Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
ПРЕПАРАТ ПОЛИВАЛЕНТНОГО БАКТЕРИОФАГА ПРОТИВ СИНЕГНОЙНОЙ ПАЛОЧКИ, ШТАММЫ БАКТЕРИОФАГА BACTERIOPHAGUM PSEUDOMONAS AERUGINOSA СПБГМА ИМ. И.И. МЕЧНИКОВА №05, №03, №06 И №07, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ПРИ ПРИГОТОВЛЕНИИ ПОЛИВАЛЕНТНОГО ПРЕПАРАТА ПРОТИВ СИНЕГНОЙНОЙ ПАЛОЧКИ
ПРЕПАРАТ ПОЛИВАЛЕНТНОГО БАКТЕРИОФАГА ПРОТИВ СИНЕГНОЙНОЙ ПАЛОЧКИ, ШТАММЫ БАКТЕРИОФАГА BACTERIOPHAGUM PSEUDOMONAS AERUGINOSA СПБГМА ИМ. И.И. МЕЧНИКОВА №05, №03, №06 И №07, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ПРИ ПРИГОТОВЛЕНИИ ПОЛИВАЛЕНТНОГО ПРЕПАРАТА ПРОТИВ СИНЕГНОЙНОЙ ПАЛОЧКИ

ПРЕПАРАТ ПОЛИВАЛЕНТНОГО БАКТЕРИОФАГА ПРОТИВ СИНЕГНОЙНОЙ ПАЛОЧКИ, ШТАММЫ БАКТЕРИОФАГА BACTERIOPHAGUM PSEUDOMONAS AERUGINOSA СПБГМА ИМ. И.И. МЕЧНИКОВА №05, №03, №06 И №07, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ПРИ ПРИГОТОВЛЕНИИ ПОЛИВАЛЕНТНОГО ПРЕПАРАТА ПРОТИВ СИНЕГНОЙНОЙ ПАЛОЧКИ

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Изобретение относится к области биотехнологии. Выделены 4 бактериофага Bacteriophagum Pseudomonas aeruginosa СПбГМА им. И.И. Мечникова 05, 03, 06 и 07, на основе которых получен препарат Combiphage, содержащий смесь этих бактериофагов в соотношении фаговых частиц: штамм 05 - 10-60%, штамм 03 - 10-60%, штамм 06 - 10-60%, штамм 07 - 10-60%. Использование препарата синегнойного фага Combiphage позволило снизить частоту внутрибольничных заражений гнойно-септическими инфекциями, вызванными синегнойной палочкой, в 4-5 раз. 5 с. и 1 з.п.ф-лы, 1 табл.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2186574
Класс(ы) патента: A61K35/66, A61K35/74, C12N1/20, A61P31/04
Номер заявки: 2001102027/13
Дата подачи заявки: 24.01.2001
Дата публикации: 10.08.2002
Заявитель(и): Яфаев Рауэль Хасанянович; Асланов Батырбек Исмелович; Зуева Людмила Павловна
Автор(ы): Яфаев Р.Х.; Асланов Б.И.; Зуева Л.П.
Патентообладатель(и): Яфаев Рауэль Хасанянович; Асланов Батырбек Исмелович; Зуева Людмила Павловна
Описание изобретения: Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к препаратам медицинского назначения на основе бактериофагов против синегнойной палочки.
К настоящему времени известны различные фаги к Pseudomonas aeruginosa (Р. aeruginosa), используемые как в диагностических целях, гак и для лечения гнойно-воспалительных заболеваний (авт. св. СССР 1472500,1987, кл. С 12 N 7/00). Описанные бактериофаги были выделены из образцов сточных вод.
Однако данные фаги имели неоднородную структуру и представляли собой смесь клонов бактериофагов. Кроме того следует отметить, что при исследовании подобных фагов в лечебных целях возможна их инактивация различными факторами гнойного экссудата (Н.W. Ackermann, M.S. Dubow. 1987. Viruses of Prokariotes. vol. I General properties of bacteriophages. CRC PRESS, Boca Raton, FL P.152).
Известен штамм пилеоспецифического бактериофага P. aeruginosa ГНЦ ПМ 03 ( пат. РФ 2112800, 1998, кл. C 12 N 7/00), проявляющий высокую литическую активность против синегнойной палочки. Штамм может быть использован для поливалентного лечебного препарата, однако штамм не является симбиотическим по отношению к другим штаммам данного препарата, кроме того воздействие его на бактерию весьма ограничено, т.к. пили не являются единственным фактором патогенности бактерий.
Прототипом заявляемого изобретения в отношении объектов "штамм" является штамм бактериофага P. aeruginosa, зарегистрированный в коллекции ГНЦ ПМ 02 (пат. РФ 2113476, 1998, кл.С12 N 7/00). Фаг имеет широкий спектр литического действия по отношению к патогенным штаммам P. aeruginosa, однако оказался недостаточно эффективен для борьбы с госпитальными штаммами синегнойной палочкой, что вызывает необходимость поиска новых штаммов бактериофагов и технологий получения поливалентного препарата против синегнойной палочки, в частности на основе разработки технологии получения симбиотических фаговых препаратов.
В настоящее время для борьбы с патогенными штаммами Р. aeru-ginosa используются, как правило, комплексные препараты-пиобак-териофаги (пат. РФ 2036232, 1995, кл. C 12 N 3/00; пат. РФ 2153534, 1999, кл. C 12 N 7/00). Однако при лечении конкретного заболевания активность препарата снижается из-за сильного разбавления фагов, что делает его мало эффективным против госпитальных штаммов. Кроме того в ряде случаев наличие большого числа посторонних белков, содержащихся в "балластных" для данного случая фагов, может приводить к нежелательным осложнениям, что делает актуальным создание препарата бактериофагов, обладающего селективным воздействием на P. aeruginosa.
Прототипом заявляемого препарата является препарат бактериофага к P. aeruginosa, получаемый выращиванием смеси бактериофагов с литической активностью 10-7-10-8, который затем очищают и смешивают с раствором хинозола, ланолина и касторового масла (пат. РФ 1704462, 1990, кл. C 12 N 7/00). Недостатком данного препарата является относительно невысокая активность и нестабильность состава, обусловленная особенностями его получения.
Задачей, стоявшей перед авторами, являлась создание препарата бактериофага, обладающего повышенным спектром литической активности для борьбы с гнойно-септическими инфекциями, вызванными, в частности, госпитальными штаммами P. aeruginosa.
Указанная задача создания препарата решалась путем отбора ингредиентов предварительным скринингом штаммов бактериофага, отбором штаммов, спектр литической активности которых в отношении госпитальных штаммов коллекции бактерий совпадает на 20-40%, с последующим их раздельным культивированием на культурах микроорганизмов, находящихся на логарифмической стадии роста, и объединением фаговых препаратов в конечный препарат. Более полное совпадение спектра литической активности приводит к появлению конкуренции между фагами, большие различия между фагами не позволяют создать устойчивого препарата.
В результате проведенных исследований было выделено 4 бактериофага, депонированные 29 июня 2000 г. в коллекции бактериофагов кафедры эпидемиологии Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И. Мечникова (СПбГМА им. И.И. Мечникова) под 03, 05, 06 и 07, на базе которых был создан новый препарат, получивший условное наименование Combiphage.
Штамм бактериофага Bacteriophagum Pseudomonas aeruginosa СПбГМА им. И.И. Мечникова 05 (условное наименование Psph-I) был выделен из клинического материала - гнойного отделяемого из раны больного хроническим остеомиелитом бедренной кости. Бактериофаг Psph-I депонирован 29 июня 2000 г. в коллекции бактериофагов кафедры эпидемиологии Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И. Мечникова (СПбГМА им. И.И. Мечникова) под 05.
Бактериофаг характеризуется следующими свойствами:
Морфологические признаки:
Головка гексогональной формы размером 62-68 нм, хвостовой отросток 137-142 нм.
На газоне чувствительных бактериальных культур Р. aeruginosa фаг Psph-I образует прозрачные пятна лизиса диаметром 1.5-2.0 мм. Центр прозрачный, край четкий, вторичный рост отсутствует.
Серологические характеристики.
Фаг не инактивируется антисыворотками, полученными к другим бактериальным вирусам P. aeruginosa из коллекции СПбГМА им. И.И. Мечникова (11 различных форм) Константа инактивации фага гомологической антисывороткой (К) составляет 85 мин-1.
Тип нуклеиновой кислоты штамма фага - ДНК.
Физико-химические свойства фага:
Фаг не инактивируется при нагревании суспензии в течение 40 мин при 55oС. Пределы допустимых значений рН, при которых литическая активность фага не изменяется, составляют 5-11.
Устойчив к хлороформу
Литический спектр бактериальною вируса
Для оценки круга штаммов-хозяев фага была использована коллекция P. aeruginosa из 280 штаммов. Фаг обладает способностью лизировать 65% культур синегнойной палочки (182 штамма P. aeruginosa).
Диапазон специфичности: лизирует P. aeruginosa, не лизирует дизентерийные палочки (шигеллы Зонне, Флекснера), свежевыделенные и музейные штаммы кишечной палочки и другие представители нормальной микрофлоры.
Бактериальные штаммы для поддержания и размножения бактериофага P.aeruginosa штамм Ра-34 и Ра-65
Оптимальные условия размножения:
Условия культивирования. Штамм фага размножается на чувствительной культуре синегнойной палочки Ра-34 на обычных питательных средах (пептонная вода, простой питательный агар) при температуре 37oС, вызывая при этом просветление пептонной воды после 6-часовой инкубации, а на простом питательном агаре образуя прозрачные колонии правильной формы после 16-18- часовой инкубации.
Условия хранения: бактериофаг Psph-I сохраняет литические свойства при хранении при температуре +4oС-+6oС в пептонной воде в течение 1 года.
Периодичность пересевов 1 год.
Способ размножения: при воспроизведении фага в клетке-хозяине продолжительность латентного периода составляет 45-50 мин, урожайность - 75-80 частиц на одну клетку.
Штамм бактериофага Bacteriophagum Pseudomonas aeruginosa СПбГМА им. И.И. Мечникова 03, (условное наименование Psph-G) был выделен из клинического материала - гнойного отделяемого из раны больного хроническим остеомиелитом правой большеберцовой кости. Бактериофаг Psph-G депонирован 29 июня 2000 г. в коллекции бактериофагов кафедры эпидемиологии Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И. Мечникова (СПбГМА им. И.И. Мечникова) под 03.
Бактериофаг характеризуется следующими свойствами:
Морфологические признаки:
Головка гексогональной формы размером 58-65 нм, хвостовой отросток 120-130 нм. На газоне чувствительных бактериальных культур Р. aeruginosa фаг Psph-G образует прозрачные пятна лизиса диаметром 1.5-2.0 мм. Центр прозрачный, край четкий, вторичный рост отсутствует.
Серологические характеристики:
Фаг не инактивируется антисыворотками, полученными к другим бактериальным вирусам P. aeruginosa из коллекции СПбГМА им. И.И. Мечникова (11 различных форм). Константа инактивации фага гомологической антисывороткой (К) составляет 80 мин-1.
Тип нуклеиновой кислоты штамма фага - ДНК.
Физико-химические свойства фага:
Фаг не инактивируется при нагревании суспензии в течение 30 мин при 55oС.
Литическая активность не изменяется в пределах рН 5-9. Устойчив к хлороформу.
Литический спектр бактериального вируса.
Для оценки круга штаммов-хозяев фага была использована коллекция P. aeruginosa из 280 штаммов. Фаг обладает способностью лизировать 46% культур синегнойной палочки (153 штамма P. aeruginosa).
Диапазон специфичности: лизирует P. aeruginosa, не лизирует дизентерийные палочки (шигеллы Зонне, Флекснера), свежевыделенный и музейные штаммы кишечной палочки и другие представители нормальной микрофлоры.
Бактериальные штаммы для поддержания и размножения бактериофага - Р. aeruginosa штаммы Ра-49, Ра-54
Оптимальные условия размножения
Условия культивирования. Штамм фага размножается на чувствительной культуре синегнойной палочки Ра-49 на обычных питательных средах (пептонная вода, простой питательный агар) при температуре 37oС, вызывая при этом просветление пептонной воды после 6-часовой инкубации, а на простом питательном агаре образуя прозрачные колонии правильной формы после 16-18- часовой инкубации.
Условия хранения: бактериофаг сохраняет литические свойства при хранении при температуре +4oС-+6oС в пептонной воде в течение 1 года.
Периодичность пересевов - 1 год.
Способ размножения: при воспроизведении фага в клетке-хозяине продолжительность латентного периода составляет 50-60 мин, урожайность - 60-70 частиц на одну клетку.
Штамм бактериофага Bacteriophagum Pseudomonas aeruginosa СПбГМА им. И.И. Мечникова 06 (условное наименование Psph-M) был выделен из клинического материала - из гнойного отделяемого с поверхности ожоговой раны. Бактериофаг Psph-I депонирован 29 июня 2000 г. в коллекции бактериофагов кафедры эпидемиологии Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И. Мечникова (СПбГМА им. И.И. Мечникова) под 06.
Бактериофаг характеризуется следующими свойствами:
Морфологические признаки:
Головка гексогонапьной формы размером 60-70 нм, хвостовой отросток 135-145 нм. На газоне чувствительных бактериальных культур P. aeruginosa фаг образует прозрачные пятна лизиса диаметром 1.5-2.0 мм. Центр прозрачный, край четкий, вторичный рост отсутствует.
Серологические характеристики:
Фаг не инактивируется антисыворотками, полученными к другим бактериальным вирусам P. aeruginosa из коллекции СПбГМА им. И.И. Мечникова (11 различных форм). Константа инактивации фага гомологической антисывороткой (К) составляет 53 мин-1.
Тип нуклеиновой кислоты штамма фага - ДНК.
Физико-химические свойства фага
Фаг не инактивируется при нагревании суспензии в течение 30 мин при 55oС.
Литическая активность не изменяется в пределах рН 5-9.
Устойчив к хлороформу.
Литический спектр бактериального вируса.
Для оценки круга штаммов-хозяев фага была использована коллекция P. aeruginosa из 205 штаммов. Фаг обладает способностью лизировать 62% культур синегнойной палочки (127 штамма P. aeruginosa).
Диапазон специфичности: лизирует P. aeruginosa, не лизирует дизентерийные палочки (шигеллы Зонне, Флекснера), свежевыделенные и музейные штаммы кишечной палочки и другие представители нормальной микрофлоры.
Бактериальные штаммы для поддержания и размножения бактериофага -P. aeruginosa штаммы Ра-113, Pa-145, Pa-165.
Оптимальные условия размножения
Условия культивирования. Штамм фага размножается на чувствительной культуре синегнойной палочки Ра-113 на обычных питательных средах (пептонная вода, простой питательный агар) при температуре 37oС, вызывая при этом просветление пептонной воды после 6-часовой инкубации, а на простом питательном агаре образуя прозрачные колонии правильной формы после 16-18- часовой инкубации.
Условия хранения: бактериофаг Psph-M сохраняет литические свойства при хранении при температуре +4oС-+6oС в среде в течение 1 года.
Периодичность пересевов 1 год.
Способ размножения: при воспроизведении фага в клетке-хозяине продолжительность латентного периода составляет 50-55 мин, урожайность - 55-60 частиц на одну клетку.
Штамм бактериофага Bacteriophagum Pseudomonas aeruginosa СПбГМА им. И.И. Мечникова 07 (условное наименование Psph-B) был выделен из клинического материала - гнойного отделяемого из раны больного с хроническим остеомиелитом седалищной кости. Бактериофаг депонирован 29 июня 2000 г. в коллекции бактериофагов кафедры эпидемиологии Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И. Мечникова (СПбГМА им. И.И. Мечникова) под 07.
Бактериофаг характеризуется следующими свойствами:
Морфологические признаки:
Головка гексогональной формы размером 67-70 нм, хвостовой отросток 131-144 нм. На газоне чувствительных бактериальных культур P. aeruginosa фаг образует прозрачные пятна лизиса диаметром 1.5-2.0 мм. Центр прозрачный, край четкий, вторичный рост отсутствует.
Серологические характеристики:
Фаг не инактивируется антисыворотками, полученными к другим бактериальным вирусам P. aeruginosa из коллекции СПбГМА им. И.И. Мечникова (11 различных форм). Константа инактивации фага гомологической антисывороткой (К) составляет 62 мин-1.
Тип нуклеиновой кислоты штамма фага - ДНК
Физико-химические свойства фага
Фаг не инактивируется при нагревании суспензии в течении 40 мин при 55oС. Литическая активность не изменяется в пределах рН 5-9. Устойчив к хлороформу.
Литический спектр бактериального вируса.
Для оценки круга штаммов-хозяев фага была использована коллекция P. aeruginosa из 186 штаммов. Фаг обладает способностью лизировать 31% культур синегнойной палочки (58 штаммов P. aeruginosa).
Диапазон специфичности: лизирует P. aeruginosa, не лизирует дизентерийные палочки (шигеллы Зонне, Флекснера), свежевыделенный и музейные штаммы кишечной палочки и другие представители нормальной микрофлоры.
Бактериальные штаммы для поддержания и размножения бактериофага - P. aeruginosa штаммы Ра-96, Ра-129.
Оптимальные условия размножения
Условия культивирования. Штамм фага размножается на чувствительной культуре синегнойной палочки Ра-96 на обычных питательных средах (пептонная вода, простой питательный агар) при температуре 37oС, вызывая при этом просветление пептонной воды после 6-часовой инкубации, а на простом питательном агаре образуя прозрачные колонии правильной формы после 16-18- часовой инкубации.
Условия хранения: ,актериофаг Psph-Е сохраняет литические свойства при хранении при температуре +4oС-+6oС в среде в течение 1 года.
Периодичность пересевов 1 год.
Способ размножения: при воспроизведении фага в клетке-хозяине продолжительность латентного периода составляет 55-60 мин, урожайность - 45-55 частиц на одну клетку.
Препарат бактериофагов Combiphage получают смешением отдельно выращенных бактериофагов в заданных параметрах. Он содержит смесь штаммов бактериофагов Bacteriophagum Pseudomonas aeruginosa СПбГМА им. И.И. Мечникова 05, 03, 06 и 07 в следующем соотношении фаговых частиц, %:
штамм 05 - 10-60
штамм 03 - 10-60
штамм 06 - 10-60
штамм 07 - 10-60
Препарат может быть получен в виде взвеси в пептонной воде или в сухом виде.
Штаммы фагов были протестированы на наборе из 20 госпитальных штаммов P. aeruginosa, выделенных из клинического материала от пациентов травматологического, ожогового и урологического стационаров и максимально отличающихся по серотипу, фаготипу и чувствительности к антибиотикам. Спектр литической активности штаммов фагов перекрывался на 20-40%. Препарат, полученный таким способом, обладает способностью лизировать более 81% культур госпитальных штаммов синегнойной палочки, выделенных в стационарах различного профиля в Санкт-Петербурге.
Пример 1. Способ выделения фага Psph-I
Штамм бактериофага был получен из клинического материала (гнойного отделяемого из раны больного хроническим остеомиелитом бедренной кости). Материал был засеян в пептонную воду вместе с двумя различными штаммами P. aeruginosa Pa-34 и Ра-65, обладающими высокой чувствительностью к фагам. После 18-часовой инкубации в термостате при температуре 37oС фаголизат профильтрован через мембранный фильтр с диаметром пор 2 мкм.
Проверка литической активности производилась путем нанесения капель фильтрата фаголизата на использованные в процессе инкубации штаммы синегнойной папочки, посеянные "газоном" на простом питательном агаре. Учет результатов производился после 18-20-часовой инкубации чашек в при температуре 37oС. На месте капель фаголизата на обоих штаммах P. aeruginosa отмечались стерильные пятна диаметром, равным размеру нанесенной капли (10-11 мм), свидетельствовавшие о лизисе бактериальных клеток.
В дальнейшем проводилось повышение титра литической активности путем последовательных пассажей штамма бактериофага на высокочувствительной культуре синегнойной палочки Ра-34 в бульоне. После инкубации штамма синегнойной палочки в пептонной воде до середины логарифмической фазы роста добавлялся штамм бактериофага из расчета 1:30, смесь инкубировалась при температуре 37oС в течение 16-18 ч.
Активность полученного фаголизата проверялась на простом питательном агаре на данном штамме синегнойной палочки после предварительного фильтрования. Последовательные пассажи фага проводились до получения стерильных пятен без образования колоний вторичного роста синегнойной палочки на месте капель фага (до полного лизиса всех бактериальных клеток). Титр активности штамма бактериофага проверялся методом Аппельмана. Титр штамма бактериофага 10-8.
Пример 2. Способ выделения фага 03
Штамм бактериофага был получен из клинического материала (гнойного отделяемого из раны больного хроническим остеомиелитом правой большеберцовой кости). Материал был засеян в пептонную воду вместе с 4 различными штаммами P. aeruginosa Pa-49, Pa-54, Pa-60, Pa-68, обладающими высокой чувствительностью к фагам. После 18-часовой инкубации в термостате при температуре 37oС фаголизат профильтрован через фильтр с диаметром пор 2 мкм.
Проверка литической активности производилась путем нанесения капель фильтрата фаголизата на использованные в процессе инкубации штаммы синегнойной палочки, посеянные "газоном" на простом питательном агаре. Учет результатов производился после 18-20-часовой инкубации чашек в при температуре 37oС. На месте капель фаголизата на обоих штаммах P. aeruginosa отмечались стерильные пятна диаметром, равным размеру нанесенной капли (10-12 мм), свидетельствовавшие о лизисе бактериальных клеток.
В дальнейшем проводилось повышение титра литической активности путем последовательных пассажей штамма бактериофага на высокочувствительной культуре синегнойной палочки Ра-49 в бульоне. После инкубации штамма синегнойной палочки в пептонной воде до середины логарифмической фазы роста добавлялся штамм бактериофага из расчета 1:30, смесь инкубировалась при температуре 37oС в течение 16-18 ч.
Активность полученного фаголизата проверялась на простом питательном агаре на данном штамме синегнойной палочки после предварительного фильтрования. Последовательные пассажи фага проводились до получения стерильных пятен без образования колоний вторичного роста синегнойной палочки на месте капель фага (до полного лизиса всех бактериальных клеток). Титр активности штамма бактериофага проверялся методом Аппельмана. Титр штамма бактериофага 10-7.
Пример 3. Способ выделения фага 06
Штамм бактериофага был получен из клинического материала (из гнойного отделяемого с поверхности ожоговой раны). Материал был засеян в пептонную воду вместе с двумя различными штаммами P. aeruginosa Pa-113, Ра-145, обладающими высокой чувствительностью к фагам. После 18-часовой инкубации в термостате при температуре 37oС фаголизат профильтрован через мембранный фильтр с диаметром пор 2 мкм.
Проверка литической активности производилась путем нанесения капель фильтрата фаголизата на использованные в процессе инкубации штаммы синегнойной палочки, посеянные "газоном" на простом питательном агаре. Учет результатов производился после 18-20-часовой инкубации чашек при температуре 37oС. На месте капель фаголизата на обоих штаммах P. aeruginosa отмечались стерильные пятна диаметром, равным размеру нанесенной капли (10-12 мм), свидетельствовавшие о лизисе бактериальных клеток.
В дальнейшем проводилось повышение титра литической активности путем последовательных пассажей штамма бактериофага на высокочувствительной культуре синегнойной палочки Ра-113 в бульоне. После инкубации штамма синегнойной палочки в пептонной воде до середины логарифмической фазы роста добавлялся штамм бактериофага из расчета 1:30, смесь инкубировалась при температуре 37oС в течение 16-18 ч.
Активность полученного фаголизата проверялась на простом питательном агаре на данном штамме синегнойной палочки после предварительного фильтрования. Последовательные пассажи фага проводились до получения стерильных пятен без образования колоний вторичного роста синегнойной палочки на месте капель фага (до полного лизиса всех бактериальных клеток). Титр активности штамма бактериофага проверялся методом Аппельмана. Титр штамма бактериофага 10-7.
Пример 4. Способ выделения фага 07
Штамм бактериофага был получен из клинического материала (гнойного отделяемого из раны больного с хроническим остеомиелитом седалищной кости). Материал был засеян в пептонную воду вместе с двумя различными штаммами P. aeruginosa Pa-96, Ра-129, обладающими высокой чувствительностью к фагам. После 18-часовой инкубации в термостате при температуре 37oС фаголизат профильтрован через мембранный фильтр с диаметром пор 2 мкм.
Проверка литической активности производилась путем нанесения капель фильтрата фаголизата на использованные в процессе инкубации штаммы синегнойной палочки, посеянные "газоном" на простом питательном агаре. Учет результатов производился после 18-20-часовой инкубации чашек в при температуре 37oС. На месте капель фаголизата на обоих штаммах P. aeruginosa отмечались стерильные пятна диаметром, равным размеру нанесенной капли (10-12 мм), свидетельствовавшие о лизисе бактериальных клеток.
В дальнейшем проводилось повышение титра литической активности путем последовательных пассажей штамма бактериофага на высокочувствительной культуре синегнойной палочки Ра-96 в бульоне. После инкубации штамма синегнойной палочки в пептонной воде до середины логарифмической фазы роста добавлялся штамм бактериофага из расчета 1:30, смесь инкубировалась при температуре 37oС в течение 16-18 ч.
Активность полученного фаголизата проверялась на простом питательном агаре на данном штамме синегнойной палочки после предварительного фильтрования. Последовательные пассажи фага проводились до получения стерильных пятен без образования колоний вторичного роста синегнойной палочки на месте капель фага (до полного лизиса всех бактериальных клеток). Титр активности штамма бактериофага проверялся методом Аппельмана. Титр штамма бактериофага 10-7.
Пример 5. Способ получения препарата Combiphage.
Препарат бактериофагов против синегнойной палочки был получен путем предварительного выделения четырех штаммов бактериофагов, их анализа, отдельного друг от друга культивирования их в присутствии госпитальных штаммов P. aeruginosa в экспоненциальной фазе роста, очистки и механического смешивания бактериофагов, полученным по примерам 1-4 в различных соотношениях.
Результаты испытаний полученного препарата приведены в таблице.
Пример 6. Применение препарата Combiphage
Препарат Combiphage, состоящий из смеси штаммов бактериофагов Bacteriophagum Pseudomonas aeruginosa 05, 03. 06 и 07 в соотношении фаговых частиц 30: 30: 30:10 и использовался в виде суспензии в пептонной воде был применен для лечения 15 пациентов, страдавших различными инфекциями, вызванными синегнойной палочкой (инфекции мочевыводящих путей, пневмонии, остеомиелиты, хронические нейротрофические язвы, ожоговая раневая инфекция). Во всех случаях применения препарата отмечался выраженный положительный клинический эффект. У пациентов с инфекциями мочеполовых путей и пневмонией быстро улучшалось общее состояние, температура снижалась, явления воспаления в пораженных органах стихали. У больных с гнойными ранами происходило очищение от некротизированных тканей, появлялись грануляции, ускорялось заживление.
Кроме оценки клинического эффекта на отдельных больных проводилась оценка возможности достижения противоэпидемического эффекта на популяции пациентов гнойного отделения травматологического стационара. После начала применения препарата синегнойного фага Combiphage в стационаре отмечалось резкое снижение частоты внутрибольничных заражений гнойносептическими инфекциями, вызванными P.aeruginosa, с 40,8 до 8,9%.
Формула изобретения: 1. Препарат бактериофагов против синегнойной палочки, содержащий бактериофаг, компоненты питательной среды и вспомогательные добавки, отличающийся тем, что в качестве бактериофага он содержит смесь штаммов бактериофагов Bacteriophagum Pseudomonas aeruginosa СПбГМА им. И.И.Мечникова 05, 03, 06 и 07 в соотношении фаговых частиц, %:
Штамм 05 - 10-60
Штамм 03 - 10-60
Штамм 06 - 10-60
Штамм 07 - 10-60
2. Препарат бактериофагов по п.2, отличающийся тем, что он представляет собой суспензию бактериофагов в пептонной воде.
3. Штамм бактериофага Bacteriophagum Pseudomonas aeruginosa СПбГМА им. И. И. Мечникова 05, используемый при приготовлении поливалентного препарата против синегнойной палочки.
4. Штамм бактериофага Bacteriophagum Pseudomonas aeruginosa СПбГМА им. И. И. Мечникова 03, используемый при приготовлении поливалентного препарата против синегнойной палочки.
5. Штамм бактериофага Bacteriophagum Pseudomonas aeruginosa СПбГМА им. И. И. Мечникова 06, используемый при приготовлении поливалентного препарата против синегнойной палочки.
6. Штамм бактериофага Bacteriophagum Pseudomonas aeruginosa СПбГМА им. И. И. Мечникова 07, используемый при приготовлении поливалентного препарата против синегнойной палочки.