Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕРПЕТИЧЕСКОЙ ВАКЦИНЫ И ЛЕКАРСТВЕННАЯ ФОРМА НА ЕЕ ОСНОВЕ
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕРПЕТИЧЕСКОЙ ВАКЦИНЫ И ЛЕКАРСТВЕННАЯ ФОРМА НА ЕЕ ОСНОВЕ

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕРПЕТИЧЕСКОЙ ВАКЦИНЫ И ЛЕКАРСТВЕННАЯ ФОРМА НА ЕЕ ОСНОВЕ

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Изобретение относится к области медицины, а именно к способам получения концентрированных вирионных антигерпетических вакцин. Согласно изобретению вирусы простого герпеса типов 1 или 2 выращивают в роллерном аппарате на монослое клеток почек зеленых мартышек Vero, чувствительных к названным вирусам; после адсорбции вирусов на клетках инфицированные таким образом клетки инкубируют в среде поддержки; для высвобождения вирусов из клеток осуществляют цикл замораживания-оттаивания; вирусы инактивируют гамма-излучением, например, кобальта-60; суспензию вирусов, образовавшуюся после отделения остатков разрушенных клеток в результате низкоскоростного центрифугирования, очищают и концентрируют фильтрацией через мембраны с диаметром пор 0,07 мкм. В качестве лекарственной формы вакцины предложена свеча, содержащая помимо самой вакцины также масло какао, гиалуроновую кислоту, α-токоферол, L-аскорбиновую кислоту и α2-интерферон. Технический результат изобретения заключается в расширении арсенала средств для борьбы с вирусной инфекцией. 2 с. и 3 з.п.ф-лы.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2142816
Класс(ы) патента: A61K39/12, A61K9/02
Номер заявки: 97110015/14
Дата подачи заявки: 20.06.1997
Дата публикации: 20.12.1999
Заявитель(и): Баринский Игорь Феликсович; Воробьева Майя Сергеевна; Лазаренко Алла Арнольдовна; Подчерняева Раиса Яковлевна; Алимбарова Людмила Михайловна; Самойленко Игорь Иннокентьевич; Еремян Людмила Константиновна
Патентообладатель(и): Баринский Игорь Феликсович; Воробьева Майя Сергеевна; Лазаренко Алла Арнольдовна; Подчерняева Раиса Яковлевна; Алимбарова Людмила Михайловна; Самойленко Игорь Иннокентьевич; Еремян Людмила Константиновна
Описание изобретения: Изобретение относится к области медицины, а именно к производству противовирусных вакцин, а также к лекарственным формам на их основе.
Известен способ получения вирионной герпетической вакцины исходя из вирусов простого герпеса типов 1 и 2 (ВПГ-1 и ВПГ-2 соответственно), выращиваемых на поверхности стационарного микроносителя при использовании первичной культуры клеток почек кролика (Андонов П. и соавт. "Вопросы вирусологии", 1979, N 6, стр. 665 - 671). Этот способ, однако, не позволяет достичь высоких урожая и концентрации вирусов ввиду использования первично трипсинизированных клеток.
В способе получения вакцины против вируса простого герпеса согласно патенту США N 4816250 (кл. 424/89; опубл. 28.03.89 г.) инфицированные клетки эмбриона человека MRC 5 после инкубирования обрабатывают поверхностно-активным веществом, полипептидные цепи цитоплазматической фракции фиксируют и проводят центрифугирование при 650 g. Метод довольно сложен и включает использование антител, иммобилизованных на сефарозе.
Получение вакцины против вируса простого герпеса согласно заявке ЕВП N 48201 (МКИ5: A 61 K 39/245; опубл. 1985 г.) предполагает экстракцию инфицированных клеток мочевиной в концентрации 2М - 8М, центрифугирование или фильтрацию, воздействие ультразвуком, концентрирование фильтрацией через особые сорбенты, обработку ферментом ДНКазой и очистку гель-хроматографией. Очевидно, что столь сложный метод едва ли приложим к рутинным, крупномасштабным наработкам.
Известен, далее, выбранный в качестве наиболее близкого аналога-прототипа заявляемого изобретения и описанный в патенте Российской Федерации N 2014084 (МКИ5: A 61 K 39/245; заявл. 28.12.91 г., опубл. 15.06.94 г.) способ получения вирионной герпетической вакцины, согласно которому вирусы выращивают на монослое фибробластов куриных эмбрионов в ростовой среде при перемешивании в биореакторе специальной конструкции, причем сами эти фибробласты предварительно выращены на носителях в форме микрочастиц (размер 100 - 1200 мкм) цитолара - 2 (денатурированного коллагена), цитопола /поливинилового спирта с желатиновым покрытием/ или цитогеля из денатурированного коллагена с размером пор 50 - 80 мкм. Фибробласты, после инфицирования их вирусом, инкубируют в течение 24 - 48 час до проявления вирусом своей цитопатичности на 80 - 90%; содержащую вирусы жидкость сливают, замораживают ее до минус 20oC и оттаивают при (37±1)oC с целью разрушения клеток и выхода вирусов наружу. Затем вирусы инактивируют формалином при конечном разведении последнего 1: 2000 сначала в течение 72 час при 37±1oC и затем в течение 10 суток при (4±1)oC, остатки разрушенных клеток (т.н. детриты) отделяют центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 мин при температуре (4±1)oC и надосадочную жидкость лиофилизируют.
К недостаткам известного способа-прототипа следует отнести необходимость применения биореакторов специальной конструкции с непрерывным перемешиванием микроносителей, что, при отсутствии необходимых параметров, отрицательно влияет на конечную концентрацию вирусов; кроме того, длительно протекающая стадия инакивации вирусов формалином (13 суток) вызывает снижение антигенной активности целевого препарата и ухудшает иммуногенные характеристики вакцины. Необходимо также отметить, что внутрикожное выведение такой вакцины сопровождается у больных неприятным чувством жжения (из-за присутствия формалина) и требует применения особого шприца.
Целью настоящего изобретения является создание такого способа получения вирионной антигерпетической вакцины, который:
- не требовал бы сложного аппаратурного оформления;
- позволял бы увеличить урожай и концентрацию вирусов;
- давал бы возможность избежать ухудшения иммуногенной активности вакцины;
- обеспечивал бы, в конечном счете, возможность получения антигерпетической вакцины в крупных ("промышленных") масштабах.
Другой целью изобретения является создание новой лекарственной формы вирионной антигерпетической вакцины, в дополнение к уже существующим.
Поставленные цели достигаются благодаря тому, что
- в способе получения вирионной антигерпетической вакцины, включаем: выращивание вирусов простого герпеса типов 1 и 2 на монослое животных клеток, которые помещены в ростовую среду; адсорбцию вирусов на клетках; инкубирование инфицированных клеток в среде поддержки; высвобождение вирусов из клеток в цикле замораживания-оттаивания; инактивирование вирусов; очистку от остатков разрушенных клеток (детритов) низкоскоростным центрифугированием; концентрирование культуральной жидкости, содержащей инактивированные вирусы, - в качестве животных клеток используют клетки почек зеленых мартышек Vero, чувствительные к вирусам простого герпеса 1 или, соответственно, 2; инактивирование вирусов осуществляют при обработке гамма-излучением, например, кобальта-60 в дозе 15 - 20 кГр в течение 2 часов при (20±1)oC; суспензию вирусов, после низкоскоростного центрифугирования, очищают и концентрируют в процессе фильтрации через мембраны, имеющие диаметр пор 0,07 мкм, при температуре (4±1)oC до достижения коэффициента концентрирования 5 и получения в фильтрате целевого продукта, при этом культивирование клеток почек зеленых мартышек осуществляют в роллерном устройстве в течение 24 - 48 часов, в зависимости от типа вируса;
- предложена новая лекарственная форма вакцины, выполненная в виде свечи (суппозитория), содержащей, помимо собственно вакцины (суспензии), также масло какао, гиалуроновую кислоту, α-токоферол, L-аскорбиновую кислоту и α2-интерферон, при следующем соотношении компонентов: вакцина - 20 мл (≈108 бляшкообразующих единиц вируса простого герпеса); - гиалуроновая кислота - 1 - 2 г; - α-токоферол - 1 - 2 г; L-аскорбиновая кислота - 1,5 - 2 г; α2-интерферон - (3 - 5)·106 международных единиц; масло какао - до 100 г.
α-Токоферол и L-аскорбиновая кислота играют роль мембранопротекторов, а гиалуроновая кислота - роль пролонгатора действия.
Выше отмечалось, что при подкожном введении вакцин нередко возникают нежелательные побочные реакции (жжение, опухание, отек, покраснение и т.п.). По этой причине не раз предпринимались попытки найти иной путь введения вакцин, отличный от инъекции. Так, например, в заявке ЕВП N 640347 (МКИ5: A 61 K 39/00; опубл. 01.03.95 г.) описана композиция антигенов для перорального введения, содержащая фосфатидилсерин и маннозу; в заявке ЕВП N 242205 (МКИ5: A 61 K 39/00; опубл. 06.10.93 г.) предложена вакцинная композиция, включающая масло и сапонин и применяемая перорально в виде эмульсии вода в масле. Вакцины для интраназального (через нос) введения описаны в патентах США N 4800078 (кл, 424/86; опубл. 24.01.89 г.) и N 5124148 (кл. 424/86; опубл. 23.06.92 г.). Использование вакцины в виде спрея (в ветеринарии, для борьбы с чумкой собак) предложено в патенте США N 3420934 (кл. 424/89; 1968 г.). Неожиданным образом в настоящем изобретении открыта возможность использовать антигерпетическую вакцину в виде свечи, что расширяет терапевтические перспективы применения вакцин.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами его осуществления.
Пример 1. Путем серийного пассирования вирусы простого герпеса, шпаммы "Ус" (ВПГ-1) и "ВН" (ВПГ-2), адаптируют к культуре перевиваемых клеток почек зеленых мартышек Vero, которые аттестованы в соответствии с нормативными указаниями РД 42-28-10-89 "Аттестация перевиваемых клеточных культур-субстратов производства и контроля медицинских и иммунобиологических препаратов" и разрешены Государственным институтом стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича Минздрава Российской Федерации для производства вакцин. Названную культуру, с посевной концентрацией 100 клеток/мл, выдерживают в роллерных матрицах при (37±1)oC в течение 48 час до образования плотного монослоя клеток. Затем вносят инфицирующий материал в дозе 0,05 бляшкообразующей единицы на клетку (0,05 БОЕ/клетку) в случае ВПГ-2 или 0,1 БОЕ/клетку в случае ВПГ-1, проводят абсорбцию вирусов в течение 1 часа и инкубируют в течение 24 часов/дня ВПГ-1) или 48 часов (для ВПГ-2) до полного разрушения монослоя клеток в результате цитопатического действия вирусов, после чего роллеры с содержимым подвергают однократному замораживанию при температуре минус (20±1)oC и оттаиванию при комнатной температуре для полного высвобождения вирусов из клеток и их перехода в культуральную жидкость. Низкоскоростным центрифугированием (1500 об/мин, 10 мин, (4±1)oC) отделяют остатки разрушенных клеток-детриты-, и полученную суспензию вирусов очищают и концентрируют на фильтрационно-мембранном аппарате с диаметром пор 0,07 мкм, производства НИИ особо чистых препаратов, г. Санкт-Петербург, при температуре (4±1)oC до достижения коэффициента концентрирования 5, вслед за чем вирусы инактивируют гамма-излучением от источника кобальт-60 при дозе 15 - 20 кГр и температуре (20±1)oC в течение 2 часов. Полученную суспензию, взятую в количестве 20 мл (что отвечает ≈108 БОЕ), смешивают с 1 - 2 г гиалуроновой кислоты, 1 - 2 г α-токоферола, 1,5 - 2 г L-аскорбиновой кислоты, (3 - 5)·106 международных единиц α2-интерферона и с маслом какао до общей массы 100 г, из полученной массы изготавливают известным способом свечи массой 1,5 - 2 г каждая. Свеча содержит ≅500 мкг/г белка, имеет остаточную влажность ≅2,5% и физиологическое значение pH 7,5±0,2, нетоксична и способна индуцировать у крыс синтез антител, нейтрализующих вирусы, при индексе нейтрализации, равном 3,0 lg ТЦД50/мл по ВПГ-2 и 2,0 lg ТЦД50/мл по ВПГ-2, где ТЦД50 означает дозу, вызывающую цитопатический эффект в 50% инфицированных вирусом пробирок с монослоем клеток.
Пример 2 (сравнительный). Поступают, как описано в примере 1, но опускают стадию концентрирования на фильтрационно-мембранном аппарате; в этом случае полученная вакцина индуцирует у крыс синтез нейтрализующих вирусы антител с индексом нейтрализации для ВПГ-1, равном 2,0 lg ТЦД50/мл, а в случае вируса ВПГ-2 равном 1,5 lg ТЦД50/мл, при этом достоверно ниже оказывается иммуногенность вакцины.
Предлагаемый способ обеспечивает стабильное накопление вирусов, а также многократное (в ≈100 раз!) увеличение концентрации вакцинных штаммов вирусов, что является перспективным с точки зрения уменьшения кратности применения препарата у больных, страдающих герпесом. Кроме того, благодаря инактивации вирусов гамма-излучением и отказу от химических агентов инактивации (формалина), сохраняются антигенность и стабильность препарата при надежном подавлении инфекционности штаммов вирусов, а недостатки инъекционного способа введения вакцины устраняются при использовании вакцины в форме свечи.
Формула изобретения: 1. Способ получения вирионной антигерпетической вакцины, включающий культивирование чувствительных к избранному вирусу перевиваемых животных клеток; внесение инфицирующего материала и его адсорбирование на клетках; инкубирование инфицированных клеток в среде поддержки; высвобождение вирусов из клеток в результате цикла замораживания - оттаивания; отделение остатков разрушенных клеток низкоскоростным центрифугированием; очистку и концентрирование суспензии вирусов и их последующее инактивирование, отличающийся тем, что в качестве перевиваемых животных клеток используют клетки почек зеленых мартышек Vero, чувствительные к вирусам простого герпеса типов 1 или 2; культивирование осуществляют в роллерном устройстве в течение 24 - 48 ч в зависимости от типа вируса; для очистки и концентрирования проводят фильтрацию через пористые мембраны с размером пор 0,07 мкм, а вирусы в полученном в виде фильтрата целевом продукте инактивируют действием гамма-излучения.
2. Способ получения вирионной антигерпетической вакцины по п.1, отличающийся тем, что процесс фильтрационной очистки и концентрирования через пористые мембраны осуществляют при (4 ± 1)oС до достижения коэффициента концентрирования 5.
3. Способ получения вирионной антигерпетической вакцины по п.1, отличающийся тем, что при проведении инактивирования вирусов в качестве источника гамма-излучения используют кобальт-60 при дозе 15 - 20 кГр в течение 2 ч при (20 ± 1)oС.
4. Лекарственная форма вирионной антигерпетической вакцины, полученной по п.1, отличающаяся тем, что она выполнена в виде свечи (суппозитория).
5. Лекарственная форма вирионной антигерпетической вакцины по п.4, отличающаяся тем, что она содержит помимо собственно вакцины также гиалуроновую кислоту, α-токоферол, L-аскорбиновую кислоту, α2-интерферон и масло какао при следующих соотношениях компонентов: вакцина - 20 мл (~108 бляшкообразующих единиц вируса простого герпеса); гиалуроновая кислота - 1 - 2 г; α-токоферол - 1 - 2 г; L-аскорбиновая кислота - 1,5 - 2 г; α2-интерферон - (3 - 5) · 106 международных единиц; масло какао - до 100 г.