Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
СПОСОБ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРИСУТСТВИЯ И/ИЛИ КОЛИЧЕСТВА КЛЕТОЧНОГО МАТЕРИАЛА В ГАЗОВОЙ СРЕДЕ
СПОСОБ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРИСУТСТВИЯ И/ИЛИ КОЛИЧЕСТВА КЛЕТОЧНОГО МАТЕРИАЛА В ГАЗОВОЙ СРЕДЕ

СПОСОБ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРИСУТСТВИЯ И/ИЛИ КОЛИЧЕСТВА КЛЕТОЧНОГО МАТЕРИАЛА В ГАЗОВОЙ СРЕДЕ

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Изобретение предназначено для контроля присутствия и/или количества клеточных микроорганизмов, таких как бактериальные клетки, в большом объеме воздуха, таком как склад или производственное помещение, или на открытом воздухе, где подозревается присутствие бактерий. Способ позволяет определять вероятность присутствия патогенного материала в окружающей среде путем измерения числа клеток партиями или в реальном масштабе времени методом люминесценции. В последнем режиме осуществляется непрерывный контроль окружающей среды на присутствие патогенов. Устройство содержит люминометр непрерывного потока, предпочтительно с подачей из циклона или высокоскоростного виртуального импактора, а также реагенты лизиса и люминесценции, которые детектируют количество АТФ или аденилат-киназы, присутствующее в пробе воздуха. Использование изобретения позволяет обеспечить постоянный контроль содержания микроорганизмов в газообразной среде. 2 с. и 34 з.п. ф-лы, 4 ил.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2142016
Класс(ы) патента: C12Q1/04, C12M1/34
Номер заявки: 97106556/13
Дата подачи заявки: 13.03.1995
Дата публикации: 27.11.1999
Заявитель(и): Министр обороны Объединенного королевства Великобритании и Северной Ирландии (GB)
Автор(ы): Дэвид Джеймс Сквиррелл (GB)
Патентообладатель(и): Министр обороны Объединенного королевства Великобритании и Северной Ирландии (GB)
Описание изобретения: Настоящее изобретение относится к способу и устройству для мониторинга газообразной среды на присутствие клеточного материала; более конкретно, оно относится к устройству, которое способно определить присутствие и/или количество клеточных микроорганизмов, таких как бактериальные клетки, в большом объеме воздуха, таком как на товарном складе или производственном помещении или на открытом воздухе, где подозревается присутствие бактерий. Способ и устройство по изобретению, в частности, пригодны для определения вероятности присутствия патогенного или аллергенного материала в окружающей среде путем непрерывного электронного подсчета количества клеток. Последняя конфигурация обеспечивает постоянный мониторинг окружающей среды.
Имеется военная необходимость выявления возникновения нападения с использованием биологических материалов, включая нападение с использованием бактерий, например, в форме клеток или спор. Такая необходимость включает способность контролировать воздух на некотором расстоянии против ветра от объекта для обеспечения достаточного предупреждения персонала на этом участке об угрозе бактериального нападения. В таких обстоятельствах требуется, чтобы мониторинг проводился постоянно, то есть в течение продолжительного периода времени для любого отдельного контрольного приспособления, например, от нескольких до нескольких десятков часов.
Кроме того, есть необходимость в определении присутствия патогенов в учреждениях, таких как больницы и в производственных помещениях, в которых продукты питания, стерильные фармацевтические средства или физиологические добавки помещают в контейнеры перед использованием. Перед производственным циклом желательно, чтобы стерильность среды упаковочного помещения контролировалась на присутствие патогенов или менее вредных бактерий, которые могут использоваться как показатель вероятного присутствия патогенов или аллергенов.
В обеих этих ситуациях необходимо обрабатывать большой объем воздуха или ввиду продолжительной природы измерения или ввиду необходимости взятия проб значительного количества чистого комнатного или стерильного складского воздуха. Кроме того, в обеих ситуациях необходимо проводить скрининг для выявления широкого диапазона бактерий, независимо от типа, поскольку угроза может исходить от неизвестного рода или вида.
Известно использование реакции с люминолом для анализа воздуха на присутствие гематина, но эта технология может реагировать и на неорганические материалы и теоретически ограничена пределом выявления 103 бактериальных клеток, поскольку лишь 10-16 г гематина можно экстрагировать из средней бактериальной клетки. Чувствительность к металлам, дающая высокие фоновые значения, делает эту систему ненадежной на практике.
Известен скрининг вероятного присутствия бактерий путем анализа проб на присутствие аденозин трифосфата. Он легко проводится с использованием люциферазы и агента люциферина, при котором присутствие АТФ позволяет люциферазе катализировать окисление люциферина, приводящее в результате к эмиссии света. Образцы загружаются в люминометр и количество испускаемого света использовалось как мера количества присутствующих бактерий. Известно, что для высвобождения такого количества АТФ, которое присутствует в любых клетках, к пробе добавляют детергент для лизиса клеток и освобождения АТФ.
Хотя такая биохимия широко использовалась с отдельными пробами, полученными прямым взятием проб с поверхностей, жидкостей и твердых веществ, проводились незначительные разработки люминометрического оборудования, подходящего для мониторинга бактерий в воздухе.
Документ Японии 62093634 раскрывает счетчик микроорганизмов, который втягивает пробу воздуха, собирает из нее микроорганизмы и экстрагирует АТФ с использованием реакции люминесценции. В этом устройстве используется мембранный фильтр с размером пор 0,2 мкм для сбора микроорганизмов из воздуха методом взятия партий проб, причем периодически проводится анализ мембраны путем ее перевода в экстрагированное положение. Подробности чувствительности этого оборудования не приводятся, но его работа ограничена способностью воздушного насоса набирать достаточную пробу воздуха через мембрану и временем, затрачиваемым на обработку микроорганизмов, содержащихся на мембране.
Документ Японии 58122281 раскрывает способ выявления бактерий в воздухе снова с использованием люминесцентных реактивов для количественного анализа АТФ. При этом способе экстракция АТФ производится с использованием жидкого буфера Трис-ЭДТК, нагретого до 100oC, из проб десятков литров воздуха в минуту партиями из 10-минутных проб. Для устранения грязи и пыли требуются фильтры, и они описываются как существенные в этом способе. Змеевик требуется во избежание увеличения фонового шума вследствие подъема температуры фотоэлектронных умножителей, используемых для контроля люминесценции. В этом приборе также используется "экстрактор" для затягивания воздуха в объеме десятков литров в минуту. Точная природа этого "экстрактора" неясна.
Известно использование устройств циклонных уловителей для захвата частиц из воздуха, причем эти устройства обычно имеют электрический привод и образуют фракции, лишенные частиц и с высокой концентрацией частиц. Известно использование таких устройств с целью получения аэрозолей и других частиц из воздуха для последующего анализа. Например, в патенте Великобритании 2245024 описывается циклонный уловитель для сбора образца большого объема биологических материалов из воздуха; а.с. СССР 1546481 и 1191146 описано использование циклонных уловителей для предоставления образца частиц, используемого для засева сосудов или чашек, содержащих питательную среду, для анализа, тогда как в а.с. СССР 916535 бактерии собирают из таких циклонных уловителей на фильтровальную полоску и вирусы в нижнем отделе, откуда они используются для заражения экспериментальных животных. Известно также использование виртуальных импакторов для сбора содержащихся в воздухе частиц, см., например, патенты США 4942297 и 4670135.
И снова, ни одна из этих систем не способна осуществлять постоянный мониторинг воздуха на присутствие бактерий, в частности, небольших количеств патогенных бактерий. Особой проблемой является изменение концентрации выхода жидкости из циклонного уловителя с изменениями влажности воздуха, пробы которого берутся. При очень высокой пропускной способности циклонный уловитель может работать почти сухим и давать высокие показатели при относительно нормальной фоновой подаче.
В документе Японии 5184350 описана система для подсчета бактериальных клеток, суспендированных в воздухе, целью которой является укорочение времени определения и повышение точности результатов. В документе Японии 60016598 описано альтернативное устройство для выявления бактерий в определенном количестве воздуха. В документе Японии 3112495 описана фильтрующая система для выявления различных микроорганизмов, плавающих в воздухе. Ни одно из этих устройств не пригодно для продолжительной работы.
Настоящее изобретение теперь обеспечивает способ и устройство для действительно непрерывной поточной люминометрии, которые способны проводить непрерывный или периодический электронный контроль бактерий в газообразной среде, в частности атмосферном воздухе так, что могут производиться измерения в реальном масштабе времени содержания бактерий в воздухе. Такое устройство особенно направлено на непрерывный мониторинг, но в равной степени пригодно для исследования образцов больших объемов воздуха, таких как объемы внутри больницы, чистого зала производственного предприятия или стерильного склада для взятия проб перед производственным циклом.
В первом аспекте настоящее изобретение предлагает способ определения присутствия и/или количества клеточного материала, присутствующего в газообразной среде, предусматривающий:
(а) непрерывный сбор пылевой фракции из окружающей среды в течение периода времени;
(b) непрерывную передачу пылевой фракции в процессовую текучую среду;
(c) непрерывное выделение внутриклеточного содержимого, включая АТФ из клеточного материала, присутствующего в процессовой текучей среде, содержащей пылевую фракцию;
(d) непрерывное давление люминесцентных реактивов в зависимости от присутствия АТФ для обеспечения люминесценции процессовой текучей среды;
(e) непрерывное измерение света, испускаемого из процессовой текучей среды, полученной на стадии (d) в люминометре, при котором люминометр выдает сигнал, соответствующий этому свету, и по присутствию и величине сигнала рассчитывается присутствие и/или количество такого материала, присутствующего в газе. Предпочтительно, сигнал анализируется в реальном масштабе времени оператором или обрабатывающим устройством, возможно в месте, отдаленном от места, где осуществляется измерение.
Предпочтительно, газ является атмосферным воздухом, материал - бактериями, а стадии (b), (c), (d) и/или (e) проводят непрерывно. Предпочтительно, стадию (b) проводят с использованием детергента, но он может проводиться с использованием теплового, звукового или другого источника энергии или литического агента, например фермента, с соответствующим охлаждающим воздействием, применяемым, если генерируется избыточное тепло.
Для непрерывного проведения всех этих стадий предпочтительно пропускать процессовую текучую среду от стадии сбора до последующих стадий с использованием трубопровода, причем время для идентификации бактерий, собранных на стадии (а), по содержанию в них АТФ, ограничено только временем, необходимым для протекания текучей среды по трубопроводу к стадиям люминометрии.
Более предпочтительно, протекание текучей среды по трубопроводу управляется средством привода, таким как один или более насосов, посредством которых постоянный поток собирающей текучей среды может анализироваться люминометрией.
Для сбора пылевого образца предпочтительно засосать воздух в устройство для сбора, осадить клеточный материал, например бактерии в виде частиц, в собирающую часть коллекторного устройства и выпустить лишенный частиц воздух из коллектора. Такой сбор предпочтительно проводят со скоростью от нескольких десятков до тысяч литров воздуха в минуту для взятия полезного образца, и предпочтительно, со скоростью 100-1000 литров в минуту.
Для дифференцирования бактерий от других клеточных материалов, таких как эукариотические клетки, например различные виды пыльцы, или грибковых спор, можно разделять содержащую пылевой материал процессовую текучую среду на два потока, или использовать два коллектора для образования двух потоков процессовой текучей среды и добавить детергент, способный освобождать содержимое клеток, включая АТФ из всех клеток и спор, в один поток, и другой детергент, который способен выделять содержимое одной из эукариотических клеток и грибковых спор в другой поток. С этой целью можно, например, добавить, например, неионный детергент для освобождения материалов из эукариотических клеток и грибковых спор и, например, катионный детергент для освобождения его из всех клеток.
Путем вычитания сигнала от люминометра с потоком неионного детергента из сигнала от люминометра с потоком катионного детергента, можно вырабатывать постоянный сигнал, показывающий присутствие и количество бактерий.
В еще более предпочтительном варианте способа бактерии выявляют путем детекции количественной характеристики активности аденилат-киназы в процессовой текучей среде, содержащей собранный пылевой материал, в котором в процессовую текучую среду добавляют аденозин-дифосфат (АДФ), который превращается любой присутствующей аденилат-киназой в аденозин-трифосфат, который в свою очередь выявляется, как описано выше. Таким образом, чувствительность способа увеличивается вследствие каскадного эффекта активности фермента, ведущего к эффективному усилению сигнала. Такой способ в случаях применения для выявления бактерий вообще, является предметом параллельной заявки PCT/GB 94/00118 того же заявителя. АДФ может быть включен в процессовую среду на стадии сбора пылевой фракции, или может добавляться ниже по потоку, например, с любыми реактивами, добавляемыми перед люминесцентными реактивами.
Чистота добавляемого АДФ должна предпочтительно быть такой, что отношение АДФ к АТФ в реактиве составляет 2000:1 или более; более предпочтительно 6000:1 или более. Концентрация АДФ в процессовой среде может теоретически быть любого уровня, при котором он выше уровня АТФ, уже присутствующего в организмах, если должна быть вызвана существенная сенсибилизация. Предпочтительно использовать по меньшей мере 0,01 мМ или более АДФ, более предпочтительно, от 0,01 до 1 мМ АДФ или более как конечной концентрации в процессовой среде.
Хотя клеточный материал содержит достаточно магния для магнийзависимого превращения АДФ в АТФ, специалистам в этой области понятно, что реактив АДФ предпочтительно использовать в присутствии ионов магния, если предполагается оптимальное образование АТФ. Таким образом, реактив АДФ предпочтительно составлен в буфере, содержащем достаточно магния для обеспечения уровней магния по меньшей мере на уровне в два или более раз выше молярности АДФ. Предпочтительно, превращение АДФ в АТФ происходит в буферном растворе с pH 5,5-8,5, более предпочтительно с pH 7,8. Обеспечение магния особенно предпочтительно, когда АДФ стабилизируют ЭДТК или подобными хелатообразующих веществами.
Специалисты в этой области поймут, что термин "непрерывный" применительно к стадии (а) здесь означает непрерывный сбор частиц в течение периода работы.
Такой период может составлять от нескольких минут до многих часов или может быть заданным периодом времени, обычно перед запуском стерильной производственной линии. Для использования во внутреннем стерильном пространстве этот период должен быть достаточен для того, чтобы устройство собрало пылевые частицы из объема, равного значительной части воздуха этого пространства, потенциально по существу всего воздуха, и может собираться партиями.
В предпочтительном варианте способа, в котором осуществляют мониторинг стерильного пространства, такого как больничное здание, чистая комната или стерильная упаковочная установка, осуществляют непрерывный сбор частиц из воздуха, в то время как различные вентиляторы, подающие воздух из воздушных кондиционеров, работают или отключены. Процессовая жидкость, соответствующая воздуху, собранному во время работы каждого воздушного вентилятора, и процессовая жидкость, собранная при отключенной системе кондиционирования воздуха, исследуются с использованием возможности способа изобретения производить измерение АТФ в реальном масштабе времени, посредством которого предоставляется быстрая индикация места бактериального загрязнения, если в одной из этих жидкостей выявляется увеличение присутствия бактерий. Когда сбор и обработку процессовой жидкости проводят в течение всего периода исследования в отличие от просто сбора партий веществ в виде частиц, возможно просто коррелировать выход люминомера в определенное время с присутствием бактерий.
Во втором аспекте настоящее изобретение предлагает устройство для осуществления способа по изобретению.
Устройство по изобретению содержит:
(а) средство непрерывного сбора пылевой фракции из газообразной среды;
(b) средство непрерывной передачи пылевой фракции в процессовую текучую среду;
(с) средство непрерывного выделения внутриклеточного содержимого, включая АТФ, из бактериальных клеток или спор, присутствующих в процессовой текучей среде;
(d) средство непрерывного добавления люминесцентных реагентов в зависимости от присутствия АТФ для придания люминесценции процессовой текучей среде;
(е) световой детектор, приспособленный для непрерывной запитки процессовой среды со стадии (d), способное выдавать сигнал, характеризующий наличие и количество детектированной люминесценции, и
(g) средство передачи сигнала для подачи сигнала от люминометра процессору, и/или дисплейное средство для индикации присутствия и/или количества бактерий.
Средство непрерывного сбора (а) предпочтительно представляет собой циклонный уловитель или виртуальный импактор, предпочтительно высокообъемный импактор. Когда требуется продолжительный контроль наружного воздуха, т.е. вне зданий, предпочтительно использовать циклон, предпочтительно такой циклон, который способен обрабатывать от 100 до 1000 литров или более воздуха в минуту, и обеспечивать непрерывный выпуск из него фракции частиц, однако нет необходимости в верхнем пределе, поскольку специалистам в этой области известны циклоны гораздо более высокой емкости. Предпочтительно, циклон представляет собой влажностеночный гидроциклон, и пылевая фракция в виде частиц предоставляется в форме текучей процессовой среды, содержащей уловленные частицы, когда она покидает циклон. Когда предполагается взятие пробы ограниченного объема газа, такой как в стерильном блоке производственной линии, предпочтительным может быть использование высокоскоростного виртуального импактора для удаления вещества в виде частиц из воздуха; такой импактор может быть для удобства способен брать пробы приблизительно от 50 до 150 литров воздуха в минуту.
В обоих вариантах средство подачи пылевой фракции в процессовую среду предпочтительно включает в себя средство подачи процессовой среды, в которую осаждается пылевая фракция. Процессовая среда представляет собой предпочтительно жидкость, такую как вода или буфер, необязательно содержащий ионы магния, АДФ и/или реагент для освобождения внутриклеточного содержимого, включая АТФ, из клеток.
Когда производится взятие проб больших объемов газа с разной влажностью, предпочтительно добавить любой детергент ниже по потоку от коллектора и использовать раздел газ-жидкость, способный поддерживать степень разведения частиц в процессовой текучей среде по существу на постоянном уровне и удалять избыточный воздух в виде пузырьков. Один из подходящих разделов "газ-жидкость" описан в патенте этого же заявителя ЕР 668095.
Предпочтительная модификация этого раздела получает процессовую среду от насоса между коллектором и разделом. Когда уровень жидкости в разделе падает ниже установленного уровня, датчик уровня передает сигнал к насосу, его работой вызывая увеличение скорости потока жидкости. В то же самое время воздух, попавший в жидкость в виде пузырьков, получает возможность уходить в атмосферу, обеспечивая таким образом достаточно постоянную подачу жидкости на стадиях ниже по ходу от устройства.
В еще одной модификации этого средства насос расположен ниже по ходу от раздела, и насос замедляет работу, когда уровень жидкости в разделе падает ниже установленного уровня, чтобы уровень жидкости мог восстановиться. Скорость потока процессовой жидкости через циклонный уловитель может быть любой, и в этот поток без сложных расчетов может подаваться соответствующее количество детергента, АДФ, фосфата и люминесцентных реактивов. Предпочтительная скорость потока составляет от 0,1 до 10 мл процессовой жидкости в минуту, при которой в то же самое время 100 литров воздуха в минуту входит в коллектор, например циклонный уловитель.
Средство выделения внутриклеточного содержимого, включая АТФ, может включать нагреватель, ультразвуковой прибор или средство добавления литического агента, такого как фермент или детергент, как описано выше в описании способа. Если средство выделения основано на физическом эффекте для выделения клеточного содержимого, оно должно производить этот эффект возле средства передачи пылевой фракции в процессовую жидкость, или ниже от него по потоку. Если средство добавляет литический агент, то оно может быть расположено выше по потоку, возле или ниже по потоку от средства передачи. Охлаждающее устройство может быть включено перед проходящими ниже по потоку стадиями люминесценции, если используется нагревание.
Процессовая жидкость проходит из своего источника подачи, т.е. резервуара, через средство передачи и в любое находящееся ниже по потоку средство выделения внутриклеточного содержимого, по жидкостному пути. Предпочтительно, этот путь выполняют в виде жидкостного канала, более предпочтительно в виде трубопровода. Процессовая жидкость представляет собой предпочтительно жидкость, подаваемую через трубопровод посредством одного или более насосов, которые предпочтительно являются перистальтическими насосами, которые воздействуют на жидкость через стенку трубопровода; причем предпочтительные трубопроводы представляют собой трубки гибкого типа, более предпочтительно гибкую прозрачную пластиковую трубку, пригодную для подачи жидкости под действием перистальтических насосов.
При использовании скоростей подачи от 0,1 до 10 мл процессовой жидкости в минуту в циклонный уловитель можно ожидать, что вследствие испарения поток еще больше уменьшится, например от 0,05 до 10 мл в минуту, но предпочтительно, чтобы от 0,5 до 5 мл в минуту поступили к разделу. При таких скоростях потока устройство может предпочтительно использовать перистальтические трубки с внутренним диаметром порядка от 0,25 до 3 мм, хотя для них не устанавливается конкретного предела, кроме того, что трубки не должны быть слишком широкими для поддержания свободного от воздуха потока жидкости через устройство. Подходящая трубка из силиконовой резины для этой цели поставляется фирмой Autoclude с внутренним диаметром 0,8 мм; альтернативная трубка выпускается фирмами Watson Marlow-UK и Ismatec-Switzerland.
Если литический агент добавляют ниже по потоку от средства передачи пылевой фракции, предпочтительно обеспечивают переходник, посредством которого одиночный перистальтический насос действует на одну или более трубок, несущих процессовую жидкость от средства передачи, и одной или более трубок, несущих литический агент, предпочтительно раствор литического агента; причем по меньшей мере одна из каждого типа трубки переходит в одиночную трубку ниже по потоку в соединении этих двух трубок.
Аналогичная компоновка, предпочтительно с отдельным перистальтическим насосом, представлена для возможного добавления любого реактива АДФ в основанный на аденилаткиназе аспект способа, в котором увеличенные количества АТФ получаются из данного количества бактерий, и аналогичным образом для средства добавления люминесцентных реактивов. В последнем случае переходник между трубопроводом, несущим процессовую жидкость со стадии (с), с трубопроводом, несущим реактивы люминесценции, предпочтительно располагают в самом устройстве измерения света, например, в светоизмерительной камере люминометра.
Если процессовая жидкость, содержащая уловленные частицы, разделяется на два потока для обработки различными литическими агентами, то эти потоки могут быть образованы раздельными циклонными уловителями или импакторами возле выпускного отверстия для процессовой жидкости одиночного циклона или импактора, возле раздела воздух-жидкость или ниже по потоку. В варианте выполнения устройства по изобретению эти потоки обеспечиваются с использованием разветвленного патрубка ниже по потоку от раздела и предпочтительно этот разветвленный патрубок используется для смешивания двух литических агентов с соответствующим потоком из указанных потоков. Таким образом, разветвленный патрубок имеет обычно центральный впуск из раздела, несущий, например, приблизительно 50% подаваемого потока жидкости, и предпочтительно 80%, к коллектору (в зависимости от испарения в циклонном уловителе или импакторе), и к которому присоединены соответствующие патрубки средств подачи двух детергентных реагентов, используемых, например, каждое в количестве 25% от центрального входящего потока. Два выпуска из разветвленного патрубка обеспечивают два комбинированных потока смесей 50:50 центрального потока и соответствующего потока детергента. Обычно поток из каждого выпуска разветвленного патрубка может быть порядка от 75 до 125% объема потока от раздела.
В предпочтительном варианте выполнения устройства по изобретению, особенно пригодного для атмосферного мониторинга, например для защиты военного объекта, предпочтительно иметь два потока процессовой жидкости и обрабатывать их двумя различными средствами выделения внутриклеточного содержимого для различения эукариотических клеток и грибковых спор с одной стороны, и бактерий с другой. Эти потоки могут исходить из одного коллектора вещества в виде частиц или их двух раздельных коллекторов, работающих в одном и том же месте. Предпочтительными детергентами, используемыми для таких потоков, являются детергенты, описанные выше для способа по изобретению и раскрытые в заявке PCT/GB 94/00118.
В альтернативном варианте выполнения изобретения один из люминесцентных агентов, предпочтительно люцифераза, иммобилизируется возле светового детектора люминометра внутри светоизмерительной камеры, где смешиваются процессовая жидкость и люминесцентные реактивы, содержащие в этом случае раствор люциферина. Путем иммобилизации возле детектора эффективность детекции света может быть доведена до максимума. Для поддержания активности люциферазы она может быть фиксирована на субстрате типа ленты, которая перематывается с одного барабана на другой так, чтобы свежая люцифераза подавалась в поступающие жидкости с желаемой скоростью. Иммобилизация может быть достигнута химическим или физическим связыванием фермента, например, с помощью химической связывающей группы, такой как глютаральдегид, с соответствующим образом выполненным плоским носителем, а непроницаемость камеры для жидкости может поддерживаться введением ленты этого вещества через, например, барабаны, которые непроницаемы для жидкости, или расположены выше уровня жидкости.
Следует учесть, что способ и устройство по изобретению могут работать при температурах окружающей среды, но могут также функционировать при более высоких температурах, насколько позволяет термоустойчивость реагента. Таким образом, трубка или светоизмерительная камера люминометра может нагреваться для увеличения количества АТФ, вырабатываемого агентом АДФ или светом, испускаемым из люминесцентных реактивов в ответ на присутствие АТФ. Для такого использования могут применяться термостабильные люциферазы из совместно поданных заявителем заявок Великобритании N 940570.2, 9501170.6 и 9500660.7 (объединенных в заявке PCT/WO 95/25788). Специалистам в этой области понятно, что после выхода из камер люминометра, например, по дальнейшим перистальтическим трубкам потоки могут направляться в дальнейшие аналитические устройства, такие как устройства, использующие специфическое связывание для более специфического определения природы любых присутствующих бактерий или других агентов, таких как вирусы, ДНК или химические вещества.
Кроме того, в способе по изобретению обеспечен трубчатый элемент или сеть таких элементов, пригодных для использования в устройстве по изобретению, содержащий перистальтический трубчатый элемент или сеть таких элементов, причем этот элемент или сеть имеет первый отрезок трубки со свободным концом, пригодным для прикрепления к выпускному штуцеру для жидкости устройства для непрерывного сбора пылевой фракции из газообразной окружающей среды, предпочтительно раздел газ-жидкость этого устройства, переходник между другим концом первого отрезка трубки и вторым отрезком трубки, причем второй отрезок трубки пригоден для подсоединения к источнику реагента, такому как контейнер реагента, а другой предоставленный отрезок трубы, ведущий от соединения первого и второго отрезков, имеет свободный конец, пригодный для подсоединения к впускному приспособлению камеры люминометра; причем все отрезки способны к перистальтике под действием перистальтического насоса.
Предпочтительно, элемент или сеть по изобретению включает в себя один или более дополнительных соединений между переходником между первым и вторым отрезками трубки с отрезками трубки, имеющими свободные концы, пригодные для подсоединения к дополнительным источникам реагентов.
Таким образом, когда детергент используется для лизиса клеточного материала и добавляется выше по потоку от коллектора частиц, и производится прямое измерение содержания бактериальной АТФ, то может использоваться трубчатый элемент, просто соединяющий раздел и светоизмерительную камеру люминометра. Если детергент добавляют ниже по потоку от коллектора и используют аденилат-киназный вариант способа, то потребуются два соединения для обеспечения связи с отрезками трубки соответственно от детергента и от источника реагента АДФ. Отдельный источник люминесцентного реагента и трубка могут быть включены вместе с элементом или сетью, как часть набора для восполнения запаса реагента.
В каждом случае предпочтительно, по самой природе устройства, чтобы свободные концы трубки, включая концы, ведущие к резервуарам с реагентами, были закрыты для предотвращения попадания бактерий и других клеточных материалов, предпочтительно пробиваемой или съемной торцевой крышкой, например, удаляемой отрывом, отрезанием или вытягиванием. Еще более предпочтительно, свободные концы к реагентам действительно прикреплены к требуемым реагентам так, что сеть стерильных сменных трубок может заменяться одновременно с количествами и концентрациями реагентов, подобранных друг к другу таким образом, что их работа продолжается одинаковый период времени.
Теперь только в целях иллюстрации будут приведены примеры способа, устройства, трубчатого элемента и сети по изобретению со ссылкой на следующие неограничивающие примеры и чертежи. Другие варианты выполнения изобретения, входящие в объем формулы изобретения, будут ясны специалистам в этой области с учетом изложенного.
Фиг. 1 - схематический вид устройства по изобретению, содержащего циклон и двойную линию питания раздела газ-жидкость неионным и катионным детергентами, средство подачи реагента люминесценции, люминометры и центральный процессорный узел (ЦПУ).
Фиг. 2 - поперечное сечение устройства по фиг. 1 через циклон и поверхность раздела газ-жидкость.
Фиг. 3 - трубчатый элемент и сеть контейнеров для реагента, пригодные для замещения реагентов в виде единого блока устройства, как описано в примере 2.
Фиг. 4 - график количества импульсов в минуту на выходе люминометра, как описано в примере 1, когда различные количества АТФ добавляются в трубку непосредственно ниже по потоку от раздела воздух-жидкость.
Пример 1. Устройство для непрерывной люминометрии потока
Устройство для непрерывной люминометрии потока по изобретению сконструировано с использованием блока циклонного уловителя 1, способного извлекать частицы из объема приблизительно 1000 литров воздуха в минуту с использованием воды в качестве процессовой жидкости и соединенного с устройством 2 раздела газ-жидкость, расположенным ниже по потоку, для дегазации жидкости и разделения потока на два параллельных процессовых потока. Таким образом, жидкость собирает частицы, включая любые аэрозоли, и несет их под действием перистальтических насосов 4 через перистальтические трубопроводы 3 из силиконовой резины 0,8 мм (Autoclude) к соединениям 5, где под действием насосов 5 подается поток детергента (0,2% водный раствор цетилтриметиламмония бромида [ЦТАБ] или 0,4% водный Тритон Х-100) из контейнеров 6 в поток процессовой жидкости (обеспечивая концентрацию в потоке 0,1% ЦТАБ или 0,2% Тритона Х-100). Следующие насосы 7 прокачивают потоки жидкости дальше и транспортируют их с той же скоростью, что и раствор, содержащий флэш-кинетическую смесь люциферазы, люциферина и буфера (Biotrace ple Bridgend, UK) из контейнеров 8 к камере измерения света (не показана) внутри корпуса люминометра 9, где соответствующие потоки и реагенты смешиваются. Насосы 7 обеспечивают синхронную подачу путем одновременного действия на линии подачи 10 и 11, и относительные количества АТФ, выделяемые из одной и той же пробы частиц под действием детергентов, обеспечивают количества света, сигнализирующие таким образом об общем количестве клеток/спор и эукариотических клеток/спор.
Циклон показан более подробно на фиг.2 и содержит впускное отверстие 12 для газа (атмосферный воздух), подлежащего разделению на обогащенную частицами и лишенную частиц фракции, средство 13 подачи водной процессовой жидкости, прокачиваемой со скоростью 1 мл/минуту, которая захватывается воздушным потоком и проходит с ним в основной объем (14) корпуса циклонного уловителя, где лишенный частиц воздух выходит под влиянием приспособления для перемещения воздуха 15, в то время как обрабатывающая жидкость и захваченные материалы в виде частиц проходят вниз к выпускному отверстию 16 на дне циклона. Перистальтический насос 17 подает процессовую жидкость в раздел газ-жидкость емкостью приблизительно 100 мкл, где пузырьки удаляются; причем скорость подачи процессовой жидкости насосом или, альтернативно, скорость отвода жидкости насосом ниже по потоку определяется уровнем жидкости в разделе. Уровень жидкости определяется датчиком уровня жидкости (не показан), и когда уровень падает ниже установленной высоты, насос включается для прокачки большого количества жидкости до тех пор, пока восстанавливается желаемый уровень. Избыток жидкости и плотные частицы из раздела удаляются периодически через выпускное отверстие 18, а воздух, покидающий жидкость в виде пузырьков, удаляется через выпускное отверстие 19, и затем процессовая жидкость подается под действием перистальтического насоса 20 в трубку, расположенную ниже по потоку, для добавления реагентов.
По мере смешивания обрабатывающей жидкости с частицами и детергента с люминесцентными реагентами в камере измерения света люминометра, светочувствительный датчик (не показан) измеряет любой свет, испускаемый в камере в результате присутствия АТФ; причем эмиссия быстрая вследствие того, что флэш-кинетическое соотношение реагента имеет избыток люциферазы в сравнении с люциферином по сравнению с соотношением, требуемым для кинетики свечения (когда измерение проводится в течение нескольких минут). Люминометр передает сигнал, характеризующий испускаемый свет, к компьютерному процессору, который в свою очередь может представить это на блоке дисплея или сравнить его с контрольными уровнями.
Используемые детергенты могут быть стандартными химическими веществами, как описано выше, но могут предоставляться в форме принадлежащих специалистам экстрагирующих растворителей, таких как агент, освобождающий АТФ, Enzymatics экстрагирующий растворитель Biotrace ХМ (Biotrace, Bridges, UK) или Lumac NRM (Lumac BV, Holland). Реактивы для люминесценции могут быть стандартными реактивами, поставляемыми поставщиками, такими как Biotrace plc и Celcis plc UK и другими; люцифераза может быть натуральной или рекомбинантной. Концентрации реагентов являются необходимыми для обеспечения флэш-кинетики, и их соотношение с количеством обработанной цетилтриметил-аммоний-бромидом процессовой жидкости выбирают согласно рекомендациям производителей для периодических процессов, принимая во внимание относительные размеры трубок каждой линии, входящей в камеру люминометра. Скорость перистальтических насосов может быть также подобрана для поддержания соотношений, когда каждый поток подается отдельным насосом.
Пример 2. Устройство непрерывной поточной люминометрии аденилат-киназы
Второй вариант выполнения люминометра по изобретению содержит дополнительный поток реагента, включенный для подачи очень чистого реагента аденозин дифосфата (АДФ), относительно АТФ, в процессовую жидкость ниже по потоку от соединения 5, где добавляют детергент, но выше по потоку от люминометра. Реагент АДФ (с чистотой 99,95% относительно АТФ) добавляют с такой скоростью потока и концентрацией, чтобы создать концентрацию 0,5 мМ в конечном потоке. Процессовая жидкость представляет собой солевой фосфатный буфер с pH 7,4 или Трис - HCl с pH 7,8, включающий 0,2 мМ ионов магния.
Пример 3. Трубки и сеть реагента для устройства по примеру 2
Трубчатый узел для восполнения реагента, предоставляемый для устройства по примеру 2, показан на фиг. 3. Все трубки изготовлены из силиконовой резины с внутренним диаметром 0,8 мм и подсоединены к прочным пластиковым переходникам, размеры которых подобраны для их насаживания. Трубка имеет протыкаемые заглушенные торцевые концы для подсоединения к одному из выходов блока раздела у первого конца 21 и к впускному отверстию светоизмерительной камеры люминометра у другого конца 22. Контейнер 6 содержит детергентный реагент и имеет герметизируемое воздушное впускное отверстие для обеспечения возможности входа компенсирующего воздуха по мере откачки реагента под действием перистальтического насоса (поз. 4 на фиг. 1) по трубке от контейнера к соединению 5; причем этот насос одновременно действует на трубку 3. Следующий отрезок трубки соединяет переходник 5 с переходником 5а, где трубка от второго контейнера для реагента 6а подает реагент АДФ под действием другого перистальтического насоса (не показана на фиг. 1). На трубку между переходником 5а и концом 22 воздействует еще один перистальтический насос (поз. 7 на фиг. 1), который также действует на трубку, подающую люминесцентный реагент в камеру люминометра.
В предпочтительном варианте поточные ячейки включены в пакет трубок и также являются одноразовыми; они изготовлены из поликарбоната или полистирола.
Пример 4. Калибровка и работа устройства по примеру 1 или 2.
Количество АТФ, присутствующее в типичной бактериальной клетке, составляет порядка 10-18 молей, что равно приблизительно 10-15 граммам (см. Lundin А. [1989] ANP Luminescence-Rapid Methods in Microbiology ed. Stanley P.E. et al; Blackwell, Oxford pp 11-30; и Stanley P.E. [1989] J.Biolumin. Chemilum., 4, pp 375-380). Следует ожидать, что эти уровни могут быть ниже у аэробных организмов, лишенных кислорода, и внутриклеточная концентрация может варьировать обычно между 2 и 10 мМ.
Калибровка продолжительных поточных люминометров по примерам 1 и 2 может проводиться путем помещения известных количеств АТФ в процессовую жидкость или циклон во время работы устройства и построения калибровочной кривой, отражающей график зависимости количества импульсов в минуту на выходе светового детектора люминометра от количества АТФ (см. фиг. 4). Альтернативно, известные концентрации бактерий, таких как Bacille Camille Guerre или E.colli, могут распыляться на заданном расстоянии, например от 1 до 10 метров, от впускного отверстия циклона, и эти количества откладывают на графике против значений выходного сигнала люминометра, как указано ранее. На обе светоизмерительные камеры люминометра будут воздействовать одинаковые количества АТФ, где для калибровки используется АТФ, тогда как при использовании бактерий камеры с неионным детергентом получат АТФ значительно меньше; таким образом, калибровка с использованием АТФ и бактерий и, возможно, эукариотических клеток или грибковых спор может быть предпочтительной для определения, работает ли все должным образом.
При работе циклон подает образец частиц в раздел, где он разделяется на два потока равного объема и скорости разветвленным патрубком, причем каждый поток содержит один из двух детергентов, неионный и катионный. Потоки смешиваются, как требуется, с соответствующим количеством АТФ/фосфатного реагента, как требуется, и подаются в светоизмерительные камеры люминометра, где с ними смешиваются реагенты люминесценции, и происходит испускание света. Эти реагенты преимущественно являются реагентами флэш-кинетического типа и обеспечивают почти мгновенное испускание света, который детектируется связанными с камерами светочувствительными датчиками, которые в свою очередь передают электрические сигналы, показывающие количество выявленной АТФ в компьютерный процессор, где оба сигнала используются для определения их разности, т. е. сигнала АТФ и сигнала бактериальных клеток и спор, между двумя потоками; причем это осуществляется посредством подачи выходного сигнала на блок дисплея или принтер, показывающие необработанный выходной сигнал люминометра или с помощью программного обеспечения прямую оценку присутствующих бактерий, полученную путем сравнения с калибровочной кривой, хранящейся в связанном с процессором запоминающем устройстве.
Вся работа насосов может контролироваться процессором в соответствии с предварительно запрограммированным режимом. Таким образом, если условия очень сухие, может быть желательным изменить скорость сбора воздуха циклонным уловителем или скорость, с которой образец проходит в или через раздел. Альтернативно, дополнительно собранная жидкость может добавляться в циклон для разведения образца, если необходимо. Другие параметры, включающие скорость работы одного или всех перистальтических насосов и скорость движения магнитной ленты с программой-драйвером накопителя запоминающего устройства с данными о иммобилизованной люциферазе, могут управляться таким же образом, понятным специалистам в этой области.
Предпочтительное устройство по изобретению, как показано на фиг. 2, использует обратную связь от раздела для управления вводом жидкости в циклон.
Формула изобретения: 1. Способ определения присутствия и/или количества клеточного материала в газовой среде, предусматривающий сбор пылевой фракции из окружающей газовой среды в течение некоторого периода времени и передачу пылевой фракции в процессовую текучую среду, отличающийся тем, что указанные стадии осуществляют непрерывно, при этом осуществляют непрерывное выделение внутриклеточного содержимого, включая АТФ, из клеток или спор микроорганизмов, присутствующих в процессовой текучей среде, содержащей пылевую фракцию, непрерывное добавление люминесцентных реагентов, в зависимости от присутствия АТФ, для обеспечения люминесценции процессовой текучей среды, поступившей с предыдущей стадии, измерение света, испускаемого этой текучей средой в люминометре, который производит сигнал, характеризующий этот свет, и наличие и величину этого сигнала соотносят с присутствием и/или количеством клеточного материала, присутствующего в газе.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что клеточный материал содержит бактериальные клетки или эукариотические клетки.
3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что газ представляет собой атмосферный воздух.
4. Способ по любому предшествующему пункту, отличающийся тем, что стадию передачи пылевой фракции в текучую среду осуществляют с использованием литического агента.
5. Способ по п.4, отличающийся тем, что литический агент представляет собой детергент или фермент.
6. Способ по любому из пп.1 - 4, отличающийся тем, что стадию передачи пылевой фракции в текучую среду осуществляют с использованием источника энергии.
7. Способ по п.6, отличающийся тем, что источник энергии представляет собой источник тепла или звука.
8. Способ по любому предшествующему пункту, отличающийся тем, что процессовую текучую среду подают со стадии сбора на другие стадии через один или несколько трубопроводов.
9. Способ по п.8, отличающийся тем, что процессовая текучая среда представляет собой жидкость.
10. Способ по п.8 или 9, отличающийся тем, что текучую среду пропускают по трубопроводу или трубопроводам с помощью насосов.
11. Способ по п.10, отличающийся тем, что насосы являются перистальтическими насосами, а трубопровод включает в себя перистальтическую трубку, на которую воздействуют насосы.
12. Способ по любому предшествующему пункту, отличающийся тем, что на стадии передачи пылевой фракции в текучую среду получают текучую среду в виде двух отдельных потоков, а стадию непрерывного выделения внутриклеточного содержимого приводят с использованием различных средств для каждого потока, при этом в первом из потоков осуществляют выделение внутриклеточного содержимого всего клеточного материала, а во втором из потоков выделяют внутриклеточное содержимое эукариотических клеток и грибковых спор, и сигнал, генерируемый световым детектором люминометра во втором потоке, вычитают из сигнала от первого потока и соотносят с количеством бактерий, присутствующих в газе, взятом на стадии сбора.
13. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что первый из потоков обрабатывают катионным детектором, а второй поток обрабатывают неионным детергентом.
14. Способ по любому предшествующему пункту, отличающийся тем, что к текучей среде добавляют АДФ(аденозиндифосфат) так, чтобы АДФ был превращен аденилат-киназой, присутствующей в высвобожденном из микроорганизмов внутриклеточном содержимом, в аденозинтрифосфат, который в свою очередь детектируют на стадии измерения света.
15. Способ по любому из пп.1 - 14, отличающийся тем, что проводят мониторинг стерильного или чистого пространства посредством непрерывного сбора пылевой фракции из воздуха при открытом или закрытом положении трубопроводов, подающих кондиционированный воздух, с определением содержания АТФ или аденилаткиназы в пробе или образце процессовой текучей среды.
16. Устройство для определения присутствия и/или количества клеточного материала в газовой среде, содержащее средство сбора фракции частиц из окружающей газовой среды, отличающееся тем, что это средство предназначено для непрерывного сбора, при этом устройство также содержит средство непрерывной передачи фракции частиц в процессовую текучую среду, средство непрерывного выделения внутриклеточного содержимого, включая АТФ, из клеточного материала, присутствующего в процессовой текучей среде, средство непрерывного добавления люминесцентных реактивов в текучую среду в зависимости от присутствия АТФ для обеспечения люминесценции, средство детекции света, приспособленное для непрерывной подачи в него процессовой текучей среды со стадии добавления люминесцентных реагентов, и способное производить сигнал, характеризующий присутствие и количество люминесценции, выявленной детекцией, и средство передачи сигнала от указанного средства детекции света к процессору и/или дисплею для индикации присутствия и/или количества клеток или спор микроорганизмов.
17. Устройство по п.16, отличающееся тем, что средство непрерывного сбора представляет собой циклон или виртуальный импактор.
18. Устройство по п.17, отличающееся тем, что указанный циклон способен обрабатывать более 100 л воздуха в минуту.
19. Устройство по п.18, отличающееся тем, что циклон способен обрабатывать 500 - 2000 л в минуту.
20. Устройство по п.19, отличающееся тем, что циклон способен обрабатывать около 1000 л в минуту.
21. Устройство по любому из пп.17 - 20, отличающееся тем, что циклон представляет собой влажностеночный гидроциклон.
22. Устройство по любому из пп.16 - 21, отличающееся тем, что оно выполнено с возможностью представления фракции частиц в виде текучей среды, содержащей частицы.
23. Устройство по п.17, отличающееся тем, что средство непрерывного сбора представляет собой высокоскоростной виртуальный импактор, способный обрабатывать 50 - 150 л воздуха в минуту.
24. Устройство по любому из пп.16 - 23, отличающееся тем, что текучая среда является жидкостью.
25. Устройство по п.24, отличающееся тем, что жидкость является водой или буфером.
26. Устройство по п.25, отличающееся тем, что вода или буфер содержит АДФ и/или реагент для высвобождения внутриклеточного содержимого, включая АТФ, из клеток.
27. Устройство по любому из пп.16 - 26, отличающееся тем, что оно выполнено с возможностью создания раздела газ-жидкость, позволяющего поддерживать концентрацию частиц в процессовой текучей среде на постоянном уровне и/или удалять избыточный воздух в виде пузырьков.
28. Устройство по любому из пп.16 - 27, отличающееся тем, что средство непрерывного выделения внутриклеточного содержимого, включая АТФ, содержит нагреватель, ультразвуковое устройство или устройство для добавления литического агента.
29. Устройство по любому из пп.16 - 28, отличающееся тем, что оно выполнено с возможностью перемещения процессовой текучей среды между указанными средствами по трубопроводу.
30. Устройство по п.29, отличающееся тем, что в качестве процессовой текучей среды использована жидкость, трубопровод содержит перистальтическую трубку, а устройство снабжено перистальтическими насосами, предназначенными для перемещения процессовой текучей среды от одного средства к другому.
31. Устройство по п.30, отличающееся тем, что средство выделения внутриклеточного содержимого и/или подачи АДФ содержит средство подачи литического агента и/или АДФ-реагента, для смешивания с процессовой жидкостью в месте соединения перистальтической трубки, проходящей от средства сбора, с трубопроводом подачи литического агента и/или АДФ-реагента.
32. Устройство по п.31, отличающееся тем, что указанное соединение находится в месте разветвления или соединения отрезков перистальтических трубок.
33. Устройство по любому из пп.16 - 32, отличающееся тем, что люминесцентные реагенты смешиваются с процессовой жидкостью в светоизмерительном устройстве - люминометре.
34. Устройство по любому из пп.16 - 33, отличающееся тем, что оно выполнено с возможностью подачи процессовой текучей жидкости в виде двух потоков, каждый из которых проходит через соответствующее средство выделения внутриклеточного содержимого, способное высвобождать АТФ или аденилат-киназу из эукариотических клеток и грибковых спор или всего клеточного материала, с последующей подачей этих потоков в соответствующие камеры светоизмерительного устройства-люминометра, где средства добавления люминесцентного реагента обеспечивают эмиссию света в присутствии АТФ, причем количество света детектируется в светоизмерительных камерах световыми детекторами, которые выдают электрические сигналы на процессор, дисплей или на принтер.
35. Устройство по п.34, отличающееся тем, что оно выполнено с возможностью вычитания сигнала, характеризующего содержание эукариотических клеток и грибковых спор, из сигнала, характеризующего содержание всего клеточного материала, причем полученное значение разности сигналов выводят на дисплей или на принтер.
36. Устройство по любому из пп.16 - 35, отличающееся тем, что оно выполнено с возможностью использования в качестве люминесцентных реагентов люциферазы, которая иммобилизована возле светового детектора внутри светоизмерительной камеры, используемой для смешения процессовой текучей среды и люминесцентных реагентов.