ящура в серологических реакциях.
Известно, что для приготовления сывороток для лабораторной диагностики ящура, дифференциации его от других везикулярных болезней и идентификации типовой принадлежности возбудителя (типирования) в качестве производственных используют штаммы вируса ящура, принятые в России и странах СНГ в качестве вакцинных и являющиеся наиболее изученными представителями вируса 7 иммунологических типов. При изготовлении сывороток для идентификации штаммовой принадлежности вируса ящура в качестве производственных используют оригинальные отечественные штаммы эпизоотического вируса, отличающиеся от вакцинных, а также некоторые актуальные для России и стран СНГ штаммы из сопредельных государств.
Известны способы получения диагностических сывороток с использованием разных схем гипериммунизации морских свинок или кроликов ящурным антигеном и применением различных адъювантов.
Известен способ получения ящурных диагностических сывороток, который включает следующие этапы. Вначале заражают морских свинок массой 450-500 г введением в кожу подушечек задних конечностей 0,2 мл 10% суспензии афтозного вируса ящура. Затем отбирают в качестве продуцентов сыворотки морских свинок, заболевших генерализованной формой ящура. Через 30-45 дней отобранным морским свинкам 2-3 раза внутримышечно в область бедра вводят 20% суспензию афтозного вируса на 1/15 М фосфатном буферном растворе сапонина. Через 10 дней после последней иммунизации животных обескровливают и получают иммунную сыворотку (1).
Известен также способ изготовления стандартных гипериммунных сывороток для определения типов вируса ящура реакцией связывания комплемента, включающий гипериммунизацию кроликов вирусом ящура типа A, предварительно адаптированным к 5-8-дневным крольчатам, в дозе 2 мл 3-4 раза с интервалом в 6-7 дней. На 8-10 день после последней инъекции сыворотку кроликов проверяют на активность в РСК. При положительных результатах кроликов обескровливают для получения типоспецифических сывороток (2).
Известен также способ получения сывороток для серодиагностики ящура животных, включающий иммунизацию кроликов введением 10% суспензии вируса ящура на физиологическом растворе (вирус для гипериммунизации получают из мышечной ткани крольчат, прошедших не менее 12 пассажей). Суспензию вируса вводят кроликам-продуцентам одновременно внутримышечно и внутривенно в области бедра и ушную вену по 2 мл. Всего делят шесть инъекций вируса с интервалом между введениями 8 дней. Забор крови осуществляют на 10 день после последней инъекции. Полученные сыворотки проверяют в РСК на активность и специфичность (3).
Известен также способ получения сыворотки для серодиагностики ящура типа A, включающий иммунизацию кроликов путем введения в их организм препарата, содержащего антигенный материал с адъювантом, с периодичностью и количеством доз, достаточных для образования в крови животных специфических антител, последующее их обескровливание и отделение целевого продукта. В качестве антигеносодержащего материала используют высококонцентрированный лапинизированный вирус или фракции 146S антигенов культурального вируса ящура, эмульгированный с масляным адъювантом до получения стабильной эмульсии типа "вода в масле". Препарат вводят кроликам по 1-2 мл в межпальцевые ткани задних конечностей (по 0,1-0,2 мл в каждую точку инъекции). Доза 146S антигена на одного донора - не менее 50 мкг. Нефракционированный высокоочищенный концентрат лапинизированного вируса с активностью в РСК 1:16 и выше содержит такое же количество 146S антигена в 1 мл. Спустя 28 дней кроликов прививают повторно внутримышечно в область бедра двойной дозой исходного препарата 146S антигена в объеме 2-5 мл с добавлением в качестве адъюванта 2,5-5 мг сапонина. Через 10 дней животных обескровливают и получают сыворотку крови. Полученная сыворотка может быть использована в качестве исходного сырья для выделения иммуноглобулина (4).
Известен также способ получения сыворотки для серодиагностики ящура животных, включающий иммунизацию кроликов путем введения в их организм в качестве антигенсодержащего материала коммерческой инактивированной эмульсионной вакцины против ящура животных с концентрацией 146S антигена, равной 32-120 мкг/мл. Кроликов иммунизируют данной вакциной внутримышечно дважды с интервалом между инъекциями 21-24 дня. Животных обескровливают через 7-8 дней после повторной инъекции антигена (1).
Недостатки известных способов получения сыворотки для иммунодиагностики ящура состоят в том, что они не позволяют получить сыворотку высокой активности и специфичности по отношению к вирусу ящура типа A, циркулирующего в странах Закавказья и Ближнего Востока.
Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существующих признаков является способ получения сыворотки для серодиагностики ящура типа A, включающий иммунизацию морских свинок путем введения в их организм препарата, содержащего антигенный материал из штамма вируса A22 N 550 с адъювантом, с периодичностью и количеством доз, достаточных для образования в крови животных специфических антител, последующее их обескровливание и отделение целевого продукта. Для иммунизации используют 10-20% суспензию афтозного вируса, полученного от морских свинок в течение 24-48 часов после заражения соответствующим штаммом. Суспензию готовят на забуференном физиологическом растворе с добавлением 0,4-0,8% сапонина. Кроме сапонина в качестве адъюванта могут быть использованы его аналоги или масляные адъюванты типа неполного адъюванта Фрейнда, которые смешивают с вирусной суспензией в равных объемах. Смесь вируса с адъювантом вводят морским свинкам в объеме 1 мл внутримышечно в область бедра дважды с интервалом 5-7 дней. Спустя 7-10 дней свинок тотально обескровливливают и получают сыворотку. Полученную сыворотку инактивируют при 56-58oC в течение 30 минут, консервируют хинозолом (1: 1000) и выдерживают при 2-8oC не менее 20 дней. Полученная сыворотка может быть использована в качестве исходного сырья для выделения иммуноглобулина (4).
Недостатки способа-прототипа состоят в том, что он также не позволяет получить сыворотку высокой активности и специфичности по отношению к вирусу ящура типа A, выделенного в 1998 году на территории Республики Армения и имеющего антигенные отличия от штамма A22N550 в РСК и реакции серонейтрализации (РН). Это свидетельствует о несоответствии используемых диагностических сывороток эпизоотическому вирусу, циркулирующему в странах Закавказья и Ближнего Востока (Иран, Турция).
В задачу создания настоящего изобретения входила разработка способа получения сыворотки для серодиагностики ящура животных, обладающей высокой активностью и специфичностью по отношению к эпизоотическому вирусу ящура типа A, циркулирующему в странах Закавказья и Ближнего Востока.
Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в повышении активности и специфичности сыворотки.
Указанный технический результат достигнут созданием способа получения сыворотки для серодиагностики ящура животных, охарактеризованного следующей совокупностью признаков:
1) способ получения сыворотки для серодиагностики ящура типа A;
2) иммунизация животных-доноров путем введения в их организм препарата, содержащего эффективное количество антигенного материала с адьювантом;
3) в качестве антигенного материала используют штамм N 1707 "Армения-98-ДЕП" вируса ящура типа A;
4) для иммунизации животных-доноров используют антиген с титром в РСК не менее 1:16;
5) препарат вводят в организм животных-доноров с периодичностью и количеством доз, достаточных для образования в крови животных специфических антител;
6) в качестве животных-доноров используют морских свинок;
7) морских свинок используют массой 450-500 г;
8) в качестве животных-доноров используют кроликов;
9) кроликов используют массой 2,5-3,0 кг;
10) обескровливание животных-доноров;
11) отделение целевого продукта.
Предлагаемое изобретение включает совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:
1) способ получения сыворотки для серодиагностики ящура типа A;
2) иммунизация животных-доноров путем введения в их организм препарата, содержащего эффективное количество антигенного материала с адъювантом;
3) в качестве антигенного материала используют штамм N 1707 "Армения-98-ДЕП" вируса ящура типа A;
4) препарат вводят в организм животных-доноров с периодичностью и количеством доз, достаточных для образования в крови животных специфических антител;
5) обескровливание животных-доноров;
6) отделение целевого продукта.
Предлагаемое изобретение характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы его выполнения:
- для иммунизации животных-доноров используют антиген с титром в РСК не менее 1:16.
Признаками изобретения, характеризующими предлагаемый способ и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:
1) способ получения сыворотки для серодиагностики ящура типа A;
2) иммунизация животных-доноров путем введения в их организм препарата, содержащего эффективное количество антигенного материала с адъювантом;
3) препарат вводят в организм животных-доноров с периодичностью и количеством доз, достаточных для образования в крови животных специфических антител;
4) обескровливание животных-доноров;
5) отделение целевого продукта.
По сравнению со способом-прототипом существенными отличительными признаками изобретения являются:
1) в качестве антигенного материала используют штамм N 1707 "Армения-98-ДЕП" вируса ящура типа A;
2) штамм N 1707 "Армения-98-ДЕП" вируса ящура типа А берут в эффективном количестве.
Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы его выполнения:
- для иммунизации животных-доноров используют антиген с титром в РСК не менее 1:16.
По сравнению с прототипом предлагаемый способ позволяет получить сыворотку, обладающую высокой активностью и специфичностью по отношению к вирусу ящура типа A, циркулирующему в странах Закавказья и Ближнего Востока.
Экспериментально подтверждена возможность использования предлагаемого способа для получения сыворотки для серодиагностики вируса ящура типа A.
Исходный вирус для получения штамма N 1707 "Армения-98" вируса ящура типа A выделен 01.08.98г. от больных коров в хозяйстве Охчик Амассийского района Республики Армения. Производственный штамм A N 1707 "Армения-98" получен путем многократных последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток. Штамм A N 1707 по данным РСК, РН и результатам секвенирования участков генома значительно отличается от производственного штамма A22N550 (R составило 8-45% соответственно, а степень нуклеотидных различий - 18%), а также от других штаммов вируса ящура типа A, имеющихся в коллекции ВНИИЗЖ. Полученный штамм депонирован в Коллекции микроорганизмов Всероссийского научно- исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов Министерства сельского хозяйства и продовольствия Российской Федерации (ВГНКИ) 12.11.98 г. под регистрационным номером 1707 "Армения-98-ДЕП". Штамм A N 1707 "Армения-98" обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации и обеспечивает получение диагностических препаратов, позволяющих серологическую диагностику изолятов вируса ящура типа A, вызывающего вспышки заболевания в последние годы в странах Закавказья и Ближнего Востока.
Сущность изобретения пояснена на графических материалах, где на:
фиг. 1 представлена аминокислотная последовательность белка VP1 штамма N 1707 "Армения-98" вируса ящура типа A (* - аминокислота не определена);
фиг. 2 изображена дендрограмма, отражающая структурное сходство участка гена VP1 штамма N 1707 "Армения-98" вируса ящура типа A с аналогичными фрагментами геномов других штаммов вируса ящура типа A.
Штамм N 1707 "Армения-98" вируса ящура типа A характеризуется следующими признаками и свойствами.
Морфологические свойства
Штамм A N 1707 "Армения-98" относится к семейству Picornaviridae, роду Aphtovirus, серотипу A и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 23-25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.
Антигенные свойства
По своим антигенным свойствам штамм A N 1707 "Армения-98" относится к серотипу A. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотках крови образуются антитела, выявляемые в РДП, ИФА, РН. При вакцинации КРС вакциной из инактивированного вируса индуцирует образование специфических антител, выявляемых в ИФА, РДП, РН. При гипериммунизации морских свинок концентрированным инактивированным вирусом индуцирует образование вирусспецифических антител, выявляемых в РСК в разведении 1:256 и в ИФА в разведении 1:6000.
При определении антигенного соответствия штамма A N 1707 "Армения- 98" с производственными штаммами и полевыми изолятами вируса ящура типа A, выделенными на протяжении 1962-1998 гг. на территории стран СНГ и ряда других государств мира, было проведено сравнительное исследование первичной структуры гена и белка VPI. Сравнительный анализ установленных структур штамма A N 1707 "Армения-98" и эпизоотических изолятов, выделенных в последние годы в Турции и Иране (А-Иран-96, А-Турция-97, А-Турция-98), показал, что оба изолята А-Армения-98 идентичны между собой и отличаются от изолятов А-Турция-97, А-Турция-98 и А-Иран-96 по трем, четырем и семи нуклеотидным основаниям соответственно. Замена в 156 кодоне является значимой и приводит к изменению треонина на аланин (фиг. 1).
Филогенетические взаимоотношения исследованных изолятов с ранее изученными штаммами, выделенными в разных странах мира за три последние десятилетия, указаны на дендрограмме (фиг.2). Установлено, что исследованные изоляты существенно отличаются от всех выделенных ранее изолятов, в том числе и от вируса подтипа A22, куда относится используемый в настоящее время для изготовления средств диагностики и специфической профилактики производственный штамм A22N550. Антигенное родство вируса ящура A N 1707 "Армения-98" с соответствующими производственными и ранее выделенными штаммами на территории Турции и Ирана изучено в РСК. Полученные результаты представлены в таблице 1.
Как свидетельствуют данные, представленные в таблице 1, вирус A N 1707 "Армения-98" отличается как от производственных, так и от ранее выделенных эпизоотических штаммов.
Аналогичное изучение антигенного родства выделенного штамма было проведено в РН, где в качестве иммунных использовались сыворотки реконвалесцентов КРС на вирусы штаммов A N 1707 "Армения-98", А-Иран-87 и A22N550. Результаты этих исследований представлены в таблице 2.
Приведенные в таблице 2 данные подтверждают антигенное отличие выделенного штамма от производственного штамма A22N550 и эпизоотического штамма, выделенного в Иране в 1987 году.
Биотехнологические характеристики
Штамм A N 1707 "Армения-98" проявляет высокую биологическую, антигенную и иммуногенную активность как в нативном виде, так и после инактивации. Штамм предназначен для использования в качестве сырья для получения диагностических сывороток и антигенных препаратов, а также изготовления инактивированной противоящурной вакцины. Вирус штамма A N 1707 репродуцируется в монослойных культурах первично- трипсинизированной культуры клеток почки свиньи (СП), перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), JB-RS-2, ВНК-21 и в течение 20-24 часов инкубирования накапливается до 7,0-8,0 lg ТЦД50/мл. При массированном заражении вызывает ЦПД через 4 часа. После 3-4 пассажей инкубирования накапливается до 6,0-8,0 lg ТЦД50/мл. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 10 пассажей.
Хемо- и генотаксономическая характеристика
Штамм A N 1707 "Армения-98" является РНК-содержащим вирусом с мол. массой 7·106Д. Нуклеиновая кислота представлена одноцепочечной линейной молекулой мол. массой 2,8·108 МД. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP1, VP2, VP3 и VP4. Липопротеидная оболочка отсутствует.
Основным антигенным белком является VP1. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники в свою очередь расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 6 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VPб6а) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.
Проведено определение первичной структуры участка генома вируса с помощью ПЦР и сиквенса (фиг. 1). Сравнительный анализ показал, что штамм отличается от штамма А-Турция-98, А-Турция-97 и А-Иран-96 по трем, четырем и семи нуклеотидным основаниям соответственно.
Установлено, что армянский изолят вируса ящура имеет наибольшую степень гомологии первичной структуры гена и белка VP1 с изолятами А-Турция-98. Две замены (в 67 и 174 кодонах) из трех, отличающих вирус ящура А-Армения-98 и А-Турция-98, являются молчащими, тогда как замена в 156 кодоне является значимой и приводит к изменению треонина на аланин. Исследуемый изолят существенно (18% различий) отличается от производственного штамма A22N550 и других вариантов и штаммов вируса ящура A5, A10, A12, A24, A32, AN1640 Узбекистан-91 и др.
Физические свойства
Масса вириона - 8,4·10-18 г. Коэффициент седиментации - 146S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность - 1,45 г/мл.
Устойчивость к внешним факторам
Вирус штамма A N 1707 "Армения-98" устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и др. органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при pH 7,0-7,6. Сдвиги pH как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам.
Дополнительные признаки и свойства
Иммуногенная активность. Ииммуноген в составе инактивированной вакцины.
Реактогенность. Реактогенными свойствами не обладает.
Патогенность. Патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, морских свинок.
Вирулентность. Вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.
Стабильность. Сохраняет исходные биологические свойства; при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 10 пассажей.
Исходя из полученных данных, можно утверждать, что штамм A N 1707 "Армения-98" по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным вариантом вируса ящура типа A. Для снижения его эпизоотической опасности необходима своевременная лабораторная диагностика вновь возникающих очагов болезни, для чего необходимы высокоактивные и специфичные антительные диагностикумы.
Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источник, характеризующийся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемого изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа, как наиболее близкого по совокупности признаков аналога, позволило установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемого способа, изложенных в независимом пункте формулы изобретения.
Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности "новизна".
Для проверки соответствия предлагаемого способа условию патентоспособности "изобретательский уровень" проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть независимого пункта формулы изобретения.
Результаты поиска показали, что предлагаемый способ не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого изобретения), а также не выявлено влияния предусматриваемых существенными признаками предлагаемого изобретения преобразований для достижения технического результата.
Следовательно, предлагаемый способ соответствует условию патентоспособности "изобретательский уровень".
Сущность предлагаемого изобретения пояснена примером его исполнения.
Пример 1.
Для получения сыворотки используют морских свинок массой 450-500 г. Свинок заражают интраплантарно предварительно адаптированным к ним вирусом ящура типа A, штамм N 1707 "Армения-98". Свинки должны заболеть в генерализованной форме в течение 96 часов. Через 30-45 дней после заражения морских свинок подвергают гипериммунизации путем введения в их организм препарата, содержащего антигенный материал из штамма N 1707 "Армения-98" и адъювант, с периодичностью и количеством доз, достаточных для образования в крови животных-доноров специфических антител. Вирус для гипериммунизации получают в суспензионной культуре клеток ВНК-21. В течение 20-24 часов инкубирования вирус накапливается до 7,0-8,0 lg ТЦД50/мл. В качестве адъюванта используют сапонин, его аналоги или масляные адъюванты типа неполного адъюванта Фрейнда. Полученную вируссодержащую суспензию очищают от балластных примесей добавлением 0,05% полигуанидина, концентрируют в 100 раз добавлением 10% полиэтиленгликоля (ПЭГ) м.м. 6000 и инактивируют аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ), который добавляют в суспензию до концентрации 0,01-0,05% (pH 7,8-8,0). Продолжительность инактивации 24 часа. Для гипериммунизации используют антиген с активностью в РСК не менее 1:16. Инактивированный концентрат антигена в смеси с равным объемом масляного адъюванта вводят морским свинкам в объеме 1 мл внутримышечно в области бедра. Через 21 день иммунизацию повторяют и через 10 дней животных тотально обескровливают.
Индивидуальные пробы крови выдерживают сначала при 36-38oC в течение 30-60 минут, а затем при 2-8oC в течение суток для отделения сгустка крови. Отстоявшуюся сыворотку инактивируют при 56-58oC в течение 30 минут, консервируют азидом натрия (1: 5000) и выдерживают при 2-8oC не менее 30 дней. Индивидуальные пробы сыворотки крови проверяют на типовую специфичность и активность в РСК согласно (5). После этого готовят серию путем смешивания типоспецифических индивидуальных проб одинаковой активности. Полученный препарат фасуют в ампулы по 1,0 мл.
Штаммовую специфичность серийного препарата определяют в одно- и двусторонних реакциях с гомо- и гетерологичными антигенами. Полученная сыворотка может быть использована в качестве исходного сырья для выделения специфического иммуноглобулина.
Указанным способом было приготовлено 2 серии гипериммунной сыворотки, характеристики которых представлены в таблице 3.
-+ Из данных таблицы 3 видно, что предлагаемый способ обеспечивает получение от морских свинок диагностической сыворотки, по специфической активности отвечающей требованиям (5).
Пример 2.
Для получения сыворотки используют кроликов массой 2,5-3,0 кг. Для гипериммунизации используют препарат, содержащий антигенный материал из штамма N 1707 "Армения-98" вируса ящура типа A и адъювант. Указанный препарат получают так, как описано в примере 1. Полученный препарат вводят по 1-2 мл в межпальцевые ткани задних конечностей кроликов (по 0,1-0,2 мл в каждую точку инъекции). Доза 146S антигена на одного донора должна составлять не менее 50 мкг. Спустя 28 дней кроликов прививают повторно внутримышечно в области бедра двойной дозой исходного препарата 146S антигена в объеме 2-5 мл с добавлением в качестве адъюванта 2,5-5,0 мг сапонина. Через 10 дней животных обескровливают и получают сыворотку крови, которая может быть использована в качестве исходного сырья для выделения специфического иммуноглобулина.
Указанным способом было приготовлено 2 серии гипериммунной сыворотки, характеристики которых представлены в таблице 4.
Из данных таблицы 4 видно, что предлагаемый способ обеспечивает получение от кроликов диагностической сыворотки, по специфической активности отвечающей требованиям (5).
Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:
- способ, воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования в ветеринарной медицине и биотехнологии;
- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;
- сыворотка, полученная в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой активностью и специфичностью.
Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию потентоспособности "промышленная применимость".
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на "Способ получения сыворотки для серодиагностики ящура типа A"
1. Авт. свид. СССР N 1741802, A 61 K 39/42, 23.06.92 г.
2. Авт. свид. СССР N 127790, A 61 K 23/00, 18.10.60 г.
3. Ногина В.Т. Получение типоспецифических ящурных сывороток от взрослых кроликов. //Ветеринария. - 1962. - N 8. -69-72.
4. Инструкция по изготовлению и контролю сывороток и иммуноглобулинов ящурных типо- и штаммоспецифических для серологических реакций (РСК, РУСК, РДП, РРИД, РЭМА), используемых в диагностических целях. Утверждена ГУВ МСХ СССР 29.01.91 г. (прототип).
5. ГОСТ 25384-82.
6. Ререр Х. Ящур. Пер. с нем. Г.А.Сурковой. Под ред. и с предисл. канд. вет. наук П.А.Малярца. -М. -Колос. -1971. -432 с.
7. Бурдов А.Н., Дудникова А.И., Малярец П.В. и др. Ящур. Под ред. А.Н. Бурдова. -М. -Агропромиздат. -1990. -320 с.
8. Сюрин В.Н. и др. Вирусные болезни животных. -М. -ВНИТИБП. -1998. -532 - 548.
Формула изобретения: 1. Способ получения сыворотки для серодиагностики ящура типа А, включающий иммунизацию животных-доноров путем введения в их организм препарата, содержащего антигенный материал с адъювантом, с периодичностью и количеством доз, достаточных для образования в крови животных-доноров специфических антител, обескровливание животных-доноров и отделение целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве антигенного материала используют штамм вируса Aphtae epizooticae, сем. Picornaviridae, род Aphtovirus, типа А, коллекция ВГНКИ N 1707 "Армения - 98 - ДЕП", взятый в эффективном количестве.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для иммунизации животных-доноров используют антиген с титром в РСК не менее 1 : 16.