Forbidden

You don't have permission to access /zzz_siteguard.php on this server.

ШТАММ SACCHAROPOLYSPORA ERYTHRAEA 52 - ПРОДУЦЕНТ АНТИБИОТИКА ЭРИТРОМИЦИНА - Патент РФ 2142509
Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
ШТАММ SACCHAROPOLYSPORA ERYTHRAEA 52 - ПРОДУЦЕНТ АНТИБИОТИКА ЭРИТРОМИЦИНА
ШТАММ SACCHAROPOLYSPORA ERYTHRAEA 52 - ПРОДУЦЕНТ АНТИБИОТИКА ЭРИТРОМИЦИНА

ШТАММ SACCHAROPOLYSPORA ERYTHRAEA 52 - ПРОДУЦЕНТ АНТИБИОТИКА ЭРИТРОМИЦИНА

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Изобретение относится к микробиологии. Штамм Saccharopolyspora erythraea 52 получен из исходного штамма S. erythraea 5 путем селекции на агаризованной среде с антибиотиком неомицином с последующим выделением мутантов, устойчивых к 130 мкг/мл неомицина, отбора мутанта с наиболее высокой продукцией эритромицина (не менее 8000 мкг/мл) и проверкой его на способность стабильно сохранять повышенную продукцию эритромицина. Штамм может быть использован для промышленного производства эритромицина. 1 табл.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2142509
Класс(ы) патента: C12P1/06, C12P19/62, C12P19/62, C12R1:465
Номер заявки: 99109702/13
Дата подачи заявки: 19.05.1999
Дата публикации: 10.12.1999
Заявитель(и): Автономная некоммерческая организация "Научно- исследовательский центр биотехнологии антибиотиков и других биологически активных веществ "БИОАН"
Автор(ы): Даниленко В.Н.
Патентообладатель(и): Автономная некоммерческая организация "Научно- исследовательский центр биотехнологии антибиотиков и других биологически активных веществ "БИОАН"
Описание изобретения: Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству макролидного антибиотика эритромицина.
Эритромицин представляет собой полиоксикетолактон, глюкозидно связанный с двумя углеродными остатками. Антибиотик наиболее активен в отношении большинства грамположительных аэробных кокков, а также золотистых стафилококков. Помимо этого он активен в отношении возбудителя болезни легионеров, а также некоторых грамположительных палочковидных микроорганизмов. В настоящее время эритромицин находит широкое применение в медицине и ветеринарии. Он также применяется, как исходный продукт для получения химических (полусинтетических) производных широко используемых в медицине.
Известны штаммы-продуценты эритромицина, в том числе Saccharopolyspora (Streptomyces) erythraea, используемые для промышленного производства эритромицина. Однако уровень продуктивности этих штаммов недостаточно высок.
Описаны способы селекции штамма S. erythraea, основанные на получении мутантов устойчивости к антибиотикам рифампицину, тиострептону и хлорамфениколу. Они позволяют получать более продуктивные на 15-20% штаммы по сравнению с исходным. Недостатком полученных мутантов является их нестабильность, в результате большинство их них в ряду поколений теряло признак высокой продуктивности эритромицина.
Известен штамм-продуцент эритромицина S.erythraea S 2-34, максимальная продуктивность которого за 168 часов достигает 7000-7500 мкг/мл при определении микробиологическим методом тестирования (1). Однако для повышения рентабельности и конкурентоспособности производства необходимо получение штаммов, обладающих более высоким уровнем продуктивности.
Цель изобретения - получение штамма S.erythraea с высоким уровнем продукции эритромицина.
Штамм Saccharopolyspora erythraea 52 получен из исходного штамма S.erythraea 5 с активностью 6500-7000 мкг/л (2).
Способ отбора высокопродуктивных штаммов S.erythraea продуцентов эритромицина состоит в том, что исходный штамм высевают на плотную, стандартную агаризованную среду, содержащую неомицин в диапазоне концентраций от 100 до 150 мкг/мл и отбирают спонтанные устойчивые мутанты, у которых модифицирована регуляция биосинтеза эритромицина. Выделенные Neor мутанты с повышенной продукцией эритромицина проверяют на способность стабильно в течении четырех-шести поколений сохранять способность к повышенной продукции эритромицина. В результате отобран стабильный штамм Saccharopolyspora erythraea 52, обладающий высоким уровнем продукции эритромицина, устойчивый к неомицину в концентрации 130 мкг/мл. Продуктивность эритромицина у штамма S.erythraea 52 при периодической ферментации на питательных средах в течение 168 часов составляет 8000-8500 мкг/мл.
При последовательных пересевах через каждые 2 месяца на плотной среде СР-6 в течение года отобранный штамм сохраняет основные морфологические и физиологические признаки, а также устойчивость к неомицину и уровень антибиотикообразования. Штамм S. erythraea 52 хранится в коллекции культур НИЦ "БИОАН" и в коллекции культур лаборатории биотехнологии продуцентов антибиотиков ГУП "ГосНИИСинтезбелок".
По основным морфологическим и биохимическим признакам Saccharopolyspora erythraea 52 существенно не отличается от типичных продуцентов этого вида и имеет следующие характеристики.
Культурально-морфологические признаки.
Спороносы спиральные с большим количеством спор, спорангии отсутствуют. Споры образуются на воздушном мицелии. Фрагментации не наблюдается.
Кукурузная среда (СР-6). Колонии темные, складчатые, блестящие. Образует меланоидные пигменты, окрашивающие воздушный мицелий в светло-коричневый, а субстратный - в коричневый цвет. Выделяет в среду пигмент.
Овсяная среда. Колонии плоские, воздушный мицелий образует концентрические круги. Цвет воздушного мицелия белый. Субстратный мицелий желтый. Диаметр колонии 4-5 мм.
Синтетическая среда с крахмалом. Колонии плоские, воздушный мицелий образует концентрические круги, в середине пуговка, слегка приподнятая над субстратом. Воздушный мицелий белый, субстратный мицелий светло-желтый. Диаметр колонии 2-3 мм.
Среда Гаузе органическая с глюкозой. Колонии слегка приподняты над субстратом, неправильной формы. Воздушный мицелий светло-желтого цвета, субстратный мицелий желтый. Диаметр колонии 2-3 мм.
Среда Ваксмана. Колонии слегка приподняты над субстратом, неправильной формы, морщинистые, слегка радиально-складчатые. Воздушный и субстратный мицелий светло-желтого цвета. Диаметр колонии 2-3 мм.
Среда Чапека. Колонии плоские, воздушный мицелий слабо развит, светло-желтого цвета. Субстратный мицелий светло-желтый. Диаметр колонии 1-2 мм.
Физиолого-биохимические признаки.
Сбраживает арабинозу, глюкозу, инозит, сахарозу, сорбит, ксилозу, мальтозу, фруктозу, рамнозу, слабо сбраживает, маннит, не сбраживает лактозу. Реакция на инверсию сахара положительная. Реакция на гидролиз крахмала - начало обесцвечивания на 1-е сутки, полное обесцвечивания на 4-е сутки. Начало разжижения желатины на 10-е сутки, полное разжижение на 20-е сутки. Начало пептонизации молока - на 11-е сутки, полная пептонизация - на 20-е сутки.
Генетические маркеры.
Устойчивость к антибиотикам: неомицин - 130 мкг/мл; канамицин - 100 мкг/мл; мономицин - 150 мкг/мл.
Пример 1. Получение штамма Saccharopolyspora erythraea 52.
Исходный штамм Saccharopolyspora erythraea 5 высевают на плотную стандартную агаризованную среду, содержащую (г/л): крахмал (30), кукурузный экстракт (10,0), сульфат аммония (4,0), мел (5,0), хлористый натрий (5,0), вода (до 1 л) и неомицин в концентрации от 100 до 150 мкг/мл (10, 20, 50, 100 или 130 мкг/мл) (3). После 12-14 дней инкубации при 35+1oC отбирают выросшие спонтанные мутанты, устойчивые к каждой из доз неомицина.
Выделенные мутанты в количестве не менее 30 проверяют на способность к биосинтезу эритромицина в жидкой ферментационной среде. В таблице приведены данные о зависимости уровня продукции эритромицина от степени устойчивости к неомицину отобранных спонтанных мутантов (Neor) штамма Saccharopolyspora erythraea 5.
Как видно из таблицы, наиболее высокой способностью продуцировать эритромицин обладают мутанты, устойчивые к 100-130 мкг/мл неомицина.
Биологическим методом был определен уровень активности мутантов, устойчивых к 130 мкг/мл неомицина. Из 8 предварительно отобранных мутантов наиболее выраженной активностью обладал штамм Saccharopolyspora erythraea 52, способный продуцировать 8000-8500 мкг/мл эритромицина. Определение компонентного состава эритромицинов и их предшественников методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) показало, что содержание эритромицина A составляет не менее 90%.
Таким образом, выделенный штамм Saccharopolyspora erythraea 52 обладает биосинтетической способностью, заметно превышающей таковую у исходного штамма.
Пример 2. Ферментация штамма Saccharopolyspora erythraea 52.
Споровой суспензией штамма Saccharopolyspora erythraea 52 засевают 5 колб емкостью 750 мл, заполненных по 50 мл посевной среды следующего состава (мас. %): глюкоза - 2; сухие дрожжи - 0,3; аммоний сернокислый (NH4)2SO3 - 0,5; натрий хлористый (NaCl) - 0,25; мел (CaCo3) - 1; масло подсолнечное - 0,8; вода - остальное. Значение pH среды составляет 7,2. Выращивание вегетативного посевного материала производят на круговой качалке (количество оборотов 140-160/мин) в течение 48 часов при температуре 35±1oC. Выращенным посевным материалом в количестве 10% от объема среды засевают ферментационную среду следующего состава (мас.%):
меласа - 6; кукурузная мука - 6; сухие дрожжи - 0,4; (NH4)2SO4 - 0,7; мел (CaCo3) - 1,2; масло подсолнечное - 0,8; вода - остальное. Значение pH среды составляет 7,2. Ферментацию осуществляют на круговой качалке (количество оборотов 140-160/мин) в течение 168 часов при температуре 35±1oC.
После завершения ферментации содержание эритромицина в культуральной жидкости, определяемое методом биологического титрования, составляет 8500 мг/л. Содержание эритромицина A, определяемое методом тонкослойной хроматографии, составляет при этом 90% от суммарного состава эритромицинов в культуральной жидкости.
Способность к высокой продукции эритромицина (8000 - 8500 мкг/мл) штамм Saccharopolyspora erythraea 52 стабильно сохраняет при многократном пассировании на питательных средах.
Таким образом, штамм Saccharopolyspora erythraea 52 обладает высокой способностью к биосинтезу эритромицина в пределах 8000- 8500 мкг/мл, хорошо расти на ферментационных средах разного состава для культивирования Saccharopolyspora erythraea и высоким содержанием (90%) эритромицина A.
С учетом вышеизложенного этот штамм может быть использован для промышленного производства эритромицина.
Список литературы.
1. Авторское свидетельство СССР N 1651557, приоритет 28.08.1989 г., МКИ C 12 P 19/62. Опубл. 27.01.1995 г. в Бюлл. N3. Штамм Streptomyces erythraens - продуцент эритромицина.
2. Настасяк Н.Н., Заворотная С.А., Кириченко Н.В., Федоренко В.А., Даниленко В. Н. Получение и изучение свойств мутантов Streptomyces erythraens с измененной устойчивостью к антибиотикам. В сб.: "Успехи в области изучения и производства антибиотиков". Труды ВНИИА "Генетическая инженерия продуцентов антибиотиков", вып.XXI. М., 1992, с. 39-45.
Формула изобретения: Штамм Saccharopolyspora erythraea 52 - продуцент эритромицина.