Forbidden

You don't have permission to access /zzz_siteguard.php on this server.

СПОСОБ ПРОМЫШЛЕННОГО ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДА С БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ ЛЕЙКОЦИТАРНОГО ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2 ЧЕЛОВЕКА - Патент РФ 2142508
Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
СПОСОБ ПРОМЫШЛЕННОГО ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДА С БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ ЛЕЙКОЦИТАРНОГО ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2 ЧЕЛОВЕКА
СПОСОБ ПРОМЫШЛЕННОГО ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДА С БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ ЛЕЙКОЦИТАРНОГО ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2 ЧЕЛОВЕКА

СПОСОБ ПРОМЫШЛЕННОГО ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДА С БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ ЛЕЙКОЦИТАРНОГО ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2 ЧЕЛОВЕКА

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при производстве рекомбинантного интерферона человека в промышленном масштабе. Рекомбинантные бактерии Pseudomonas Species VG-84 культивируют в питательной среде с содержанием глюкозы 25-60 г/л, стрептомицина и тетрациклина. Культивирование проводят в условиях аэрации. Культивирование может быть осуществлено с дробной подачей питательной среды с содержанием глюкозы 80 г/л. Изобретение позволяет повысить выход человеческого рекомбинантного интерферона альфа-2. 1 з.п.ф-лы., 3 ил., 3 табл.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2142508
Класс(ы) патента: C12N15/21, C12P21/00, C07K14/56
Номер заявки: 97112593/13
Дата подачи заявки: 23.07.1997
Дата публикации: 10.12.1999
Заявитель(и): Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"
Автор(ы): Пикалова М.И.; Доманова З.М.; Хайбуллина И.И.; Еникеева Р.В.; Наумова Н.В.; Колокольцов А.А.
Патентообладатель(и): Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"
Описание изобретения: Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к производству рекомбинантного интерферона человека в промышленном масштабе.
Интерферон - белок с молекулярной массой около 18000 Да, продуцируемый в организме человека активированными лейкоцитами, обладает ярко выраженной противовирусной активностью по отношению к ряду ДНК- и РНК- содержащих вирусов. Клинические исследования показали перспективность использования рекомбинантного интерферона альфа-2 человека при лечении ряда вирусных инфекций (вирусные гепатиты, вирусы гриппа, вирус герпеса и др.), а также при некоторых видах опухолевых заболеваний (волосатоклеточный лейкоз и др.).
Известны способы получения человеческого лейкоцитарного интерферона альфа-2 [1-3] . В частности, предложен способ [1], который заключается в том, что в лабораторном ферментере (объем не указан) культивируют штамм-продуцент Pseudomonas species VG-84, несущий плазмиду pVG3, в условиях аэрации и перемешивания.
Состав питательной среды, г/л: триптон - 10; дрожжевой экстракт - 5; аденин - 80 мл/л; глюкоза - 10; стрептомицин - 0,15; тетрациклин - 0,05; вода дистиллированная до 1 л.
Процесс ведут при температуре 28±0,5oC; pH 6,7-6,9; режим аэрации и перемешивания подбирают таким, чтобы поддерживать парциальное давление кислорода на уровне 5-10% от насыщения. Для стабилизации водородного показателя используют аммиачную воду.
Ферментацию прекращают при величине оптической плотности 5 ед. Оптическую плотность измеряют при длине волны 540 нм.
Одной из модификаций описанного выше способа является следующий способ [2] . Состав питательной среды, г/л: раствор гидролизата казеина - 120 мл/л; гидролизат пекарских дрожжей - 5,0; Д - глюкоза - 10,0; сернокислый аммоний - 3,0; фосфорнокислый двузамещенный трехводный калий - 1,5; фосфорнокислый однозамещенный калий - 0,6; хлористый натрий - 0,5; сернокислый семиводный магний - 0,25; дистиллированная вода до 1 л. Ферментацию проводят при 30oC, pH среды 7, каждые 30 мин берут пробы для измерения оптической плотности, pO2 изменяют по динамике роста:
после засева pO2 поддерживают 40% от насыщения, при достижении 2,5-3 опт. ед. - 50%, при 4,5 - 5 опт. ед. - 60%, при 6,5-7 опт. ед. - 70% от насыщения. Оптическую плотность измеряют при длине волны 540 нм. Спустя 1 ч после достижения максимальной скорости роста процесс биосинтеза завершают.
Модификацией способа [2] является способ [3], который заключается в том, что в лабораторном ферментере, с рабочим объемом 10 л, выращивают биомассу Ps. species VG-84. Состав питательной среды, г/л: гидролизат казеина - 120 мл/л; гидролизат пекарских дрожжей - 5; Д - глюкоза - 10; сернокислый аммоний - 3; фосфорнокислый однозамещенный калий - 0,6; фосфорнокислый двузамещенный трехводный калий - 1,5; хлористый натрий - 0,5; сернокислый семиводный магний - 0,25; хлористый кальций - 0,011; тетрациклин - 0,05; стрептомицин - 0,15; вода дистиллированная до 1 л. Ферментацию начинают при 30±0,5oC, pH среды поддерживают на уровне 7, каждые 30 мин берут пробу культуральной жидкости для измерения оптической плотности. При засеве pO2 поддерживают на уровне 40% от насыщения, при достижении 2,5-3 опт. ед. - 50%, при 4,5-5 опт. ед. - 60%, при 6,5-7 опт. ед. - 70% от насыщения. Через 15-30 мин после достижения максимальной скорости роста бактерий температуру понижают от 30±0,5oC до 20±0,5oC и процесс завершают в начале стационарной фазы или через 2,5±0,5 ч после снижения температуры. Оптическую плотность измеряют при длине волны 540 нм.
Описанный способ позволяет получить 1,5·106 ME/мл культуральной жидкости альфа-2 интерферона, является наиболее близким к заявленному техническим решением и выбран в качестве прототипа.
Недостатками способа-прототипа являются:
- описанная технология получения интерферона альфа-2 человека микробиологическим синтезом осуществлена на лабораторном оборудовании; прямой перенос результатов от лабораторной установки к промышленному аппарату невозможен, так как методы теории подобия, позволяющие получать критерии масштабирования, в биотехнологии так же, как и в химической технологии, непригодны [4];
- невысокий выход целевого продукта (табл. 2,3), что может быть объяснено неоптимальным составом питательной среды и резким снижением температуры в конце процесса.
Анализ используемой в способе-прототипе питательной среды показал, что в ее состав входят практически все аминокислоты. Наиболее потребляемыми из них при накоплении биомассы рекомбинантных бактерий Ps. putida VG-84 являются следующие: треонин, серин, глютаминовая кислота, гистидин, триптофан и аспарагин. Утилизация глюкозы происходит раньше утилизации аминокислот и к моменту полного потребления глюкозы содержание аминокислот составляет примерно 70% от исходного значения, даже в том случае, если используется питательная среда с исходной концентрацией глюкозы 25 г/л (табл.1). Дополнительное однократное внесение глюкозы до исходной концентрации в процессе роста бактерий ведет к более глубокому потреблению аминокислот и к моменту полной утилизации глюкозы в культуральной жидкости остается около 35% вышеперечисленных аминокислот. При этом, как видно из табл.1, возрастает выход по целевому белку в 4,67 раз. Результаты, приведенные в табл. 1, получены на лабораторном ферментере с рабочим объемом 7 л.
Экспериментально было изучено влияние концентрации глюкозы в питательной среде на выход целевого продукта. С этой целью провели ряд экспериментов на средах с различным содержанием глюкозы, содержание остальных компонентов питательной среды оставалось неизменным и соответствовало питательной среде способа-прототипа. Эксперименты проводились на промышленном ферментере вместимостью 100 л. Полученные результаты приведены в табл. 2. Из данных табл.2 видно, что максимальное накопление целевого белка идет при содержании глюкозы 40 г/л питательной среды, при этом выход целевого белка в 3,3 раза выше, чем на среде, указанной в способе-прототипе.
Задачей предлагаемого изобретения является разработка технологии крупномасштабного культивирования рекомбинантного штамма Pseudomonas putida VG-84 и оптимизация состава питательной среды с целью увеличения выхода по целевому белку.
Поставленная задача решается тем, что в способе промышленного получения полипептида с биологической активностью альфа-2 интерферона человека рекомбинантными бактериями Ps. putida VG-84, культивирование ведут глубинным методом, при pH 6,8-7,0, температуре 28-29oC и концентрации растворенного кислорода не менее 20%, в присутствии стрептомицина и тетрациклина на питательной среде, содержащей 25-60 г/л глюкозы. Для сохранения указанной концентрации глюкозы длительное время ведут дробную подачу питательной среды с удвоенным содержанием глюкозы. Снижение температуры в конце процесса ведут ступенчато.
Сущность предлагаемого способа заключается в том, что культивирование ведут в промышленном ферментере с рабочим объемом 100 л, на питательной среде, содержащей, г/л; экстракт пекарских дрожжей - 5,0; гидролизат казеина сернокислотный - 10,0: Д - глюкоза -25 - 60; сернокислый аммоний - 3,0; натрий хлористый - 0,5; магний сернокислый семиводный - 0,25; кальций хлористый - 0,011; калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный - 1,5; калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,6; стрептомицина сульфат - 0,15; тетрациклина гидрохлорид - 0,05; вода водопроводная до 1 л, при следующих условиях: объем питательной среды - 100 л; температура ~ 28,5±0,5oC; водородный показатель - 6,8-7,0 pH; концентрация растворенного кислорода не менее 20%; скорость вращения перемешивающего устройства - 700 об/мин.
Значение водородного показателя регулируют подачей аммиачной воды. Сразу после засева и далее каждый час берут пробу культуральной жидкости для определения водородного показателя, оптической плотности, удельной скорости роста и микроскопии. Оптическую плотность измеряют при длине волны 540 нм.
Через час после достижения максимальной скорости роста при температуре 28,5±0,5oC температуру культуральной жидкости снижают до 25oC, после достижения максимальной скорости роста при Т=25oC температуру культуральной жидкости снижают до 20oC. Процесс заканчивают через 15-2O мин после стабилизации водородного показателя.
Для длительного поддержания высокой концентрации глюкозы, по результатам анализа, ведут дробную подачу питательной среды с содержанием глюкозы 80 г/л (далее - среда ПС-80).
Новыми признаками способа по сравнению с прототипом являются:
- повышение содержания глюкозы до 25-60 г/л, позволяющее более полно утилизировать аминокислоты питательной среды и увеличить выход белка со свойствами лейкоцитарного интерферона человека альфа-2 в 3,3 раза по сравнению с прототипом (табл.2);
- дробная подача питательной среды с содержанием глюкозы 80 г/л, позволяющая длительное время удерживать высокую удельную скорость роста биомассы и увеличить выход целевого белка в 5,9 раза по сравнению с прототипом (табл. 3);
- ступенчатое снижение температуры, позволяющее увеличить выход биомассы (фиг. 1, 2), и, следовательно, целевого продукта.
Техническим результатом использования новых признаков является повышение выхода и стабилизация интерферона альфа-2.
Указанная совокупность признаков экспериментально установлена авторами, неизвестна из литературных источников и, следовательно, предлагаемое техническое решение соответствует критериям изобретения "новизна" и "изобретательский уровень".
Перечень приведенных графиков:
Фиг. 1 - влияние снижения температуры культуральной жидкости в конце процесса на удельную скорость роста биомассы бактерий Ps.putida: а - изменение удельной скорости роста биомассы во времени;
б - изменение температуры культуральной жидкости во времени.
Фиг. 2 - влияние снижения температуры культуральной жидкости в конце процесса на удельную скорость роста биомассы бактерий Ps.putida: а - изменение удельной скорости роста биомассы во времени;
б - изменение температуры культуральной жидкости во времени.
Фиг. 3 - влияние дробной подачи питательной среды ПС-80 на удельную скорость роста биомассы бактерий Рs, putida. Стрелками указаны моменты подачи ПС-80.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Посевной материал для промышленного ферментера выращивают в лабораторном ферментере вместимостью 5 л. Готовят LB -среду с антибиотиками: 150 мг/л стрептомицина и 50 мг/л тетрациклина. Для приготовления питательной среды используют водопроводную воду, очищенную от механических и органических примесей методом ультрафильтрации на аппаратах разделительных с диаметром пор 5 микрон (например, ультрафильтрационный волоконный аппарат НПО "Химволокно"). Стерилизуют питательную среду известным методом стерилизующей фильтрации (например, используя фильтры фирмы "Millipor").
Лабораторный ферментер со стерильной питательной средой засевают рекомбинантными бактериями Pseudomonas putida, выращенными на агаризованной LB-среде. Объем питательной среды 3 л. Культивирование ведут при перемешивании и аэрации в течение 15-17 ч. Воздух подают из расчета 1±0,1 л/мин на литр питательной среды, скорость вращения перемешивающего устройства 250 об/мин, начальное значение водородного показателя среды 7,0-7,2 pH и далее не регулируют.
Питательную среду для промышленного ферментера готовят на водопроводной воде, очищенной от механических и органических примесей методом ультрафильтрации на аппаратах разделительных с диаметром пор 5 мкм и стерилизуют методом стерилизующей ультрафильтрации. Состав питательной среды (ПС-40), г/л: экстракт пекарских дрожжей - 5,0; гидролизат казеина сернокислотный - 10,0; Д-глюкоза - 40,0; сернокислый аммоний - 3,0; натрий хлористый - 0,5; магний сернокислый семиводный - 0,25; кальций хлористый - 0,011; калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный - 1,5; калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,6; стрептомицина сульфат - 0,15; тетрациклина гидрохлорид - 0,05; вода водопроводная до 1 л. Выращенный инокулят вводят в промышленный ферментер со стерильной питательной средой. Культивирование ведут при следующих условиях: объем питательной среды - 100 л; температура - 28,5±0,5oC; водородный показатель - 6,8-7,0 pH; концентрация растворенного кислорода не менее 20%.: скорость вращения перемешивающего устройства - 700 об/мин. Значение водородного показателя регулируют подачей аммиачной воды. Сразу после засева и далее каждый час берут пробу культуральной жидкости для определения водородного показателя, оптической плотности, удельной скорости роста и микроскопии. Оптическую плотность измеряют при длине волны 540 нм.
Через час после достижения максимальной скорости роста при температуре 28±0,5oC температуру культуральной жидкости снижают до 25oC. При этом повышается, либо остается на прежнем уровне удельная скорость роста (фиг. 1,2). Через час после достижения максимальной скорости роста при T=25oC температуру культуральной жидкости до 20oC. Процесс заканчивают через 15-20 мин после стабилизации водородного показателя.
Накопление полипептида со свойствами интерферона альфа-2 человека при этом составляет 8,12·106 ME/мл культуральной жидкости с сохранением стабильности целевого белка. Приведено среднее значение по результатам 32 ферментаций.
Пример 2. Дальнейшего увеличения выхода по целевому белку достигают культивированием в промышленном ферментере с дробной подачей питательной среды. Способ осуществляют следующим образом. Готовят питательную среду ПС-40, питательную среду ПС-80, отличающуюся от ПС-40 удвоенным содержанием Д-глюкозы и готовят посевной материал, как описано в примере 1. Посевной материал вводят в промышленный ферментер с 30 л питательной среды ПС-40 и культивируют при следующих условиях: температура 28,5±0,5oC; водородный показатель 6,8-7,0 pH; концентрация растворенного кислорода не менее 20%; скорость вращения перемешивающего устройства 700 об/мин.
Значение водородного показателя регулируют подачей аммиачной воды. Сразу после внесения посевного материала и далее каждый час берут пробу культуральной жидкости для определения водородного показателя, оптической плотности, удельной скорости роста, концентрации глюкозы и микроскопии. Оптическую плотность измеряют при длине волны 540 нм.
Концентрацию глюкозы определяют глюкозооксидазным методом (Тест-система "Новоглюк", производство "Вектор-Бест"). По результатам анализа добавляют питательную среду ПС-80 из расчета 30-45 г/л глюкозы в конечном объеме. Культивирование в таких условиях обеспечивает сохранение высокой удельной скорости роста в течение длительного времени (фиг. 3). Конечный объем культуральной жидкости - 100 л.
После снижения удельной скорости роста при температуре 28,5±0,5oC температуру культуральной жидкости снижают до 25oC. При этом увеличивается либо сохраняется на прежнем уровне удельная скорость роста. Через час после достижения максимальной скорости роста при температуре 25oC, температуру культуральной жидкости снижают до 20oC. Процесс заканчивают через 15-20 мин после стабилизации водородного показателя.
Накопление полипептида со свойствами альфа-2 интерферона человека при этом составляет 1,45·107МЕ/мл с сохранением стабильности целевого белка. Сравнительный анализ результатов, полученных при культивировании по способу-прототипу и предлагаемому способу, приведен в табл. 3.
Таким образом, видно, что промышленное культивирование по предлагаемому способу позволяет при несущественных дополнительных затратах повысить выход человеческого рекомбинантного интерферона альфа-2 в 3,3-5,9 раза по сравнению с культивированием по способу-прототипу.
Используемая литература.
1. Авторское свидетельство СССР N 1364343, кл. C 12 N 15/00. Способ получения человеческого лейкоцитарного интерферона альфа-2.
2. Патент Российской Федерации N 1616143, кл. C 12 N 15/21. Способ получения человеческого лейкоцитарного интерферона альфа-2.
3. Авторское свидетельство СССР N 1712416, кл. C 12 N 15/00. Способ получения человеческого лейкоцитарного интерферона альфа-2 рекомбинантными бактериями Pseudomonas species.
4. Аэрация и перемешивание в процессах культивирования микроорганизмов. Обзор. Бирюков В.В., Кузьмина Л.М. 1984, ВНИИСЭНТИ.
Формула изобретения: 1. Способ получения человеческого лейкоцитарного интерферона альфа-2, предусматривающий глубинное культивирование рекомбинантных бактерий Pseudomonas species Vg-84 в питательной среде в присутствии стрептомицина и тетрациклина, в условиях аэрации, отличающийся тем, что культивирование осуществляют в промышленном ферментере на питательной среде с содержанием глюкозы 25 - 60 г/л при достижении максимальной скорости роста температуру дважды ступенчато понижают до 25 и 20oС.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что культивирование осуществляют с дробной подачей питательной среды с содержанием глюкозы 80 г/л.