Forbidden

You don't have permission to access /zzz_siteguard.php on this server.

ШТАММ N 1707 "АРМЕНИЯ-98" ВИРУСА ЯЩУРА ТИПА A ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ВАКЦИННЫХ ПРЕПАРАТОВ - Патент РФ 2140452
Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
ШТАММ N 1707 "АРМЕНИЯ-98" ВИРУСА ЯЩУРА ТИПА A ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ВАКЦИННЫХ ПРЕПАРАТОВ
ШТАММ N 1707 "АРМЕНИЯ-98" ВИРУСА ЯЩУРА ТИПА A ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ВАКЦИННЫХ ПРЕПАРАТОВ

ШТАММ N 1707 "АРМЕНИЯ-98" ВИРУСА ЯЩУРА ТИПА A ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ВАКЦИННЫХ ПРЕПАРАТОВ

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Изобретение предназначено для изготовления диагностических и вакцинных препаратов. Производственный штамм 1707 "Армения-98" получен путем многократных последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток. Штамм депонирован в Коллекции микроорганизмов ВГНКИ под регистрационным 1707 "Армения-98-ДЕП". Штамм 1707 "Армения-98" отличается как от производственных, так и от ранее выделенных эпизоотических штаммов вируса ящура типа А. Вирус штамма 1707 "Армения-98" репродуцируется в чувствительных культурах клеток. В течение 20-24 ч инкубирования накапливается до 7,0 - 8,0 lg ТТЦ50/мл. При массированном заражении вызывает ЦПД через 4 ч. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в культурах клеток в течение 10 пассажей. Новый производственный штамм вируса ящура типа А обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью и пригоден для изготовления средств специфической профилактики и диагностики ящура типа А, гомологичных эпизоотическому вирусу, циркулирующему в странах Закавказья и Ближнего Востока. 2 ил., 8 табл.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2140452
Класс(ы) патента: C12N7/00, A61K39/135, G01N33/569, A61K39/42, C07K16/08
Номер заявки: 99105412/13
Дата подачи заявки: 15.03.1999
Дата публикации: 27.10.1999
Заявитель(и): Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных (RU)
Автор(ы): Захаров В.М.(RU); Спирин В.К.(RU); Гриценко А.И.(RU); Маслова Н.С.(RU); Гусев А.А.(RU); Михалишин Д.В.(RU); Кошецян Т.Ф.(RU); Дрыгин В.В.(RU); Щербаков А.В.(RU); Кругликов Б.А.(RU); Нерсесян Слава Ервандович (AM)
Патентообладатель(и): Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных (RU)
Описание изобретения: Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при изготовлении средств для специфической профилактики и диагностики ящура типа A.
Ящур - это острое контагиозное вирусное заболевание парнокопытных животных, проявляющееся лихорадкой, везикулярными (афтозными) поражениями слизистой оболочки ротовой полости, бесшерстных участков кожи головы, вымени, венчика, межкопытной щели и сопровождающееся нарушением движения. Для него характерна тенденция к широкому распространению и эпизоотическому течению. Болезнь сопровождается большими потерями молока, мяса и других видов животноводческой продукции, затрудняет коммерческие операции и хозяйственную деятельность. Многолетний опыт показывает, что наличие эндемичного ящура снижает доходы в молочном и мясном животноводстве на 30-40%.
Вирус ящура относится к роду афтовирусов, семейству пикорнавирусов. Он включает 7 иммунологических типов и большое количество подтипов.
Хорошо известной особенностью возбудителя ящура является антигенная изменчивость штаммов в пределах одного серотипа, происходящая в различные временные промежутки, на разных территориях, зависящая от видового состава восприимчивого поголовья, его иммунного статуса и множества других факторов. Считается, что основной причиной антигенной изменчивости является изменение аминокислотной последовательности в полипептидах вирусных белков, составляющих капсид вириона. Практически такие антигенные изменения могут выражаться от незначительных отличий между штаммами, улавливаемых только с помощью тонких методов молекулярного анализа, до появления совершенно отличающихся штаммов, требующих использования новых средств для серологической диагностики и специфической профилактики болезни, вызываемой этими штаммами.
Известны штаммы вируса ящура типа A, использовавшиеся в качестве производственных на территории СССР в течение последних 35 лет. К ним относятся следующие штаммы: A7 N 103, выделенный в 1962 г. в Куйбышевской области; Aт N 2, выделенный в 1965 г. в Таджикской ССР; A N 717/73, выделенный в Ставропольском крае в 1973 г.
Указанные штаммы использовались для получения диагностикумов и противоящурных вакцин, применявшихся в различных регионах страны. Однако после ликвидации ящура, вызываемого близкими в антигенном отношении штаммами вируса, они были сняты с производства и в настоящее время поддерживаются лишь в музее штаммов ВНИИ защиты животных [1, 2, 3, 4, 5].
Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является штамм N 550 вируса ящура A22, выделенный в 1964 году в Азербайджане и используемый в Российской Федерации в качестве производственного при изготовлении средств специфической профилактики и диагностики, применяемых на всей территории России и в странах-членах СНГ [6].
Штамм N 550 вируса ящура A22 имеет следующие характеристики, представленные в таблице 1.
Недостатки данного штамма состоят в его низкой биологической, антигенной и иммуногенной активности.
Об этом свидетельствует тот факт, что в 1998 году в Республике Армения были отмечены очаги заболевания ящуром типа A крупного рогатого скота, иммунизированного бивалентной вакциной AO, в состав которой входит антиген из производственного штамма A22 N 550. Однако вакцина не обеспечила удовлетворительной защиты иммунизированных животных. Лабораторными исследованиями во ВНИИЗЖ афтозного материала, выделенного от больных животных, был установлен вирус ящура типа A, имеющий антигенные отличия от штамма A22 N 550 в реакции связывания комплемента и реакции серонейтрализации вируса. Это свидетельствовало о несоответствии используемых средств специфической профилактики и диагностики ящура типа A, используемых Россией и странами СНГ, эпизоотическому вирусу, циркулирующему в 1998 году в странах Закавказья и Ближнего Востока (Турция, Иран).
В задачу создания настоящего изобретения входило получение нового производственного штамма вируса ящура типа A, обладающего высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации и обеспечивающего изготовление диагностических и вакцинных препаратов, гомологичных эпизоотическому вирусу, появившемуся в странах Закавказья и Ближнего Востока.
Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в получении нового производственного штамма вируса ящура типа А, обладающего высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью и пригодного для изготовления средств специфической профилактики и диагностики ящура типа А, гомологичных эпизоотическому вирусу, циркулирующему в странах Закавказья и Ближнего Востока.
Указанный технической результат достигнут получением штамма N 1707 "Армения-98" вируса ящура типа A. Штамм A N 1707 "Армения-98" является новым, ранее неизвестным. Исходный вирус для получения штамма A N 1707 "Армения-98" выделен 01.08.98 г. от больных коров в хозяйстве Охчик Амассийского района Республики Армения. Производственный штамма A N 1707 "Армения-98" получен путем многократных последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток.
Полученный штамм депонирован в Коллекции микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов Министерства сельского хозяйства и продовольствия Российский Федерации (ВГНКИ) 12.11.98 г. под регистрационным номером 1707 "Армения-98-ДЕП".
По сравнению с прототипом штамм A N 1707 "Армения-98" обладает более высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации. Экспериментально подтверждена его возможность использования для приготовления диагностических препаратов и инактивированной вакцины. Штамм N 1707 "Армения-98" вируса ящура типа A обеспечивает получение диагностических препаратов, позволяющих серологическую диагностику изолятов вируса ящура типа A, вызывающего вспышки заболевания в последние годы в странах Закавказья и Ближнего Востока, и противоящурной инактивированной вакцины, создающей защиту восприимчивых животных против указанного возбудителя заболевания.
Сущность изобретения пояснена на графических материалах, где на:
фиг. 1 представлена аминокислотная последовательность белка VP1 штамма N 1707 "Армения-98" вируса ящура типа A (* - аминокислота не определена);
фиг. 2 изображена дендрограмма, отражающая структурное сходство участка гена VP1 штамма 1707 "Армения-98" вируса ящура типа A с аналогичными фрагментами геномов других штаммов вируса ящура типа A.
Штамм A N 1707 "Армения-98" вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.
Морфологические свойства
Штамм A N 1707 "Армения-98" относится к семейству Picornaviridae, роду Aphtovirus, серотипу A и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 23-25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.
Антигенные свойства
По своим антигенным свойствам штамм A N 1707 "Армения-98" относится к серотипу A. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются антитела, выявляемые в РДП, ИФА, PH. При вакцинации КРС вакциной из инактивированного вируса индуцирует образование специфических антител, выявляемых в ИФА, РДП, PH. При гипериммунизации морских свинок концентрированным инактивированным вирусом индуцирует образование вирусспецифических антител, выявляемых в РСК в разведении 1: 256 и в ИФА в разведении 1: 6000.
При определении антигенного соответствия штамма A N 1707 "Армения-98" с производственными штаммами и полевыми изолятами вируса ящура типа A, выделенными на протяжении 1962-1998 гг. на территории стран СНГ и ряда других государств мира, было проведено сравнительное исследование первичной структуры гена и белка VP1. Сравнительный анализ установленных структур штамма A N 1707 "Армения-98" и эпизоотических изолятов, выделенных в последние годы в Турции и Иране (A-Иран-96, A-Турция-97, A-Турция-98) показал, что оба изолята A-Армения-98 идентичны между собой и отличаются от изолятов A-Турция-97, A-Турция-98 и A-Иран-96 по трем, четырем и семи нуклеотидным основаниям соответственно. Замена в 156 кодоне является значимой и приводит к изменению треонина на аланин (фиг. 1).
Филогенетические взаимоотношения исследованных изолятов с ранее изученными штаммами, выделенными в разных странах мира за три последних десятилетия, указаны на дендрограмме (фиг.2). Установлено, что исследованные изоляты существенно отличаются от всех выделенных ранее изолятов, в том числе и от вируса подтипа A22, куда относится используемый в настоящее время для производства средств диагностики и специфической профилактики производственный штамма A22 N 550.
Антигенное родство вируса ящура A N 1707 "Армения-98" с соответствующими производственными и ранее выделенными штаммами на территории Турции и Ирана изучено в РСК. Полученные результаты представлены в таблице 2.
Как свидетельствуют данные, представленные в таблице 2, вирус A N 1707 "Армения-98" отличается как от производственных, так и от ранее выделенных эпизоотических штаммов.
Аналогичное изучение антигенного родства выделенного штамма было проведено в реакции нейтрализации, где в качестве иммунных использовались сыворотки реконвалесцентов КРС на вирусы штаммов A N 1707 "Армения-98", A-Иран-87 и A22 N 550.
Результаты этих исследований представлены в таблице 3.
Приведенные в таблице 3 данные подтверждают антигенное отличие выделенного штамма от производственного штамма A22 N 550 и эпизоотического штамма, выделенного в Иране в 1987 году.
Биотехнологические характеристики
Штамм A N 1707 "Армения-98" проявляет высокую биологическую, антигенную и иммуногенную активность как в нативном виде, так и после инактивации. Штамм предназначен для использования в качестве сырья для получения диагностических сывороток и антигенных препаратов, а также изготовления инактивированной противоящурной вакцины. Вирус штамма A N 1707 репродуцируется в монослойных культурах первично-трипсинизированной культуры клеток почки свиньи (СП), перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), IB-RS-2, ВНК-21 и в течение 20-24 часов инкубирования накапливается до 7,0-8,0 lg ТЦД50/мл. При массированном заражении вызывает ЦПД через 4 часа.
После 3-4 пассажей инкубирования накапливается до 6,0-8,0 lg ТЦД50/мл. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 10 пассажей.
Хемо- и генотаксономическая характеристика
Штамм A N 1707 "Армения-98" является РНК-содержащим вирусом с мол.массой 7 · 106Д.
Нуклеиновая кислота представлена одноцепочечной линейной молекулой мол. массой 2,8 · 108 МД. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP1, VP2, VP3 и VP4. Липопротеидная оболочка отсутствует.
Основным антигенным белком является VP1. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники в свою очередь расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 6 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (Vpб6a) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.
Проведено определение первичной структуры участка генома вируса с помощью ПЦР и сиквенса. Результаты исследований представлены на фиг.1 и 2. Сравнительный анализ показал, что штамм отличается от штамма A-Турция-98, A-Турция-97 и A-Иран-96 по трем, четырем и семи нуклеотидным основаниям соответственно.
Установлено, что армянский изолят вируса ящура имеет наибольшую степень гомологии первичной структуры гена и белка VP1 с изолятами A-Турция-98. Две замены (в 67 и 174 кодонах) из трех, отличающих вирус ящура A-Армения-98 и A-Турция-98, являются молчащими, тогда как замена в 156 кодоне является значимой и приводит к изменению треонина на аланин. Исследуемый изолят существенно (18% различий) отличается от производственного штамма A22 N 550 и других вариантов и штаммов вируса ящура A5, A10, A12, A24, A N 1640 Узбекистан-91 и др.
Физические свойства
Масса вириона - 8,4 · 10-18 г. Коэффициент седиментации -146S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность - 1,45 г/мл.
Устойчивость к внешним факторам
Вирус штамма A N 1707 "Армения-98" устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и др. органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при pH 7,0- 7,6. Сдвиги pH как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ -облучению, высоким температурам.
Дополнительные признаки и свойства
Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.
Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.
Патогенность - патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, морских свинок.
Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.
Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 10 пассажей.
Исходя из полученных данных, можно утверждать, что штамм A N 1707 "Армения-98" по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным вариантом вируса ящура типа A.
Для снижения его эпизоотической опасности необходимо обеспечить своевременную лабораторную диагностику и вакцинопрофилактику вновь возникающих очагов болезни, для чего необходимы высокоактивные и специфичные антительные и антигенные диагностикумы и вакцина, полученные с использованием данного штамма в качестве производственного.
По мнению заявителя, предлагаемый штамм соответствует условиям патентоспособности "новизна" и "изобретательский уровень".
Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исполнения.
Пример 1
Получение штамма
Штамм вируса ящура A N 1707 "Армения-98" был изолирован из полевого материала, поступившего во ВНИИЗЖ в виде эпителия афт от КРС, подозреваемого в заболевании ящуром, при проведении лабораторной диагностики этого заболевания и дифференциации его от других везикулярных болезней. При изоляции вируса использован комплекс биологических, вирусологических и биохимических методов, предусмотренных [7].
Биологические и вирусологические методы включали интрадермолингвальную инокуляцию материала полевого изолята КРС (1 пассаж) и последующую адаптацию вируса, выделенного от заболевшего животного, к культурам первично-трипсинизированных и перевиваемых линий клеток. Были использованы культуры клеток СП, ПСГК-30, IB- RS-2 и ВНК-21. Первичные и перевиваемые культуры клеток для постановки биопробы выращивали на соответствующих питательных средах во флаконах емкостью 50-100 мл, отмывали от ростовой среды и заражали 10% суспензией афтозного материала (множественность заражения составляла 1-10 ТЦД50 на клетку), приготовленной в растворе Хенкса с 0,5% ГЛА и антибиотиками по стандартной рецептуре. Для удаления микрофлоры и балластных клеточных компонентов суспензию обрабатывали хлороформом в отношении 1:10. После 30-минутного инкубирования при 37oC во флаконы вносили по 5-10 мл поддерживающей среды и инкубировали при 37oC до появления ЦПД вируса. При наличии ЦПД (округление клеток, повышение их оптической плотности, дегенерация и отделение клеток от стекла) флаконы подвергали замораживанию-оттаиванию, очистке клеточной взвеси хлороформом и центрифугированию при 3000g в течение 15 мин. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей и исследования в РСК на наличие вирусного антигена, при этом использовали набор коммерческих типоспецифических сывороток и сыворотки, хранящиеся в музее штаммов ВНИИЗЖ.
Результаты адаптации вируса к различным клеточным культурам представлены в таблице 4.
Данные, приведенные в таблице 4, свидетельствуют о хорошей адаптационной активности штамма A N 1707 к использованным клеточным культурам.
Изолированный с помощью перечисленных методов вирус был исследован в РСК с набором диагностикумов на все типы вируса ящура, везикулярного стоматита, везикулярной экзантемы и везикулярной болезни свиней с целью идентификации типовой принадлежности и контроля на чистоту. Результаты типирования вируса в РСК представлены в таблице 5.
Приведенные в таблице 5 результаты свидетельствуют о том, что выделенный вирус относится к типу A, однако с гипериммунной сывороткой из производственного штамма A22 N 550 в РСК дает отрицательный результат.
Пример 2
Получение и испытание гипериммунной сыворотки на морских свинках
Для гипериммунизации морских свинок используют антиген из вируса ящура, штамм A N 1707 "Армения-98", репродуцированного в суспензионной культуре клеток ВНК-21. Вируссодержащую суспензию очищают от балластных примесей добавлением 0,05% полигуанидина. Очищенный вирус концентрируют в 100 раз добавлением 10% полиэтиленгликоля (ПЭГ) м.м. 6000 и инактивируют аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ) в концентрации 0,01- 0,05% pH 7,8-8,0.
Инактивированный концентрат антигена в смеси с равным объемом масляного адъюванта вводят морским свинкам в объеме 1,0 мл внутримышечно. Через 21 день иммунизацию повторяют и через 10 дней животных обескровливают. Индивидуальные пробы сыворотки крови проверяют на типовую специфичность и активность в РСК согласно [7].
После этого готовят серию путем смешивания типоспецифичных индивидуальных проб одинаковой активности. Штаммовую специфичность серийного препарата определяют в одно- и двусторонних реакциях с гомо- и гетерологичными антигенами.
После консервирования азидом натрия (1: 5000) и выдерживания при +4oC в течение 30 дней полученную сыворотку фасуют в ампулы по 1,0 мл.
Способом, описанным в примере 2, было приготовлено 2 серии гипериммунной сыворотки, характеристики которых представлены в таблице 6.
Данные таблицы 6 свидетельствуют, что способом, описанным в примере 2, получены диагностические сыворотки, по специфической активности отвечающие требованиям [7].
Пример 3
Получение и испытание диагностического антигена
Для получения антигена для иммунохимических реакций используют вирус ящура, штамм A N 1707 "Армения-98", адаптированный к культуре клеток перевиваемых линий ПСГК-30 и ВНК- 21. Для адаптации используют вируссодержащий материал в виде 10% суспензии афт КРС. Адаптацию проводят в течение 5 последовательных пассажей. Полученную матричную расплодку вируса используют для наработки вирусного сырья. Заражение клеточных культур и сбор вирусного материала проводят по общепринятой методике. Полученную вируссодержащую жидкость концентрируют в 100 раз добавлением 8-10% ПЭГ. Полученный концентрат инактивируют прогреванием при 56oC в течение 40 минут, фасуют в ампулы и высушивают методом сублимации под вакуумом.
Указанным способом было приготовлено 2 серии диагностического антигена, характеристики которых приведены в таблице 7.
Результаты исследований, приведенные в таблице 7, свидетельствуют, что способом, описанным в примере 3, получены диагностические антигены, специфическая активность которых соответствует требованиям [7].
Пример 4
Приготовление и испытание инактивированной адсорбат-вакцины
Инактивированную адсорбат-вакцину против ящура типа А готовят из вируса штамма N 1707 "Армения-98", выращенного в суспензионной культуре клеток ВНК-21. Полученный вирус подвергают инактивации АЭЭИ в концентрации 0,025-0,05% при 36-37oC в течение 12-24 часов и pH 7,2-7,6. По окончании инактивации в суспензию добавляют полигексаметиленгуанидин до концентрации 0,005-0,007% для флокуляции балластных примесей и инактивации возможных контаминантов. Суспензию охлаждают до 4-8oC. После этого проводят седиментацию флокулированных белков и их удаление. Полученный антиген подвергают контролю на авирулентность, содержание вирусспецифического белка и 146S + 75S компонентов вируса, стерильность. Необходимую концентрацию 146S + 75S компонентов в прививной дозе адсорбированной вакцины получают путем концентрирования антигена гелем гидрата окиси алюминия (ГОА).
Для этого в охлажденную суспензию антигена добавляют расчетный объем геля ГОА 3% концентрации. После седиментации ГОА сливают расчетный объем надосадочной жидкости или измеряют объем оставшейся суспензии. Конечная концентрация ГОА должна быть в пределах 1,62 ± 0,488 P < 0,01 мг/мл n=10, а концентрация 146S + 75S компонентов вируса ящура по меньшей мере 6,0 мкг/мл. Затем добавляют 10% раствор сапонина до конечной концентрации 0,075%. Полученную вакцину расфасовывают в стеклянные флаконы и подвергают контролю на стерильность по [8] . Авирулентность и безвредность вакцины проверяют на 5 головах КРС, вводя вакцину сначала под слизистую языка в дозе 2,0 мл, а затем подкожно в дозе 10 мл. Наблюдение за клиническим состоянием животных ведут 10 суток. Авирулентную, безвредную и стерильную вакцину проверяют на иммуногенную активность на КРС или на морских свинках.
Полученная адсорбат-вакцина против ящура типа A имеет оптимальный компонентный состав, мкг/мл:
Авирулентный и очищенный, антигенный материал из иммуногенных (146S + 75S) компонентов вируса ящура штамма A N 1707 "Армения-98" - ≥6,0
Гель ГОА - 1132,0-2108,0
Сапонин - ≥ 750
Поддерживающая среда - Остальное
Иммуногенная активность одной из производственных серий адсорбат-вакцины из вируса ящура A N 1707 "Армения-98" была проверена на КРС. Ее ИмД22 была равна 0,15 мл, т.е. в одном мл вакцины содержалось 6,67 ИмД50.
Для сравнения производственная серия адсорбат-вакцины из вируса ящура A22 N 550 имела ИмД50 КРС, равную 0,22± 0,012 мл P < 0,001, т.е. в одном мл вакцина содержала 4,55 ИмД50. Объем прививной дозы вакцины должен содержать не менее 7 ИмД50.
Пример 5
Приготовление и испытание инактивированной эмульсионной вакцины
Вирус ящура типа А штамма N 1707 "Армения-98" выращивают, инактивируют, очищают от балластных примесей и возможных контаминантов, подвергают контролю на авирулентность, содержание вирусспецифического белка, иммуногенных компонентов (146S + 75S) и стерильность так, как описано в примере 4. Необходимую концентрацию 146S + 75S компонентов в прививной дозе эмульсионной вакцины получают путем концентрирования антигена проточной ультрафильтрацией или полиэтиленгликолем.
Для этого используют ультрафильтры БТУ 0,5-2. Фильтрование ведут под давлением 1,5 атм. Полученный концентрат антигена хранят при 4-6oC до момента использования в вакцине. Эмульсионную вакцину получают путем диспергирования на коллоидных мельницах концентрата антигена и масляного адъюванта в соотношении 3:7-1:1 соответственно.
В результате получают инактивированную эмульсионную вакцину против ящура типа А, которая представляет собой молокоподобную жидкость, не растворимую в воде. Вакцина имеет жидкую консистенцию, легко рассасывается с места введения, не вызывает образования абсцессов, не вызывает общей реакции в виде подъема температуры и обладает выраженной иммуногенностью для свиней в дозе 1 мл через 1-21 день после вакцинации, для КРС в дозе 5 мл через 3-21 день после вакцинации и для овец в дозе 1 мл через 3-21 день после введения. Вакцину вводят свиньям внутримышечно, а КРС и овцам - подкожно. В прививном объеме должно содержаться не менее 2 мкг 146S + 75S компонентов.
Полученная эмульсионная вакцина против ящура типа А имеет оптимальный компонентный состав, мкг/мл:
Авирулентный и очищенный антигенный материал из иммуногенных (146S + 75S) компонентов вируса ящура штамма А N 1707 "Армения-98" - ≥ 2,0
Масляный адъювант - 500000 - 700000
Поддерживающая среда - Остальное
Иммуногенная активность эмульсионной вакцины проверена на свиньях массой 35-50 кг. Результаты исследований представлены в таблице 8.
В прививном объеме 1 мл вакцины содержится 7,1 ИмД50 для свиней.
Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:
- штамм N 1707 "Армения-98" вируса ящура типа A, воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;
- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;
- штамм N 1707 "Армения-98" вируса ящура типа A, полученный в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой специфической, иммуногенной и антигенной активностью и пригоден для изготовления диагностикумов и инактивированной вакцины.
Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость".
Источники информации
1. Дарда П.И. и др. Антигенные свойства вируса ящура штамма A22(Aи). Ветеринария. - 1966, 1, 20-22.
2. Bojko A. A. Declaration sur l'apparition en URSS d'un type virus aphteux different des souches de type A anterieurement etudies dans le Pays. BOIE, 1965, 64, 2, 1075-1077.
3. Pepep X. Ящур. Пер. с нем. Г.А.Сурковой/под ред. и с предисл. канд. вет.наук П.В.Малярца.-М.; Колос, 1971, 432 с.
4. Бурдов А. Н., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур/ Под ред. А.Н. Бурдова. - М.; Агропромиздат, 1990, 320 с.
5. Сюрин В. Н. и др. Вирусные болезни животных. -М.; ВНИТИБП, 1998, 532-548.
6. Инструкция по изготовлению и контролю вакцины моновалентной эмульсионной против ящура типа А, типа О, типа С, типа Азия-1 (из вируса, выращенного в клетках ВНК-21). Утверждена ГУВ Госкомиссии СМ СССР по продовольствию и закупкам 24.01.91.
7. Методические указания по выделению и идентификации штаммов вируса ящура ГОСТ 25384-82 М.; Колос, 1974.
8. ГОСТ 28085-89.
Формула изобретения: Штамм вируса Aphtae epizooticae, сем.Picornaviridae, род Aphtovirus, тип А, коллекция ВГНКИ N 1707 "Армения-98-ДЕП", для изготовления диагностических и вакцинных препаратов.