Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
СТАНОЛОВАЯ КОМПОЗИЦИЯ И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ
СТАНОЛОВАЯ КОМПОЗИЦИЯ И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ

СТАНОЛОВАЯ КОМПОЗИЦИЯ И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Изобретение относится к медицине. Изобретение характеризуется тем, что станоловая композиция, содержащая в дополнение к главному компоненту ситостанолу по меньшей мере 10% кампестанола, при введении в съедобные продукты эффективно понижает уровень холестерола в сыворотке крови. В этерифицированном виде композиция особенно полезна в съедобных жирах и маслах и в жиросодержащих продуктах питания. 3 с. и 5 з.п. ф-лы, 4 табл.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2172629
Класс(ы) патента: A61K7/00, A61K31/575, A23D7/015
Номер заявки: 99105132/14
Дата подачи заявки: 02.09.1996
Дата публикации: 27.08.2001
Заявитель(и): РАЙСИО БЕНЕКОЛ ЛТД. (FI)
Автор(ы): ВЕСТЕР Ингмар (FI); ПАЛМУ Тапио (FI); МИЕТТИНЕН Тату (FI); ГИЛЛИНГ Хелена (FI)
Патентообладатель(и): РАЙСИО БЕНЕКОЛ ЛТД. (FI)
Описание изобретения: Настоящее изобретение относится к композиции растительных станолов, содержащей ситостанол и специально предназначенной для применения в качестве препарата, понижающего уровень холестерола в сыворотке крови. Изобретение относится также к соответствующей этерифицированной форме такой композиции, которая обладает преимуществами при применении в съедобных маслах и жирах, а также в жиросодержащих продуктах питания. Изобретение относится также к способу получения пищевых препаратов с использованием данной композиции.
Уровень техники
Растительные стеролы являются существенными компонентами всех растений. Их функции в растениях сходны с функциями холестерола у млекопитающих. Наиболее распространенными растительными стеролами для флоры являются β-ситостерол, кампестерол и стигмастерол. Химическая структура этих растительных стеролов очень похожа на структуру холестерола с различиями в боковой цепи скелета молекулы. Например, по сравнению с холестеролом боковые цепи ситостерола и кампестерола содержат дополнительно соответственно этиловую и метиловую группы.
С 1950-х годов было известно, что растительные стеролы эффективно понижают уровни холестерола в сыворотке крови. Даже при введении относительно небольших доз (несколько граммов в день) они эффективно понижают способность к поглощению как билиарного, так и диетического холестерола, уменьшая таким образом уровни суммарного и LDL-холестерола в сыворотке крови (12, 28, см. также 27, 32). Механизм, по которому происходит ограничение поглощения холестерола, до сих пор в деталях неизвестен, но допускается, что растительные стеролы вытесняют холестерол из мицеллярной фазы и, таким образом, предотвращают его поглощение. Практически во всех ранних исследованиях основным изучаемым растительным стеролом был ситостерол или его гидрогенизованная форма ситостанол. Однако стероловая композиция испытуемых препаратов не всегда была хорошо продокументирована, и примененные в большинстве исследований стероловые препараты содержали также различные количества других стеролов.
Растительные стеролы рассматривались как безопасный способ понижения уровня холестерола в сыворотке крови, поскольку они являются натуральными компонентами овощных жиров и масел. Кроме того, их поглощение из кишечника здорового субъекта ограничено, и ограниченные поглощенные количества экскрегируются из тела в желчь. Степень поглощения растительных стеролов колеблется от субъекта к субъекту и различается в зависимости от вида растительного стерола, но для здоровых людей из пищеварительного тракта обычно поглощается менее 5% растительных стеролов (27). Однако, было показано (20), что диетический кампестерол поглощается в количестве до 10%.
При некоторых редких болезнях, таких как ситостеролемия, растительные стеролы поглощаются исключительно эффективно, к тому же нарушается выведение их из тела по билиарному маршруту. В сыворотке крови уровни ситостерола, кампестерола, а также их насыщенных форм, т.е. ситостанола и кампестанола, резко повышаются. Повышенные уровни насыщенных станолов имеют место скорее из-за их более эффективного эндогенного синтеза, а не из-за более эффективного поглощения (10, 27). При отсутствии лечения ситостеролемия уже в юном возрасте приводит к ксантоматозу и коронарной болезни сердца. Для людей с этой болезнью введение ненасыщенных растительных стеролов в количествах, превышающих обычное содержание в пищевых продуктах, может привести к вредным для здоровья эффектам.
Lees и Lees (25) испытывали воздействие трех различных ситостероловых препаратов на концентрации липидов и липопротеинов в плазме. Одним из этих препаратов был Cytellin, промышленный препарат (Eli Lilly Co., США), содержащий 60-65% ситостерола и 35-40% других стеролов, преимущественно кампестерола. Средняя доза 18 г/день, разделенная на три дозы, приводила к понижению суммарного холестерола в плазме в среднем на 10,5% и к понижению LDL-холестерола на 15%. Однако если обычно в плазме обнаруживаются только следы растительных стеролов, включающих кампестерол (10, 33), у субъектов, участвовавших в испытаниях, проведенных Lees и Lees, концентрация кампестеролов в плазме колебалась от 4 до 21 мг/дл. При обсуждении результатов авторы очень решительно утверждают, что поскольку атерогенность кампестерола неизвестна, применение ситостеролового препарата с относительно высоким содержанием кампестерола, такого как использованный в их исследовании препарат Cytellin, не может быть рекомендовано.
В дальнейшем Lees с соавт. (26) изучали эффективность растительных стеролов из масла, полученного из соевых бобов, и таллового масла для понижения уровня холестерола в крови. Для каждого растительного стерола они применяли две различные физические формы, а именно суспензию и порошок. Соевый стерол состоял из 60- 65% ситостерола и 35% кампестерола, и ежедневная средняя доза 18 г стеролов в день (интервал доз 9-24 г) выдавалась тремя равными дозами. В этом исследовании применялся препарат стерола из таллового масла, содержащий только приблизительно 5% кампестерола. Для обоих стероловых препаратов из таллового масла (порошок и суспензия) испытывалась ежедневная доза 3 г. Кроме того, испытывалась доза 6 г суспензии стерола из таллового масла.
Соевый стерол в обоих физических формах и стерол из таллового масла в форме порошка понижали содержание холестерола в плазме в среднем на 12% (26). Однако уже показанная ранее относительно высокая способность кампестерола к поглощению наблюдалась также и в этом исследовании. У пяти испытанных пациентов уровни кампестерола в плазме находились в интервале от 5 до 21 мг/дл (в среднем 16 мг/дл). Опять-таки, даже для случая доказанного значительного эффекта понижения холестерола соевым стеролом авторы не рекомендуют его применение в качестве реагента, понижающего холестерол. Напротив, они рекомендуют, чтобы фармацевтические препараты растительных стеролов содержали минимум кампестерола и максимум ситостерола. На основании двух вышеописанных исследований можно заключить, что применение стеролов на основе овощных масел, таких как соевый стерол, решительно не может быть рекомендовано.
Насыщенные растительные стеролы, такие как ситостанол и кампестанол, присутствуют в большинстве овощных масел только в виде следов. Однако стеролы из таллового масла содержат 10-15% ситостанола, насыщенной формы ситостерола. Ситостанол может быть получен также гидрогенизацией двойной связи в ситостероле. В последующих исследованиях, проведенных как на экспериментальных животных, так и на людях, было показано, что в качестве реагента, понижающего холестерол, ситостанол более эффективен, чем ситостерол (8, 16, 17, 18, 19, 36).
Дополнительным преимуществом ситостанола является то, что он фактически не поглощается. Несколько исследований (например, 9, 16, 17, 21) показали, что ситостанол практически не способен поглощаться, в то время как небольшие количества (< 5%) ненасыщенной формы ситостерола (33) могут быть поглощены. Сходным образом в исследовании in vitro Amstrong и Carey (6) также показали, что холестанол, насыщенная форма холестерола, был более гидрофобным и менее способным к поглощению, чем холестерол.
При получении ситостанола гидрогенизацией большинства обычных источников растительных стеролов из кампестерола формируется также другой насыщенный растительный стерол, а именно кампестанол. До недавнего времени про способность к поглощению и возможный гипохолестеролемический эффект этого станола было известно относительно немного. На основании вышеуказанных данных, утверждающих, что насыщенные стеролы имеют меньшую способность к поглощению, чем их ненасыщенные формы, можно было бы в порядке гипотезы заключить, что кампестанол может быть фактически не способным к поглощению.
С целью изучения способности различных растительных стеролов к поглощению Heinemann с соавт. (20) с использованием техники перфузии кишечника сравнили поглощение холестерола в кишечнике человека с аналогичным эффектом для кампестерола, ситостерола, стигмастерола, а также для низких концентраций ситостанола и кампестанола. Результаты показали, что степень поглощения различных растительных стеролов изменялась в группе различных растительных стеролов, составляя в среднем 4,2% для ситостерола, 4,8% для стигмастерола, 9,6% для кампестерола и 12,5% для кампестанола. Для десяти подопытных мужчин были выявлены большие вариации эффективности поглощения.
Таким образом, согласно данным Heinemann с соавт. (20) было показано, что кампестанол поглощался более эффективно, чем его ненасыщенная форма - кампестерол. Это противоречит допущению, основанному на вышеуказанных исследованиях, которые показали, что насыщенные стеролы (ситостанол, холестанол) должны обладать меньшей способностью к поглощению, чем ненасыщенные (ситостерол, холестерол). Причина этого остается невыясненной, хотя Heinemann с соавт. (20) выдвинули предположение, что причина такого противоречивого результата может заключаться в том, что, во-первых, исследование Amstrong и Carey (6) проводилось в условиях in vitro и, во-вторых, теория гидрофобности как главного фактора в мицеллярном связывании и/или поглощении не может быть применена в условиях in vivo. Однако это предположение не объясняет того факта, что несколько исследований, показавших для ситостанола более низкую способность к поглощению по сравнению с этим параметром для ситостерола, проводились в условиях in vivo. Таким образом, результаты Heinemann с соавт. (20), противоречащие предыдущим результатам, остаются авторами необъясненными.
Sugano с соавт. (34) изучали гипохолестеролемическую активность кукурузных стеролов (состав: 31% кампестерола, 4% стигмастерола и 65% ситостерола) и кукурузных станолов (состав: 31% кампестанола и 69% ситостанола), полученных гидрогенизацией смеси стеролов из кукурузного масла. Были проведены два эксперимента на крысах. При приеме холестерола внутрь (1% диета) как стерол, так и станол показали гипохолестеролемические эффекты при уровне 0,5-1% диеты. В первом эксперименте существенного различия в гипохолестеролемическом эффекте фитостеролов и фитостанолов не наблюдалось. Однако во втором эксперименте при таких же диетических уровнях фитостанолы по сравнению с фитостеролами показали значительно большую способность к понижению концентрации холестерола в плазме (статистически значимую при p < 0,02). Более того, крысы, питавшиеся по 1,0% станоловой диете, имели существенно более низкие уровни холестерола в плазме (p < 0,02), чем животные, питавшиеся по диете, свободной от холестерола. Этот эффект не наблюдался для крыс, питавшихся по 1,0% стероловой диете.
Sugano с соавт. (34) не исследовали различие гипохолестеролемического эффекта между смесями станолов с высоким содержанием ситостанола и низким содержанием кампестанола (на основе стерола из таллового масла) и смесями станолов с существенно более высоким уровнем кампестанола (на основе стерола из овощного масла). Они сравнивали гипохолестеролемический эффект смеси ненасыщенных стеролов и соответствующей смеси насыщенных станолов. Более поздние исследования, проведенные этой исследовательской группой, были сфокусированы на эффекте понижения холестерола с помощью ситостанола как самом по себе, так и в сравнении с данными по ситостеролу (21, 22, 23, 35). Фактически в более поздней публикации (23) они ссылаются на вышеуказанное исследование фитостанола (34), только упоминая гипохолестеролемический эффект β-ситостанола в сравнении с данными по β-ситостеролу без обсуждения какого-либо гипохолестеролемического эффекта насыщенных стеролов (включая кампестанол) в сравнении с данными по ненасыщенным стеролам. В более поздних исследованиях применялись вышеуказанные смеси стеролов с типичной композицией гидрогенизованных стеролов из таллового масла с высоким содержанием ситостанола (> 90%).
Miettinen и Vanhanen (30) показали, что для понижения уровня холестерола в сыворотке крови ситостанол в форме эфира жирной кислоты более эффективен, чем свободный ситостанол. Более поздние исследования показали также, что применение эфиров ситостанола в качестве компонента ежедневной диеты является эффективным способом понижения концентраций суммарного холестерола и LDL-холестерола в сыворотке крови (13, 14, 15, 31, 37, 38). Преимущество применения эфиров станола вместо свободного станола заключается также в том, что эфиры станола растворимы в жирах и поэтому могут быть легко введены в широкий ряд продуктов питания без изменения вкуса, запаха или физического поведения конечного продукта. Способ приготовления эфиров, образованных ситостанолом и жирными кислотами, и применение растворимых в жирах эфиров станолов в продуктах питания были описаны в патенте США N 5502045 (2), включенном в данное описание посредством ссылки на него.
Straub (3) предложил применение насыщенных станолов (ситостанол, клионастанол, 22,23-дигидробрассикастанол, кампестанол и их смеси) в способе приготовления композиции пищевых добавок, в котором станолы смешивают со съедобным растворяющим реагентом, эффективным количеством подходящего противоокислителя и эффективным количеством подходящего диспергатора. Эти пищевые добавки предназначены для понижения поглощения холестерола из продуктов питания и напитков, содержащих холестерол, например из мяса, яиц и молочных продуктов. Однако в этом патенте не приведены данные, показывающие, имеют ли место какие-либо клинические эффекты или поглощение диетических стеролов.
Eugster с соавт. (1) описывают применение небольших количеств стеролов, их эфиров жирных кислот и глюкозидов для лечения опухолей. Способы приготовления, предложенные Eugster с соавт., включают вредные химические реагенты, такие как N,N'-карбонилдиимидазол, тионилхлорид, и растворители, такие как тетрагидрофуран, бензол, хлороформ или диметилформамид. Eugster с соавт. комментируют возможное применение этих препаратов в качестве диетических продуктов питания и пищевых добавок, но не приводят каких-либо данных о гипохолестеролемических эффектах и не формулируют каких-либо предложений по поводу такого применения. Из описания Eugster с соавт. трудно получить четкую картину того, как очистить конечный продукт с получением достаточно чистого эфира стерола в количествах, достаточно больших для применения в качестве пищевого компонента. Единственными предлагаемыми процессами очистки являются тонкослойная хроматография и высокоэффективная жидкостная хроматография. Во всяком случае способ приготовления, предлагаемый в патенте Eugster с соавт., ограничен только небольшими количествами.
Патент США N 3751569 (4) описывает добавление эфиров, образованных растительными стеролами и жирными кислотами, к кулинарному маслу с целью понижения уровня холестерола в сыворотке крови человека. Для применения в этерификации свободных стеролов патент предлагает способ, который не во всех отношениях удовлетворяет требованию, налагаемому на приготовление продукта пищевого ряда. Согласно патенту этерификация происходит между свободным стеролом и ангидридом жирной кислоты в присутствии перхлорной кислоты, действующей как катализатор. Применяемые катализатор и реагент не могут быть допущены для участия в пищевых процессах. Кроме того, патент относится к эфирам, образованным жирными кислотами и только природными растительными стеролами. Способ, предлагаемый в патенте Германии N 2248921 (5) для этерификации стеролов, присутствующих в маслах и жирах, путем технологии химической этерификации удовлетворяет критериям, прилагаемым к пищевым процессам. В этом патенте свободный стерол и избыток эфиров жирных кислот добавляют к смеси масла или жира, после чего всю жировую смесь интерэтерифицируют с помощью обычной известной технологии интерэтерификации. В результате жировая смесь фактически всех свободных стеролов конвертировалась в эфиры жирных кислот. Целью этой операции является защита свободных стеролов в овощных и животных маслах от возможных изменений в течение процесса.
Более ранние данные показывают, что кампестерол, один из основных растительных стеролов, поглощается относительно эффективно. Поэтому к применению были рекомендованы смеси только растительных стеролов с минимальным содержанием кампестерола. На практике это приводит к применению смесей стеролов, таких как стеролы из таллового масла, с высоким содержанием ситостерола.
Большинство работ по станолам касалось только ситостанола. Исследование Heinemann с соавт. (20), показывающее, что кампестанол, насыщенная форма кампестерола, поглощается легче, чем кампестерол или ситостерол (соответственно 12,5, 9,6 и 4,2%), привело к "консенсусу" по поводу того, что смеси насыщенных стеролов с "повышенными" уровнями кампестанола из-за поглощения кампестанола небезопасны. Очевидным доказательством этого является тот факт, что все клинические исследования, касающиеся применения станолов (ситостанол) основывались на смесях стеролов с высоким уровнем ситостанола и низким уровнем кампестанола.
Многими исследованиями (например, 8, 17, 18, 19, 23, 36) установлен факт более высокой эффективности ситостанола, насыщенной формы ситостерола, по сравнению с соответствующим ненасыщенным ситостеролом, в понижении уровня холестерола в крови. Более того, насыщенные стеролы поглощаются в очень ограниченных количествах, что делает применение насыщенных стеролов безопасным средством понижения холестерола в масштабах популяции. Из всех ненасыщенных стеролов в особенности кампестерол поглощается в количествах, в высокой степени достаточных для того, чтобы сформулировать рекомендации против применения смесей стеролов с повышенными уровнями кампестерола (например, смесей стеролов на основе овощных масел) (25, 26).
Согласно сказанному существовало сильное предубеждение против применения кампестанола в любых существенных количествах в качестве препарата, добавляемого к продуктам питания, и это серьезно ограничивало спектр сырьевых материалов, содержащих фитостерол, соединениями с относительно небольшим количеством кампестерола и его насыщенной формы, кампестанола.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к композициям растительных станолов, в качестве основного компонента содержащим ситостанол, но вместе с тем и существенные количества кампестанола, в свободной форме или этерифицированные в эфиры жирных кислот, и предназначенным для понижения уровня холестерола в сыворотке крови. Изобретение относится также к применению смеси фитостеролов, включающей в добавление к ситостеролу существенное количество кампестерола, в качестве сырьевого материала для получения данной композиции.
Кроме того, изобретение относится к пищевым препаратам и к способу получения этих препаратов на основе станоловых композиций, в качестве основного компонента содержащих ситостанол, но вместе с тем и существенные количества кампестанола, или их эфиры жирных кислот, в съедобных продуктах в виде диетического компонента, предназначенного для понижения уровня холестерола в сыворотке крови.
Задача, решаемая настоящим изобретением, заключается в расширении ряда растительных сырьевых материалов, пригодных для приготовления препаратов для съедобных продуктов, в особенности съедобных масел и жиров, а также жиросодержащих продуктов питания, и предназначенных для регулирования уровня холестерола в сыворотке крови. Изобретение позволяет применять в качестве сырьевых материалов для этих целей растительные масла и жиры, содержащие в добавление к ситостеролу также существенное количество кампестерола.
Пригодными сырьевыми материалами для применения при приготовлении композиций настоящего изобретения являются, например, кукуруза, соевые бобы и рапс, но могут применяться также и другие растительные вещества с фитостероловой композицией с высоким содержанием кампестерола.
Новая композиция по настоящему изобретению, в особенности ее этерифицированная форма, может быть введена в пищевые вещества, такие как кулинарные масла, маргарины, масло, майонез, салатные гарниры, добавляемые в тесто жиры, сыры (включая несозревший и созревший сыры) и другие жиросодержащие продукты питания.
Композицию согласно настоящему изобретению можно также употреблять и саму по себе.
Согласно настоящему изобретению композиция растительных станолов, в добавление к своему основному компоненту ситостанолу, содержит также существенное количество, по меньшей мере 10%, кампестанола.
Композиция предпочтительно содержит кампестанол (от 20 до 40%, наиболее предпочтительно от 25 до 35%, например около 30%) или его эфир жирной кислоты в том случае, когда композиция для придания ей липофильности подвергалась этерификации.
В настоящем описании все проценты приведены в виде процентов по весу за исключением особо оговоренных случаев, а номера в скобках относятся к публикациям, помещенным в приложенном списке ссылок.
Полученные данные, необычные и противоречащие существующему мнению, показывают, что гидрогенизованная смесь станолов, содержащая в качестве основного компонента ситостанол, но вместе с тем и существенные количества кампестанола, по меньшей мере так же эффективна, как смесь станолов, содержащая больше 90% ситостанола и низкий уровень кампестанола, указывая тем самым на то, что кампестанол по меньшей мере так же эффективен в понижении поглощения холестерола, как и ситостанол. Более того, данные анализа стерола в сыворотке крови четко показывают, что кампестанол остается фактически непоглощенным, при этом его содержание в сыворотке крови приблизительно на 40% меньше, чем содержание ситостанола. Таким образом, смесь станолов, содержащую в качестве основного компонента ситостанол, а также заметные количества кампестанола, следует считать по меньшей мере такой же безопасной, как и обычную смесь станолов на основе талловых стеролов. Эти данные находятся в резком противоречии с распространенным мнением относительно эффективности и безопасности смесей станолов с повышенными количествами кампестанола (см. 20, 27, 34).
В патенте США N 5502045 (2) показано, что эфиры, образованные ситостанолом и жирными кислотами, более эффективны в понижении уровня холестерола в крови, чем свободный ситостанол. Последующие исследования четко подтвердили эффект понижения холестерола для маргарина, содержащего растворимые в жирах эфиры, образованные ситостанолом и жирными кислотами (см., например, 31).
Применение эфиров, образованных станолами и жирными кислотами, вместо свободных станолов, критично для их широкого применения в различных жиросодержащих пищевых продуктах, т.к. только эфиры, образованные станолами и жирными кислотами, растворимы в съедобных маслах и жирах в количествах, достаточно больших для достижения уровней, эффективных в понижении поглощения как диетического, так и билиарного холестерола из пищеварительного тракта.
Растворимость станоловых эфиров в съедобных маслах и жирах достигает 35-40%, в то время как растворимость свободных стеролов в этих объектах ограничена только максимумом 2% по весу при температуре 21oC (24). Более высокие количества можно было бы ввести путем применения различных сурфактантов и реагентов растворяющего или диспергирующего типа, однако применение таких веществ не обеспечивает растворимости в жирах. Применение вышеуказанных препаратов обычно ограничивается или даже запрещается законом. Кроме того, свободные стеролы при уровне 1% будут воздействовать на физическое поведение продукта. Ситуация здесь отличается от случая применения эфиров, образованных станолами и жирными кислотами, т.к. физические свойства жировых смесей могут быть легко модифицированы изменением композиции жирных кислот смеси.
Очевидно, что эфиры, образованные станолами и жирными кислотами, могут быть легко введены и в другие продукты питания, отличные от маргарина и прочих пастообразных продуктов, описанных в этом изобретении. В патенте США N 5502045 (2) приводятся другие примеры возможного применения. Для специалистов в этой области, однако, очевидно, что эфиры, образованные станолами и жирными кислотами, могут быть добавлены в широкий ряд различных продуктов питания, в особенности, жиросодержащих продуктов питания.
Предлагалось много способов получения жирнокислотных эфиров стеролов. Недостатками этих способов является то, что почти все они применяют реагенты, которые не могут быть допущены в производство продукта, предназначенного для использования в качестве макропитательного компонента в продуктах питания. Обычным делом является применение таких токсичных реагентов, как тионилхлорид или ангидридные производные жирных кислот.
Предпочтительный способ получения станоловых жирнокислотных эфиров на основе стеролов описан в патенте США N 5502045 (2, включен в данное описание посредством ссылки на него). Этот способ имеет в своей основе процесс интерэтерификации, широко применявшийся в производстве съедобных жиров и масел. От предыдущих способов этот процесс этерификации отличается тем преимуществом, что не применяет никаких препаратов кроме свободного станола, эфира жирной кислоты или смеси эфиров жирных кислот и катализатора интерэтерификации типа этилата натрия. Одной из важных особенностей способа является то обстоятельство, что один из реагентов, а именно эфир жирной кислоты, применяется в избытке и функционирует как растворитель, растворяющий станол при используемых условиях (вакуум 5-15 мм Hg). Реакция производит смесь эфиров жирных кислот и эфиров, образованных станолами и жирными кислотами. Эфир, образованный станолом и жирной кислотой, может быть легко сконцентрирован в почти чистую консистенцию путем вакуумной дистилляции, удаляющей избыток эфиров жирных кислот. В порядке альтернативы смесь сама по себе может быть добавлена к конечной жировой смеси до проведения стадии дезодорации.
В небольших количествах станолы найдены в природе, например, в пшенице, ржи, кукурузе и тритикале и, таким образом, в небольших количествах их можно найти (11, 14) в ежедневной пище. Станолы могут быть легко получены гидрогенизацией смесей природных стеролов. На начало 1996 г. в коммерческой продаже имелись только смеси талловых стеролов с достаточно высокой чистотой (содержание стерола > 98%), предназначенные сами по себе для пищевого применения. Растительные стеролы с существенными количествами кампестерола, такие как смеси стеролов на основе овощных масел, могут быть получены, например, как побочный продукт при получении токоферолов из дистиллятов овощных масел. Полученные растительные стеролы могут быть конвертированы в станолы с помощью уже известных технологий гидрогенизации, таких как технологии на основе применения Pd/C-катализатора в органических растворителях (публикация 7, введенная в данное описание посредством ссылки на нее). Для специалистов в этой области очевидно, что широкое разнообразие Pd-катализаторов и растворителей может быть использовано для осуществления гидрогенизации, которая при проведении в оптимальных условиях оставляет неконвертируемыми только небольшие количества ненасыщенных стеролов, в то время как формирование типичных дегидроксилированных побочных продуктов станолов и стеролов остается на низком уровне (< 1,5%).
В рамках настоящего изобретения сравнивается гипохолестеролемический эффект смеси станолов, содержащей высокий уровень ситостанола, обычно считающегося экспертами в этой области самым безопасным и наиболее эффективным растительным стеролом с точки зрения понижения поглощения холестерола и, посредством этого, уровня холестерола в сыворотке крови, с аналогичным эффектом смеси станолов, содержащей существенное количество кампестанола. В настоящем описании впервые сообщается о гипохолестеролемических воздействиях станолов на основе овощного масла на людей. В настоящем описании впервые показано, что смесь станолов с существенным количеством кампестанола (выше 10%, предпочтительно около 30%) по меньшей мере так же эффективна, как смеси станолов с высокими уровнями ситостанола. Более того, результаты настоящего исследования четко указывают на то, что кампестанол, вопреки данным, сообщенным Heinemann с соавт. (20), фактически не поглощается.
Клинические исследования
Для изучения гипохолестеролемических воздействий маргаринов с эфирами станолов на основе овощного и таллового масел было предпринято 5-недельное перекрестное исследование по двойному слепому методу с 2-недельным периодом промывания. Испытательная схема исследования была следующей.
Испытательная схема исследования воздействия.
Номерами 1-6 обозначены образцы крови, собранные при домашнем питании (1, 2), после первого периода воздействия (3, 4) и после второго периода воздействия (5, 6). OC - маргарин с эфиром станола на основе овощного масла, TC - маргарин с эфиром станола на основе таллового масла.

Двадцать четыре добровольца, неработающие здоровые женщины с умеренно повышенным уровнем холестерола (в среднем 6,12 ± 0,16 ммоль/л) принимали приблизительно 25 г в день (250-граммовая туба/10 дней) проходящего испытания маргарина как части ежедневной диеты в случайном порядке. Липиды сыворотки крови (суммарный холестерол, LDL-холестерол, HDL-холестерол и триглицериды) и содержания стеролов в сыворотке крови измеряли при домашнем питании и в конце каждого периода испытания. Образцы крови брались дважды, после одной недели при домашнем питании и в конце каждого периода испытания маргарина. Полученные значения липидов в сыворотке крови представлены в таблице 1.
Для обоих прошедших испытание маргаринов были обнаружены положительные изменения в липидах сыворотки крови. Понижение значений для LDL-холестерола и повышение значений для HDL-холестерола были статистически значимыми (на уровне p < 0,05 или менее). Кроме того, для эфира стерола на основе овощного масла при статистической обработке результатов также было показано понижение суммарного холестерола. Полученное понижение суммарного холестерола и LDL-холестерола было выше для маргарина с эфиром станола на основе овощного масла по сравнению с маргарином с эфиром станола на основе таллового масла. Для уровней триглицеридов изменений не получено. Результаты, полученные для липидов сыворотки крови, показывают, что маргарин с эфиром станола на основе овощного масла, содержащий в своей станоловой фракции существенное количество кампестанола, может быть даже более эффективным, чем маргарин с эфиром станола на основе таллового масла. Маргарин с эфиром станола на основе таллового масла в более ранних исследованиях (14, 15, 31) показал эффективные гипохолестеролемические воздействия. Таким образом, на основании перекрестной схемы настоящего исследования можно заключить, что станолы на основе овощного масла показывают по меньшей мере такие же гипохолестеролемические воздействия, что и станолы на основе таллового масла.
Концентрации стеролов в сыворотке крови были количественно определены путем газожидкостной хроматографии согласно опубликованному ранее методу (публикация 29, включенная в настоящее описание посредством ссылки на нее). Были рассчитаны средние значения результатов двух измерений липидов в сыворотке крови из образцов крови, взятых на каждом периоде. В таблицах 2 и 3 представлены данные по средним концентрациям растительных стеролов в сыворотке крови при домашней диете и после каждого испытательного периода, а также усредненные изменения, наблюдаемые в этих концентрациях.
Оба прошедших испытание маргарина заметно понижали уровни кампестерола и ситостерола в сыворотке крови. Известно, что у людей концентрация кампестерола в сыворотке крови соотносится с поглощением холестерола в кишечнике (29, 39). Таким образом, чем ниже значение холестерола, тем ниже поглощаемое процентное отношение холестерола в кишечнике.
Заметное падение уровней кампестерола в сыворотке крови (25 - 28%) в процессе периодов исследования указывает, что оба маргарина с эфирами станолов уменьшают поглощение холестерола в кишечнике. Более того, не удалось обнаружить какого-либо различия концентрации ситостанола в сыворотке крови, в то время как средняя концентрация кампестанола в сыворотке крови после периода воздействия эфира станола на основе овощного масла была значительно выше, чем при домашней диете и после периода воздействия эфира станола на основе таллового масла. Однако абсолютная концентрация кампестанола составляла только приблизительно 63% от концентрации ситостанола, который обычно считают фактически нерастворимым веществом. Такая низкая концентрация кампестанола в сыворотке крови четко указывает на очень ограниченный характер поглощения кампестанола, что находится в противоречии с результатами, представленными Heinemann с соавт. (20). Таким образом, поскольку смеси станолов, содержащие высокие уровни ситостанола, считаются безопасными для людей при приеме внутрь, смеси станолов, содержащие существенные количества кампестанола, должны считаться такими же безопасными на основании того факта, что кампестанол подобно ситостанолу фактически не обладает способностью к поглощению.
В приведенных ниже рабочих примерах детально описывается приготовление композиции эфиров станолов согласно изобретению и маргаринов, примененных в вышеуказанных клинических исследованиях.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Пример 1. Гидрогенизация смесей стеролов.
Серийно выпускаемую смесь стеролов, полученную из дистиллята овощного масла (состав: брассикастерол 2,7%, кампестерол 26,7%, стигмастерол 18,4%, ситостерол 49,1% и ситостанол 2,9%), гидрогенизовали в пилотном реакторе (25 I). В реактор поместили 26 г волокнистого Pd-катализатора (Smop-20; содержание Pd 10% по весу, Smoptech, Финляндия), 26 г дистиллированной воды для активации катализатора и 11,7 кг пропанола. Реактор заполнили азотом и провели активацию катализатора под газообразным водородом при давлении 1 бар и температуре 65oC в течение 30 мин. После активации смесь охладили до 40oC, после чего добавили 1,3 кг смеси стеролов.
Смесь пропанола и стеролов нагрели от температуры азотной атмосферы до 65oC, после чего азот заместили водородом. После того, как произошло полное заполнение водородом, была проведена реакция гидрогенизации при давлении водорода 1 кгс/см2. Время нормального превращения составляет приблизительно 120 мин. Превращение может быть легко проконтролировано отбором доз, которые анализируют с помощью ВЭЖХ.
Давление водорода сбросили и реактор заполнили азотом. Волокнистый катализатор отфильтровали при давлении азота. Смесь пропанола и станолов оставили выкристаллизовываться в течение ночи при 10oC, после чего кристаллы станолов отфильтровали вакуумным способом и остаток промыли в 0,5 кг холодного пропанола. Полученную смесь станолов высушили при 60oC в вакуумном сушильном шкафу. Выход составил 75%, а композиция полученной смеси станолов по данным капиллярного ГХ-анализа была следующей: кампестерол 0,2%, кампестанол 28,9%, стигмастерол 0,1%, ситостерол 0,2%, ситостанол 70,1%. Следует отметить, что брассикастерол гидрогенизуется в 24β-метилхолестанол, эпимер кампестанола, однако, т.к. в операциях обычной капиллярной газовой хроматографии он проявляется в виде такого же пика, который согласно хиральности невозможно разделить, он обычно рассчитывается как кампестанол. Если исходить из первичной смеси стеролов, содержание 24β-метилхолестанола составило бы 2,7%.
Пример 2. Приготовление эфиров, образованных станолами и жирными кислотами.
Смесь эфиров, образованных станолами и жирными кислотами, приготовили в пилотной установке. 6 кг станолов, полученных в результате комбинации нескольких партий, обработанных согласно описанной в примере 1 процедуре гидрогенизации, сушили в течение ночи при 60oC и этерифицировали с 8,6 кг смеси метилированных эфиров, образованных низшей эруковой кислотой на основе рапсового масла. Применялась следующая стероловая композиция смесей станолов: кампестерол 0,4%, кампестанол (+ 24β--метилхолестанол) 29,7%, стигмастерол 0,1%, ситостерол 0,4% и ситостанол 68,0%. Содержание станолов в смеси составляло 98,2%. Этерификацию проводили следующим образом.
Смесь станолов и метилированного эфира, образованного низшей жирной эруковой кислотой на основе рапсового масла, выдержали в нагретом состоянии в реакционном сосуде при 90-120oC под вакуумом 5-15 мм Hg. После высушивания в течение 1 часа добавили 21 г этилата Na и реакцию продолжали в течение приблизительно 2 часов. Добавлением воды (30% по весу) при 90oC был разрушен катализатор. После фазового разделения водную фазу удалили и провели второе промывание. После разделения водной фазы маслообразную фазу высушили вакуумным способом при 95oC с перемешиванием со скоростью 200 об/мин. Смесь эфиров, образованных станолами и жирными кислотами, слегка отбелили в течение 20 минут при 30 мм Hg и температуре 110oC с помощью отбеливающей земли (1,0%) (Tonsil Optimum FF, фирма Sudchemie, Германия) при перемешивании со скоростью 200 об/мин. Отбеливающую землю отфильтровали, и полученная смесь метилированных эфиров жирных кислот и эфиров, образованных станолами и жирными кислотами, может быть добавлена сама по себе к жировым смесям до стадии дезодорации или избыток метилированных эфиров может быть дистиллирован под вакуумом. Соответственно, смесь может быть дезодорирована с получением не имеющей вкуса смеси эфиров, образованных станолами и жирными кислотами, которая сама по себе может быть добавлена к различным процессам производства продуктов питания.
Конверсия процесса этерификации составляет обычно > 99%, по данным быстрой ВЭЖХ, а выход составляет около 95%.
Пример 3. Производство маргаринов для клинических исследований.
80% маргаринов с эфирами, образованными станолами на основе таллового масла и жирными кислотами, а также эфирами, образованными станолами на основе овощного масла и жирными кислотами, были получены на пилотной установке (перфекторе) Gerstenberg & Agger 3 х 57. Эфиры, образованные станолами на основе таллового масла и жирными кислотами, были получены из обычной маргариновой продукции Benecol® фирмы Raision Margarini, Финляндия. Применялась нормальная транс-смесь жиров, свободных от жирных кислот (состав: 30% негидрогенизованного интерэтерифицированного овощного жира и 70% жидкого масла LEAR), к которой добавили смеси эфиров, образованных станолами и жирными кислотами. Планировалось получить содержание станолов в конечном продукте 12 г/100 г продукта, что обеспечивало бы ежедневный прием 3 г станолов при уровне употребления 25 г/день. Продукты были получены согласно следующему рецепту:
Смесь жиров, включающая эфиры, образованные станолами и жирными кислотами - 80%
Вода - 19%
Соль - 0,5%
Эмульгатор, Dimodan BP
Бикарбонат Na и лимонная кислота в качестве реагентов,
регулирующих pH
β-Каротин в качестве реагента-красителя
Вкусовые добавки
Полученные маргарины были упакованы в полипропеновые тубы весом 250 г, защищенные алюминиевой фольгой. Вкус и плотность продуктов были эквивалентны аналогичным параметрам промышленных маргаринов.
Содержание станолов составляло 12,7 г/100 г продукта для маргарина со станолом на основе талового масла и 12,6 г/100 г продукта для маргарина со станолом на основе овощного масла. Стероловая композиция двух продуктов приведена в таблице 4.
Источники информации
1. Eugster C. , Eugster C., Haldemann W., Rivara G. Стеролы, их эфиры жирных кислот и глюкозиды; способы их приготовления; самопроизвольно диспергирующиеся реагенты, содержащие эти соединения, и их применение для лечения опухолей. 1993. Патент США N 5270041.
2. Miettinen T. A. , Vanhanen H., Wester I. Применение эфиров, образованных станолами и жирными кислотами, для понижения уровня холестерола в сыворотке крови. 1996. Патент США N 5502045.
3. Straub C.D. Станолы для понижения поглощения холестерола из продуктов питания и способы их приготовления и применения. 1993. Патент США N 5244887.
4. Стерильное приготовление и салатные масла, имеющие гипохолестеролемические свойства. 1973. Патент США N 3751569.
5. Baltes J., Merkle R. Способ получения смесей из растительных и животных масел, например жиров и эфиров жирных кислот. Патент Германии N 2248921.
6. Amstrong M. J., Carey M.C. Термодинамические и молекулярные факторы растворимостей стеролов в мицеллах желчных солей. J. Lipid Res. 1987; 28: 1144-1155.
7. Augustine R.L, Reardon Jr. E.J. 1969. Палладий, катализирующий гидрогенизацию холестерола. Org. Prep. and Proced. 1969; 1: 107-109.
8. Becker M., Staab D., von Bergmann К. Лечение острой семейной гиперхолестеролемии в детском возрасте ситостеролом и ситостанолом. J. pediatr. 1993; 122: 292-296.
9. Czubayko F., Beumers В., Lammsfuss S., Lutjohann D., von Bergmann K. Упрощенный микроспособ количественного анализа фекальной экскреции нейтральных и кислых стеролов для амбулаторных исследований людей. J. Lipid Res. 1991; 32: 1861-1867.
10. Dayaj B., Tnt G.S., Batta A.K., Speck J., Khachadurian A.K., Schefer S., Salen G. Идентификация 5α-станолов у пациентов с ситостеролемией и ксантоматозом: стереохимия протонирования стероидных органоборанов. Steroids 1982; 40:233-243.
11. Dutta P. C., Appelqvist L.A. Насыщенные стеролы (станолы) в негидрогенизованных и гидрогенизованных съедобных овощных маслах и в липидах зерновых растений. J. Sci. Food Agric. 1996; 71: 383-391.
12. Grundy S. M. , Mok H.Y.I. Воздействия низких доз фитостеролов на поглощение холестерола в человеке. In: Greten Н. (Ed.). Метаболизм липопротеинов. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, 1976: 112-118.
13. Gylling Н. , Miettinen T.A. Холестерол сыворотки крови, понижаемый диетическим ситостанолом, соотносится с пониженным поглощением и синтезом холестерола и уменьшением транспорта LDL апопротеина В у людей с диабетом типа II. In: Gotto Jr. А.М., Mancini М., Richter W.O., Schwandt P. (Eds.). Лечение острой дислипопротеинемии в предотвращении коронарной болезни сердца. 4th Int. Symp. Munich 1992, Karger, Basel, 1993:57-59.
14. Gylling H., Miettinen T.A. Холестерол сыворотки крови и метаболизм холестерола и липопротеинов у пациентов с гиперхолестеролемией типа NIDDM до и в процессе курса лечения маргарином с ситостаноловым эфиром. Diabetologia 1994; 37: 773-780.
15. Gylling H. , Siimes M.A., Miettinen T.A. Маргарин с ситостаноловым эфиром в диэтическом лечении детей с семейной гиперхолестеролемией. J. Lipid Res. 1995; 36: 1807-1812.
16. Hassan A. S. , Rampone A.J. Поглощение в кишечнике и лимфатический транспорт холестерола и β-ситостанола у крыс. J. Lipid Res. 1979; 20: 646-653.
17. Heinemann T., Leiss O., von Bergmann К. Воздействие низких доз ситостанола на холестерол сыворотки крови у пациентов с гиперхолестеролемией. Atherosclerosis 1986; 61: 219-223,
18. Heinemann Т. , Pietruck В., Kullak-Ublick G., von Bergmann K. Сопоставление воздействия ситостерола и ситостанола на ингибирование поглощения холестерола в кишечнике. Agents Actions (Suppl) 1988; 26:117-122.
19. Heinemann T., Kullak-Ublick G.-A., Pietruck В., von Bergmann К. Механизмы воздействия растительных стеролов на ингибирование поглощения холестерола. Eur. J. Clin. Pharmacol. 1991; 40: 59-63.
20. Heinemann T., Axtmann G., von Bergmann К. Сопоставление поглощения холестерола и различных растительных стеролов в кишечнике человека. Eur. J. Clin. Invest. 1993; 23: 827-831.
21. Ikeda I., Sugano М. Сопоставление поглощения и метаболизма β ситостерола и β-ситостанола у крыс. Atherosclerosis 1978; 30: 227-237.
22. Ikeda I., Tanabe Y., Sugano М. Воздействия ситостерола и ситостанола на мицеллярную растворимость холестерола. J. Nutr. Sci. Vitaminol 1989; 35: 361-369.
23. Ikeda I. , Kawasaki A., Samezima К., Sugano M. Антигиперхолестеролемическая активность β -ситостанола у кроликов. J. Nutr. Sci. Vitaminol 1981; 27: 243-251.
24. Jandacek R. J., Webb M.R., Mattson F.H. Воздействие водной фазы на растворимость холестерола в маслообразной фазе. J. Lipid. Res. 1977; 18: 203-210.
25. Lees R. S. , Lees А.М. Воздействия ситостероловой терапии на концентрации липидов и липопротеинов в плазме. In: Greten Н. (Ed.). Метаболизм липопротеинов. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, 1976:119-124.
26. Lees А.М., Mok H.Y.I., Lees R.S., McCluskey M.A., Grundy S.M. Растительные стеролы в качестве реагентов, понижающих холестерол: клинические испытания на пациентах с гиперхолестеролемией и исследования баланса стеролов. Atherosclerosis 1977; 28: 325-338.
27. Ling W.H., Jones P.J.H. Краткий обзор диетических фитостеролов: обзор метаболизма, преимуществ и побочных эффектов. Life Sciences 1995; 57: 195-206.
28. Mattson F.H., Grundy S.M., Grouse J.R. Оптимизация воздействия растительных стеролов на поглощение холестерола у человека. Am. J. Clin. Nutr, 1982; 35: 697-700.
29. Miettinen T.A., Koivisto P. Нехолестерольные стеролы и образование желчной кислоты у страдающих гиперхолестеролемией пациентов с идеальным шунтированием. In: Paumgarter G., Stiehl A., Gerok W. (Eds.). Желчная кислота и ее концентрация у здоровых и больных. МТР Press, Boston 1983:183-187.
30. Miettinen T.A., Vanhanen Н. Диэтический ситостанол в связи с поглощением, синтезом и уровнем холестерола в сыворотке крови в различных фенотипах аполипротеина Е. Aterosclerosis 1994; 105: 217-226.
31. Mettinen T.A., Puska P., Gylling H., Vanhanen H., Vartiainen Е. Понижение холестерола в сыворотке крови ситостанол- эфирным маргарином у людей с средней гиперхолестеролемией. New Engl, J. Med. 1995; 333: 1308-1312.
32. Pollak O. J. Воздействие растительных стеролов на липиды сыворотки крови и атеросклероз. Pharmac. Ther. 1985; 35: 177-208.
33. Salen G., Ahrens Jr. E.H., Grundy S.M. Метаболизм β -ситостерола у человека. J. Clin. Invest. 1970; 49: 952-967. J. Nutr. Sci. Vitaminol 1981; 27: 243-251.
34. Sugano M., Kamo P., Ikeda I., Morioka H. Липидопонижающая активность фитостанолов у крыс. Atherosclerosis 1976; 24: 301-309.
35. Sugano M. , Morioka H., Ikeda I. Сопоставление гипохолестеролемической активности β-ситостерола и β-ситостанола у крыс. J. Nutr. 1977; 107: 2011-2019.
36. Vanhanen H.T., Miettinen T.A. Воздействия ненасыщенных и насыщенных диэтических растительных стеролов на их содержания в сыворотке крови. Clin. Chim. Acta 1992; 205: 97-107.
37. Vanhanen H.T., Blomqvist S., Enholm C., Hyvonen M., Jauhiainen M., Torstila I., Miettinen T.A. Холестерол сыворотки крови, предшественники холестерола и растительные стеролы в субъектах с гиперхолестеролемией с различными апоЕ-фенотипами в процессе диетического лечения эфиром ситостанола. J. Lipid Res. 1993; 34: 1535-1544.
38. Vanhanen H.T., Kajander J., Lehtovirta H., Miettinen T.A. Уровни в сыворотке крови, эффективность поглощения, фекальная элиминация и синтез холестерола в процессе увеличения доз диэтических эфиров ситостанола у субъектов с гиперхолестеролемией. Clin. Sci. 1994; 87: 61-67.
39. Tilvis R.S., Miettinen T.A. Растительные стеролы сыворотки крови и их связь с поглощением холестерола. Am. J. Clin. Nutr. 1986;43: 92-97.
Формула изобретения: 1. Композиция эфиров, образованных растительными станолами и жирными кислотами, предназначенная для применения в качестве препарата, понижающего уровни холестерола в сыворотке крови, включающая в качестве основного компонента эфир, образованный ситостанолом и жирной кислотой, и содержащая, по меньшей мере, 10% эфира, образованного кампестанолом и жирной кислотой.
2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что она содержит от 20 до 40% эфира, образованного кампестанолом и жирной кислотой.
3. Композиция по п.2, отличающаяся тем, что она содержит от 25 до 35% эфира, образованного кампестанолом и жирной кислотой.
4. Композиция по п.3, отличающаяся тем, что она содержит около 30% эфира, образованного кампестанолом и жирной кислотой.
5. Композиция по любому из пп.1 - 4, отличающаяся тем, что она содержит от 50 до 80% эфира, образованного ситостанолом и жирной кислотой.
6. Способ получения пищевого препарата путем добавления к продуктам питания, например к жиросодержащим продуктам, компонента диеты для понижения уровня холестерола в сыворотке крови, отличающийся тем, что в качестве указанного компонента используют композицию по любому из пп.1 - 5.
7. Пищевой продукт, содержащий эффективную в понижении уровня холестерола в сыворотке крови композицию эфиров, образованных растительными станолами и жирными кислотами, которая содержит эфир, образованный ситостанолом и жирной кислотой, и дополнительно содержит эфир, образованный кампестанолом и жирной кислотой, при весовом отношении эфира кампестанола к эфиру ситостанола от 1:9 до 4:6.
8. Пищевой препарат по п.7, отличающийся тем, что указанное весовое отношение составляет от 2:8 до 3,5:6,5.