Forbidden

You don't have permission to access /zzz_siteguard.php on this server.

’»ћ≈–Ќџ… –≈√”Ћя“ќ–Ќџ… ”„ј—“ќ  ƒЋя Ё —ѕ–≈——»» √≈Ќќ¬ ¬ –ј—“≈Ќ»я’ (¬ј–»јЌ“џ),  Ћј—“≈– ƒЋя Ё —ѕ–≈——»» √≈Ќј (¬ј–»јЌ“џ) ,  Ћј—“≈– ƒЋя »Ќƒ”÷»Ѕ≈Ћ№Ќќ… Ё —ѕ–≈——»» „”∆≈–ќƒЌќ√ќ √≈Ќј (¬ј–»јЌ“џ), —ѕќ—ќЅ Ё —ѕ–≈——»» √≈Ќј ¬ –ј—“≈Ќ»» (¬ј–»јЌ“џ), —ѕќ—ќЅ »Ќƒ”÷»Ѕ≈Ћ№Ќќ… Ё —ѕ–≈——»» „”∆≈–ќƒЌќ√ќ √≈Ќј ¬ –ј—“≈Ќ»» (¬ј–»јЌ“џ) » ѕЋј«ћ»ƒј (¬ј–»јЌ“џ) - ѕатент –‘ 2142998
√лавна€ страница  |  ќписание сайта  |   онтакты
’»ћ≈–Ќџ… –≈√”Ћя“ќ–Ќџ… ”„ј—“ќ  ƒЋя Ё —ѕ–≈——»» √≈Ќќ¬ ¬ –ј—“≈Ќ»я’ (¬ј–»јЌ“џ),  Ћј—“≈– ƒЋя Ё —ѕ–≈——»» √≈Ќј (¬ј–»јЌ“џ) ,  Ћј—“≈– ƒЋя »Ќƒ”÷»Ѕ≈Ћ№Ќќ… Ё —ѕ–≈——»» „”∆≈–ќƒЌќ√ќ √≈Ќј (¬ј–»јЌ“џ), —ѕќ—ќЅ Ё —ѕ–≈——»» √≈Ќј ¬ –ј—“≈Ќ»» (¬ј–»јЌ“џ), —ѕќ—ќЅ »Ќƒ”÷»Ѕ≈Ћ№Ќќ… Ё —ѕ–≈——»» „”∆≈–ќƒЌќ√ќ √≈Ќј ¬ –ј—“≈Ќ»» (¬ј–»јЌ“џ) » ѕЋј«ћ»ƒј (¬ј–»јЌ“џ)
’»ћ≈–Ќџ… –≈√”Ћя“ќ–Ќџ… ”„ј—“ќ  ƒЋя Ё —ѕ–≈——»» √≈Ќќ¬ ¬ –ј—“≈Ќ»я’ (¬ј–»јЌ“џ),  Ћј—“≈– ƒЋя Ё —ѕ–≈——»» √≈Ќј (¬ј–»јЌ“џ) ,  Ћј—“≈– ƒЋя »Ќƒ”÷»Ѕ≈Ћ№Ќќ… Ё —ѕ–≈——»» „”∆≈–ќƒЌќ√ќ √≈Ќј (¬ј–»јЌ“џ), —ѕќ—ќЅ Ё —ѕ–≈——»» √≈Ќј ¬ –ј—“≈Ќ»» (¬ј–»јЌ“џ), —ѕќ—ќЅ »Ќƒ”÷»Ѕ≈Ћ№Ќќ… Ё —ѕ–≈——»» „”∆≈–ќƒЌќ√ќ √≈Ќј ¬ –ј—“≈Ќ»» (¬ј–»јЌ“џ) » ѕЋј«ћ»ƒј (¬ј–»јЌ“џ)

’»ћ≈–Ќџ… –≈√”Ћя“ќ–Ќџ… ”„ј—“ќ  ƒЋя Ё —ѕ–≈——»» √≈Ќќ¬ ¬ –ј—“≈Ќ»я’ (¬ј–»јЌ“џ),  Ћј—“≈– ƒЋя Ё —ѕ–≈——»» √≈Ќј (¬ј–»јЌ“џ) ,  Ћј—“≈– ƒЋя »Ќƒ”÷»Ѕ≈Ћ№Ќќ… Ё —ѕ–≈——»» „”∆≈–ќƒЌќ√ќ √≈Ќј (¬ј–»јЌ“џ), —ѕќ—ќЅ Ё —ѕ–≈——»» √≈Ќј ¬ –ј—“≈Ќ»» (¬ј–»јЌ“џ), —ѕќ—ќЅ »Ќƒ”÷»Ѕ≈Ћ№Ќќ… Ё —ѕ–≈——»» „”∆≈–ќƒЌќ√ќ √≈Ќј ¬ –ј—“≈Ќ»» (¬ј–»јЌ“џ) » ѕЋј«ћ»ƒј (¬ј–»јЌ“џ)

ѕатент –оссийской ‘едерации
—уть изобретени€: √руппа изобретений может быть использована в селекции растений. ’имерные регул€торные участки нуклеотидных последовательностей и генные конструкции на основе генов опин-синтазы Agrobacterium fumefaciens обеспечивают повышенные уровни экспрессии чужеродных генов в растени€х. ƒл€ увеличени€ экспрессии генов различные "upstream"-расположенные активирующие последовательности, например, из генов маннопин- и октопин-синтазы операбельно соедин€ют с промоторами, которые, в свою очередь, операбельно соедин€ют с чужеродным геном.  онструкции ввод€т в растительные клетки с помощью плазмид. 19 с. и 13 з.п.ф-лы, 9 ил., 2 табл.
ѕоиск по сайту

1. — помощью поисковых систем

   — помощью Google:    

2. Ёкспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. ѕо номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Ќомер патента: 2142998
 ласс(ы) патента: C12N15/11, C12N15/82
Ќомер за€вки: 96113114/13
ƒата подачи за€вки: 17.11.1994
ƒата публикации: 20.12.1999
«а€витель(и): Ѕиотекнолэджи –исеч энд ƒивелопмент  опэрейшн (US); ѕедью –исеч ‘аундейшн (US)
јвтор(ы): √елвин —тэнтон Ѕ. (US); ’оптмэн –ендл (US); Ќай ћин (US);  уи ƒикей (CN)
ѕатентообладатель(и): Ѕиотекнолэджи –исеч энд ƒивелопмент  опэрейшн (US); ѕедью –исеч ‘аундейшн (US)
ќписание изобретени€: »зобретение относитс€ к химерным регул€торным участкам, примен€емым дл€ контрол€ экспрессии генов в растени€х. Ёти химерные регул€торные участки выделены из генов опин-синтазы патогена растений Agrobacterium tumefaciens.
A. tumefaciens - грамотрицательна€ почвенна€ бактери€, котора€ инфицирует большинство двудольных и р€д однодольных растений. »нфекци€ A. tumefaciens часто приводит к образованию корончатых галлов на инфицированных растени€х. ¬ процессе инфекции A. tumefaciens определенный сегмент ƒЌ  (“-ƒЌ ) большой плазмиды, индуцирующей опухоли (Ti), переноситс€ в клетку чувствительного растени€ и интегрируютс€ в €дерный геном растени€. ѕри этом происходит экспресси€ генов “-ƒЌ . Ќекоторые гены “-ƒЌ  кодируют ферменты, участвующие в синтезе гормонов, активных в растени€х. Ёти гормоны могут вызывать образование опухоли у инфицированных растений. ƒругие гены “-ƒЌ  направл€ют синтез и секрецию уникальных производных аминокислот и сахаров, называемых опинами. A. tumefaciens может использовать эти опины в качестве источников углерода и (иногда) азота. —м. Gelvin, Plant Physiol. 92: 281-85 (1990); Gelvin, Transgenic Plants (Academic Press 1993); Ream, Ann. Rev. Phytopathol. 27: 583-618 (1989; Zambryski, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 43: 465-90 (1992).
√ены “-ƒЌ  содержат участки, работающие в растени€х и обладающие сходством с регул€торными участками растений. Ќапример, большинство промоторов растений содержат цис-действующие элементы, такие как расположенные против хода транскрипции активирующие последовательности (UAS) (часто называемые энхансерами), которые, св€зыва€ транс-действующие факторы, определ€ют или вли€ют на силу промотора и тканеспецифичную экспрессию. Atchison, Annu. Rev. Cell Biol. 4:127-53 (1988). ќбща€ сила промотора, а также экспресси€ соответствующего ему гена может определ€тьс€ комбинацией и пространственной ориентацией цис-действующих элементов, а также наличием €дерных факторов, взаимодействующих с этими элементами. Dynan, Cell 58:1-4 (1989). »значально наход€сь на прокариотной плазмиде, гены “-ƒЌ  сохран€ют все элементы последовательности (промоторы и UAS), необходимые дл€ транскрипции в растени€х. Ќапример, гены “-ƒЌ  содержат области “ј“ј, которые наход€тс€ в сайте инициации транскрипции и содержат расположенные перед ними элементы на рассто€нии более ста пар осн. от сайта инициации транскрипции, что модулирует уровни транскрипции. —м. Gelvin, Transgenic Plants (Academic Press 1993).
ƒва гена, которые содержат расположенные против хода транскрипции активирующие последовательности, представлены генами октопин-синтазы (ocs) и маннопин-синтазы (mas). √ен ocs кодирует продукт, который конденсирует аргинин и пируват с образованием октопина. Hack and Kemp, Plant Physiol. 65:949-55 (1980). ѕалиндром из 16 пар оснований, расположенный перед геном ocs, активирует гетерологичный промотор кукурузы adhl в временной экспрессирующей системе. Ellis et al., EMBO J. 6:11-16 (1987); Ellis et al., EMBO J. 6:3203-08 (1987). Ётот палиндром также важен дл€ активности промотора ocs в стабильно трансформированном каллюсе табака. Leisner and Gelvin, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85: 2553-57 (1988); Leisner and Gelvin, Plant Cell 1: 925-36 (1989).
√ены mas 1' и 2' дел€т двойной двунаправленный промотор и интергенный участок из 479 пар осн. Ёти гены кодируют ферменты двустадийного пути синтеза маннопина Ellis et al., Mol. Gen. Genet. 195:466-73 (1984); Komro et al., Plant Mol. Biol. 4: 253-63 (1985). “ранскрипци€ генов mas €вл€етс€ дивергентной, а интергенный участок содержит все цис-действующие элементы, необходимые дл€ транскрипции обоих генов. DiRita and Gelvin, Mol. Gen. Genet. 207: 233-41 (1987); Fox et al. Plant Mol. Biol. 20: 219-33 (1992); Leung et al., Mol. Gen. Genet. 230: 463-74 (1991); Guevara-Garcia et al., Plant J. 4: 495-505 (1993).
ѕромоторы генов ocs и mas использовали дл€ направлени€ экспрессии св€занных генов в трансгенных растени€х. ќднако применение этих промоторов было ограничено низким уровнем экспрессии в определенных ткан€х трансгенных растений. DiRita and Gelvin, supra; Harpster et al., Mol. Gen. Genet. 212: 182-90 (1988); Sanger et al., Plant Mol. Biol. 14: 433-43 (1990). Ќапример, промотор ocs направл€ет определенную, специфичную дл€ клеток экспрессию в трансгенном табаке. Kononowicz et al., Plant Cell 4: 17-27(1992). √ен mas отличаетс€ слабой экспрессией в листь€х и стебл€х при более сильной экспрессии в корн€х. ќн про€вл€ет повышенную экспрессию в повреждени€х и индуцируетс€ ауксином. Langridge et al. , Proc. Nat'l Acad. Sci 86: 7890-94 (1989); Teeri et al., EMBO J., 8: 343-50 (1989); Saito et al., Planta 184: 40-46 (1991) Guevara-Garcia et al., loc. cit.
ѕоскольку промоторы и другие регул€торные участки имеют различную силу и тканевую специфичность, были разработаны определенные рекомбинантные регул€торные участки. Ќапример, энхансерные элементы, которые специфично св€зывают определенные транс-действующие факторы, могут модулировать активность транскрипции и экспрессию, специфичную дл€ клеток. Bienz and Pelham, Cell 45: 753-60 (1986).
»звестно также применение определенных конститутивных промоторов, например 35S конструкций вируса мозаики цветной капусты (CaMV). ѕромотор CaMV 35S имеет активаторы с множественными доменами, которые активируют промотор 35S в зависимости от стадии развити€ и тканевой специфичности. —м. Benfey et al. , EMBO J. 8: 2195-2202 (1989); Benfey et al., EMBO J. 9: 1677-1684 (1990): Benfey et al., EMBO J. 9: 1685-96.
ѕубликаци€ Koziel et al., Bio/Technology 11: 194-199 (1993) относитс€ к промоторам, примен€емым в конструкци€х, получаемых дл€ тканеспецифичной стимул€ции гетерологичного гена. Koziel предлагает конструкцию системы экспрессии гена, котора€ содержит усеченный ген crylA(b) (фрагмент гена, кодирующий первые 648 аминокислот инсектицидного белка из Bacillus thuringiensis, состо€щего из 1155 аминокислот), св€занный с промотором CaMV 35S или комбинацией 2-х тканеспецифичных промоторов, выделенных из кукурузы (промотор фосфоенолпируват-карбоксилазы (PEPC) и промотор, специфичный дл€ пыльцы). Koziel отмечает высокие уровни экспрессии при использовании любой промоторной конфигурации. Koziel et al. также использовали (1) промотор PEPC, который, как известно, вызывает специфичную дл€ зеленых тканей экспрессию, и (2) промотор, специфичный дл€ пыльцы кукурузы. ѕолученна€ экспресси€ инсектицидного белка на уровне 1500 - 4000 нг/мг €вл€етс€ достаточно высоким уровнем экспрессии.  роме того, применение промоторов PEPC/специфичных к пыльце приводило к тканеспецифичной экспрессии.
»звестны также попытки получить рекомбинантную экспрессию иными способами. »зобретение Bevan et al., PCT/GB92/00566 (1992) в основном относитс€ к применению единственного промотора, отличного от промотора, описанного Koziel et al., дл€ получени€ тканеспецифичной экспрессии гетерологичного гена. Ёто применение св€зано с использованием промотора фенилаланин-аммоний-лиазы бобов (PAL) дл€ получени€ тканеспецифичной экспрессии. Ѕыл сконструирован гибридный ген, в котором слиты участки регул€ции транскрипции геномного клона PAL (клона, содержащего в дополнение к кодирующим последовательност€м, промежуточные последовательности, €вл€ющиес€ частью последовательностей гена PAL) и открыта€ рамка считывани€ (ORF), содержаща€ 68 аминокислот N-конца белка PAL с полной ORF бета-глюкуронидазы (GUS) после участка полиаденилировани€ и терминации транскрипции нопалин-синтазы (сли€ние двух последних элементов типично дл€ большинства экспрессирующих векторов эукариотных растений и обеспечивает эффективную экспрессию). ѕоскольку исходна€ конструкци€ обладала сильной активностью в р€де растений, исследователи создали делеции в участках промотора PAL гибридного гена. ћинимальный промотор PAL, необходимый дл€ полной экспрессии, как было показано, состоит из 253 пар осн. стартового сайта (инициации) транскрипции PAL. ¬арьированием участков делеции, главным образом в этом минимальном участке, исследователи установили возможность модификации степени тканеспецифичной экспрессии.
ѕатент —Ўј N 5034322 в основном относитс€ к применению промоторов нопалин-синазы с малой субъединицей гена рибулоза-1,5-бис-фосфат-карбоксилазы.
Ѕыло также показано, что химерный промотор, названный "Mac", который содержит участок от +65 до -301 mas и участок от -90 до -941 энхансера 35S, обладает активностью GUS на уровне, в несколько раз превышающем уровень двойного промотора CaMV 35S в трансгенных растени€х табака Comai et al., Plant Mol. Biol. 15: 373-81 (1990).
ќписанные выше конструкции имеют р€д ограничений в плане эффективности и контролируемости экспрессии. Ќапример, известные подходы не обеспечивают сильную конститутивную экспрессию в услови€х, когда она желательна.
—ущность изобретени€
÷елью насто€щего изобретени€ €вл€етс€ получение химерных регул€торных участков дл€ улучшенной экспрессии генов в растени€х.
»зобретение также позвол€ет получать химерные регул€торные участки, которые содержат промоторы и наход€щиес€ против хода транскрипции активирующие последовательности из A. tumefaciens.
—огласно изобретению также возможно получение генных кластеров, содержащих гены, экспрессирующиес€ под контролем химерных регул€торных участков, которые содержат промоторы и наход€щиес€ против хода транскрипции активирующие последовательности из A. tumefaciens.
≈ще одним объектом изобретени€ €вл€етс€ способ получени€ индуцибельной экспрессии чужеродных генов в растени€х.
», наконец, получение плазмид и трансгенных растений, содержащих генные кластеры, также предусмотрено насто€щим изобретением.
¬ соответствии этим, согласно изобретению представлены химерные регул€торные участки дл€ экспрессии генов в растени€х, которые содержат указанную активирующую последовательность, выделенную из первого гена опин-синтазы A. tumefaciens, оперативно св€занную с промотором, выделенным из второго гена опин-синтазы A. tumefaciens, отличного от первого гена опин-синтазы A. tumefaciens. ѕервый и второй гены опин-синтазы A. tumefaciens предпочтительно представлены генами маннопин-синтазы или октопин-синтазы.
“акже представлены химерные регул€торные участки дл€ экспрессии генов в растени€х, содержащие по меньшей мере две активирующие последовательности опин-синтазы A. tumefaciens, оперативно св€занные с промотором опин-синтазы A. tumefaciens. ”казанные активирующие последовательности могут быть выделены из одного и того же или различных генов опин-синтазы A. tumefaciens, например маннопин-синтазы и октопин-синтазы. ƒополнительно одна или обе активирующие последовательности и промотор могут быть выделены из одного и того же гена опин-синтазы A. tumefaciens.
¬ соответствии с изобретением предложены также генные кластеры, содержащие экспрессируемый ген, оперативно св€занный с химерным регул€торным участком, как описано выше. √енный кластер может содержать также терминаторы транскрипции и сигналы полиаденилировани€, например сигнал полиаденилировани€ нопалин-синтазы.
 роме того, предложен кластер дл€ индуцибельной экспрессии чужеродного гена, который содержит чужеродный ген, оперативно св€занный с регул€торным участком, который содержит промотор, выделенный из гена маннопин-синтазы A. tumefaciens и расположенную против хода транскрипции активирующую последовательность, выделенную из гена маннопин-синтазы A. tumefaciens. –егул€торный участок может также содержать активирующие последовательности, выделенные из гена октопин-синтазы A. tumefaciens.
ќбъектами изобретени€ €вл€ютс€ также способы экспрессии генов в растени€х, которые предусматривают стадии св€зывани€ гена с химерным регул€торным участком, соответствующим изобретению, инсерцию гена и химерного регул€торного участка в растение и обеспечение экспрессии гена в растении.
 роме того, представлены плазмиды и трансгенные растени€, несущие описанные в изобретении химерные регул€торные участки и генные кластеры.
»ные объекты, отличи€ и преимущества насто€щего изобретени€ будут рассмотрены при обсуждении экспериментальных данных и чертежей.
 раткое описание чертежей.
Ќа фиг. 1 схематически представлена структура химерных регул€торных участков на основе mas и ocs. —трелки указывают на ориентацию расположенных против хода транскрипции активирующих последовательностей относительно промоторов mas и ocs. ÷ифры означают положение нуклеотидов относительно сайтов инициации транскрипции. “ример активирующей последовательности ocs был использован в конструкци€х 3 и 4. ћономер или тример активирующей последовательности ocs был использован в конструкци€х 5 и 6.
Ќа фиг. 2 показана активность GUS конструкций на основе промотора mas в экстрактах первичных трансформантов табака. јктивность GUS оценивали по общему белку, выделенному из тканей листьев (граф. ј), стеблей (граф. Ѕ) или корней (граф. ¬).  аждый столбец представл€ет активность отдельного трансформанта. –азличные конструкции указаны внизу графиков. „исло отдельных трансгенных растений, проанализированных в отношении каждой конструкции, представлено "n". —редн€€ активность GUS дл€ каждой конструкции обозначена "". A - активирующа€ последовательность, P - промотор, (Aocs)3 - тример активирующей последовательности ocs.
Ќа фиг. 3 показана активность GUS конструкций на основе промотора mas плюс активирующей последовательности в экстрактах первичных трансформантов табака. јктивность GUS оценивали по общему белку, выделенному из тканей листьев (граф. ј), стеблей (граф. Ѕ) или корней (граф. ¬).  аждый столбец представл€ет активность отдельного трансформанта. „исло отдельных трансгенных растений, проанализированных в отношении каждой конструкции, представлено "n". –азличные конструкции указаны внизу графиков. —редн€€ активность GUS дл€ каждой конструкции обозначена "". A - активирующа€ последовательность, P - промотор, AocsAmasPmas - мономер активирующей последовательности ocs, св€занной с активирующей последовательностью mas и промотором; (Aocs)3AmasPmas - тример активирующей последовательности ocs, св€занной с активирующей последовательностью mas и промотором.
Ќа фиг. 4 показана активность GUS конструкций на основе промотора ocs в экстрактах первичных трансформантов табака. јктивность GUS оценивали по общему белку, выделенному из тканей листьев (граф. ј), стеблей (граф. Ѕ) или корней (граф. ¬).  аждый столбец представл€ет активность отдельного трансформанта. –азличные конструкции указаны внизу графиков. „исло отдельных трансгенных растений, проанализированных в отношении каждой конструкции, представлено "n". —редн€€ активность GUS дл€ каждой конструкции обозначена "". A - активирующа€ последовательность, P - промотор, Amas' - участок mas от -213 до -318, Amas'' - участок mas от -111 до -318.
Ќа фиг. 5 показана активность GUS конструкций на основе промотора ocs плюс активирующей последовательности в экстрактах первичных трансформантов табака. јктивность GUS оценивали по общему белку, выделенному из тканей листьев (граф. ј), стеблей (граф. Ѕ) или корней (граф. ¬).  аждый столбец представл€ет активность отдельного трансформанта. –азличные конструкции указаны внизу графиков. „исло отдельных трансгенных растений, проанализированных в отношении каждой конструкции, представлено "n". —редн€€ активность GUS дл€ каждой конструкции обозначена "". A - активирующа€ последовательность, P - промотор, Amas' - участок mas от -213 до -318, Amas'' - участок mas от -111 до -318.
Ќа фиг. 6 представлены приблизительные уровни экспрессии активности GUS двойных промоторов CaMV 35S и Mac в листь€х (двойной 35SL, MacL), стебл€х (двойной 35SS, MacS) и корн€х (двойной 35SR, MacR) нескольких трансгенных растений табака.
Ќа фиг. 7 схематично представлены конструкции, использованные при изучении индуцибельной экспрессии. UAS - расположенна€ против хода транскрипции активирующа€ последовательность, pmas - промотор mas, GUS - ген β -глюкуронидазы, NOS - сигналы полиаденилировани€ нопалин-синтазы.
Ќа фиг. 8 представлен уровень активности GUS в выделенных зрелых €йцах нематод. јнализы проводили при pH 5,5 и 7,5 дл€ проверки активности GUS бактериального и животного происхождени€.
Ќа фиг. 9 представлена активность индуцированной нематодами GUS в различных трансгенных растени€х. Ќа панели ј представлены трансгенные растени€, имеющие промотор Pmas, но не имеющие активирующих последовательностей, на панели Ѕ - трансгенные растени€, имеющие промотор AmasPmas, на панели ¬ - трансгенные растени€, имеющие промотор AocsAmasPmas.
ѕодробное описание предпочтительных вариантов изобретени€.
Ќасто€щее изобретение относитс€ к химерным регул€торным участкам, содержащим различные расположенные против хода транскрипции активирующие последовательности и промоторы из генов опин-синтазы A. tumefaciens, которые примен€ют дл€ контрол€ экспрессии чужеродных генов. „ужеродный ген содержит любую ƒЌ , планируемую дл€ экспрессии в трансгенном растении. ¬ данном контексте ген, независимо от его происхождени€, ввод€т в геном растени€, и он, таким образом, €вл€етс€ чужеродным растению в локализации инсерции даже в случае, когда ген выделен из трансформируемого растени€. »зобретенные конструкции в соответствии с насто€щим изобретением также описаны в патентной за€вке —Ўј N 08/155067, за€влено 19.11.93, включенной в насто€щее описание путем ссылки.
¬се типы продуктов, кодируемых генами, можно получить с помощью насто€щего изобретени€. „ужеродные гены, экспрессируемые в трансгенных растени€х, согласно насто€щему изобретению, включают, но не ограничиваютс€ β -глюкуронидазой, генами, кодирующими инсектицидные и фунгицидные токсины, соединени€ми, обусловливающими устойчивость к патогенам, соединени€ми, обусловливающими сверхчувствительную реакцию, например пероксидазами, глюканазами и хитиназами, а также фитоалексинами; генами устойчивости к пестицидам, гербицидам и фунгицидам; ферментами растений, например св€занными с содержанием белков, крахмала, сахаров и жиров; ингибиторами ферментов растений, например ингибиторами протеазы и амилазы; гормонами растений; гормонами и феромонами насекомых; фармацевтическими и пищевыми соединени€ми, например бета-каротином; витаминами и антителами, в том числе фрагментами и одноцепочечными производными антител, и антисмысловыми транскриптами, нарушающими нуклеотидные последовательности, присутствующие в растени€х. —м., например, Kung and Wu, Transgenic Plants, vol. 1 (Academic Press 1993).
¬ общем, природный промотор маннопин-синтазы с активирующей последовательностью или природный промотор октопин-синтазы с активирующей последовательностью €вл€ютс€ относительно слабыми в ткан€х трансгенных растений табака (активность GUS, обусловленна€ св€занными репортерными генами gusA, составл€ет несколько сотен, несколько тыс€ч единиц активности GUS). ¬ соответствии с насто€щим изобретением сочетание UAS из этих генов с промотором с активирующей последовательностью заметно повышает активность GUS св€занного гена gusA (на два пор€дка), привод€ к активност€м пор€дка сотен тыс€ч единиц активности GUS. √истохимическое исследование ткани трансгенных растений табака экспрессирующих эти слитые гены промотор-gusA показывает, что новые комбинации промотора и активирующей последовательности, представленные в изобретении, работают в большинстве типов клеток растений. “аким образом, эти комбинации (химерные регул€торные участки) могут быть более конститутивными по сравнению с известными промоторами.
»зобретение относитс€ к улучшенным регул€торным участкам растений, обеспечивающим сильную и посто€нную стимул€цию экспрессии генов. ƒополнительно может быть получена тканенеспецифична€ и/или повышенна€ в определенных ткан€х экспресси€. ¬ыбор активирующих последовательностей и промоторов в соответствии с изобретением обусловливает желаемый тип экспрессии.
ѕредставленные химерные регул€торные участки характеризуютс€ более сильной экспрессией в табаке, чем любой другой известный регул€торный участок. “абак €вл€етс€ широко используемой моделью дл€ трансформации растений. ƒополнительно описанные регул€торные участки могут быть близкими к конститутивным (посто€нно включающимис€) и потенциально могут быть использованы в большем числе тканей растений, чем известные регул€торные участки.
»зобретение относитс€ к химерному регул€торному участку дл€ экспрессии генов в растени€х. ќн может содержать расположенную против хода транскрипции активирующую последовательность, выделенную из первого гена опин-синтазы A. tumefaciens, оперативно св€занную с последовательностью промотора, выделенной из второго гена опин-синтазы A. tumefaciens или с расположенной против хода транскрипции активирующей и промоторной последовательностью, выделенной из второго гена опин-синтазы A. tumefaciens.
’имерные регул€торные участки, согласно изобретению, могут быть оперативно св€заны с последовательностью чужеродного гена, котора€ может быть оперативно св€зана с работающей в растении терминаторной последовательностью и далее оперативно св€зана с работающей в растении сигнальной последовательностью полиаденилировани€. ’имерный регул€торный участок в соответствии с изобретением может быть высоко конститутивным во многих случа€х.
–асположенна€ против хода транскрипции активирующа€ последовательность €вл€етс€ последовательностью, естественное положение которой обычно, по меньшей мере, на сто пар оснований предшествует положению природного сайта инициации транскрипции и котора€ может оказывать вли€ние на экспрессию. UAS генов октопин- и маннопин-синтазы используют, в частности, с этой целью. Ёти UAS могут быть затем оперативно св€заны с последовательностью промотора или с расположенной против хода транскрипции активирующей последовательностью и промотором, выделенными из иного гена опин-синтазы A. tumefaciens.
“ермин "выделены", примен€емый в отношении таких участков ƒЌ , как промоторы и расположенные против хода транскрипции активирующие последовательности, описывает ситуации, когда "выделенный" участок ƒЌ  получают из участка ƒЌ  или он имеет основой природный участок ƒЌ  или участок ƒЌ  из иного источника. "¬ыделенный" участок ƒЌ  может отличатьс€ мутацией от природного участка ƒЌ  или участка ƒЌ , полученного из иного источника.
¬ыражение "оперативно св€занные" относитс€ к первой(ым) последовательности(€м), помещенной(ым) достаточно близко ко второй(ым) последовательности(€м) дл€ того, чтобы перва€(ые) последовательность(и) оказывала(и) вли€ние в области второй(ых) последовательности(ей) или участка, наход€щегос€ под контролем этой второй последовательности. Ќапример, UAS может быть оперативно св€зана с промотором, при этом она повышает транскрипционную силу промотора. ¬ такой ситуации типично 5'-расположение UAS относительно промотора. UAS и промотор, в свою очередь, могут быть оперативно св€заны с генами, при этом экспресси€ гена будет находитьс€ под контролем комбинации UAS/промотор, дл€ которой также типично 5'-положение относительно гена. ќбычно промотор содержит 30 - 50 пар оснований от стартового сайта транскрипции и до нескольких сотен пар оснований от стартового сайта трансл€ции. јктивирующа€ последовательность обычно составл€ет несколько сот пар оснований промотора. Ќапример, большинство активирующих последовательностей содержат 300 - 400 пар оснований усиливаемого промотора. ¬ вариантах изобретени€, где используетс€ более одной активирующей последовательности, они обычно содержат 100 - 200 пар оснований одна другой.
¬ сконструированном согласно изобретению химерном регул€торном участке источники генов опин-синтазы различны и предпочтительно выбраны из группы генов опин-синтазы, содержащей гены маннопин-, октопин-, нопалин- и агропин-синтазы.
Ёкспресси€ активности GUS, направл€ема€ промоторами mas и ocs с активирующими последовательност€ми, ограничена определенными типами клеток. ќперативное св€зывание активирующей последовательности ocs с промотором mas и с активирующей последовательностью, а также оперативное св€зывание активирующей последовательности mas с промотором ocs и с активирующей последовательностью показывает модул€цию экспрессии в сравнении с нативными конструкци€ми. “ак, экспресси€ GUS, а также иных генов может быть получена в большом числе типов клеток, включа€ сосуды ксилемы и эпидермальные клетки листьев. — другой стороны, ограниченные образцы экспрессии также могут быть получены в другом варианте изобретени€. ’имерный регул€торный участок, оперативно св€зывающий UAS ocs и минимальный промотор mas, дает сниженную экспрессию в сосудистой ткани листьев и экспрессию в стебл€х, св€занную с ткан€ми флоэмы.
»зобретение также относитс€ к рекомбинантному кластеру генов, кодирующему чужеродный полипептид. –екомбинантный кластер генов может содержать наход€щуюс€ против хода транскрипции активирующую последовательность, выделенную из первого гена опин-синтазы A. tumefaciens и последовательность промотора или активирующую и промоторную последовательность, выделенные из иного, второго гена опин-синтазы A. tumefaciens. ¬се указанные последовательности оперативно св€заны с последовательностью чужеродного гена. ¬ конструкции последовательность чужеродного гена может быть оперативно св€зана с работающей в растении последовательностью терминатора и/или работающей в растении сигнальной последовательностью полиаденилировани€. ѕри этом последовательность терминатора и сигнал полиаденилировани€ могут оказывать вли€ние на ген или транскрипт гена. ѕоследовательность терминатора и сигнал полиаденилировани€ имеют 3'-положение относительно гена.
—ледующий аспект изобретени€ относитс€ к комбинаци€м промотора и расположенной против хода транскрипции активирующей последовательности (регул€торным участкам), которые индуцируютс€ повреждени€ми или вредител€ми. ѕерва€ из разработанных комбинаций (AmasPmas) предпочтительно экспрессируетс€ в ткан€х корней и индуцируетс€ патогенами, тогда как друга€ (AocsAmasPmas) экспрессируетс€ во всем растении, но индуцируетс€ вредител€ми. Ёти экспрессирующие системы применимы дл€ генов, направленных на корневых вредителей, например на нематоды или грибы, и могут использоватьс€ против вредных насекомых и патогенов листьев. Ќапример, гены, кодирующие нематоцидные токсины и белки, которые нарушают репродуктивный цикл нематод, могут быть применены в рамках насто€щего изобретени€.
«аражение патогенами индуцирует химерные регул€торные участки, в которых использован промотор маннопин-синтазы с активирующими последовательност€ми mas или ocs, как описано выше. –€д генов, используемых дл€ получени€ устойчивости против патогенов, описан Keen, Plant Molec. Biol. 19: 109-22 (1992).
“ранскрипционные элементы, например промоторы и расположенные против хода транскрипции активирующие последовательности генов опин-синтазы, могут быть получены на основе имеющейс€ информации о последовательност€х. Ќапример, транскрипционные элементы генов октопин-синтазы описаны Leisner et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85: 2553-57 (1988); Leisner et al., Plant Cell 1: 925-36 (1989). “ранскрипционные элементы генов маннопин-синтазы описаны DiRita and Gelvin, supra, Fox et al., Plant Molec. Biol. 20: 219-33(1992); Leung et al., Mol. Gen. Genet. 230:463-74 (1991); Langridge et al., Proc. Nat'l Acad. Sci USA 86: 3219-23 (1989). “ранскрипционные элементы генов нопалин-синтазы Ha et al., Nucl. Acids Res. 17: 215-23 (1989); Mitra et al., Mol. Gen. Genet. 215: 294-99 (1989); Ebert et al., Proc. Nat'l Acad. Sci USA 84: 57-49 (1987); An et al. , Mol. Gen. Genet. 203: 245-50 (1986). Ёлементы контрол€ транскрипции гена агропин-синтазы описаны Bandyopadhyay et al., J. Biol. Chem. 264: 19399-406 (1989). ƒополнительно, полна€ последовательность “-ƒЌ  описана Barker et al., Plant Molec. Biol. 2: 335-50 (1983).
–азличные уровни и образцы экспрессии были получены следующими приведенными способами.  оличество и образец экспрессии оценивают с помощью маркерных систем, например, описанных здесь gusA. »зобретение проиллюстрировано следующими примерами, которые не ограничивают его.
ѕример 1
ƒобавление расположенных против хода транскрипции активирующих последовательностей mas или ocs к промотору mas или ocs и активирующей последовательности значительно увеличивает экспрессию GUS.
 ак показано на фиг. 1, были созданы новые комбинации промоторов mas и ocs. Ѕыли проанализированы различные субдомены UAS mas, поскольку предварительный делеционный анализ показал, что последовательности из 138 пар оснований, наход€щиес€ перед сайтом инициации транскрипции, €вл€ютс€ достаточными дл€ точной инициации транскрипции слитого гена mas2'/nptll в ткан€х корончатых галл подсолнечника. ѕоследовательности от -138 до -318, однако, могут также участвовать в регул€ции количественного уровн€ активности промотора mas2'. DiRita and Gelvin, Mot. Gen. Genet. 207; 233-41 (1987). ѕроанализированные UAS mas представлены: (i) UAS от -318 до -138; (ii) UAS' от -318 до -213; (iii) UAS'' от -318 до -111. —м. фиг. 1.
ѕерва€ группа химерных регул€торных участков была сконструирована и св€зана в качестве транскрипционных сли€ний с геном uidA (gusA) с помощью двух делеций -318 и -138 пар оснований от сайта инициации транскрипции (конструкции 1-6 фиг. 1) промотора mas. ѕервый сет химерных регул€торных участков содержит (в любой ориентации) мономер или тример активирующей последовательности ocs (от-116 до -333) перед делецией -138 промотора mas (конструкции 3 и 4 фиг. 1). ¬торой сет химерных регул€торных участков содержит подобные мономеры или тримеры активирующих последовательностей ocs перед делецией -318 промотора mas (конструкции 5 и 6 фиг. 1). Ётот участок ocs содержит палиндром из 16 пар оснований, а также 5'- и 3'-последовательности модул€тора, которые важны дл€ активировани€ промотора ocs в каллюсе и растени€х табака при стабильной инкорпорации в геном растений. Leisner and Gelvin, 1988 and 1989 supra; Kononowicz et al., Plant Cell 4: 17-27 (1992).
¬тора€ группа химерных регул€торных участков была сконструирована в виде трансл€ционных сли€ний с геном uidA на основе двух делеций ocs в положени€х -333 и -116 от сайта инициации транскрипции (конструкци€ 8-16 фиг. 1). Ѕыло создано два участка расположенной против хода транскрипции активирующей последовательности mas.  ороткий участок mas, содержащий последовательность от -213 до -318, был использован в конструкци€х 9-12 фиг. 1. ƒлинный участок mas, содержащий последовательность от -111 до -318, был использован в конструкци€х 13-16 фиг. 1.  ороткий или длинный участки mas были введены перед двум€ делеци€ми ocs.
’имерные конструкции были получены следующим образом. ќсновой всех конструкций был бинарный вектор pBl101.2 из Clontech. ѕлазмида pBl101.2 имеет основой репликон pRK290. ѕлазмида pBl101.2 содержит границы “-ƒЌ , химерный ген nos-nptll дл€ селекции на фоне канамицина у растений и не имеющий промотора ген GUS после сигнала полиаденилировани€. –егион промотора mas был получен из фрагмента EcoRV-XbaI, который содержит участок от -138 до +65, соответствующий сайту инициации транскрипции (пары оснований 20128 - 20343) из pKan2-138. Barker et al., Plant Mol. Biol. 2: 335-50 (1983): DiRita and Gelvin, supra. јктивирующа€ последовательность и промоторный участок mas от -318 до +65, соответствующие сайту инициации транскрипции (пары оснований 20128 - 20513) из pKan2-318, были изначально клонированы в сайты SmaI-XbaI CUp31 (производное pUC13, имеющее основу pUC13, но содержащее полилинкер, считываемый в направлении 5' - 3' как HindIII, PstI, SstI, SmaI, BamH1, XbaI). ѕолученные фрагменты рестрикции HindIII-XbaI из CUp31 были последовательно реклонированы в сайты HindIII-XbaI мультилинкера pBl101.2, с образованием плазмид pNi1 и pNi2 (конструкции 1 и 2 соответственно).
‘рагмент энхансера ocs из плазмиды pEN Δ 1 (Leisner and Gelvin (1988) supra) был получен с помощью линкеров HindIII. Ётот фрагмент соответствует от -333 до -116 сайта инициации транскрипции (пары оснований 13774 -13991, Barker et al., supra). ќн был клонирован как тример в сайт HindIII pNi1 перед промотором mas в обеих ориентаци€х, что дало конструкции 3 и 4 (см. фиг. 1). ƒл€ создани€ конструкций 5 и 6 этот же фрагмент активирующей последовательности ocs был клонирован как тример или как мономер в сайт HindIII pNi2 перед активирующей последовательностью и промотором mas.
‘рагмент BamH1-EcoRI, содержащий участок промотора ocs с частью структурного гена ocs, который соответствует от -116 до +296 сайта инициации транскрипции (пары оснований 13774 - 13362) и фрагмент XbaI-EcoRI, содержащий активирующую последовательность и промоторный участок ocs, соответствующий участку от -333 до +296 сайта инициации транскрипции (пары оснований 13991 - 13362) из pEN1 (Leisner and Gelvin (1988), supra) были клонированы в сайты BamH1-EcoRI и XbaI-EcoRI соответственно, pBluescriptll SK+ (—тратаген). ‘рагменты XbaI-EcoRV из полученных производных pBluescript были последовательно клонированы в сайты XbaI-SmaI pBl101.2 с созданием трансл€ционных сли€ний GUS в плазмидах pLH3 (конструкци€ 7) и pNi3 (конструкци€ 8). ‘рагмент XhoI-HaeIII, содержащий короткую активирующую последовательность mas, соответствующую участку от -318 до -213 сайта инициации транскрипции (пары оснований 20513 - 20407) из pKan2-318, был клонирован в сайты XhoI-HincII pUX13 (производное pUC13 содержащее основу pUC13, но с сайтом SmaI, превращенным в сайт XhoI). ѕолученный XhoI-HindIII фрагмент был сделан непосредственно из фрагмента Klenow при введении линкеров XnaI. ‘рагмент клонирован в обеих ориентаци€х в сайты XbaI pLH3 (конструкции 9 и 19) и pNi3 (конструкции 11 и 12). јналогично длинный фрагмент активирующей последовательности masXhoI-MnII, соответствующей сайту инициации транскрипции (пары оснований 20513-20305) из pKan2-318, был сделан при непосредственном использовании фрагмента Klenow. Ѕыли введены линкеры XbaI и фрагмент был клонирован в обеих ориентаци€х в сайты XbaI pLH3 (конструкции 13 и 14) и pNi3 (конструкции 15 и 16).
 аждой из описанных конструкций последовательно трансформировали E. coli DH5a, выращенную при 37oC в среде LB с канамицином. ќриентации инсерций были определены рестрикционным картированием. ѕлазмида pBl121 (Clontech), содержаща€ фрагмент HindIII-BamHI из 800 пар оснований с промотором CaMV 35S была использована в качестве контрол€ дл€ сравнени€ относительных длин химерных регул€торных участков.
–екомбинантные плазмиды, содержащие инсерций, были введены в A. tumefaciens LBA4404 способом скрещивани€ с участием трех родителей с использованием E. coli MM294, несущей мобилизующую плазмиду pRK2013. Hoekema et al., Nature 303: 179-80 (1983); Ditta et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. 77: 7347-51 (1980). ¬ LBA4404 рекомбинантные плазмиды сохран€ютс€ как независимые репликоны (бинарные векторы), которые могут быть перенесены в растени€ с последующей интеграцией в €дерную ƒЌ  растени€. »ные способы, например электропораци€, также могут быть использованы дл€ трансформации клеток A. tumefaciens плазмидами.
“рансконьюганты A. tumefaciens были отселектированы на чашках с минимальной средой AB, содержащей 0,5% глюкозы, 10 мкг/мл рифампицина и 50 мкг/мл канамицина. Lichtenstein and Draper, DNA Cloning: a practical approach (Glover ed. , Oxford-IRL Press 1986). »нтродукци€ мобилизованной плазмиды в реципиентный штамм A. tumefaciens была определена блоттингом ƒЌ .
ƒиски, вырезанные из листьев шестинедельных стерильных культур Nicotiana tabacum var. Wisconsin 38, были трансформированы с помощью A. tumefaciens несущей конструкции, с использованием способа трансформации листовых дисков. Horsh et al., Science 227: 1229-31 (1985). »нфицированные листовые диски в течение трех дней выращивали на среде MS3+ без антибиотиков, затем диски перенесли на свежую среду, индуцирующую образование проростков, котора€ содержала 1250 мг/л карбенициллина и 200 мг/л канамицина. Kononowicz et al., Plant Cell 4: 17-27 (1992). „ерез 4 - 5 недель по одному побегу с каждого листового диска перенесли в среду, индуцирующую образование корней, котора€ содержала 500 мг/л карбенициллина и 50 мг/л канамицина. „ерез две недели растени€ перенесли в среду BGS (среда MS, содержаща€ 1 мг/л фолиевой кислоты, 10 мг/л индол-уксусной кислоты и 30 мг/л кинетина), содержащую 50 мг/л канамицина, с целью поддержани€ культур каждой линии in vitro.
–егенерированные трансгенные растени€ табака, содержащие каждую из описанных конструкций, были проверены на активность GUS. ћаленькие кусочки ткани растени€ были выделены из четвертого или п€того полностью развернувшегос€ листа, около стеблей и из активно растущих молодых корней, когда растени€ сформировали по 10 - 12 листьев. “кани были растерты в 200 мкл экстракционного буфера и сохран€лись при -70oC. Jefferson and Wilson, Plant Molecular Biology (Gelvin & Schilperoot eds., Kluwer Acad. Press 1991). јктивность GUS определ€ли по Jefferson and Wilson, использу€ 10 мкл экстракта (20 - 30 мкг белка) и MUG (4-метилумбеллиферил -β- D-глюкуронид) в качестве субстрата.  онцентрацию белка определ€ли по Patterson, Analyt Biochem. 83: 346-56 (1977).
ќтдельные трансгенные растени€, содержащие одну и ту же конструкцию, имели различи€ в активности GUS (см. фиг. 2 - 5). ќднако, при определении активности GUS у большого числа растений, несущих одну и ту же конструкцию, можно установить относительную силу каждого химерного регул€торного участка. ѕоскольку не были установлены различи€ в уровне активности GUS при использовании конструкций, в которых элементы активирующих последовательностей были клонированы в противоположных ориентаци€х, данные по каждой двучленной подгруппе конструкций были суммированы (3 и 4, 5 и 6, 9 и 10, 11 и 12, 13 и 14, 15 и 16).
¬о всех исследованных ткан€х экспресси€, направл€ема€ делецией -138 mas, имела минимальный уровень активности GUS (фиг. 2 конструкци€ 1). ƒобавление природной активирующей последовательности mas к минимальному промотору mas приводило к образованию конструкции 2, котора€ обусловливала низкий уровень активности GUS в ткан€х листьев и стеблей. ќн составл€л около тыс€чи единиц (фиг. 2, граф. ј и Ѕ). ƒл€ этой конструкции была отмечена относительно высока€ активность GUS в ткан€х корней. ќна составл€ла около 12 тыс€ч единиц (фиг. 2, граф. ¬). Ёти результаты показывают, что данные промотор и активирующий участок mas обеспечивают предпочтительную экспрессию в корн€х промотора mas2', описанного выше. «амена активирующей последовательности mas гетерологичной активирующей последовательностью ocs (в виде тримера) перед делецией -138 mas (конструкции 3 и 4) практически не измен€ет уровень активности GUS относительно комбинаций гомологичной активирующей последовательности mas и промотора mas в ткан€х листьев и стеблей (фиг. 2, граф. ј и Ѕ). ¬месте с результатами, которые показывают, что экспресси€ активирующей последовательности ocs и промотора незначительно выше в корн€х, чем в листь€х (см. ниже конструкци€ 8), данные результаты позвол€ют предположить, что предпочтительна€ экспресси€ в корн€х промотора mas обусловлена элементом из 138 пар оснований сайта инициации транскрипции mas.  оличественный уровень тканеспецифичной экспрессии может быть еще более повышен активирующими последовательност€ми ocs или mas.
»дентифицирован гомолог тандемного повтора AS-1 (Lam et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. 86: 7890-94 (1989) в участке промотора mas в положении -66. Ётот элемент, наход€сь в промоторе CaMV 35S, взаимодействует с транс-действующим фактором ASF-1 (Lam et al., loc. cit.) и направл€ет тканеспецифичную экспрессию с высокой активностью в корн€х (Benfey et al., supra).
јктивность GUS, направл€емую химерными конструкци€ми, сравнили с активностью, полученной при использовании промотора CaMV 35S (-800 pBl121). Ѕольшинство трансформантов 35S GUS имели активность, близкую или ниже таковой у растений, содержащих конструкции активирующей последовательности mas и промотора (фиг. 2). Lam et al., supra показана предпочтительна€ дл€ корней экспресси€ промотора 35S.
–езультаты показывают, что промоторы ocs и mas содержат цис-элементы, которые направл€ют транскрипцию тканеспецифичным образом. Kononowicz et al., Plant Cell 4: 17-27 (1992); Leung et al., Mol. Gen. Genet. 230: 463-74 (1991). ¬ свете этих результатов был проведен анализ комбинаций гетерологичных активирующих последовательностей с целью установлени€, может ли комбинаци€ мен€ть образец экспрессии, направл€емый одним промотором ocs или mas, и повышать или снижать активность промотора в определенных ткан€х растени€. ƒл€ проверки этой гипотезы конструкции 5 и 6 (см. фиг. 1), которые содержат тример или мономер активирующей последовательности ocs, расположенный перед активирующей последовательностью mas и промотором, были интродуцированы в табак. јктивность GUS при этом была измерена в различных ткан€х (фиг. 3). Ќовые химерные участки, содержащие мономер активирующей последовательности ocs, повышали экспрессию активности GUS в 6,6 раза в листь€х, в 3,0 раза в стебл€х и в 3,4 в корн€х в сравнении с промотором и активирующей последовательностью mas2' (см. фиг. 2 и 3).  онструкции, содержащие тример активирующей последовательности ocs, сильно повышали экспрессию активности GUS в листь€х (в 22 раза), в стебл€х (1,7 раза) и корн€х (в 9 раз) в сравнении с промотором и активирующей последовательностью mas2' (конструкци€ 2 на фиг. 1 и 2), не содержащими дополнительной активирующую последовательность ocs. Ёти результаты показывают, что по меньшей мере в ткан€х листьев и корней введение множественных копий активирующей последовательности ocs дает неожиданно мощный усиливающий эффект на соответствующую активность промотора и активирующей последовательности mas2'.
јнализы показывают, что активность промотора CaMV 35S в листь€х трансгенных растений (в среднем 200 пмол/мин/мг белка) была сравнима с данными Comai et al., Plant Mol. Biol. 15: 373-81 (1990). ƒупликаци€ энхансера 35S привела к двукратному повышению активности GUS в листь€х. —равнива€ результаты, приведенные Comai et al., loc. cit., с данными, полученными дл€ предложенных конструкций, можно сказать, что химерные участки конструкций 5 и 6 обеспечивали соответственно 156- и 26-кратное усиление экспрессии GUS в листь€х по сравнению с промотором 35S и усиленным двойным промотором 35S соответственно.
Ѕыли также проверены семена генерации T2 растений табака, содержащие конструкции двойной 35S-GUS или Mac-GUS. ќпределени€ активности GUS в листь€х этих трансгенных растений подтвердили
относительные силы промоторов, как указано выше. ¬ таблице 1 представлена средн€€ активность GUS в листь€х трансгенных растений табака, несущих различные варианты сли€ний промотор-uidA.
¬ таблице 2 приведена средн€€ активность GUS в листь€х в поколении F1 трансгенных растений табака, несущих различные варианты сли€ний промотор-uidA.
—ери€ химерных конструкций на основе минимального промотора ocs (от -116 до +296) была проанализирована с целью оценки силы и образцов тканеспецифичной экспрессии, как показано на фиг. 4, активирующа€ последовательность ocs и промотор определ€ют низкий и относительно универсальный уровень активности GUS (200 - 400 пмол/мин/мг белка) в ткан€х листьев, стебл€ и корней трансгенных растений табака. «амещение активирующей последовательности ocs коротким вариантом активирующей последовательности mas (от -213 до -318, конструкции 9 и 10) приводило к образованию химерной конструкции, определ€ющей низкий уровень активности GUS во всех исследованных ткан€х.
ƒлинный вариант активирующей последовательности mas (от -111 до -318), расположенный перед минимальным промотором ocs (конструкции 13 и 14), был также проанализирован. Ёти конструкции обусловливали несколько повышенный уровень активности GUS, но только в ткан€х корней. ¬ дополнение к гомологу AS-1 в положении -66 последовательность, близка€ к элементу AS-1, была обнаружена в положении -290. ’от€ эта последовательность присутствует в коротком варианте активирующей последовательности mas, иные последовательности между положени€ми -213 и -103 необходимы дл€ предпочтительной экспрессии в корн€х.
 ороткий вариант активирующей последовательности mas (от -318 до -213, конструкции 11 и 12) был помещен перед активирующей последовательностью ocs и промотором. ¬ сравнении с конструкцией, содержащей только активирующую последовательность ocs и промотор (конструкци€ 8), эти конструкции обеспечивали 6-, 2,5- и 15-кратное повышение активности GUS в ткан€х листьев, стебл€ и корней соответственно (см. фиг. 5). Ёкспресси€ этих конструкций была несколько более предпочтительной в корн€х, что предполагает возможность взаимодействи€ элемента, подобного AS-1, с активирующей последовательностью ocs.  онструкции, содержащие длинный вариант UAS mas (св€занные с активирующей последовательностью ocs и промотором (конструкции 15 и 16)), обусловливали незначительно более низкий уровень активности GUS по сравнению с конструкци€ми 11 и 12, содержащими короткую активирующую последовательность mas (см. фиг. 5). —в€зывание активирующих последовательностей ocs и mas по 5'-концу с промотором mas приводило к значительному увеличению силы промотора по сравнению с конструкцией, состо€щей из активирующей последовательности ocs и промотора.
ѕример 2
 оррел€ци€ между числом копий “-ƒЌ  и активностью GUS в трансгенных растени€х табака.
ƒл€ установлени€ св€зи между числом копий “-ƒЌ  и активностью GUS была проанализирована геномна€ ƒЌ  из 16 трансгенных растений, содержащих конструкцию 5 или 11. √еномную ƒЌ  экстрагировали из тканей растений и расщепл€ли полностью с помощью HindIII. Rogers and Bendich, PLANT MOLECULAR BIOLOGY (Gelvin and Schilperoot eds., Kluwer Acad. Pub., 1992). 10 мкг ƒЌ  обрабатывали HindIII, фрагменты раздел€ли электрофоретически в 1,0% агарозном геле и элюировали ƒЌ  на нейлоновую мембрану способом капилл€рного переноса. Maniatis et al. , MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor 1982). Ќуклеиновые кислоты фиксировали на мембране нагреванием при 80oC под вакуумом в течение 2 часов. ѕредварительную гибридизацию проводили в течение 2 - 4 часов при 65oC в 1,5xSSC (раствор хлорида и цитрата натри€) (1xSSC - 0,15 ћ NaCl, 0,015 ћ цитрат натри€), 1,0% SDS (додецилсульфат натри€), 0,5% Blotto и 0,5 мг/мл ƒЌ  измельченной молоки лосос€.
√ибридизацию проводили при 65oC в течение ночи в свежем растворе с зондом, содержащим участок кодирующей последовательности GUS (рестрикционный фрагмент XbaI-SstI из pBl101.2) и меченным 32P-dCTP. ѕосле окончани€ гибридизации мембрану промывали в течение 15 минут при комнатной температуре следующими растворами: 2х SSC/0,1% SDS, 0,5х SSC/0,1% SDS, 0,1х SSC/0,1% SDS. ќкончательное промывание проводили в течение 30 минут при 50oC 0,1х SSC/1,0% SDS.
— помощью этой комбинации рестриктаз и гибридизационного зонда число копий “-ƒЌ  устанавливали по числу и интенсивности гибридизационных бэндов. „исло интегрированных копий варьировало от одного до нескольких в отдельных трансформантах. јктивность GUS не коррелировала с числом интегрированных генов uidA. Ќапример, растение, содержащее единственный интегрированный ген uidA, в р€де случаев обладало значительно более высокой активностью GUS в листь€х, чем растение, содержащее множественные интегрированные копии гена uidA.
ѕример 3
 оррел€ци€ между активностью GUS и м–Ќ  uidA в трансгенных растени€х табака.
ѕоскольку активность GUS была использована как мера силы экспрессии, было необходимо удостоверитьс€, что эта активность отражает существующий уровень м–Ќ  uidA. Ёта коррел€ци€ €вл€етс€ важной, потому, что существуют данные, что активность GUS не коррелируют с количеством м–Ќ  uidA при использовании промотора mas2' и репортерного гена uidA. Hensgens et al., Plant Mol. Biol. 20: 921-38 (1992).
¬ соответствии с этим был изучен уровень м–Ќ  uidA, выделенной из листьев отдельных трансгенных растений, содержащих 4 различных конструкции (конструкции 2, 5, 8, 11). —начала выделили общую –Ќ  по de Vries et al., PLANT MOLECULAR BIOLOGY (Gelvin and Schilperoot eds., Kluwer Acad. Pub., 1992). ќбразцы по 5 мг были фракционированы электрофорезом в формальдегидном геле через 1,2% агарозный гель в буфере ћѕ— /Ёƒ“ј (50 мћ ћѕ— , 1 мћ Ёƒ“ј, pH 7,0) с последующим блоттингом на нейлоновой мембране. ÷ельность –Ќ  была проверена электрофорезом в агарозном геле и окрашиванием этидий-бромидом. ‘люоресценци€ нуклеиновых кислот также служила дл€ подтверждени€ того, что кажда€ дорожка содержала равные количества –Ќ . ”слови€ гибридизации были описаны выше дл€ анализа геномной ƒЌ . ѕосле окончани€ гибридизации мембрану промывали в течение 15 минут при комнатной температуре следующими растворами: 2х SSC/0,1% SDS, 0,5х SSC/0,1% SDS, 0,1х SSC/0,1% SDS. ќкончательное промывание проводили в течение 30 минут при 60oC 0,1х SSC/1,0% SDS.
ѕри блоттинг-анализе –Ќ  с помощью гибридизационного зонда, выделенного из кодирующей последовательности GUS, был получен транскрипт ожидаемого размера (приблизительно 2300 нуклеотидов). Ѕыла отмечена тесна€ коррел€ци€ между активностью GUS и уровнем м–Ќ  uidA, что противоречит данным Hensgens et al.
ѕример 4
ћодул€ци€ специфичной дл€ клеток экспрессии GUS различными комбинаци€ми промоторов и активирующих последовательностей ocs и mas.
√истологические исследовани€ тканей трансгенного табака были проведены дл€ установлени€ специфичной дл€ клеток активности GUS. “акие образцы экспрессии были получены при гистохимическом окрашивании тонких срезов тканей растени€ X-gluc.
Ёти гистохимические исследовани€ проводились по Jefferson and Wilson, supra. –астительные материалы предварительно фиксировали в течение 20-40 минут 0,1-0,3% формальдегидом, 0,1 ћ “ритоном ’-100, 0,1 ћ фосфатным буфером (pH 7,0), промывали 0,1 ћ фосфатным буфером и окрашивали 1 - 2 мћ X-gluc (в 0,1 ћ “ритоне ’-100, 0,01 ћ Ёƒ“ј, 0,1 ћ фосфатном буфере) в течение 2 - 14 часов. ѕосле повторной фиксации в течение двух часов с использованием 3-5% формальдегида в 0,1 ћ фосфатном буфере образцы обрабатывали 70% этанолом, помещали в парафин и делали срезы (12 - 18 мм) на роторном микротоме. —резы тканей контрастно окрашивали 1,0% периодной кислотой - 0,5% реактивом Ўиффа ("PAS").
Ќи в одной из исследованных типах клеток тканей листьев растений, несущих промотор mas, но не имеющих активирующую последовательность (конструкци€ 1), не было обнаружено активности GUS. –астени€, содержащие химерный ген uidA под контролем природной активирующей последовательности mas и промотора (конструкци€ 2), имели средний уровень активности GUS в клетках мезофилла листьев (включа€ столбчатую и губчатую паренхиму) и замыкающих клетках, но не имели активности GUS в клетках эпидермиса. ¬ ткан€х сосудов было отмечено умеренное окрашивание трахеид ксилемы при относительно более слабом окрашивании флоэмы и клеток лучевой паренхимы. Ѕлизкие значени€ активности GUS были отмечены в листовых пластинках, несущих тример активирующей последовательности ocs и промотора mas (конструкци€ 3 и 4). ќднако в сосудистых ткан€х листьев активность GUS была сильно снижена во всех типах клеток. —в€зывание тримера активирующей последовательности ocs с активирующей последовательностью mas с промотором (конструкции 5 и 6) обусловило сильную активность GUS не только в мезофилле и замыкающих клетках листьев, но и в эпидермальных клетках. Ёто означает, что дистальна€ и проксимальна€ гетерологичные активирующие последовательности взаимодействуют, модулиру€ экспрессию. ¬ сосудистых ткан€х листьев экспресси€ не зависела от наличи€ тримерных активирующих последовательностей, св€занных с активирующей последовательностью mas с промотором.
јктивность GUS не была отмечена в ткан€х листьев, содержащих минимальный промотор ocs (конструкци€ 7). Ёкспресси€ активности GUS, определ€емой активирующей последовательностью ocs с промотором (конструкци€ 8), была близка к таковой, обусловленной активирующей последовательностью mas с промотором в поперечных срезах листовой пластинки. Ётот образец активности GUS был отмечен в листовых пластинках растений, в которых ген uidA находилс€ под контролем химерного промотора, состо€щего из короткой активирующей последовательности mas и активирующей последовательности ocs с промотором (конструкции 11 и 12). ¬ сосудистой ткани черешков листьев активирующа€ последовательность ocs с промотором также направл€ла экспрессию GUS, но только в трахеидах. ¬ отличие от активирующей последовательности mas с промотором, активирующа€ последовательность ocs с промотором определ€ла умеренный уровень экспрессии активности GUS в клетках флоэмы и очень слабую экспрессию в трахеидах паренхимы и ксилемы в основных сосудистых ткан€х листьев. Ѕлизкий образец активности GUS был получен в сосудистой ткани листьев независимо от добавлени€ короткой активирующей последовательности mas к активирующей последовательности ocs с промотором. ’от€ активность была значительно более высокой в паренхиме, лучевых клетках и клетках флоэмы, активность GUS не определ€лась в растени€х, содержащих активирующую последовательность mas, св€занную с промотором ocs (конструкции 9 и 10).
јктивирующа€ последовательность mas с промотором (конструкци€ 2) определ€ла слабую экспрессию активности GUS в ножках железистых трихом, но сильную экспрессию в головках. ќперативное св€зывание тримера активирующей последовательности ocs с активирующей последовательностью mas с промотором (конструкции 5 и 6) приводило к близкому образцу экспрессии. ќднако относительный уровень активности GUS был сильно повышен в клетках ножек. Ёкспресси€ активности GUS в трихомах, направл€ема€ конструкци€ми, содержащими короткую активирующую последовательность mas св€занную с активирующей последовательностью ocs с промотором (конструкции 11 и 12), была сильной в головках железистых трихом, но слабой в клетках ножек.
¬ стебл€х трансгенных растений активирующа€ последовательность mas с промотором (конструкци€ 2) определ€ла слабую экспрессию активности GUS в корковых клетках. —ильна€ активность GUS была отмечена в лучевых клетках и клетках флоэмы, но экспресси€ в трахеидных клетках ксилемы была относительно слабой. Ётот образец экспрессии не измен€лс€ даже при использовании тримера активирующей последовательности ocs перед активирующей последовательностью mas с промотором (конструкции 5 и 6).  огда активирующа€ последовательность mas была заменена тримером активирующей последовательности ocs (конструкции 3 и 4), был отмечен иной образец экспрессии. Ёкспресси€ активности GUS оставалась сильной в клетках флоэмы, но была слабой в лучевых клетках и клетках трахеид ксилемы. ¬ отличие от активирующей последовательности mas с промотором активирующа€ последовательность ocs с промотором (конструкци€ 8) определ€ла относительно более слабую экспрессию в лучевых клетках и клетках флоэмы при сильной экспрессии в клетках трахеид.  огда короткий промотор mas был введен перед активирующей последовательностью ocs с промотором (конструкци€ 11), образец экспрессии в основном сохран€лс€.
јктивность GUS, определ€ема€ активирующей последовательностью mas с промотором (конструкци€ 2) в ткан€х корней, была различной. Ѕыло получено регенерированное растение, в котором активность GUS определ€ли в клетках корневого чехлика, эпидермальных клетках, корневых волосках, корковых клетках корней, в клетках флоэмы и ксилемы зоны созревани€ корн€. ќднако, в зоне удлинени€ корн€ была зарегистрирована низка€ активность GUS. јктивность GUS часто, но не всегда определ€ли в каждом типе клеток зоны созревани€ корн€ в случае, когда тример активирующей последовательности ocs был добавлен к активирующей последовательности mas с промотором (конструкции 5 и 6). «амена активирующей последовательности mas тримером активирующей последовательности ocs (конструкции 3 и 4) обусловливала активность GUS только в корковых и эндодермальных клетках зоны удлинени€ периферических корней. ѕодобные образцы активности GUS были отмечены, когда промотор ocs и активирующа€ последовательность (конструкци€ 8) или коротка€ активирующа€ последовательность mas с активирующей последовательностью ocs с промотором (конструкции 11 и 12) направл€ли экспрессию гена uidA.
ѕример 5
—равнение предлагаемых химерных регул€торных участков с иными регул€торными участками.
јктивность активирующей последовательности mas с промотором €вл€етс€ наивысшей в ткан€х корней. ¬ведение тримера активирующей последовательности ocs к активирующей последовательности mas с промотором повышало уровень активности GUS в 2-23 раза. Ёто повышение активности максимально в ткан€х листьев, но также отмечаетс€ в ткан€х стебл€ и корн€. јктивность активирующей последовательности ocs с промотором приблизительно одинакова в листь€х, стебл€х и корн€х трансгенных растений табака. ¬ведение короткого варианта активирующей последовательности mas к активирующей последовательности ocs с промотором повышало уровень экспрессии GUS в 2-20 раз. Ёто повышение активности было наиболее значительным в ткан€х листьев. —очетание множественных копий активирующей последовательности ocs с активирующей последовательностью mas с промотором приводило к образованию транскрипционного регул€торного элемента, который в листь€х был примерно в 156 раз сильнее, чем промотор 35S, в 26 раз сильнее, чем усиленный двойной промотор CaMV 35S и в 4,2 раза сильнее, чем промоторы "Mac" и "Big Mac", описанные Comai et al., Plant Mol. Biol. 15: 373-81 (1990) (см. фиг. 2 и 3 и табл. 1). ƒанные относительно двойного промотора 35S и промотора mas дл€ листьев (L), стеблей (S) и корней (R) представлены на фиг. 6. —ледует отметить, что больша€ активность химерных промоторов, представленна€ конструкци€ми 5 и 6 относительно двойного промотора CaMV 35S и промоторов Mac и Big Mac, оцениваетс€ минимально. ƒополнительно гистохимический анализ клеток трансгенных растений, несущих эти конструкции, показал, что эти дополнительные активирующие последовательности направл€ли экспрессию активности GUS почти во всех типах клеток. Ќапример, сильна€ экспресси€ активности GUS была отмечена в ксилеме и эпидермальных клетках листьев, а также в мезофилле, замыкающих клетках, трихомах и клетках флоэмы листьев. ¬ стебле активность была отмечена в клетках флоэмы и паренхимы, а также в корковых клетках. ¬ корн€х активность GUS была обнаружена в корневом чехлике и корневых волосках, а также в большинстве клеток зрелых частей корн€.
¬озможное вли€ние условий роста растений на различные химерные конструкции промотор-uidA должно быть прин€то во внимание. Hensgens et al., Plant Mol. Biol. 20: 921-38 (1992) показали, что активность GUS у растений, выращенных in vitro (укорененных в стерильном агаре), была в три раза больше, чем у растений, выращенных в почве в теплице. ƒополнительно было показано, что листь€ растений, выращенных в почве в услови€х внешней среды, экспрессировали активность GUS на более низком уровне, чем растени€, выращенные in vitro. ќднако относительные уровни активности GUS, определ€емые различными регул€торными участками, не зависели от условий выращивани€ растений (табл. 2, supra). ƒополнительно, относительна€ сила различных химерных регул€торных участков в листь€х поколени€ F1 самоопыленных трансгенных растений табака была близка к таковой трансформированных и регенерированных растений (табл. 2).
Ѕыла обнаружена тесна€ коррел€ци€ между уровнем м–Ќ  и активностью GUS у растений. Ётот результат подтверждает достоверность использовани€ данных анализа активности GUS как меры силы экспрессии. Ёти данные противоречат таковым Hensgens et al., supra. Ёти противоречи€ могут объ€сн€тьс€ неудачным выбором условий денатурации дл€ блоттинг-анализа –Ќ  указанным автором.
Comai et al., supra показали, что, когда растени€ выращиваютс€ в почве, участок активирующей последовательности mas2' и промотора короче, чем в наших исследовани€х (-301 в сравнении с -318) и направл€ет только 10% активности GUS относительно силы промотора CaMV 35S. ¬ведение последовательностей перед -301 повышало относительную активность GUS до 40% от активности промотора 35S. Comai et al. считают, что участок, расположенный против хода транскрипции, но близко к -300, необходим дл€ реализации полной активности промотора mas2'. јктивность этого промотора (-318), используема€ в приведенных экспериментах, была несколько выше, чем активность, определ€ема€ промотором 35S.
Langridge et al., supra показали, что активность слитого гена mas2'-lux может повышатьс€ в несколько раз с помощью гормонов. ’от€ были проведены исследовани€ на растени€х, выращенных in vitro в присутствии гормонов, эти услови€ роста не оказывали сильного вли€ни€ на результаты, которые продемонстрировали близкие относительные уровни активности GUS, полученные дл€ растений, выращенных в почве.
Langridge et al. также показали, что в стебл€х трансгенного табака активность промотора mas2' максимально экспрессируетс€ в сосудистых ткан€х. Saito et al., supra продемонстрировали сильное окрашивание в корневом чехлике при более слабом окрашивании клеток флоэмы корней табака. Ќаши данные хорошо коррелируют с указанными. ќднако Saito et al. определили активность GUS в сосудах, но не в клетках мезофилла листьев. ¬ наших экспериментах активность GUS была обнаружена в клетках мезофилла листьев трансгенных растений, несущих химерный ген mas2'-uidA. ћногие представленные нами результаты также коррелируют с результатами Leung et al. касательно экспрессии промотора mas2' в различных ткан€х трансгенных растений табака. ќднако Leung et al. не отметили активность GUS в сосудистых клетках стеблей при использовании их конструкций.
 омбинирование гетерологичных активирующих последовательностей ocs или mas с активирующими последовательност€ми mas или ocs с промотором сильно повышало уровень активности GUS во всех исследованных ткан€х табака. Ёти данные показывают, что повышенна€ экспресси€ химерных регул€торных участков обусловлена совместным синергическим взаимодействием, а не аддитивными эффектами между положительными регул€торными элементами, которые наход€тс€ в химерных регул€торных участках.
ѕример 6
»спользование химерных регул€торных участков в индуцибельной экспрессии.
ƒругой аспект изобретени€ относитс€ к комбинаци€м промотора с расположенной против хода транскрипции активирующей последовательностью, индуцируемым повреждени€ми или вредител€ми. ќдна из полученных комбинаций (AmasPmas) предпочтительно экспрессируетс€ в ткан€х корней и индуцируетс€ патогеном, тогда как друга€ (AocsAmasPmas) экспрессируетс€ более генерализованно, но индуцируетс€ вредител€ми. Ёти экспрессирующие системы примен€ют дл€ генов с направленностью на вредителей корней, например нематод и грибы, они могут быть использованы против вредных насекомых и иных патогенов листьев.
’имерные регул€торные участки были сконструированы с использованием €дра участка промотора маннопин-синтазы с делецией до -138. Ётот промотор был слит с кодирующей последовательностью GUS и терминирован сигналами полиаденилировани€ нопалин-синтазы (NOS). —м. фиг. 7, конструкци€ 1.
UAS от -318 до -138 промотора маннопин-синтазы использовали в сочетании с €дром промотора маннопин-синтазы дл€ создани€ конструкции 2 фиг. 7.  онструкции 5 и 6 фиг. 7 содержат тример UAS из гена октопин-синтазы от -333 до -116 в обеих ориентаци€х. Ёти конструкции были введены в табак с помощью A. tumefaciens. јктивность GUS определ€ли в листь€х, стебл€х и корн€х большого числа отдельных трансгенных растений. јктивность промотора mas и активирующей последовательности (фиг. 7 конструкци€ 2) сильнее в корн€х и значительно слабее в листь€х и стебл€х. ¬ведение активирующей последовательности ocs к активирующей последовательности mas и промотору (фиг. 7 конструкции и 6) повышали активность GUS в 10 раз в корн€х и в 50 - 100 раз в стебл€х и листь€х по сравнению с конструкцией 2. ќриентаци€ активирующей последовательности ocs эффекта не оказывала.
»ндуцибельность повреждени€ми промотора mas с активирующей последовательностью возрастает до 30 раз в листь€х, 17 раз в стебл€х и до 3 раз в корн€х трансгенных растений табака.
ƒл€ проверки индуцибельности различных химерных регул€торных участков патогенами отдельные трансгенные растени€, содержащие конструкции 1, 2, 5 и 6, инфицировали нематодами, а затем проводили мониторинг индукции активности GUS. „тобы удостоверитьс€ в отсутствии эндогенной экспрессии активности GUS в нематодах, были проанализированы очищенные препараты развитых €иц нематод. Ѕыли использованы нематоды Meloidogyne incognita расы 3, выделенные из корней томатов. «релые €йца получали, помеща€ зараженные корни в 10% раствор хлорокса на 4 мин при посто€нном перемешивании. «атем раствор отмывали через €чеистое сито 200 дл€ удалени€ корневого дебриса, а €йца собирали на €чеистом сите 500. яйца промывали и подсчитывали с использованием ”стройства дл€ подсчета нематод Nematode Counting Slide (Olympic Equine Products). ¬ качестве контрол€ дл€ определени€ эндогенной активности GUS у нематод €йца анализировали при pH 5,5 и 7,5. јктивность GUS при pH 5,5 обусловлена эндогенной экспрессией животных форм гена, котора€ дает фоновую активность. јктивность GUS при pH 7,5 обусловлена бактериальной экспрессией гена. јктивность GUS в зрелых €йцах нематод была минимальной при указанных значени€х pH (фиг. 8). “аким образом, Meloidogyne incognita не несла бактериальной и животной активности GUS, которые могли бы создать проблемы фоновой активности в анализах с использованием €иц нематод.
“рансгенные растени€ были инфицированы 10000 очищенных €иц нематод и выращены на песчаной почве в тепличных услови€х в течение нескольких мес€цев. Ѕыли собраны корни зрелых растений, в которых визуально определили места нематодной инфекции по образованию корневых узелков, содержащих нематод и кладки €иц, тогда как неинфицированные места имели нормальный вид. Ёти корневые узелки использовали дл€ измерени€ активности GUS в инфицированных участках, а нормальные участки корней использовали в качестве контрол€. »нфицированные и неинфицированные корни сравнивали у одного и того же растени€, поэтому результаты не зависели от положени€ растени€ и вариаций экспрессии гена в различных растени€х. »ндукци€ активности GUS была определена в конструкции 1 с использованием растени€ номер 7 (1-7) при pH 5,5 и 7,5 (фиг. 9, панель ј).
”ровни экспрессии были низкими в сравнении с трансгенными растени€ми, несущими конструкции 2, 5, 6. Ёто указывает на то, что один промотор Pmas экспрессирует только базовый уровень активности и не индуцируетс€ инфекцией нематод.
 огда промотор Pmas содержит активирующую последовательность mas, Amas (конструкци€ 2), экспресси€ активности GUS высока€ и индуцируетс€ нематодной инфекцией (фиг. 9, панель Ѕ). ¬ведение UAS промотора ocs (Aocs) дает подобную индукцию при нематодной инфекции (фиг. 9, панель ¬). ќдно растение (5-5) не про€вл€ло индуцибельную экспрессию. Ёто объ€сн€етс€ возрастом ткани корн€ или инсерцией гена в место на хромосоме, которое вызывало изменени€ в экспрессии, поскольку другой трансформант (5-2) давал реакцию индукции.
Ёти результаты демонстрируют, что патоген индуцирует химерные регул€торные участки с помощью промотора маннопин-синтазы с активирующими последовательност€ми mas или ocs. Ёти участки могут быть использованы дл€ экспрессии генов нематоцидных токсинов или гормональных соединений, которые нарушают питание и размножение нематод. Ќапример, р€д токсинов из Bacillus thuringiensis (токсины Bt) эффективны в отношении нематод. —м. Adang et al., Plant Molec. Biol. 21: 1131-45 (1993). јминокислотные последовательности этих токсинов и нуклеотидные последовательности кодирующих их генов представлены в ѕатентах —Ўј N 5281530 и 5322932, публикации PCT WO 92/04453 и ≈вропейской патентной публикации 0517367 A1.
ѕрименение этих индуцибельных регул€торных участков не ограничиваетс€ применением против нематод. Ёти участки могут быть равно эффективными против иных патогенов, вызывающих повреждени€.
ѕример 7
’имерные регул€торные участки, контролирующие экспрессию инсектицидных токсинов.
ѕредставленные в насто€щем изобретении химерные регул€торные участки могут быть использованы дл€ контрол€ экспрессии инсектицидных токсинов в трансгенных растени€х. ¬ качестве предпочтительного применени€ токсины Bt могут быть помещены под контроль представленных регул€торных участков.
— целью повышени€ уровней экспрессии в трансгенных растени€х были разработаны модифицированные гены, кодирующие токсины Bt. Perlak et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 88: 3324-28 (1991) предложил модификации гена CryIA дл€ замены последовательностей, которые не работают в растени€х. Ёти модификации повышают уровень активного токсина CryIA. јналогично Adang et al., supra предложили модификации гена cryIIIA дл€ улучшени€ экспрессии. ƒругие гены семейства токсина Bt также могут быть подвергнуты модификаци€м и использованы с насто€щим изобретением. ¬озможно также применение генов, св€занных с гиперчувствительной реакцией. —м. Keen, supra. Ќасто€щее изобретение не ограничено никаким специфичным типом токсина или соединени€. »нсектицидные токсины или соединени€ любого типа, кодируемые генами или образуемые ферментами или иными веществами, кодируемыми генами, могут быть использованы с насто€щим изобретением.
ѕример 8
’имерные регул€торные участки, контролирующие экспрессию генов устойчивости к гербицидам.
ѕредложенные в насто€щем изобретении химерные регул€торные участки могут быть использованы дл€ экспрессии в трансгенных растени€х генов, несущих устойчивость к гербицинам. Ёта устойчивость определ€етс€ трем€ первичными подходами: (i) св€занна€ с растени€ми детоксикаци€ гербицидов, (ii) повышенна€ экспресси€ мишеней гербицидов и (iii) мутаци€ сайтов св€зывани€ гербицидов. —м. Schulz et al., Crit. Rev. Plant Sci. 9: 1-15 (1990). Ћюбой из описанных подходов может быть использован с насто€щим изобретением, хот€ первые два подхода более соответствуют ему.
»звестно несколько ферментов-детоксификаторов многих обычно примен€емых гербицидов. Ќапример, глутатион-S-трансферазы обусловливают устойчивость к s-триазиновым и хлорацетамидным гербицидам. —м. например Schulz et al., supra; Shah et al., Plant Molec. Biol. 6:203-11 (1986); Weigand et al., Plant Molec. Biol. 7: 235-43 (1986). ‘осфинотрицин был инактивирован с помощью гена из Streptomyces hygroscopicus. De Block et al., EMBO J. 6: 2513-18 (1987); Thompson et al., EMBO J. 6: 2519-23 (1987). Ѕыло показано, что гены нитрилазы детоксифицируют бромоксинил. Stalker et al., Science 242: 419-23 (1988). ќстальные детоксифицирующие ферменты также могут быть использованы с насто€щим изобретением.
ƒругой подход к первичной устойчивости основан на повышенной экспрессии мишеней гербицида. Ќапример, глиофосфат €вл€етс€ конкурентным ингибитором 5-енол-пирувилшикимат-3-фосфат-синтазы (EPSP-синтазы). ”стойчивость к глиофосфату преодолеваетс€ повышенной экспрессией EPSP-синтазы, которую получают при использовании сильных конститутивных промоторов насто€щего изобретени€ дл€ контрол€ экспрессии последовательностей EPSP-синтазы. ƒополнительно множественные копии последовательностей EPSP-синтазы с промоторами, предложенными в насто€щем изобретении, могут быть помещены в трансгенные растени€ дл€ получени€ еще более высоких уровней экспрессии. »звестны последовательности, кодирующие EPSP-синтазу из различных источников. —м. Duncan et al. , FEBS Lett. 170: 59 (1984); Stalker et al., J. Biol. Chem. 260: 4724-28 (1985); Shah et al., Science 233: 478-81 (1986).
», наконец, изменение сайта св€зывани€ гербицида также может быть использовано дл€ получени€ устойчивости к гербицидам. Stalker et al. и Shah et al. показали, что изменение аминокислот в EPSP-синтазе может определ€ть устойчивость к глиофосфату. јналогично, изменение в синтазе ацетогидроксикислот может обусловливать устойчивость к сульфанилмочевинам и имидазолинонам. —м. Schulz et al., supra и Wek et al., Nucl. Acid. Res. 13: 3995-4010 (1985).
ѕример 9
’имерные регул€торные участки, контролирующие экспрессию генов устойчивости к вирусам.
”стойчивость к вирусам в растени€х может быть обусловлена экспрессией вирусных генов или антисмысловых последовательностей вирусных генов. ѕервичными подходами дл€ получени€ устойчивости к вирусам €вл€ютс€: (i) устойчивость, св€занна€ с белками, обычно белками оболочки и (ii) устойчивость, св€занна€ с антисмысловой –Ќ . Beachy et al., Annu. Rev. Phytopathol. 28: 451-74 (1990) предложили обзор обоих указанных подходов. “рансгенные растени€, экспрессирующие белок оболочки вируса, имеют большую устойчивость к вирусам, чем растени€, содержащие антисмысловую –Ќ . Beachy et al., supra; Cuozzo et al., Bio/technology 6: 549-57 (1988).
–егул€торные участки, описанные в насто€щем изобретении, могут быть использованы дл€ экспрессии любого гена, определ€ющего устойчивость трансгенных растений к вирусам. Ќапример, известны аминокислотные последовательности многих белков оболочки вирусов растений, что позвол€ет определить их нуклеотидные последовательности. ƒополнительно известны нуклеотидные последовательности генов, кодирующих белки оболочки вирусов, что позвол€ет осуществить синтез точных последовательностей антисмысловых –Ќ . ¬озможна экспресси€ этих последовательностей в трансгенных растени€х с целью получени€ устойчивости.
Cuozzo et al., supra предложили последовательности белка оболочки вируса мозаики огурца. Ѕыли сконструированы трансгенные растени€, содержащие иные вирусные последовательности, например Anderson et al. , Phytopath. 79: 1284-90 предложили трансгенные растени€, которые экспрессируют белки оболочки вируса табачной мозаики и вируса мозаики люцерны. Hemenway et al., EMBO J. 7: 1273-80 (1988) предложили трансгенные растени€, которые экспрессируют белок оболочки и антисмысловую –Ќ  вируса X картофел€. Huisman et al., J. Gen. Biol. 69: 1789-98 (1988) описали последовательность этого вируса. Gerlach et al. , Nature 328: 802-05 (1987) представили трансгенные растени€, которые экспрессируют сателлитную –Ќ  вируса кольцевой п€тнистости табака. Ёта сателлитна€ –Ќ  ослабл€ет симптомы кольцевой п€тнистости. Eggenberger et al. , J. Gen. Virol. 70: 1853-60 представили последовательность из вируса мозаики сои. ќднако применение насто€щего изобретени€ не ограничено определенными типами вирусов. ѕоследовательность из любого типа вируса может быть использована с насто€щим изобретением.
—ледует отметить, что описание, примеры, фиг. 1 - 9 и данные, представл€ющие предпочтительное использование, даны как иллюстраци€ и в качестве примеров, а не дл€ ограничени€ насто€щего изобретени€. –азличные изменени€ и модификации в рамках изобретени€ станут очевидными исследователю из приведенных дискуссии и открыти€.
‘ормула изобретени€: 1. ’имерный регул€торный участок дл€ экспрессии генов в растени€х, отличающийс€ тем, что содержит расположенную против хода транскрипции активирующую последовательность, выделенную из гена октопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens и оперативно св€занную с промотором, выделенным из гена маннопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens.
2.  ластер дл€ экспрессии гена, отличающийс€ тем, что содержит ген, оперативно св€занный с химерным регул€торным участком, содержащим расположенную против хода транскрипции активирующую последовательность, полученную из гена октопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens и оперативно св€занную с промотором, полученным из гена маннопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens.
3.  ластер по п.2, отличающийс€ тем, что содержит сигнал полиаденилировани€ нопалин-синтазы.
4. ’имерный регул€торный участок дл€ экспрессии генов у растений, отличающийс€ тем, что содержит, по меньшей мере, две расположенные против хода транскрипции активирующие последовательности гена опин-синтазы Agrobacterium tumefaciens, в котором, по меньшей мере, один из расположенных против хода транскрипции активирующих элементов выделен из иного, чем промотор, гена опин-синтазы.
5. ’имерный регул€торный участок по п.4, отличающийс€ тем, что расположенные против хода транскрипции активирующие последовательности выделены из разных генов опин-синтазы Agrobacterium tumefaciens.
6. ’имерный регул€торный участок по п.4, отличающийс€ тем, что расположенные против хода транскрипции активирующие последовательности выделены из тех же генов опин-синтазы Agrobacterium tumefaciens.
7. ’имерный регул€торный участок по п.4, отличающийс€ тем, что одна из расположенных против хода транскрипции последовательностей и промотор получены из одного гена опин-синтазы Agrobacterium tumefaciens.
8.  ластер дл€ экспрессии гена, отличающийс€ тем, что содержит ген, оперативно св€занный с химерным регул€торным участком, содержащим не менее двух расположенных против хода транскрипции активирующих последовательностей, полученных из генов опин-синтазы Agrobacterium tumefaciens и оперативно св€занных с промотором, полученным из гена опин-синтазы Agrobacterium tumefaciens, в котором, по меньшей мере, один из расположенных против хода транскрипции активирующих элементов выделен из гена опин-синтазы, иного, чем промотор.
9.  ластер по п. 8, отличающийс€ тем, что расположенные против хода транскрипции активирующие последовательности получены из разных генов опин-синтазы Agrobacterium tumefaciens.
10.  ластер по п.8, отличающийс€ тем, что одна из расположенных против хода транскрипции активирующих последовательностей и промотор получены из одного гена опин-синтазы Agrobacterium tumefaciens.
11.  ластер по п. 8, отличающийс€ тем, что расположенные против хода транскрипции активирующие последовательности получены из одних и тех же генов опин-синтазы Agrobacterium tumefaciens.
12.  ластер по п.8, отличающийс€ тем, что содержит сигнал полиаденилировани€ нопалин-синтазы.
13.  ластер дл€ индуцибельной экспрессии чужеродного гена, отличающийс€ тем, что содержит чужеродный ген, оперативно св€занный с регул€торным участком, содержащим промотор, полученный из гена маннопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens путем делеции нуклеотида в положении -138, и расположенную против хода транскрипции активирующую последовательность, полученную из гена маннопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens.
14.  ластер по п.13, отличающийс€ тем, что содержит сигнал полиаденилировани€ нопалин-синтазы.
15.  ластер дл€ индуцибельной экспрессии чужеродного гена, отличающийс€ тем, что содержит чужеродный ген, оперативно св€занный с регул€торным участком, содержащим промотор, полученный из гена маннопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens, расположенную против хода транскрипции активирующую последовательность, полученную из гена маннопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens, и расположенную против хода транскрипции активирующую последовательность, полученную из гена октопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens.
16. —пособ экспрессии гена в растении, отличающийс€ тем, что включает св€зывание гена с химерным регул€торным участком, содержащим расположенную против хода транскрипции активирующую последовательность, полученную из гена октопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens и оперативно св€занную с промотором, полученным из гена маннопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens, инсерцию гена и химерного регул€торного участка в растение, последующую экспрессию гена в растении.
17. —пособ экспрессии гена в растении, отличающийс€ тем, что включает св€зывание гена с химерным регул€торным участком, содержащим не менее двух расположенных против хода транскрипции активирующих последовательностей, полученных из гена опин-синтазы Agrobacterium tumefaciens, оперативно св€занного с промотором, полученным из гена опин-синтазы Agrobacterium tumefaciens, в котором, по меньшей мере, один из расположенных против хода транскрипции активирующих элементов выделен из гена опин-синтазы, иного, чем промотор, инсерцию гена и химерного регул€торного участка в растение, последующую экспрессию гена в растении.
18. —пособ по п.17, отличающийс€ тем, что расположенные против хода транскрипции активирующие последовательности выделены из разных генов опин-синтазы Agrobacterium tumefaciens.
19. —пособ по п. 17, отличающийс€ тем, что расположенные против хода транскрипции последовательности получены из одних и тех же генов Agrobacterium tumefaciens.
20. —пособ по п.17, отличающийс€ тем, что одна из расположенных против хода транскрипции активирующих последовательностей и промотор получены из одного гена опин-синтазы Agrobacterium tumefaciens.
21. —пособ индуцибельной экспрессии чужеродного гена в растении, отличающийс€ тем, что включает св€зывание чужеродного гена с регул€торным участком, содержащим промотор, полученный из гена маннопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens путем делеции нуклеотида в положении -138, и расположенную против хода транскрипции активирующую последовательность из гена маннопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens, инсерцию чужеродных гена и регул€торного участка в растение, индукцию экспрессии чужеродного гена.
22. —пособ по п.21, отличающийс€ тем, что индукци€ вызываетс€ воздействием насекомых или нематод на растение.
23. —пособ индуцибельной экспрессии чужеродного гена в растении, отличающийс€ тем, что включает св€зывание чужеродного гена с регул€торным участком, содержащим промотор, полученный из гена маннопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens, расположенную против хода транскрипции активирующую последовательность, полученную из гена маннопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens, и расположенную против хода транскрипции активирующую последовательность, полученную из гена октопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens, инсерцию чужеродного гена и регул€торного участка в растение, индукцию экспрессии чужеродного гена.
24. ѕлазмида, отличающа€с€ тем, что содержит химерный регул€торный участок по п.1.
25. ѕлазмида, отличающа€с€ тем, что содержит химерный регул€торный участок по п.4.
26. ѕлазмида, отличающа€с€ тем, что содержит кластер по п.2.
27. ѕлазмида, отличающа€с€ тем, что содержит кластер по п.8.
28. ’имерный регул€торный участок дл€ экспрессии генов у растений, отличающийс€ тем, что содержит не менее трех расположенных против хода транскрипции активирующих последовательностей, полученных из гена октопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens, оперативно св€занных с промотором, полученным из гена маннопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens.
29. ’имерный регул€торный участок дл€ экспрессии генов у растений, отличающийс€ тем, что содержит не менее трех расположенных против хода транскрипции активирующих последовательностей, полученных из гена октопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens, оперативно св€занных с расположенной против хода транскрипции активирующей последовательностью, полученной из гена маннопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens, котора€ оперативно св€зана с промотором, полученным из гена маннопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens.
30.  ластер дл€ экспрессии гена, отличающийс€ тем, что содержит ген, оперативно св€занный с химерным регул€торным участком, содержащим не менее трех расположенных против хода транскрипции активирующих последовательностей, полученных из генов октопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens, оперативно св€занных с промотором, полученным из гена маннопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens.
31. —пособ экспрессии гена в растении, отличающийс€ тем, что включает св€зывание гена с химерным регул€торным участком, содержащим не менее трех расположенных против хода транскрипции активирующих последовательностей, полученных из гена октопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens, оперативно св€занных с промотором, полученным из гена маннопин-синтазы Agrobacterium tumefaciens, инсерцию гена и химерного регул€торного участка в растение, осуществление экспрессии гена в растении.
32. ѕлазмида, отличающа€с€ тем, что содержит кластер по п. 30.