√лавна€ страница  |  ќписание сайта  |   онтакты
–≈ ќћЅ»ЌјЌ“Ќјя ѕЋј«ћ»ƒЌјя ƒЌ  P UA BC22,  ќƒ»–”ёўјя ћќƒ»‘»÷»–ќ¬јЌЌџ… ј “»¬ј“ќ– ѕЋј«ћ»Ќќ√≈Ќј ”–ќ »Ќј«Ќќ√ќ “»ѕј, Ќ≈“–јЌ—Ћ»–”≈ћџ… ƒЌ -ЁЋ≈ћ≈Ќ“ - »— ”——“¬≈ЌЌјя ћ≈∆√≈ЌЌјя ѕќ—Ћ≈ƒќ¬ј“≈Ћ№Ќќ—“№ ћ√ѕ14 » Ў“јћћ Ѕј “≈–»… ESCHERICHIA COLI - ѕ–ќƒ”÷≈Ќ“ ћќƒ»‘»÷»–ќ¬јЌЌќ√ќ ј “»¬ј“ќ–ј ѕЋј«ћ»Ќќ√≈Ќј ”–ќ »Ќј«Ќќ√ќ “»ѕј
–≈ ќћЅ»ЌјЌ“Ќјя ѕЋј«ћ»ƒЌјя ƒЌ  P UA BC22,  ќƒ»–”ёўјя ћќƒ»‘»÷»–ќ¬јЌЌџ… ј “»¬ј“ќ– ѕЋј«ћ»Ќќ√≈Ќј ”–ќ »Ќј«Ќќ√ќ “»ѕј, Ќ≈“–јЌ—Ћ»–”≈ћџ… ƒЌ -ЁЋ≈ћ≈Ќ“ - »— ”——“¬≈ЌЌјя ћ≈∆√≈ЌЌјя ѕќ—Ћ≈ƒќ¬ј“≈Ћ№Ќќ—“№ ћ√ѕ14 » Ў“јћћ Ѕј “≈–»… ESCHERICHIA COLI - ѕ–ќƒ”÷≈Ќ“ ћќƒ»‘»÷»–ќ¬јЌЌќ√ќ ј “»¬ј“ќ–ј ѕЋј«ћ»Ќќ√≈Ќј ”–ќ »Ќј«Ќќ√ќ “»ѕј

–≈ ќћЅ»ЌјЌ“Ќјя ѕЋј«ћ»ƒЌјя ƒЌ  P UA BC22,  ќƒ»–”ёўјя ћќƒ»‘»÷»–ќ¬јЌЌџ… ј “»¬ј“ќ– ѕЋј«ћ»Ќќ√≈Ќј ”–ќ »Ќј«Ќќ√ќ “»ѕј, Ќ≈“–јЌ—Ћ»–”≈ћџ… ƒЌ -ЁЋ≈ћ≈Ќ“ - »— ”——“¬≈ЌЌјя ћ≈∆√≈ЌЌјя ѕќ—Ћ≈ƒќ¬ј“≈Ћ№Ќќ—“№ ћ√ѕ14 » Ў“јћћ Ѕј “≈–»… ESCHERICHIA COLI - ѕ–ќƒ”÷≈Ќ“ ћќƒ»‘»÷»–ќ¬јЌЌќ√ќ ј “»¬ј“ќ–ј ѕЋј«ћ»Ќќ√≈Ќј ”–ќ »Ќј«Ќќ√ќ “»ѕј

ѕатент –оссийской ‘едерации
—уть изобретени€: »зобретение относитс€ к генной инженерии, а именно к технологии получени€ высокопродуктивных штаммов Eserichia coli - продуцентов рекомбинантных белков человека, используемых в современной медицине в качестве тромболитических агентов. Ќова€ рекомбинантна€ плазмидна€ ƒЌ  рUABC22, кодирующа€ модифицированный активатор плазминогена урокиназного типа (мјѕ”“) имеет размер 4,5 т.п.н. и содержит: XmnI - BamHI - фрагмент ƒЌ  плазмиды рUј¬—22 размером 2,99 т. п. н.; BamHI - KpnI - фрагмент ƒЌ  размером 0,177 т.п.н., содержащий участок кодирующей области гена мјѕ”“, соответствующий 12 —-концевым аминокислотам мјѕ”“, и нетранслируемый элемент - искусственную межгенную последовательность ћ√ѕ14; Kpn I - SacI - фрагмент ƒЌ  размером 0,57 т.п. н. , содержащий ген т–Ќ  јrg; SасI - XmnI - фрагмент ƒЌ  вектора рU—19 размером 0,79 т. п. н.; участок инициации репликации и промоторно-операторную область lас-оперона; генетические маркеры; ген устойчивости к ампициллину. Ќетранслируемые ƒЌ -элементы - искусственна€ межгенна€ последовательность ћ√ѕ14 и ген т–Ќ  јrg повышают общую стабильность системы экспрессии мјѕ”“ в клетках Escherichia coli и усиливают ее транслирующую активность в отношении эукариотических генов. Ќовый штамм ¬ ѕћ ¬-7666 дает 3,0 г клеточной биомассы на 1 л культуральной среды и производит мјѕ”“ преимущественно в проферментной форме (мол.м. 43 кƒа) в количестве 200000 - 250000 ед. на 1 г биомассы. 3 с.п. ф-лы, 4 ил.
ѕоиск по сайту

1. — помощью поисковых систем

   — помощью Google:    

2. Ёкспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. ѕо номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Ќомер патента: 2140453
 ласс(ы) патента: C12N15/52, C12N15/58, C12N15/63, C12N1/21, C12N9/72
Ќомер за€вки: 99106228/13
ƒата подачи за€вки: 06.04.1999
ƒата публикации: 27.10.1999
«а€витель(и): ќбщество с ограниченной ответственностью Ќаучно- производственное предпри€тие "“ехноген"
јвтор(ы): Ѕибилашвили –.Ў.; Ѕелогуров ј.ј.; ƒельвер ≈.ѕ.; √урский я.√.; ћинашкин ћ.ћ.; „игаева —.ћ.; √ригорьева Ќ.¬.; Ћогунова Ќ.ј.; ћ€лкин ј.ј.
ѕатентообладатель(и): ќбщество с ограниченной ответственностью Ќаучно- производственное предпри€тие "“ехноген"
ќписание изобретени€: »зобретение относитс€ к генной инженерии, а именно к технологии получени€ высокопродуктивных штаммов Escherichia coli - продуцентов рекомбинантных белков человека, используемых в современной медицине в качестве тромболитических агентов,
»звестно, что урокиназа, выдел€ема€ из мочи, представлена трем€ формами: низкомолекул€рной (33 кƒа), высокомолекул€рной двухцепочной (50-55 кƒа) и высокомолекул€рной одноцепочной (проурокиназа), со значительным преобладанием низкомолекул€рной формы. Ќаибольшую ценность дл€ медицины представл€ют тромболитические препараты в виде высокомолекул€рных предшественников активаторов плазминогена, в особенности проурокиназа, вследствие ее низкой активности до момента ее активации на тромбе. ѕроцесс получени€ проурокиназы из культуральной среды эукариотических клеток-продуцентов сравнительно несложен, но невыгоден из-за высокой стоимости культивировани€ клеток, что и послужило причиной развити€ генно-инженерного подхода к решению задачи производства активаторов плазминогена урокиназного типа на базе штаммов микроорганизмов.
»звестна рекомбинантна€ плазмида pUK54trp207-I, кодирующа€ урокиназу человека и штамм Escherichia coli, полученный трансформацией клеток бактерий данной плазмидой (Holmes W.E., Pennica D. et al., Cloning and expression of human urokunaze type plasminogen activator in Esherichia coli, Bio Thechnology (1985) V. 3, p. 923-929).
Ёкспресси€ рекомбинантной урокиназы в плазмиде pUK54trp207-I осуществл€етс€ с триптофанового промотора после индукции индолакриловой или индолуксусной кислотой. ¬ыход составл€ет около 40 ед. активной урокиназы на 1 мл биомассы.
»звестна рекомбинантна€ плазмидна€ ƒЌ  pUABC, кодирующа€ модифицированный активатор плазминогена урокиназного типа (мјѕ”“), и штамм Escherichia coli - продуцент мјѕ”“ (ѕатент –‘ N 1692151, C 12 N 15/52, 1990).
ѕлазмида pUABC состоит из следующих структурных элементов:
XbaI - BglI - фрагмента (1.39 т.п.н.), содержащего район инициации репликации и промоторно-операторную область lac-оперона вектора pUC19;
BglI - PstI - фрагмента (1.28 т.п.н.), содержащего ген лактамазы вектора pUC18;
PstI - XbaI - фрагмента кƒЌ  урокиназы человека (1.44 т.п.н.).
ћодифицированный активатор плазминогена, кодируемый данной плазмидой, представл€ет собой рекомбинантную проурокиназу, котора€ отличаетс€ от природной проурокиназы заменой первых 24 аминокислот N-концевого домена, гомологичного эпидермальному ростовому фактору, на 15 чужеродных аминокислот.
ƒл€ конструировани€ плазмиды pUABC используют штамм Escherichia coli JM109, векторы pUC18 и pUC19 и фрагменты кƒЌ  проурокиназы человека ScaI - EcoRI (0.42 т.п.н.), EcoRI - EcoRI (0.42 т.п.н.) и EcoRI - PstI (0.60 т.п.н. ), полученные в результате иммуно- и олигонуклеотидного скрининга библиотеки кƒЌ  HL1011b из легочных фибробластов человека на основе вектора lambda gt11 (фирма CLONTECH, —Ўј). ’арактерной особенностью данной конструкции €вл€етс€ модификаци€ N-концевого домена проурокиназы, привод€ща€ к утрате препаратом свойства придавать клеткам подвижность, промотиру€ тем самым рост и метастазирование опухолей.
Ўтамм-продуцент модифицированного јѕ”“ ¬ ѕћ ¬-4534 получают трансформацией клеток Escherichia coli JM109 плазмидой pUABC. Ўтамм ¬ ѕћ ¬-4534 устойчив к ампициллину и при выращивании в LB среде дает 2.2 г клеточной биомассы на 1 л культуральной среды и производит модифицированный јѕ”“ преимущественно в проферментной форме (мол. м. 43 кƒа) в количестве 60000 ед. на 1 г биомассы (или 320 ед. на 1 мл биомассы) в лабораторном масштабе.
ќднако данный продуцент недостаточно стабилен и продуктивен при широкомасштабном производстве.
«а€вл€ема€ группа изобретений позвол€ет значительно повысить продуктивность и стабильность штамма-продуцента мјѕ”“.
”величение продуктивности и стабильности штамма-продуцента достигаетс€ прежде всего за счет изменени€ нетранслируемых последовательностей векторной части плазмиды pUABC, которые, не затрагива€ последовательности гена, непосредственно кодирующего мјѕ”“, повышают общую стабильности системы экспрессии мјѕ”“ в клетках Escherichia coli и усиливают ее транслирующую активность в отношении эукариотических генов. “аким образом, поскольку модификаци€ не затрагивает кодирующих последовательностей, все свойства белкового продукта оказываютс€ сохраненными, что подтверждаетс€ определением нуклеотидной последовательности гена мјѕ”“ и его N- и C-концевых аминокислот.
Ќова€ рекомбинантна€ плазмидна€ ƒЌ  pUABC22 (фиг. 1), кодирующа€ модифицированный активатор плазминогена урокиназного типа, имеет размер 4,5 т.п. н. и содержит:
- XmnI - BamHI - фрагмент ƒЌ  плазмиды pUABC22 размером 2.99 т.п.н.;
- BamHI - KpnI - фрагмент ƒЌ  размером 0.177 т.п.н., содержащий участок кодирующей области гена мјѕ”“, соответствующий 12 C-концевым аминокислотам мјѕ”“, и нетранслируемый элемент - искусственную межгенную последовательность ћ√ѕ14;
- KpnI - SacI - фрагмент ƒЌ  размером 0.57 т.п.н., содержащий ген т–Ќ  Arg.;
- SacI - XmnI - фрагмент ƒЌ  вектора pUC19 размером 0.79 т.п.н.;
- участок инициации репликации и промоторно-операторную область lac-оперона;
- генетические маркеры;
- ген устойчивости к ампициллину.
XmnI - BamHI - фрагмент ƒЌ  плазмиды pUABC содержит 3'-концевую часть гена устойчивости к ампициллину, участок инициации репликации вектора pUC19 (ori), промоторную область и большую часть кодирующей области гена урокиназы, соответствующую последовательности мјѕ”“ с 1 по 389 аминокислоту.
√ен т–Ќ  Arg кодирует соответствующую т–Ќ  и не кодирует какой-либо белок.
SacI - XmnI - фрагмент ƒЌ  вектора pUC19 содержит фрагмент гена бета-галактозидазы E.coli и 5'-концевую часть гена устойчивости к ампициллину.
ѕлазмиду pUABC22 получают путем модификации плазмиды pUABC (фиг. 2), а именно введением в ее векторную часть двух нетранслируемых ƒЌ -элементов: искусственной межгенной последовательности ћ√ѕ14 (0,13 т.п.н.), по структуре подобной межгенным повторам в геноме бактерий (ћ√ѕ последовательности) (Cell (1984), V.37, р.1015-1026), и последовательности гена т–Ќ  Arg (0,42 т.п.н. ), изолированной из хромосомы E.coli при помощи полимеразной цепной реакции.
Ќова€ искусственна€ межгенна€ последовательность ћ√ѕ14 представлена на фиг.«. ƒанна€ последовательность не кодирует белковых продуктов.
Ќовый штамм-продуцент мјѕ”“ ¬ ѕћ ¬-7666 получают трансформацией клеток ≈. coli JM109 двум€ плазмидами: pUABC22, кодирующей мјѕ”“, и плазмидой pR4, продуцирующей дополнительное количество регул€торного белка LacI, также обладающего стабилизационным эффектом. —интез рекомбинантного белка мјѕ”“ осуществл€етс€ под контролем регул€торных элементов lac-оперона вектора pUABC. Ўтамм ¬ ѕћ ¬-7666 дает 3.0 г клеточной биомассы на 1 л культуральной среды и производит мјѕ”“ преимущественно в проферментной форме (мол.м. 43 кƒа) в количестве 200-250 000 ед. на 1 г биомассы (3-5 мг на 1 л культуры). Ѕлагодар€ применению двух нетранслируемых ƒЌ -элементов, эффективность системы экспрессии мјѕ”“ в новом штамме-продуценте ¬ ѕћ ¬-7666 в 3-4 раз выше, чем у известного штамма ¬ ѕћ ¬-4534.
ƒл€ получени€ активного рекомбинантного мјѕ”“ штамм-продуцент выращивают на LB-среде, клетки осаждают центрифугированием, вскрывают обработкой лизоцимом и ультразвуком, осадочную фракцию белков раствор€ют в гуанидинхлориде с 2-меркаптоэтанолом, разбавл€ют и провод€т реконституцию в присутствии денатурирующего агента гуанидинхлорида и окисленной и восстановленной форм глютатиона, после чего препарат диализуют. јктивность продукта измер€ют при помощи теста на фибринолизис на фибриновых пластинках.
ѕример 1.  онструирование плазмиды pUABC22.
ѕлазмиду pUABC гидролизуют рестриктазой AvaII и производ€т достройку липких концов с помощью фрагмента  ленова ƒЌ -полимеразы I. ѕосле фенольной депротеинизации и переосаждени€ этанолом производ€т гидролиз рестриктазой BamHI. ѕосле электрофоретического разделени€ рестрикционных фрагментов в 10% полиакриламидном геле фрагмент длиной 50 п.н. элюируют из гел€, очищают и клонируют в вектор Bluescript KS+, гидролизованный рестриктазами BamHI и SmaI ѕолученные рекомбинанты идентифицируют по длине рестриктного фрагмента KpnI-SacI. ѕоследовательность нуклеотидов вставки определ€ют по —энгеру.
ѕолученную плазмиду pBCOO гидролизуют рестриктазами PstI и KpnI и используют в качестве векторной последовательности. —интетические олигонуклеотиды RRE1, RRE2, RRE3 и RRE4, последовательности которых представлены на фиг. 4, фосфорилируют при помощи полинуклеотидкиназы фага T4, попарно отжигают и легируют с вектором при помощи ƒЌ -лигазы фага T4. ѕолученные рекомбинанты идентифицируют по длине рестриктного фрагмента KpnI-SacI и последовательность нуклеотидов определ€ют по —энгеру.
ѕолученную плазмиду pRE4, содержащую последовательность ћ√ѕ14, используют дл€ конструировани€ плазмиды pNO1. ƒл€ этого плазмиду pUABC гидролизуют рестриктазами BamHI и XmnI, фрагмент размером 3 т.п.н. выдел€ют с помощью электрофореза в 0.8% агарозном геле. ѕлазмиду pUC19 гидролизуют рестриктазами KpnI и XmnI, фрагмент размером 0.79 т.п.н. выдел€ют с помощью электрофореза в 0.8% агарозном геле. ѕлазмиду pRE4 гидролизуют рестриктазами KpnI и BamHI и выдел€ют фрагмент размером 0.177 т.п.н. с помощью электрофореза в 1.2% агарозном геле. ѕолученные три фрагмента легируют при помощи ƒЌ -лигазы фага T4 и получают плазмиду pNO1.
ƒл€ получени€ фрагмента т–Ќ  Arg используют полимеразную цепную реакцию (ѕ÷–), которую провод€т на матрице ƒЌ  E.coli 294 с использованием в качестве праймеров олигонуклеотидов YI и Y2:
5'-GCTGATTCAGTCAGGCGTCCCATTATCAGTG-3' и
5'-CAGGAAGGTAAAACCGTCTGTTCCGGGCA-3'
”слови€ реакции ѕ÷–: концентраци€ олигонуклеотидов составл€ет 50 uM, концентраци€ каждого из 4-х дезоксинуклеотидтрифосфатов составл€ет 250 uM. »спользуют буфер HEPES - NaOH (50 mM, pH 8.5), концентраци€ MgCl2 составл€ет 1.6 mM. –ежим –÷–: 93oC 1 мин; далее 35 циклов (93oC 30 сек; 67oC 3 мин). ѕродукт ѕ÷– по результатам анализа в 1% агарозном геле имеет длину 0.5 т.п. н. ѕродукт ѕ÷– гидролизуют рестриктазами SphI и ClaI и выдел€ют фрагмент размером 0.57 т.п.н. с помощью электрофореза в агарозном геле.   полученному фрагменту присоедин€ют при помощи ƒЌ -лигазы фага T4 фланкирующие последовательности - олигонуклеотиды KC1, KC2 и SP1, SP2 соответственно
5'-CCGATCCGT-3';
3'-CATGGGCTAGGCAGC-5';
5'-CATGCGGCCGCAATTCGAGCT-3';
3'-GTACGTACGCCGGCGTTAAGC-5'
и клонируют между участками узнавани€ рестриктаз KpnI и SacI плазмиды pNO1. B результате получают плазмиду pUABC22. ѕравильность сборки рестриктных фрагментов подтверждают путем определени€ нуклеотидной последовательности по методу —энгера.
ѕример 2.  онструирование плазмиды pR4.
ѕлазмиду pACYC184 гидролизуют рестриктазой PvuII с образованием фрагментов размером 0.5 и 3.7 т.п.н., гидролизат легируют с синтетическим SalI- линкером (5'-GGTCGACC-3') и, после инактивации ƒЌ -лигазы, гидролизуют сначала рестриктазой SalI с образованием набора фрагментов длиной 0.5, 1.6 и 2.1 т. п. н., а затем рестриктазой HindIII с образованием фрагментов длиной 0.5, 1.0, 1.6 и 2.1 т. п.н. ‘рагмент длиной 1.0 т.п.н. очищают и используют в дальнейшем. ѕлазмиду pNEO гидролизуют рестриктазами SalI и HindIII с образованием фрагментов размером 1.8 и 3.7 т.п.н. ‘рагмент длиной 1.8 т.п.н. очищают и используют в дальнейшем. ѕолученные фрагменты легируют и образовавшимс€ фрагментом трансформируют клетки штамма E.coli JM109. ѕолученна€ плазмида pK0 размером 2.8 т.п.н. устойчива к канамицину. »дентификацию производ€т по длинам рестриктных фрагментов SalI - HindIII.
ѕлазмиду pK0 гидролизуют рестриктазой AvaII таким образом, чтобы один акт гидролиза приходилс€ в среднем на одну молекулу плазмиды. ѕосле фенольной депротеинизации полученный гидролизат обрабатывают при помощи нуклеазы Mung bean. ѕосле фенольной депротеинизации гидролизат легируют с синтетическим SalI-линкером (5'-GGTCGACC-3') и после инактивации ƒЌ -лигазы гидролизуют рестриктазой SalI. ѕосле фенольной депротеинизации смесь обрабатывают ƒЌ -лигазой фага T4 и трансформируют клетки штамма E.coli JM109. —реди рекомбинантов, устойчивых к канамицину, отбирают клон, имеющий размер 2.5 т.п.н. и содержащий уникальный участок узнавани€ рестриктазы SalI и получают плазмиду pK1.
ѕлазмиду pMC9 расщепл€ют рестриктазой EcoRI, достраивают липкие концы с помощью фрагмента  ленова ƒЌ -полимеразы I. ѕосле фенольной депротеинизации и переосаждени€ этанолом гидролизат легируют с синтетическим SalI-линкером (5'-GGTCGACC-3') и после инактивации ƒЌ -лигазы гидролизуют рестриктазой SalI. ‘рагмент длиной 1.3 т.п.н. очищают и легируют с плазмидой K1, расщепленной с помощью рестриктазы SalI. ѕолученной лигазной смесью трансформируют клетки штамма E.coli JM109.  олонии трансформантов высевают на чашки с L-агаром, содержащим канамицин 25 мкг/мл и выращивают в LB-среде, содержащей канамицин 25 мкг/мл). ¬ыдел€ют плазмидную ƒЌ , отбирают клон, содержащий фрагмент SalI-SalI длиной 1.3 т.п.н. и получают плазмиду pR4 размером 3.8 т. п.н.
ѕример 3. ѕолучение штамма-продуцента.
 летки штамма Escherichia coli JM109 трансформируют двум€ плазмидами: pR4 и pUABC22 и получают штамм-продуцент модифицированного активатора плазминогена урокиназного типа.
ѕример 4. ѕолучение рекомбинантного модифицированного активатора плазминогена урокиназного типа.
Ѕактерии штамма E. coli ¬ ѕћ ¬-766, содержащие плазмиды pUABC22 и pR4, выращивают до плотности OD600 = 2.5 в течение 16 ч в 50 мл LB-среды с ампициллином (100 мкг/мл) при 37oC и интенсивной аэрации. ѕо окончании выращивани€ клетки собирают центрифугированием 30 мин при 4000 об/мин, суспендируют в 2.5 мл 20 мћ “рис-HCl, pH 6.7, 30 мћ NaCl, добавл€ют 2.5 мг лизоцима, инкубируют 10 мин при 4oC, добавл€ют “рис-HCl, pH 8.3 до 50 мћ, Ёƒ“ј до 20 мћ, инкубируют 30 мин при 4oC, после чего обрабатывают ультразвуком 1 мин. ќсадочную фракцию клеточного экстракта отдел€ют центрифугированием в течение 90 мин при 5000 об/мин, суспендируют в 1 мл 2%-ного “ритона ’-100, центрифугируют 5 мин при 14000 об/мин, суспендируют в 100 мкл 200 мћ Ёƒ“ј, 500 мћ “рис-HCl, pH 8.0, добавл€ют 800 мкл денатурирующего раствора (6 ћ гуанидинхлорид, 100 мћ 2-меркаптоэтанол), инкубируют 20 мин при 65oC нерастворимый осадок убирают центрифугированием.
ѕроцедуру реконституции ферментативной активности провод€т следующим образом. –аствор разбавл€ют в 20 раз буфером: 100 мћ “рис-HCl, pH 9.0, 200 мћ аргинин-хлорид, 5 мћ восстановленный глютатион, 1 мћ окисленный глютатион, денатурирующий агент (1 ћ гуанидинхлорид), инкубируют 40 ч при 4oC, после чего диализуют против двух смен по 1 л 100 мћ NaCl, 20 мћ “рис-HCl, pH 8.0, в течение 6 ч. ¬ыпавший осадок удал€ют центрифугированием и измер€ют активность в тесте на фибринолизис как описано выше. јктивность мјѕ”“ в образце составл€ет 1500.
–енатурированный рекомбинантный модифицированный активатор плазминогена представлен, главным образом, проферментной формой с молекул€рной массой 43 кƒа, что демонстрируют данные электрофоретического и зимографических анализов. ¬ыход активного мјѕ”“ составл€ет 200000-250000 ед. на 1 г биомассы, что в 4 раза превосходит выход мјѕ”“, получаемый в аналогичных услови€х в случае штамма-продуцента ¬ѕ ћ ¬-4534.
‘ормула изобретени€: 1. –екомбинатна€ плазмидна€ ƒЌ  pUABC22, кодирующа€ модифицированный активатор плазминогена урокиназного типа, имеюща€ размер 4,5 т.п.н. и содержаща€ XmnI - BamHI - фрагмент ƒЌ  плазмиды pUABC22 размером 2,99 т.п.н.; - BamHI - KpnI - фрагмент ƒЌ  размером 0,177 т.п.н., содержащий участок кодирующей области гена мјѕ”“, соответствующий 12 —-концевым аминокислотам мјѕ”“, и нетранслируемый элемент - искусственную межгенную последовательность ћ√ѕ 14; KpnI - SacI - фрагмент ƒЌ  размером 0,57 т.п.н., содержащий ген т–Ќ  Arg; SacI - XmnI - фрагмент ƒЌ  вектора pUC19 размером 0,79 т.п.н.; участок инициации репликации и промоторно-операторную область lac-оперона; генетические маркеры; ген устойчивости к ампициллину.
2. Ќетранслируемый ƒЌ -элемент - искусственна€ межгенна€ последовательность ћ√ѕ 14 размером 0,13 т.п.н.: -5'-GGGCTGCAGGCCGGGCGGCGCCGTGCGCGCCCGGCCGCCGATGCTCCCCGGCGGCCGGGCGCGCACGGCGCCGCCGGGCACTGCAGCCCCGCGGGGCCCCTCAGGGGGCCCCGCGGGGTTTTTTGGTACC-3'.
3. Ўтамм бактерий Escherichia coli ¬ ѕћ ¬-7666-продуцент модифицированного активатора плазминогена урокиназного типа.