Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности к способам получения антигена вируса лейкоза (ВЛКРС) для серологической диагностики болезни. Способ состоит в 2-5-кратном разделении концентрата бессывороточной культуральной жидкости линии клеток, продуцирующих вирус лейкоза крупного рогатого скота, в двухфазной системе. Способ позволяет получать более специфичный и стабильный антиген ВЛКРС и увеличить его выход.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2185854
Класс(ы) патента: A61K39/12, C12N7/02, G01N33/569
Номер заявки: 2001107926/13
Дата подачи заявки: 27.03.2001
Дата публикации: 27.07.2002
Заявитель(и): Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко
Автор(ы): Гулюкин М.И.; Иванова Л.А.; Коромыслов Г.Ф.; Замараева Н.В.
Патентообладатель(и): Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко
Описание изобретения: Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности к способам получения антигена вируса лейкоза (ВЛКРС) для серологической диагностики болезни.
Лейкоз крупного рогатого скота относится к опухолевым заболеваниям вирусной этиологии.
Материалы официальной ветеринарной статистики за последние годы свидетельствуют о повсеместном распространении лейкоза крупного рогатого скота в РФ. В 45 из 75 субъектов РФ уровень инфицирования крупного рогатого скота вирусом лейкоза (ВЛКРС) составляет 10-50%. В предыдущем пятилетии лейкоз вышел на первое место в структуре инфекционной патологии.
Это заболевание наносит существенный ущерб животноводству, складывающийся из гибели животных и утилизации пораженных туш, преждевременной выбраковки скота, недополучения молодняка и молочной продукции, ограничения племпродажи. Особенно ощутимый ущерб наносится племенному генофонду высокопродуктивного скота.
Таким образом, проблема лейкоза крупного рогатого скота остается чрезвычайно актуальной.
Известны способы получения антигена вируса лейкоза с использованием фазовых систем декстран - полиэтиленгликоль(ПЭГ), сульфат декстрана - ПЭГ, сульфат декстрана - поливиниловый спирт, сульфат декстрана - метилцеллюлоза [1].
В задачу наших исследований входило разработать способ получения более специфичного и стабильного препарата антигена, осуществимого в промышленном производстве.
Предложенный способ получения антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота заключается в следующем.
Вируспродуцирующую культуру выращивают на ростовой среде, дополненной 5-20% сыворотки крови животных. По окончании формирования клеточного монослоя ростовую среду собирают и используют для выделения антигена ВЛКРС одним из существующих способов, а выросший монослой переводят на поддерживающую среду, отличающуюся от ростовой отсутствием каких-либо сывороточных добавок. В дальнейшем смену поддерживающей среды проводят 3-4 раза каждые 1-5 дней. Полученную бессывороточную культуральную жидкость осветляют фильтрованием или центрифугированием при 5000-10000 об/мин в течение 20-30 мин, добавляют 10-4 моль/л фенилметилсульфонилфторида и проводят предварительное 50-100-кратное концентрирование культуральной жидкости через мембраны с пределом задержания 15000 Д или обрабатывают без предварительного концентрирования следующим образом.
К антигенсодержащей жидкости добавляют 5-10% ПЭГ 6000 и 0,3-0,5 моль/л NaCl, растворяют при перемешивании, выдерживают в течение 16-24 ч при 4oС, образовавшийся осадок отделяют центрифугированием и ресуспендируют в забуференном фосфатами физиологическом растворе в объеме, равном 0,1-0,001 первоначального. Полученную суспензию подвергают разделению в фазовой системе ПЭГ - K2HРО4. Для этого к антигенсодержащей суспензии добавляют 7,0-7,6% ПЭГ 6000 и 14-16% K2HPO4, растворяют при перемешивании, выдерживают 3-24 часа при 4-20oС для разделения фаз, верхнюю фазу отделяют и центрифугируют при 8000-10000 об/мин в течение 20-30 мин. Осадок и интерфазу ресуспендируют в нижней фазе, добавляют 0,3-0,4 объема 7,0-7,6% водного раствора ПЭГ 6000 и повторяют процедуру фазового разделения в этом режиме 2-4 раза. Верхние фазы объединяют, осветляют центрифугированием в указанном выше режиме и проводят 1-2-кратную обработку следующим образом: смешивают с трехкратным объемом 18-21% водного раствора K2HPO4, оставляют для разделения фаз на 3-24 ч при 4-20oС, отделяют верхнюю фазу. Полученный продукт осветляют центрифугированием и используют в качестве антигена ВЛКРС в серологических реакциях.
Пример 1. Для изготовления 1000 диагностических доз антигена берут 1 л культуральной жидкости, полученной при культивировании вируспродуцирующей культуры на бессывороточной поддерживающей среде, осветляют центрифугированием при 8000 об/мин в течение 30 мин, к супернатанту добавляют 10-4 моль/л фенилметилсульфонилфторида, 0,02% азида натрия, 0,5 моль/л NaCl и 10% ПЭГ 6000, растворяют при перемешивании и оставляют при 4oС на 16 ч. Центрифугируют при 5000 об/мин в течение 30 мин, супернатант отделяют, осадок ресуспендируют в 5 мл фосфатно-солевого буфера и добавляют 7% ПЭГ 6000 и 14,5% K2HPO4, перемешивают до полного растворения, оставляют на 3 ч при oС, отделяют верхнюю фазу от нижней фазы и интерфазы. Центрифугируют верхнюю фазу при 10000 об/мин 20 мин, отделяют супернатант. Полученный осадок объединяют с нижней фазой и интерфазой, добавляют 0,3 объема 7% раствора ПЭГ 6000, перемешивают и оставляют на 2 ч для разделения фаз. Отделяют и осветляют верхнюю фазу. Повторяют фракционирование нижней фазы, интерфазы и осадков, полученных после осветления верхней фазы в том же режиме еще 2 раза. Верхние фазы объединяют, добавляют трехкратный объем 20% раствора К2НРO4, перемешивают, оставляют на 5 ч при 4oС и после разделения фаз отделяют верхнюю фазу, которую после осветления в указанном выше режиме используют в качестве антигена для ИФА. Полученный антиген в рабочем разведении обеспечивает выявление с дискриминирующим показателем P/N: сильноположительной контрольной сыворотки - 35,0, слабоположительной контрольной сыворотки (контроль чувствительности) - не ниже 3,0.
Пример 2. Для изготовления 80000 диагностических доз антигена ВЛКРС 100 л культуральной жидкости, полученной при культивировании антигенпродуцирующей культуры, концентрируют на ультрафильтрационных установках УПВ 6/3 с пределом задержания более 15000 дальтон до объема, равного 0,01 первоначального, добавляют 10-4 моль/л фенилметилсульфонилфторида и 0,02% азида натрия, осветляют центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 мин, добавляют 10% ПЭГ 6000 и 0,5 моль/л NaCl, растворяют при перемешивании и оставляют на 20 ч при 4oС. Отделяют осадок центрифугированием в течение 30 мин при 5000 об/мин, ресуспендируют в минимальном объеме забуференного фосфатами физиологического раствора хлорида натрия, рН 7,2, добавляют 7,6% ПЭГ 6000 и 16% K2HPO4, растворяют при перемешивании, оставляют на 16 ч при 4oС, отделяют верхнюю фазу. Центрифугируют верхнюю фазу при 10000 об/мин 20 мин, отделяют супернатант. Полученный осадок объединяют с нижней фазой, добавляют 0,4 объема 7% раствора ПЭГ 6000, перемешивают и оставляют на 3 ч для разделения фаз. Отделяют и осветляют верхнюю фазу. Нижнюю фазу объединяют с интерфазой и осадком, полученным при осветлении нижней фазы, и подвергают фракционированию в этом же режиме еще 3 раза, отделяя и объединяя верхние фазы. Верхние фазы объединяют, добавляют трехкратный объем 20%-ного водного раствора К2НРO4, перемешивают, оставляют на 16 час при 4oС, после разделения фаз отделяют верхнюю фазу и повторяют процедуру разделения, отделяя верхнюю фазу, которую после осветления в указанном выше режиме и добавления 10-4 моль/л фенилметилсульфонилфторида и 0,02% азида натрия используют в качестве антигена для ИФА. Полученный антиген в рабочем разведении обеспечивает выявление с дискриминирующим показателем P/N: сильноположительной контрольной сыворотки - 30,0, слабоположительной контрольной сыворотки (контроль чувствительности) - не ниже 2,7.
Пример 3. Для изготовления 50000 диагностических доз антигена ВЛКРС 100 л культуральной жидкости, полученной при культивировании антигенпродуцирующей культуры, концентрируют на ультрафильтрационных установках УПВ 6/3 с пределом задержания более 15000 дальтон до объема, равного 0,01 первоначального, добавляют 10-4 моль/л фенилметилсульфонилфторида и 0,02% азида натрия, осветляют центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 мин. К супернатанту добавляют 5% ПЭГ 6000 и 0,5 моль/л NaСl, растворяют при перемешивании, оставляют на 16 ч при 4oС, отделяют образовавшийся осадок центрифугированием при 8000 об/мин в течение 20 мин, ресуспендируют его в минимальном объеме 0,85% раствора NaCl, добавляют 7% ПЭГ 6000 и 14,4% К2НРO4, растворяют при перемешивании, оставляют на 3 ч при 20oС, отделяют верхнюю фазу, центрифугируют при 10000 об/мин 20 мин. Полученный осадок объединяют с нижней фазой и интерфазой, добавляют 0,3 объема 7% раствора ПЭГ 6000, перемешивают и оставляют на 3 ч для разделения фаз. Фракционирование осадков, интерфаз и нижних фаз проводят в этом режиме 3 раза, отделяя и объединяя верхние фазы. Объединенные верхние фазы осветляют центрифугированием в указанном выше режиме и дважды подвергают разделению в фазовой системе: добавляют трехкратный объем 18% К2НРO4, перемешивают, оставляют на 16 ч при 4oС, отделяют верхнюю фазу. После осветления в указанном выше режиме верхнюю фазу второго разделения подвергают лиофильному высушиванию и затем используют в качестве антигена для ИФА. Полученный антиген в рабочем разведении обеспечивает выявление антител к гликопротеидному антигену вируса лейкоза у крупного рогатого скота, овец и кроликов, инокулированных рекомбинантным вирусом осповакцины, экспрессирующим наружный гликопротеид вируса лейкоза, с дискриминирующим показателем P/N не ниже 2,0.
Предложенный способ осуществим в промышленных масштабах, позволяет получить более специфичный и стабильный антиген ВЛКРС и увеличить его выход.
Антиген, полученный предложенным способом, апробирован нами в лабораторных условиях в 1992-1999 гг. при исследовании сывороток крови крупного рогатого скота из молочно-товарных хозяйств, а также в опытах по разработке вакцины против лейкоза крупного рогатого скота на основе покс-вирусного вектора, со встроенным геном env ВЛКРС. Результаты испытаний свидетельствуют о высокой специфичности антигена и наличии в его составе активного наружного гликопротеида ВЛКРС, что позволило эффективно выявлять антитела к антигенам вируса лейкоза в сыворотках крови как инфицированных ВЛКРС, так и инокулированных рекомбинантным вакцинным препаратом животных.
Антиген, полученный предложенным способом, найдет применение в производственных ветеринарных лабораториях и научно-исследовательских учреждениях при проведении серологического мониторинга эпизоотической ситуации и научных исследований при лейкозе крупного рогатого скота.
Источники информация
1. HAMMAR L., MERZA М., MALM К., ERIKSSON S., MOREIN В. The use of aqueous two-phase systems to concentrate and purify bovine leukemia virus outer envelope protein gp51. / Biotechnology and biochemistry. - 1989. - 11. - 296-306.
Формула изобретения: Способ получения антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота, включающий культивирование вируспродуцирующей культуры на ростовой среде с сывороткой крови, смену ростовой среды на поддерживающую, отделение культуральной жидкости с последующим ее концентрированием, отличающийся тем, что после концентрирования антигенсодержащее вещество подвергают 2-5-кратной очистке в фазовой системе, содержащей 7,0-7,6% ПЭГ 6000 и 14-16% К2НРО4, и верхнюю фазу используют в качестве антигена.