Forbidden

You don't have permission to access /zzz_siteguard.php on this server.

—ѕќ—ќЅ ¬џѕќЋЌ≈Ќ»я ћјЌ»ѕ”Ћя÷»» — ѕќ—Ћ≈ƒќ¬ј“≈Ћ№Ќќ—“№ё Ќ” Ћ≈»Ќќ¬ќ…  »—Ћќ“џ, ”—“–ќ…—“¬ќ ƒЋя ѕ–ќ¬≈ƒ≈Ќ»я ћјЌ»ѕ”Ћя÷»… Ќј ѕќ—Ћ≈ƒќ¬ј“≈Ћ№Ќќ—“» Ќ” Ћ≈»Ќќ¬ќ…  »—Ћќ“џ, ѕ–ќ“ќ„Ќџ… —ќ—”ƒ, “¬≈–ƒџ… Ќќ—»“≈Ћ№ ƒЋя »ћћќЅ»Ћ»«ј÷»» ѕќ—Ћ≈ƒќ¬ј“≈Ћ№Ќќ—“» Ќ” Ћ≈»Ќќ¬ќ…  »—Ћќ“џ, “¬≈–ƒџ… Ќќ—»“≈Ћ№, —ѕќ—ќЅ ѕќЋ”„≈Ќ»я Ќќ—»“≈Ћя ƒЋя »ћћќЅ»Ћ»«ј÷»» ѕќ—Ћ≈ƒќ¬ј“≈Ћ№Ќќ—“» Ќ” Ћ≈»Ќќ¬ќ…  »—Ћќ“џ - ѕатент –‘ 2186852
√лавна€ страница  |  ќписание сайта  |   онтакты
—ѕќ—ќЅ ¬џѕќЋЌ≈Ќ»я ћјЌ»ѕ”Ћя÷»» — ѕќ—Ћ≈ƒќ¬ј“≈Ћ№Ќќ—“№ё Ќ” Ћ≈»Ќќ¬ќ…  »—Ћќ“џ, ”—“–ќ…—“¬ќ ƒЋя ѕ–ќ¬≈ƒ≈Ќ»я ћјЌ»ѕ”Ћя÷»… Ќј ѕќ—Ћ≈ƒќ¬ј“≈Ћ№Ќќ—“» Ќ” Ћ≈»Ќќ¬ќ…  »—Ћќ“џ, ѕ–ќ“ќ„Ќџ… —ќ—”ƒ, “¬≈–ƒџ… Ќќ—»“≈Ћ№ ƒЋя »ћћќЅ»Ћ»«ј÷»» ѕќ—Ћ≈ƒќ¬ј“≈Ћ№Ќќ—“» Ќ” Ћ≈»Ќќ¬ќ…  »—Ћќ“џ, “¬≈–ƒџ… Ќќ—»“≈Ћ№, —ѕќ—ќЅ ѕќЋ”„≈Ќ»я Ќќ—»“≈Ћя ƒЋя »ћћќЅ»Ћ»«ј÷»» ѕќ—Ћ≈ƒќ¬ј“≈Ћ№Ќќ—“» Ќ” Ћ≈»Ќќ¬ќ…  »—Ћќ“џ
—ѕќ—ќЅ ¬џѕќЋЌ≈Ќ»я ћјЌ»ѕ”Ћя÷»» — ѕќ—Ћ≈ƒќ¬ј“≈Ћ№Ќќ—“№ё Ќ” Ћ≈»Ќќ¬ќ…  »—Ћќ“џ, ”—“–ќ…—“¬ќ ƒЋя ѕ–ќ¬≈ƒ≈Ќ»я ћјЌ»ѕ”Ћя÷»… Ќј ѕќ—Ћ≈ƒќ¬ј“≈Ћ№Ќќ—“» Ќ” Ћ≈»Ќќ¬ќ…  »—Ћќ“џ, ѕ–ќ“ќ„Ќџ… —ќ—”ƒ, “¬≈–ƒџ… Ќќ—»“≈Ћ№ ƒЋя »ћћќЅ»Ћ»«ј÷»» ѕќ—Ћ≈ƒќ¬ј“≈Ћ№Ќќ—“» Ќ” Ћ≈»Ќќ¬ќ…  »—Ћќ“џ, “¬≈–ƒџ… Ќќ—»“≈Ћ№, —ѕќ—ќЅ ѕќЋ”„≈Ќ»я Ќќ—»“≈Ћя ƒЋя »ћћќЅ»Ћ»«ј÷»» ѕќ—Ћ≈ƒќ¬ј“≈Ћ№Ќќ—“» Ќ” Ћ≈»Ќќ¬ќ…  »—Ћќ“џ

—ѕќ—ќЅ ¬џѕќЋЌ≈Ќ»я ћјЌ»ѕ”Ћя÷»» — ѕќ—Ћ≈ƒќ¬ј“≈Ћ№Ќќ—“№ё Ќ” Ћ≈»Ќќ¬ќ…  »—Ћќ“џ, ”—“–ќ…—“¬ќ ƒЋя ѕ–ќ¬≈ƒ≈Ќ»я ћјЌ»ѕ”Ћя÷»… Ќј ѕќ—Ћ≈ƒќ¬ј“≈Ћ№Ќќ—“» Ќ” Ћ≈»Ќќ¬ќ…  »—Ћќ“џ, ѕ–ќ“ќ„Ќџ… —ќ—”ƒ, “¬≈–ƒџ… Ќќ—»“≈Ћ№ ƒЋя »ћћќЅ»Ћ»«ј÷»» ѕќ—Ћ≈ƒќ¬ј“≈Ћ№Ќќ—“» Ќ” Ћ≈»Ќќ¬ќ…  »—Ћќ“џ, “¬≈–ƒџ… Ќќ—»“≈Ћ№, —ѕќ—ќЅ ѕќЋ”„≈Ќ»я Ќќ—»“≈Ћя ƒЋя »ћћќЅ»Ћ»«ј÷»» ѕќ—Ћ≈ƒќ¬ј“≈Ћ№Ќќ—“» Ќ” Ћ≈»Ќќ¬ќ…  »—Ћќ“џ

ѕатент –оссийской ‘едерации
—уть изобретени€: —пособ применим, в частности дл€ анализа медицинских проб. —пособ проведени€ манипул€ции последовательностью нуклеиновой кислоты предусматривает обеспечение системы твердого носител€, с которым св€зан одноцепочечный олигонуклеотид, комплементарный специфической последовательности на нуклеиновой кислоте-мишени, более длинной, чем данный олигонуклеотид, добавление источника одноцепочечной нуклеиновой кислоты-мишени к системе твердого носител€, гибридизацию нуклеиновой кислоты-мишени с олигонуклеотидом и проведение манипул€ции на гибридизованной нуклеиновой кислоте-мишени. ћанипул€ци€ может представл€ть собой, например, копирование или амплификацию последовательности нуклеиновой кислоты-мишени. ¬ предпочтительном варианте обеспечен носитель в проточном сосуде, который облегчает промывание носител€ дл€ удалени€ примесей и оставлени€ "чистой" пробы нуклеиновой кислоты-мишени, на которой может быть проведена манипул€ци€. ѕредпочтительно носитель имеет силоксановый матрикс, с которым св€зан олигонуклеотид. Ёто обеспечивает стабильную св€зь между олигонуклеотидом и носителем. 6 с. и 41 з.п. ф-лы, 11 ил.
ѕоиск по сайту

1. — помощью поисковых систем

   — помощью Google:    

2. Ёкспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. ѕо номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Ќомер патента: 2186852
 ласс(ы) патента: C12Q1/68, B01D15/08, C12M1/00
Ќомер за€вки: 94031166/13
ƒата подачи за€вки: 23.12.1992
ƒата публикации: 10.08.2002
«а€витель(и): “≈ѕЌ≈Ћ ћ≈ƒ» јЋ Ћ»ћ»“≈ƒ (GB)
јвтор(ы): ћ»Ќ“≈– —тефен (GB)
ѕатентообладатель(и): “≈ѕЌ≈Ћ ћ≈ƒ» јЋ Ћ»ћ»“≈ƒ (GB)
ќписание изобретени€: ƒанное изобретение касаетс€ способа и устройства дл€ проведени€ манипул€ций на последовательност€х нуклеиновых кислот с применением системы твердого носител€, а также носителей дл€ применени€ в способе и устройстве.
»звестны различные способы манипулировани€ последовательност€ми нуклеиновых кислот. Ќапример, ≈–-ј-0200362 /Cetus/ описывает жидкофазный способ амплификации, обнаружени€ и/или/ клонировани€ последовательностей нуклеиновых кислот. —пособ предусматривает следующие стадии:
/i/ обработку отдельных комплементарных цепей последовательности нуклеиновой кислоты двум€ олигонуклеотидными праймерами, каждый из которых гибридизуетс€ с одной из этих цепей;
/ii/ удлинение праймеров с образованием двухцепочечных последовательностей нуклеиновой кислоты;
/iii/ денатурацию продукта на /ii/ с образованием одиночных цепей нуклеиновой кислоты;
/iv/ применение одиночных цепей из /iii/ дл€ повторени€ стадий /i/-/iii/, причем весь процесс повтор€ют столько раз, сколько это необходимо.
ќсобенностью этого предшествующего способа €вл€етс€ то, что обе комплементарные цепи примен€ют в качестве матриц дл€ второй и последующих стадий амплификации.  роме того, в способе ≈–-ј-0200362 смесь реагентов содержит негибридизованную нуклеиновую кислоту-мишень /целевую нуклеиновую кислоту/, негибридизованную копию мишени и негибридизованный праймер, что делает эту систему очень неэффективной. ¬ дополнение к этому люба€ ошибка при копировании на любой стадии приводит к ошибке, переносимой в "полимеразную цепную реакцию".
—пособы амплификации с применением систем твердофазных носителей также известны, например, с применением магнитных гранул DYNAL /Trade Mark/, описанных в ≈–-ј-0091453 и ≈–-ј-0106873. ѕри применении магнитных гранул ƒЌ  синтезируетс€ на них и затем отщепл€етс€ от гранул гидроконцом аммони€. «атем гранулы можно отделить от синтезированной ƒЌ  при помощи магнита. јльтернативно, к одному концу синтезированной или природной ƒЌ  может быть добавлен биотин и эту последовательность можно извлечь при помощи магнитной гранулы, предварительно компьюгированной со стрептавидином /аттрагиру€ биотики дл€ извлечени€ ƒЌ /. ѕроблема, возникающа€ с этим типом твердого носител€, заключаетс€ в том, что св€зь биотина со стрептавидином €вл€етс€ биодеградируемой.
ƒругими известными системами твердых носителей €вл€ютс€ пористые кремнеземы. Ќаличие пор может создавать проблемы, т.к. рост нуклеотидной цепи происходит внутри пор, что приводит к неэффективному вымыванию и оставлению остатков внутри пор, что оп€ть-таки снижает выход и приводит к относительно неэффективному св€зыванию.
≈–-ј-0184056 описывает способ широкомасштабного получени€ зондов ƒЌ  при помощи твердого субстрата. —пособ этой предшествующей спецификации предусматривает ковалентное св€зывание с твердым субстратом полинуклеотида, комплементарного получаемому зонду, и последующую гибридизацию этого полинуклеотида с олигонуклеотидом, действующим в качестве праймера. «атем олигонуклеотид удлин€етс€ в направлении от субстрата /с применением полинуклеотида в качестве матрицы/ с образованием удлиненной последовательности, комплементарной св€занному с субстратом полинуклеотиду. ѕосле этого гибридизованные полинуклеотид и удлиненный олигонуклеотид денатурируют дл€ высвобождени€ удлиненного олигонуклеотида из твердого субстрата дл€ коллекции. ”длиненный олигонуклеотид можно использовать в качестве аналитического зонда. Ќапример, полинуклеотидом, исходно св€занным с носителем, может быть ген, а удлиненный олигонуклеотид можно примен€ть в качестве зонда дл€ обнаружени€ этого гена в биологической пробе.
ќднако имеетс€ р€д неблагопри€тных моментов, св€занных со способом, описанным в ≈–-ј-0184056. ¬ частности, если полинуклеотид, который следует св€зать с носителем, не €вл€етс€ "чистым" и содержит другие полинуклеотиды, то они будут также св€зыватьс€ с носителем. ¬ результате олигонуклеотид может также гибридизоватьс€ с этими другими полинуклеотидами, так что полученный в конечном счете удлиненный олигонуклеотид может фактически быть смесью продуктов. ѕоэтому этот способ не очень хорош дл€ получени€ "чистых" проб нуклеоиновых кислот.
ѕоэтому объектом данного изобретени€ €вл€етс€ устранение или ослабление вышеупом€нутых неблагопри€тных моментов.
—огласно первому аспекту данного изобретени€ обеспечен способ осуществлени€ манипул€ции последовательностью нуклеиновой кислоты, который предусматривает
/а/ обеспечение системы твердого носител€, с которым св€зан одноцепочечный олигонуклеотид, комплементарный специфической последовательности на нуклеиновой кислоте-мишени, котора€ имеет большую длину, чем олигонуклеотид,
/b/ добавление источника одноцепочечной нуклеиновой кислоты-мишени к системе твердого носител€,
/с/ гибридизацию нуклеиновой кислоты-мишени с олигонуклеотидом и
/d/ осуществление манипул€ции на гибридизованной нуклеиновой кислоте-мишени.
ƒанный способ приводит к тому, что целева€ нуклеинова€ кислота изобретательно гибридизуетс€ с олигонуклеотидом на носителе. Ћюбые примеси, присутствующие в системе /например, введенные в пробе, содержащей целевую нуклеиновую кислоту/, можно удалить промыванием, что оставл€ет "чистую" пробу целевой нуклеиновой кислоты, на которой можно выполн€ть манипул€цию. ѕромывание провод€т при температуре, при которой не происходит плавлени€ целевой нуклеиновой кислоты с отделением ее от олигонуклеотида.
Ќуклеинова€ кислота-мишень может, например, быть очищенной или неочищенной, нативной или синтезированной нуклеиновой кислотой. ћишенью может быть люба€ ƒЌ  или –Ќ  из вирусного, бактериального, животного или растительного источника.
ќлигонуклеотид, св€занный с носителем, должен содержать, как правило, не менее 8 нуклеотидов. ќбычно полинуклеотид, который должен гибридизоватьс€ с олигонуклеотидом, содержит 1000-2000 оснований и значительно длиннее, чем олигонуклеотид.
ќлигонуклеотид может быть св€зан с носителем в результате реакции между пригодными дл€ этого реактивными группами, обеспеченными на носителе, и олигонуклеотидом. јльтернативно олигонуклеотид может быть синтезирован in situ на носителе.
ќлигонуклеотид может быть св€зан с твердым носителем в ориентации 31-51 или 51-31.
Ћюбые защитные группы на олигонуклеотиде удал€ют перед стадией гибридизации /с/.
¬ способе данного изобретени€ одноцепочечна€ нуклеинова€ кислота-мишень гибридизуетс€ с олигонуклеотидом, св€занным с носителем. ѕоследовательность олигонуклеотида должна быть очень специфичной дл€ гибридизуемой мишени. ¬ результате гибридизацию можно проводить при температуре, котора€ очень специфична€ дл€ гибридизации между этим олигонуклеотидом и мишенью.
√ибридизацию нуклеиновой кислоты-мишени идеально проводить при температуре едва ниже /например, 1-3o—/ температуры /“п/, при которой нуклеинова€ кислота-мишень отсоедин€етс€ путем плавлени€ от олигонуклеотида. ¬ виде общего правила “п можно рассчитать по формуле, известной в данной области исследований
п =2 (ј+“) +3 (√+÷)
где ј, “, √, ÷ обозначают соответственно число остатков аденина, тимина, гуанина и цитозина, присутствующих в олигонуклеотиде, св€занном с носителем. ‘ормула обычно применима дл€ последовательностей длиной до 30 нуклеотидов. ѕосле стадии гибридизации носитель можно промыть при температуре, слегка более низкой, чем “п, дл€ удалени€ негибридизовавшейс€ мишени и примесей /например, белков при нежелательных последовательностей нуклеиновых кислот/. ѕоэтому можно добавить к системе твердого носител€ смесь полинуклеотидов /которые могут присутствовать в биологической пробе/, но только специфический целевой полинуклеотид /т.е. мишень/ удержитс€ на носителе. “аким образом, после промывани€ манипул€ции полинуклеотидом можно проводить на его "чистой" пробе.
ѕоследовательные манипул€ции можно проводить на гибридизовавшейс€ целевой нуклеиновой кислоте. јльтернативно исходное манипулирование можно выполн€ть дл€ получени€ копии мишени, св€занной с носителем. Ёту копию можно затем примен€ть дл€ последующих операций манипулировани€.
ћежду каждыми двум€ манипул€ци€ми можно промывать, если необходимо, дл€ удалени€ примесей, после чего собирают требуемый продукт. ѕосле дальнейшего промывани€ носител€ /если необходимо/ манипул€цию можно повтор€ть.
ћанипул€ци€ может представл€ть собой, например, копирование, амплификацию последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, транскрипцию in vitro или очистку ƒЌ -св€зывающих белков. ћанипул€цией может быть также обнаружение присутстви€ мишени тестированием на гибридизацию меченого праймера с мишенью. ћанипул€ции на полинуклеотидной последовательности можно выполн€ть при помощи ранее известных способов. Ќапример, в способах манипулировани€ можно использовать ƒЌ - полимеразу 1, ее фрагменты  ленова, термостабильную полимеразу и/или/ обратную транскриптазу вместе с дезоксинуклеотидтрифосфатами. Ќуклеотиды могут, если нужно, быть мечеными, например, 33s, 33р, хромофорами, биотином, пероксидазой, биофатазой или любым другими биологическим маркером по выбору.
—пособ изобретени€, в частности, применим дл€ анализа проб /например, медицинских проб/ дл€ обнаружени€ присутстви€ или отсутстви€ определенной нуклеиновой кислоты. ≈сли, например, пробу тестируют на состо€ние болезни, при котором наблюдаетс€ относительно высокое количество определенной нуклеиновой кислоты /мишени/, то обнаружение этой нуклеиновой кислоты можно выполн€ть следующим образом. ≈сли того как мишень /если она присутствует/ гибридизовалась с носителем и носитель промыли дл€ оставлени€ на нем "чистой" пробы мишени, меченый олигонуклеотидный праймер, комплементарный последовательности на мишени, добавл€ют к носителю при услови€х, в которых праймер будет гибридизоватьс€ с мишенью. ћетка может быть, например, радиоактивной меткой, хромофором или реагентом, соединенным с ферментом. «атем носитель промывают дл€ удалени€ негибридизовавшегос€ праймера, причем промывание провод€т при температуре, более низкой, чем та, при которой праймер, гибридизовавшийс€ с целевой нуклеиновой кислотой, отсоедин€етс€ плавлением от мишени. «атем температуру носител€ можно повысить дл€ отсоединени€ гибридизовавшегос€ праймера /либо с целевой ƒЌ , либо без нее/. ƒл€ обнаружени€ присутстви€ праймера можно использовать детектор. ≈сли праймер детектируетс€, то это €вл€етс€ подтверждением того, что нуклеинова€ кислота-мишень присутствует в пробе.
ќднако, если проба содержит лишь относительно низкое количество целевой нуклеиновой кислоты, то можно провести повтор€ющиес€ реакции амплификации /см. ниже, кажда€ из которых продуцирует меченые копии амплифицированного продукта, если исходно предполагаема€ мишень присутствует в пробе. «атем можно провести операцию детектировани€ дл€ определени€, присутствует ли меченый продукт амплификации. ≈сли это так, то это €вл€етс€ подтверждением того, что исходно предполагаема€ мишень присутствует в пробе.  онечно, желательно, чтобы можно было бы провести любое количество амплификаций, так чтобы тест был очень чувствительным и давал возможность определени€ присутстви€ очень низких количеств мишени в исходной пробе.
¬ажной особенностью данного изобретени€ €вл€етс€ то, что обнаружение присутстви€ мишени в исходной пробе может достигатьс€ без необходимости разделени€ продуктов на гел€х.
ќсобенно предпочтительно в соответствии с данным изобретением обеспечение носител€ в проточном сосуде /например, в колонке/, что облегчает промывание носител€, а также последующую манипул€цию, что будет видно из дальнейшего описани€.
ѕрименение проточного сосуда €вл€етс€ важной особенностью и поэтому согласно второму аспекту данного изобретени€ обеспечен проточный сосуд, имеющий входное и выходное отверсти€ и содержащий систему твердого носител€ со св€занным с ней одноцепочечным олигонуклеотидом, комплементарным специфической последовательности на нуклеиновой кислоте-мишени.
—осуд может быть размером, например, на 150-250 мкл.
ћанипулирование можно выполн€ть при помощи устройства /в котором помещен проточный сосуд/ дл€ подачи растворов реагентов к сосуду и дл€ сбора и обнаружени€ продукта манипулировани€.
—огласно третьему аспекту данного изобретени€ обеспечено устройство дл€ выполнени€ манипулировани€ на последовательности нуклеиновой кислоты, содержащее
проточный сосуд,
средства дл€ хранени€ растворов, удал€емых из сосуда во врем€ промывани€ или других процедур, перед тем как эти растворы возвращаютс€ в колонку,
детекторные средства дл€ детектировани€ продуктов манипулировани€ нуклеиновыми кислотами и
контрольные средства дл€ отведени€ растворов в сосуд и из сосуда, в зоны отходов или хранени€ и к детекторным средствам.
¬ предпочтительной форме устройства выходное отверстие сосуда может избирательно сообщатьс€ с /i/ участком хранени€ реагентов, /ii/ участком детектировани€ продукта манипулировани€ и /iii/ выпускным отверстием дл€ отходов. ”часток сбора реагентов позвол€ет раствору реагентов, исходно подаваемому к сосуду, через его входное отверстие, проходить к участку сбора реагентов дл€ последующего возврата к сосуду, где должны выполн€тьс€ повторные манипул€ции на той же самой нуклеиновой кислоте-мишени /или на ее копии/. ѕродукт из каждой операции манипулировани€ может затем проходить к детекторному участку дл€ детектировани€. ≈сли нужно, устройство может быть таким, что продукт из последовательных манипул€ций собирают перед его прохождением к детектору.
”стройство содержит, конечно, клапанное приспособление /например, управл€емые соленоидом клапаны/, дл€ того чтобы растворы, продукт и т.д. могли перемещатьс€/ предпочтительно под давлением газа/ через устройство.
“вердый носитель может содержать непористые частицы, имеющие размер 100-200 микронов. ѕрименение непористого материала имеет особые преимущества, т.к. оно позвол€ет избежать некоторых проблем, св€занных с пористыми носител€ми, примен€емыми ранее, а именно: рост нуклеотидной цепи внутри пор приводит к неэффективному промыванию и оставлению остатков внутри пор, что снижает выход и ведет к относительно неэффективному св€зыванию. Ќоситель может представл€ть собой кальцинированные сферические частицы с диаметром 100-200 микронов. Ќоситель может быть, например, непористым силикагелем.
Ќоситель может иметь реактивные группы /например, эпоксигруппы/ дл€ применени€ их в иммобилизации олигонуклеотидной последовательности на носител€х.
ѕредпочтительно, чтобы носитель имел сшитый поперечными св€з€ми силоксановый матрикс, имеющий реактивные группы, которые могут быть использованы дл€ обеспечени€ иммобилизованного олигонуклеотида на носителе. “акой носитель €вл€етс€ также важной особенностью и поэтому согласно четвертому аспекту данного изобретени€ обеспечена система твердого носител€ дл€ иммобилизации последовательности нуклеиновой кислоты, имеющего сшитый поперечными св€з€ми силоксановый матрикс с реактивными группами, которые могут быть использованы дл€ обеспечени€ иммобилизованной нуклеиновой кислоты на этом носителе.
—огласно п€тому аспекту данного изобретени€ обеспечен способ получени€ носител€ дл€ иммобилизации последовательности нуклеиновой кислоты, предусматривающий реакцию твердого носител€, имеющего свободные гидроксигруппы, с предшественником силоксанового матрикса, который реагирует со свободными гидроксигруппами и имеет группу, котора€ может быть использована дл€ иммобилизации последовательности нуклеиновой кислоты на носителе, и нагревание продукта с образованием силоксанового матрикса.
ѕрименение силоксанового матрикса особенно предпочтительно благодар€ устойчивости к кислотам и основани€м. Ёто €вл€етс€ преимуществом при сравнении этого матрикса с прежними носител€ми, содержащими св€зь биотин-стрептавидин, которые €вл€ютс€ биодеградируемыми. —илоксановый матрикс делает возможным проведение широкого диапазона манипул€ций без удалени€ олигонуклеотида из носител€. Ќапример, аммиак можно примен€ть в качестве реагента дл€ депротектировани€ олигонуклеотида, который остаетс€ на носителе. Ќормальные св€зи с €нтарной кислотой, примен€емые дл€ иммобилизации олигонуклеотида, лабильны в присутствии щелочей, что вызывает отделение олигонуклеотида от носител€.
ѕредпочтительной реактивной группой, котора€ может примен€тьс€ дл€ иммобилизации последовательности нуклеиновой кислоты, €вл€етс€ эпоксигруппа.
≈сли требуетс€, свободные гидроксигруппы, присутствующие на носителе, после реакции с предшественником силоксанового матрикса, но перед образованием сшитого поперечными св€з€ми силоксанового матрикса могут быть блокированы, например, при помощи хлорсилана.
ѕредпочтительно предшественник силоксанового матрикса представл€ет собой глицидоксисоединение формулы

где R представл€ет собой —1-—4-алкил, a R1 представл€ет собой алкилен. Ќаиболее предпочтительно R обозначает метил, a R1 обозначает -(—Ќ2)3-.
—интетический олигонуклеотид может быть ковалентно св€зан с носителем через эпоксигруппу. јльтернативно, натриева€ соль нуклеотида может быть ковалентно св€зана с носителем и может быть проведен синтез олигонуклеотида /с применением β-цианоэтилфосфоамидита/.
ƒалее изобретение будет описано при помощи примера, только со ссылкой на соответствующие чертежи, в которых
фиг. 1 представл€ет в виде схемы принцип изобретени€;
фиг.2 изображает продольный разрез проточной колонки, содержащей систему олиго-твердое вещество;
фиг. 3 иллюстрирует путь реакции дл€ получени€ твердого носител€ дл€ иммобилизации олигонуклеотида;
фиг. 4а дают схематическое изображение системы твердого и 4в носител€ и реакций, участвующих в св€зывании с ней олигонуклеотида;
фиг. 5а-5d дают схематические изображени€ стадий, участвующих в амплификации нуклеиновой кислоты-мишени;
фиг. 6 иллюстрирует устройство дл€ проведени€ манипулировани€ в соответствии с изобретением, и
фиг.7 - радиоавтограф, показывающий результаты примера 3.
Ќа фиг.1 иллюстрировано /в сильно увеличенном масштабе/ множество частиц 1 материала твердого носител€, кажда€ из которых несет иммобилизованные на ней идентичные олигонуклеотидные последовательности 2, которые специфичны относительно одноцепочечной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени 3, содержащейс€ внутри пробы 4, котора€ содержит также нежелательные примеси /например, другие последовательности нуклеиновых кислот, белки и т.д./, представленные треугольными 5.
ѕробу 4 добавл€ют к носителю 1 при гибридизационных услови€х, так что часть последовательностей нуклеиновой кислоты 3 св€зываетс€ с олигонуклеотидом, а часть этих последовательностей остаетс€ внегибридизованном виде вместе с примес€ми 5 в жидкой фазе. ¬о врем€ последующего промывани€ негибридизованна€ нуклеинова€ кислота 3 вместе с примес€ми удал€етс€ из носител€ 1, как показано, оставл€€ чистую пробу целевой нуклеиновой кислоты 3 на носителе в св€занном виде.
ќсобенно предпочтительно, чтобы частицы 1 носител€ находились внутри проточной колонки 6 /см. фиг.2/, имеющей входной и выходной клапаны 7 и 8, как показано на чертеже, а также нагреватель 9. „астицы могут удерживатьс€ внутри колонки пористыми элементами 10. ƒл€ удобства частицы 1, изображенные в фиг.2, представлены как имеющие только одну иммобилизованную на них олигонуклеотидную последовательность.
Ќуклеиновую кислоту-мишень добавл€ют в проточную колонку через входной клапан 7 в отношении, например, 1000:1 /олигонуклеотид:мишень/, в подход€щем буфере, например, в высокосоленом буфере и гибридизацию провод€т при услови€х, специфических дл€ св€занного с носителем олигонуклеотида и нуклеиновой кислоты-мишени. ≈сли источником нуклеиновой кислоты-мишени €вл€етс€ двухцепочечна€ ƒЌ , то ее сначала раздел€ют на одиночные цепи обычными способами либо перед нанесением на колонку, либо когда она уже находитс€ на колонке.
ѕроба 4 удерживаетс€ в колонке благодар€ тому, что выпускной клапан 8 закрыт. ѕосле стадии гибридизации нежелательные примеси 5 /которые не иммобилизуютс€ на носителе/ можно удалить промыванием /с открытым клапаном 8/, тогда как чиста€ проба нуклеиновой кислоты-мишени остаетс€ на носителе.
Ќа фиг. 3-5 изображен способ, при помощи которого готов€т твердый носитель /с иммобилизованным олигонуклеотидом/.
—начала сделана ссылка на фиг.3, который иллюстрирует один вариант пути реакции дл€ получени€ носител€ с реакционными группами, при помощи которых может быть иммобилизован олигонуклеотид.
ѕроцедура начинаетс€ с частиц 1 силикагел€, имеющих поверхностные гидроксигруппы, как показано на чертеже. ¬ первой стадии реакции частицы обрабатывают 3-глицидоксипропилтриметоксисиланом /II/, например, при температуре не выше 95o— в течение 2 часов в атмосфере азота. ¬ результате происходит реакци€ конденсации, вследствие которой остатки /II/ станов€тс€ св€занными с частицами кремнезема /I/ с образованием продукта, изображенного как /III/. ’от€ чертеж показывает только два остатка, св€занных с частицей диоксида кремни€ /кремнезема/, это сделано лишь дл€ €сности. Ќа практике значительно большее количество остатков соедин€етс€ с частицей диоксида кремни€.
ќбычно уровень св€зывани€ составл€ет 40-45 микромолей /I/ на грамм диоксида кремни€.
«атем продукт /III/ промывают последовательно сухим толуолом, сухим метанолом и сухим эфиром.
—ледующа€ стади€ предусматривает нагревание продукта дл€ проведени€ сшивани€ остатков поперечными св€з€ми.  ак правило, эту реакцию сшивани€ провод€т при температуре 110o— в течение по меньшей мере 2 часов. ќбразующийс€ продукт представлен в /IV/, где видно, что атомы кремни€ соединены вместе через атомы кислорода.
—вободные гидроксигруппы, оставшиес€ на поверхности частиц диоксида кремни€, могут, если нужно, быть блокированы хлорсиланом. Ѕлокирующим агентом может быть, например, триметилхлорсилан и реакцию провод€т в пиридине в течение двух часов при комнатной температуре. ѕосле блокировани€ носитель может быть подвергнут операции промывани€.
ѕолученный таким образом носитель имеет свободные эпоксигруппы, которые могут быть применены дл€ иммобилизации олигонуклеотида.
ћожно, например, при помощи известных процедур синтезировать in situ на носителе олигонуклеотид, комплементарный специфической последовательности на целевой нуклеиновой кислоте. “ак, натриева€ соль защищенного диметокситритилом /DMT/ нуклеотида может реагировать с носителем посредством того, что - 0 часть в 31- положении нуклеотида реагирует со свободной эпоксигруппой с образованием продукта /Y/. Ќатриевую соль можно приготовить из DMT-нуклеотида /который был высушен над F2O5/ путем растворени€ в сухом DMF, выдерживани€ этого раствора в безводной атмосфере и добавлени€ гидрида натри€. «атем гидрид натри€ отфильтровывают, получа€ натриевую соль.
ѕосле удалени€ ƒћ“-защитной группы целевой олигонуклеотид можно синтезировать из отдельных нуклеотидов при помощи известных процедур синтеза олигонуклеотидов.
јльтернативно можно св€зать с носителем заранее синтезированный олигонуклеотид /комплементарный специфической последовательности на целевой нуклеиновой кислоте и предпочтительно содержащий также сайт расщеплени€ рестриктазы/.
»меетс€ в распор€жении р€д синтетических олигонуклеотидов, комплементарных р€ду последовательностей нуклеиновых кислот-мишеней и применимых в качестве зондов дл€ тестировани€ на присутствие определенных бактерий, вирусов, паразитов и т.п., см. приложение ј. »зобретение можно примен€ть, например, дл€ детектировани€ следующих организмов, дл€ которых на носителе должны быть иммобилизованы представленные ниже олигонуклеотидные последовательности.
¬ирус Ёпштейна-Ѕарра √јЌ јј÷ “÷√ √÷÷ √“÷ ј“√ √ј
“охор lasma gongii ÷√ј ј÷“ √÷ј “÷÷ √““ ѕј“ √ј√
N rypa nosom a Brucei Brucei ÷√ј ј“√ јј“ јјј ÷јј “√÷
√÷ј
ќлигонуклеотид может быть св€зан на носителе либо в ориентации 31-51, либо в ориентации 31-31. —в€занные в ориентации 31-51 может быть достигнуто реакцией эпоксигруппы на носителе с первичной гидроксигруппой натриевой соли нуклеотида (например, тимидина (диметокситритил-дезоксирибонуклеозида) (д“) см. фиг.4а)) с образованием св€зи, котора€ устойчива как к кислотам, так и к щелочам в отличие от примен€емых в насто€щее врем€ соединительных групп.
—в€занные в ориентации 51-31 может быть достигнуто следующим образом /см. также фиг. 4/. 51-иод-51-дезокситимидин реагирует с трифенилметилмеркаптилом натри€ в ƒћ‘ с образованием соединени€ S-тритила. ƒалее это соединение реагирует с диизопропиламмо-тетразолидом и 2-цианэтокси-бас N,N-диизопропиламино)-фосфоамидитом в DCM с образованием β-цианоэтила. S-тритил удал€ют восстановительными реакци€ми известными способами /Connoly, Nucleic Acid Research.
13,12,1985; Chu, Nac L eic Acid Research, 16, 9, 1988;
Guar, Nucleic Acid Research, 17, 11, 1989/
перед соединением с эпокси-замещенным носителем при помощи гидрида натри€. »звестны и другие способы приготовлени€ олигонуклеотидов дл€ соединени€ в 51-31 ориентации /Anisorge, Nucleic Acid Research, 15, 11, 1987; Sproat, Nucleic Acid Research.
15, 12, 1987; Zuckevman, Nucleic Acid Reseach.
13, 5305, 1987; Verheeden, JOREGA
CHEM. 35, 2319, 1970/, хот€ этот перечень не €вл€етс€ исчерпывающим и любой другой способ, известный исследовател€м в этой области, может быть применен дл€ получени€ олигонуклеотидов в ориентации либо 31-51, либо 51-31 дл€ св€зи с системой твердого носител€ данного изобретени€.
≈сли олигонуклеотид имеет защитные группы в результате реакции синтеза, например, бутил/изопропил группы на основани€х /√, ј, ÷/ 31-51-олигонуклеотидов и β-цианоэтил в 51-31-oлигoнyклeoтидax, они должны быть удалены после синтеза. Ќоситель с олигонуклеотидом /олиготвердый носитель/ можно нагреть до 55o— в течение 2 часов в 38% NH4CH дл€ удалени€ защитных групп и образовани€ незащищенного олигонуклеотида.
ѕримерам манипул€ции, пригодной дл€ этой системы, €вл€етс€ амплификаци€ целевой последовательности нуклеиновой кислотой.
‘иг. 5а-5с схематически изображают стадии, участвующие в амплификации, в зависимости от места праймера /затравки/, ориентации олигонуклеотида /т.е. 31-51 или 51-31/ и, следовательно целевой последовательности нуклеиновой кислоты и присутствии одной или двух олигонуклеотидных последовательностей /т. е. олигонуклеотидов с обратной ориентацией/. —тадии амплификации известны, т. е. добавление праймера, удлинение праймера, добавление второго праймера дл€ обратного копировани€ копии мишени и т.д.
¬ варианте, представленном в фиг.5а, 51 - конец олигонуклеотида может быть св€зан с носителем и манипул€цией может быть амплификаци€ нуклеиновой кислоты-мишени, котора€ гибридизуетс€ с олигонуклеотидом. ¬ этом случае олигонуклеотид может служить в качестве праймера или отдельный праймер 11 может быть легирован с олигонуклеотидом перед стадией гибридизации. ¬ любом случае синтезируетс€ продукт удлинени€ праймера 12 /с использованием нуклеиновой кислоты-мишени в качестве матрицы/, начина€ с праймера и до конца целевой нуклеиновой кислоты. “аким образом получена последовательность нуклеиновой кислоты, св€занна€ с носителем и комплементарна€ нуклеиновой кислоте-мишени. ƒл€ удобства эту комплементарную последовательность называют здесь "копией мишени".
«атем носитель можно промыть, а гибридизованные цепи нуклеиновой кислоты /т. е. мишень и копию мишени/ можно впоследствии денатурировать при помощи известных способов /например, нагреванием при определенной температуре/, чтобы на твердом носителе осталась в св€занном через олигонуклеотид виде только копи€ мишени. ƒл€ удобства твердый носитель со св€занным олигонуклеотидом будет называтьс€ в дальнейшем "олиготвердый носитель".
—истему носител€ можно промыть, а копию мишени, котора€ остаетс€ на нем, можно затем применить дл€ синтеза новых количеств исходной нуклеиновой кислоты -мишени. “акой синтез предусматривает гибридизацию праймера 13 с копией мишени, промывание носител€ дл€ удалени€ негибридизовавшегос€ праймера, проведение удлинени€ праймера /с использованием копии мишени в качестве матрицы/ и денатурацию и сбор синтезированной последовательности нуклеиновой кислоты 14. Ётот процесс можно повтор€ть столько раз, сколько требуетс€, до желаемой степени амплификации исходной нуклеиновой кислоты-мишени. ѕредпочтительно, чтобы в каждой стадии амплификации примен€ли один и тот же набор молекул копии мишени.
ѕроцедура, изображенна€ в фиг.5а, пригодна, в частности, дл€ обнаружени€ присутстви€ низких количеств нуклеиновой кислоты-мишени в медицинской пробе. ѕраймер 13 может быть помещен известными способами и операцию детектировани€ провод€т дл€ обнаружени€ соответственно меченой последовательности нуклеиновой кислоты 14. ƒетектирование метки €вл€етс€ подтверждением того, что нуклеинова€ кислота-мишень 3 присутствует в исходной пробе.
¬ модификации, описанной в фиг.5а, процедура двухцепочечна€ нуклеинова€ кислота может содержать сайт рестрикции /например, обеспеченный праймером, лигированным с олигонуклеотидом/ и дл€ отделени€ двухцепочечной молекулы от носител€ примен€ют в этом случае подход€щую рестриктазу.
¬ альтернативном варианте изобретени€ /см. фиг.5/, в котором с носителем св€зан 31- конец олигонуклеотида, манипул€цией может быть секвенирование гибридизованной нуклеиновой кислоты-мишени при помощи стандартной методологии /например, Sanger DNA sequencing technique/. “ак, например 15 может быть гибридизован с нуклеиновой кислотой-мишенью/, котора€ гибридизована с олигонуклеотидом на носителе/. ¬ этом случае пригоден праймер, который будет гибридизоватьс€ с мишенью при температуре, при которой мишень не отсоедин€етс€ плавлением от олигонуклеотида. –еакцию синтеза цепи провод€т затем со смесью четырех дезоксинуклеотидов /дј“‘, т““‘, д“√‘, д÷“‘/ вместе с одним дидезоксинуклеотидом. —интез идет в направлении 51-31 с праймера в направлении олигонуклеотида.
–еакцию провод€т 4 раза с использованием разных дидезоксинуклеотидов каждый раз.  ак известно, присутствие дидезоксинуклеотида позвол€ет получать последовательности нуклеиновых кислот разной длины, как это обозначено прерывистыми лини€ми. ѕродукты четырех реакций раздел€ют параллельно на подход€щем геле и последовательности определ€ют по положению полос на четырех треках. Ётот вариант данного изобретени€ пригоден, в частности, дл€ определени€ точковых мутаций в нуклеиновой кислоте /например, в случае медицинской пробы/ путем сравнени€ полученной последовательности с последовательностью контрольной пробы, с которой известно, что она €вл€етс€ "нормальной" последовательностью.
¬ариант, в котором с носителем св€зан 31 - конец олигонуклеотида, может быть применен также дл€ амплификации последовательности нуклеиновой кислоты-мишени. ¬ этом случае пригоден праймер, который гибридизуетс€ с кислотой при температуре более низкой, чем температура, при которой мишень отсоедин€етс€ плавлением от олигонуклеотида. ”длинение праймера провод€т затем при известных услови€х в направлении олигонуклеотида. ѕолученный продукт - копи€ может быть отсоединен от нуклеиновой кислоты-мишени плавлени€ при условии, в которых нуклеинова€ кислота-мишень остаетс€ гибридизованной с носителем и может примен€тьс€ дл€ следующих реакций амплификации.
¬о всех описанных выше реакци€х амплификации одна и та же матрица остаетс€ св€занной с олиго-твердым носителем и примен€етс€ дл€ последующих реакций амплификации. Ёто €вл€етс€ существенным отличием данного изобретени€ от способа, описанного в ≈–-ј-0200362, т.к. в нем в качестве матриц использовали обе цепи нуклеиновой кислоты-мишени и после первого копировани€ в качестве матриц дл€ второй и последующих стадий амплификации использовали как цепи мишени, так и цепи-копии. ѕоэтому, если на какой-либо из стадий происходила ошибка в копировании, эта ошибка копировалась в "цепной реакции".
ƒанное изобретение избегает этой проблемы либо благодар€ тому, что провод€т одну стадию копировани€ и сохран€ют полученную копию во всех последующих амплификаци€х, либо сохран€ют исходную последовательность мишени дл€ всех амплификаций. ƒанное изобретение также более эффективно, чем описанный в ≈–-ј-0200362 способ, т.к. в данном изобретении негибридизовавшиес€ праймеры и последовательности мишени дл€ копий удал€ют из системы промыванием, а в ≈–-ј-0200362 негибридизовавшиес€ мишень, праймер и продукт - копи€ присутствуют при проведении всего способа, что делает системы неэффективной.
≈ще в одном варианте /см. фиг.5с/ могут быть добавлены два праймера, которые комплементарны различным част€м мишени или копии мишени, в ориентации либо 51-31, либо 31-51, и использованы дл€ проверки последовательности на точковые мутации согласно известным способам (ƒЌ -лигазна€ реакци€ отжига (гибридизации)). ¬ таком анализе праймеры обычно €вл€ютс€ мечеными и тест применим дл€ быстрой диагностики, например, мутации –53 опухолевого супрессорного гена, поскольку 75% всех больных с раком толстой кишки имеют точковую делецию в этом гене.
»з описанного выше должно быть пон€тно, что данный способ отличаетс€ от известных способов тем, что твердофазна€ система и устройство данного изобретени€ делают возможными большую эффективность и больший выход амплифицированной нуклеиновой кислоты. Ёто св€зано с возможностью проведени€ способа в виде отдельных стадий.  олонку можно промывать после каждой гибридизации дл€ удалени€ негибридизовавшейс€ ƒЌ  и р. и "очищать" систему, что значительно повышает эффективность.  омпоненты реакционного раствора на колонке, т. е. вновь амплифицированна€ последовательность-мишень, могут быть отведены в детектор, такой как оптическа€ €чейка, соединенный с колонкой, и присутствие или отсутствие последовательности - мишени быстро подтверждаетс€. Ёто, в частности, применимо дл€ диагностики проб, вз€тых у больных, дл€ определени€ присутстви€ любого вызывающего заболевание организма в пробе при помощи быстрого и надежного способа, не доступного ранее.
—ледующий вариант изобретени€ /который не касаетс€ амплификации/ представлен на фиг.5d. ¬ариант применим дл€ тестировани€ проб на присутствие или отсутствие относительно большого количества нуклеиновой кислоты-мишени. ¬ варианте фиг. 5d и системе носител€ добавл€ют меченый праймер, который гибридизуетс€ с нуклеиновой кислотой-мишенью при температуре, более низкой, чем температура, при которой мишень отсоедин€етс€ от олигонуклеотида плавлением. ≈сли нуклеинова€ кислота-мишень 3 присутствует, то праймер гибридизуетс€ с ней. «атем носитель может быть промыт при температуре, более низкой, чем температура, при которой праймер 6 отсоедин€етс€ плавлением от нуклеиновой кислоты-мишени, дл€ удалени€ негибридизовавшегос€ праймера 16. ¬ следующей стадии твердый носитель нагревают до температуры, при которой праймер 16 отсоедин€етс€ /либо с нуклеиновой кислотой-мишенью, либо без нее/, носитель промывают и элюированный продукт направл€ют к детектору.
≈сли метка детектируетс€, это свидетельствует о присутствии нуклеиновой кислоты-мишени в исходной пробе.
Ќа фиг. 6 изображено устройство, в котором можно проводить гибридизацию нуклеиновой кислоты-мишени с олигонуклеотидом, св€заны с носителем, а также реакции амплификации.
”стройство, изображенное на фиг.6, содержит колонку 20 /эквивалентную колонке 6 - фиг.2/, предварительно загруженную частицами носител€ 21 со св€занным с ними олигонуклеотидом. ќбычно колонка 20 имеет объем приблизительно 200 мкл и имеет входное 23 и выходное 24 отверсти€, снабженные пористыми удерживающими элементами 25 дл€ удерживани€ частиц 21 внутри колонки. ”стройство имеет клапанное приспособление 26-34, как показано на чертеже, и также обеспечено источником сжатого газа, который может подаватьс€ в соответствии со стрелками G. √аз примен€ют дл€ перемещени€ реагентов и продуктов внутри устройства. Ќекоторые клапаны приспособлены дл€ обеспечени€ выброса газа, как указано стрелками V.
 лапан 26 делает возможным селективное сообщение внутреннего пространства колонки 20 с узлом подачи реагентов 35, имеющим отдельные сосуды 35а-35, содержащие растворы /например, пробы, праймеры, буферы и т.д./, которые подаютс€ к колонке 20 через открытые клапаны 26 и 27 при помощи давлени€ газа.  лапан 29 можно примен€ть во врем€ этой процедуры дл€ сн€ти€ избытка давлени€ газа.
Ќа выходной стороне клапана 28 имеетс€ передаточна€ зона 36, котора€ может селективно сообщатьс€ /через клапан 30/ с зоной сбора продукта 37, соединенной с детектором 38, который может быть например, оптическим детектором или детектором дл€ радиоактивной метки. ћожно примен€ть также и другие типы детекторов.
ѕередаточна€ зона 36 может также селективно сообщатьс€ /через клапан 31/ с удерживающей раствор зоной 39 или приемником отходов 40. «она сбора раствора 39 обеспечена одной из трубчатых линий устройства и имеет объем, по меньшей мере равный объему колонки 20.
¬округ колонки обеспечен нагреватель 41, как описано на чертеже.
¬ устройстве могут примен€тьс€, например, тефлоновые клапаны /zero dead Teflon seated valves из Generak Valve, U.S.ј/, а трубки, примен€емые в устройстве, могут быть тефлоновыми трубками диаметром 1,5 мм.
ѕри использовании устройства пробу вместе с подход€щими буферами подают к колонке 20 под давлением газа, как указано ранее. √ибридизацию нуклеиновой кислоты-мишени провод€т при подход€щей температуре с последующим промыванием колонки раствором, подаваемым из узла 35. ѕромывные растворы могут проходить к приемнику отходов 40 через клапаны 28 и 31.  лапан 34 может быть открыт во врем€ этой процедуры дл€ сбора избыточного давлени€.
ѕосле этого провод€т манипул€цию на нуклеиновой кислоте-мишени, наход€щейс€ на носителе. ƒл€ этого соответствующие растворы реагентов подают из узла 36 через р€д клапанов /как дл€ подачи жидкости, так и дл€ сброса давлени€/.
ѕосле проведени€ манипул€ции раствор реагентов может проходить из колонки 20 к зоне удерживани€ раствора 39.
ƒалее продукт манипул€ции отсоедин€ют плавлением от носител€ 21 и направл€ют его к зоне сбора продукта 37 либо дл€ непосредственного детектировани€, либо дл€ хранени€.
≈сли на нуклеиновой кислоте-мишени /или ее копии/, наход€щейс€ на носителе, должна проводитьс€ следующа€ манипул€ци€, то раствор, удерживаемый в зоне 39, может быть возвращен к колонке 20 под давлением газа через клапан 32. ќписанный выше процесс может быть после этого повторен.
ѕродукт манипул€ции может быть собран так часто, как это необходимо, в зоне 37. ¬о врем€ сбора продукта клапан 33 должен быть поставлен на выброс. ƒл€ предотвращени€ немедленного прохождени€ продукта к детектору клапан 33 может быть закрыт после короткого периода времени, так что собранный продукт не может проходить достаточно далеко вдоль зоны 37, чтобы достичь детектора 38. ѕодача газа к детектору 38 позвол€ет очистить его в случае необходимости.
ќписанное выше устройство может быть автоматизировано путем обеспечени€ электронного контрол€ дл€ клапанов.
”стройство может иметь одну колонку, как это показано на фиг.6, или может содержать несколько колонок дл€ тестировани€ нескольких олигонуклеотидных зондов на одной пробе или дл€ тестировани€ одного олигонуклеотидного конца /например, ¬»„-1/ на нескольких пробах.
 роме того, колонка 20 не должна быть фиксированной частью устройства. ћожно, например, обеспечить съемные колонки 20, предварительно загруженные твердым носителем с присоединенным к нему олигонуклеотидом, и затем помещать колонку в устройство. Ёто позвол€ет избежать необходимости удалени€ твердого носител€ из колонки, котора€ возникает дл€ фиксированной колонки.
»зобретение будет описано далее не ограничивающими его примерами. ќлигонуклеотиды, примен€емые в этих примерах /как св€занные с колонкой, так и отщепленные от нее пробы праймеров/, были синтезированы по стандартной программе св€зывани€ на синтезаторе ƒЌ  Biosearch Model 8500. ƒл€ синтеза использовали β-цианоэтил-замещенные фосфоамидиты. ќтщепленные от колонки пробы праймеров были полностью деблокированы /все группы ƒћ√р удалены/ и отщепл€лись автоматически при помощи NH4OH от GPG-колонок.
—в€занные с колонкой олигонуклеотиды не отщепл€лись NH4ќЌ и конечна€ группа ƒћ“р не удал€лась, если это не указано.
ѕосле синтеза как св€занные с колонкой, так и отщепленные олигонуклеотиды переносили в пробирки с завинчивающимис€ крышками с 38% NH4OH /1 мл/. ѕробирки помещали в фиксаторах на 1 час в печь /56o—/ дл€ удалени€ защитных rpegg/. «атем пробирки и фиксаторы переносили в морозильник /-20o—/ на 10 мин. —упернатант с NH4OH удал€ли из св€занных с колонкой олигонуклеотидов и выбрасывали. ѕробы сушили замораживанием в центрифужном сушителе Sav ant и хранили в эксикаторе.  аждый отщепленный от колонки олигонуклеотид делили на три пробирки и очищали присутствующий неочищенный олигонуклеотид.
ѕример 1
ѕриготовление носител€ из силикагел€
1 г кальцинированного носител€ Spherisorb GC сушили над P2O5 в колбе с круглым дном с 40 мл безводного толуола. —одержимое колбы перемешивали при помощи магнитной мешалки и образующуюс€ суспензию нагревали до 90-95o— в масл€ной бане. Ѕезводный 3-глицидосипропил-триметоксисилан /1,5 мл/ добавл€ли к суспензии и продолжали реакцию при перемешивании в течение 3 часов при 90-95o—. ѕри этом следили, чтобы температура не превышала 95o—. ѕосле трех часов реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, фильтровали и промывали безводным толуолом /40 мл/, метанолом /40 мл/ и эфиром /20 мл/. —одержащий функциональные группы силикагель сушили над –2O5 и диоксидом кремни€ в течение ночи.
ѕример 2
—интез замещенного нуклеотидом цитозином носител€
/а/ ѕолучение натриевой соли производного цитозина: 1. диметокситритил-дезоксирибонуклеизида цитозина /ƒћ“р- д÷/ сушили над P2O5 и диоксидом кремни€ в течение нескольких дней. ¬ысушенный ƒћ“р- д÷ раствор€ли в безводном N, N-диметилформамиде /ƒћ‘/ /20 мл/ в атмосфере азота. ѕосле завершени€ растворени€ добавл€ли 0,6 г гидрида натри€ и проводили реакцию с ƒћ“р- д÷ в безводном јћ‘ в течение 20 мин при перемешивании. NaH затем отфильтровывали от реакционной среды.
/а/ –еакци€ приготовленного силикагел€ и производного нуклеозида: высушенный носитель из силикагел€ добавл€ли непосредственно к отфильтрованной натриевой соли нуклеозида и смесь перемешивали с обратным холодильником в течение двух часов. —месь св€занного нуклеозида и носител€ охлаждали до комнатной температуры в течение ночи. «амещенный носитель из диоксида кремни€ фильтровали через фильтр из силицированного матированного стекла и промывали 20 мл каждого из растворителей: безводного ƒћ‘, безводного толуола, метанола и смеси метанола с эфиром. «атем твердый носитель сушили и хранили в эксикаторе.
51 - кислород сахарной части производного нуклеозида защищали группой ƒћ“р, котора€ лабильна в кислоте, и может быть удалена безводными кислотами, такими как дихлоруксусна€ кислота, с образованием €рко-оранжевого катиона ƒћ“р. „асть высушенного замещенного носител€ обрабатывали дихлоруксусной кислотой /1 мл 2% дихлоруксусной кислоты в дихлорметане/. ярко-оранжева€ окраска свидетельствовала о том, что св€зывание носител€ и производного цитозина было успешным.
ѕример 3
Ѕыла разработана процедура выделени€ клона из смеси бактериальной и вирусной ƒЌ , применимого в качестве тест-системы. ÷елева€ последовательность /клонированный ген/ был помещен внутрь бактериофага ћ13mр и содержал две следующие последовательности
√ѕ√ √√“ ÷ѕ÷ јјјј √√√ “÷ј √“√ ÷“√ /1 /
ћ√“ √“√ “÷÷ “““ √“÷ √ј“ ј÷“√ /2/
ћ13 mp €вл€етс€ стандартным вирусом, примен€емым в молекул€рной биологии в качестве рутинного секвенирующего вектора.
Ќа носителе, приготовленном в примере 2, был синтезирован олигонуклеотид следующей последовательности, котора€ гомологична последовательности /1/
÷√÷ ÷÷ј √√√ “““ ‘√“ ÷ј÷ √ј÷ /3/
¬ носитель, полученный в примере 2, был включен остаток цитозина на левом конце этой последовательности.
15 мг твердого носител€ со св€занным с ним олигонуклеотидом помещали в проточную колонку, после чего на колонку наносили смесь E. coli продукт из 10 клеток /и 1 мкг ћ13 ƒЌ  после денатурации нагреванием.  ислоту выдерживали при температуре (“п-2)o—, где “п - температура плавлени€ последовательности /3/, рассчитанна€ по формуле
п=2 (ј+“) +3 (√+÷)
где ј, “, √ и ÷ обозначают соответственно количество остатков аденина, тимина, гуанина и цитозина в последовательности /3/.
ѕоскольку колонку поддерживают при температуре слегка ниже температуры плавлени€ /“п/, вирусна€ ƒЌ  способна гибридизоватьс€ со св€занным олигонуклеотидом.
 олонку поддерживали при (“п-2)o— и промывали 2,5 мл гибридизационного буфера /10 мћ MgCl2 и 10 мћ “рис-HCl, pH 7,5/. ѕромывные растворы из колонки собирали в пробирки по фракци€м 200 мкл /всего 11 фракций/.
 аждую из собранных фракций подвергали затем стандартной реакции секвенировани€ /способ Sanger Coulson/ путем добавлени€ 1 кг последовательности /3/ и каждой из пробирок вместе с ƒЌ -полимеразой /фрагментом  ленова/ и дезоаксирибонуклеотидами и дидезоксирибонуклеотидами в стандартной реакционной смеси.
–еакцию секвенировани€ проводили также на материале, иммобилизованном на колонке. —в€занный с колонкой материал отсоедин€ли плавлением и собирали. —еквенирование проводили с применением той же самой реакционной смеси, которую примен€ли в секвенировании фазы раствора.
ѕродукты реакций секвенировани€ как св€занной с носителем фазы, так и фазы раствора раздел€ли и про€вл€ли на стандартном 8%-ном полиакриламидном геле с использованием стандартных процедур. –езультаты представлены на радиоавтографе фиг. 7, где
ƒорожка /трек/ - ќбъ€снение
1 - ѕоследовательность, полученна€ на св€занном с твердым носителем материале после промывани€ 2,5 мл гибридизационной смеси
2 - ѕоследовательность, полученна€ дл€ первых 200 мкл
3 - ѕоследовательность, полученна€ дл€ следующих 200 мкл
4 - » т.д.
5 - "
6 - "
7 - "
8 - "
9 - "
10 - "
11 - "
12 - "
ƒорожка 1 показывает, что нуклеинова€ кислота-мишень /вирусна€ ƒЌ / действительно была св€зана с носителем /что подтверждено тем фактом, что праймерна€ последовательность /3/ была способна гибридизоватьс€ с нуклеиновой кислотой-мишенью и делала возможной осуществление реакции секвенировани€/. ƒорожки 1-10 также демонстрируют, что не было перекрестной реакции или размытости от ƒЌ  E. coli. —ледовательно, вирусна€ ƒЌ  избирательно удерживалась на носителе.  роме того, св€занна€ с носителем ƒЌ  - мишень стабильно удерживалась на носителе. Ќе было стерического преп€тстви€ дл€ фрагмента  ленова у самого носител€, т.к. реакции секвенировани€ проводили на св€занной с носителем ƒЌ .
ƒорожки 2-12 представл€ют прогрессивно уменьшающиес€ количества ƒЌ -мишени /т. е. вирусной ƒЌ / в промывных растворах из колонки. —ледовательно, к колонке был добавлен избыток вирусной ƒЌ , который не гибридизовалс€ с олигонуклеотидной последовательностью /3/. ѕоэтому св€зывающую способность /емкость/ колонки можно "настрить" на концентрацию нуклеиновой кислоты-мишени.
‘ормула изобретени€: 1. —пособ выполнени€ манипул€ции с последовательностью нуклеиновой кислоты, включающий использование системы твердого носител€, содержащего ковалентно св€занный олигонуклеотид, способный гибридизироватьс€ с нуклеиновой кислотой-мишенью, добавление источника нуклеиновой кислоты-мишени в систему твердого носител€, гибридизацию ее с олигонуклеотидом и промывание твердого носител€, отличающийс€ тем, что используют, по меньшей мере, один олигонуклеотид, имеющий последовательность оснований, комплементарную части последовательности данной одноцепочечной нуклеиновой кислоты-мишени, котора€ содержит большее количество оснований, чем указанный олигонуклеотид, €вл€ющийс€ специфичным дл€ указанной нуклеиновой кислоты-мишени, манипул€цию на нуклеиновой кислоте-мишени выбирают из ее копировани€, денатурации и/или гибридизации, а промывание твердого носител€, размещенного в проточном сосуде, осуществл€ют после гибридизации.
2. —пособ по п.1, отличающийс€ тем, что используют сосуд в виде колонки.
3. —пособ по любому из п.1 или 2, отличающийс€ тем, что используют твердый носитель, содержащий диоксид кремни€.
4. —пособ по любому из пп.1-3, отличающийс€ тем, что используют систему твердого носител€, содержащую частицы.
5. —пособ по п.4, отличающийс€ тем, что используют непористые частицы.
6. —пособ по п.4, отличающийс€ тем, что используют частицы размером от 100 до 200 мкм.
7. —пособ по любому из пп.1-6, отличающийс€ тем, что олигонуклеотиды ковалентно св€заны с системой твердого носител€ посредством прочных основных св€зей.
8. —пособ по п.7, отличающийс€ тем, что указанные св€зи стабильны в течение 2 ч в 38% водном растворе аммиака при 55o—.
9. —пособ по любому из пп.1-8, отличающийс€ тем, что используют твердую систему носител€, содержащую поперечно сшитую силоксановую матрицу.
10. —пособ по любому из пп.1-9, отличающийс€ тем, что используют проточный сосуд объемом 150-250 мкл.
11. —пособ по любому из пп.1-10, отличающийс€ тем, что кодируют последовательность нуклеиновой кислоты с получением копии, по меньшей мере, части указанной последовательности.
12. —пособ по п.11, отличающийс€ тем, что при копировании удлин€ют олигонуклеотид в направлении 5'-3' при использовании гибридизированной нуклеиновой кислоты-мишени в качестве матрицы, при этом получают иммобилизованную копию мишени, ковалентно св€занную с носителем, причем олигонуклеотид ковалентно св€зан носителем 5'-концом.
13. —пособ по п.12, отличающийс€ тем, что включает следующие дополнительные стадии:
(I) денатурацию нуклеиновой кислоты-мишени от указанной иммобилизованной копии нуклеиновой кислоты-мишени, ковалентно св€занной с носителем,
(II) выполнение проточной промывки системы твердого носител€ дл€ удалени€ из нее указанной нуклеиновой кислоты-мишени,
(III) гибридизацию праймера с указанной иммобилизованной копией нуклеиновой кислоты-мишени, ковалентно св€занной с носителем, и
(IV) удлинение праймера в 5'-3' направлении назад к указанному твердому носителю при использовании указанной копии нуклеиновой кислоты-мишени в качестве матрицы, посредством чего получают удлиненный продукт праймера.
14. —пособ по п.13, отличающийс€ тем, что дополнительно провод€т денатурацию удлиненного продукта праймера от иммобилизованной копии с последующим сбором удлиненного праймера.
15. —пособ по п. 14, отличающийс€ тем, что, по меньшей мере, один раз повтор€ют операции по пп.13 и 14.
16. —пособ по п.13, отличающийс€ тем, что при гибридизации используют меченый праймер с последующим получением меченого удлиненного продукта.
17. —пособ по п.11, отличающийс€ тем, что дополнительно провод€т гибридизацию праймера с нуклеиновой кислотой-мишенью, а копирование включает удлинение праймера, ковалентно прикрепленного 3'-концом нуклеотида к системе твердого носител€, в направлении 5'-3' назад к указанной системе твердого носител€.
18. —пособ по п.17, отличающийс€ тем, что дополнительно включает стадии денатурации удлиненного продукта праймера от нуклеиновой кислоты-мишени, в то врем€ как указанна€ нуклеинова€ кислота-мишень остаетс€ гибридизованной с олигонуклеотидом.
19. —пособ по п. 17, отличающийс€ тем, что выполн€ют копирование со смесью четырех дезоксинуклеотидов dј“‘, dT“‘, d√“‘, d÷“‘ с одним из четырех дидезоксинуклеотидов, денатурируют и собирают удлиненные продукты праймера, в то врем€ как нуклеинова€ кислота-мишень остаетс€ гибридизированной с олигонуклеотидом, повтор€ют вышеуказанные стадии по очереди с трем€ другими дидезоксинуклеотидами с последующим анализом собранных удлиненных продуктов праймера дл€ определени€ последовательности нуклеиновой кислоты-мишени.
20. —пособ по любому из пп.1-10, отличающийс€ тем, что провод€т денатурацию нуклеиновой кислоты-мишени от указанных нуклеотидов.
21. —пособ по любому из пп.1-10, отличающийс€ тем, что используют гибридизацию меченого зонда с нуклеиновой кислотой-мишенью.
22. ”стройство дл€ проведени€ манипул€ций на последовательности нуклеиновой кислоты, содержащее проточный сосуд, отличающеес€ тем, что проточный сосуд снабжен системой твердого носител€, с которым ковалентно св€заны посредством основных стабильных св€зей одноцепочечные олигонуклеотиды, имеющие последовательность оснований, комплементарную к части последовательности кислоты-мишени, котора€ содержит большее количество оснований, чем указанный олигонуклеотид, причем указанный олигонуклеотид, который специфичен дл€ указанной нуклеиновой кислоты-мишени, средство дл€ хранени€ растворов, удаленных из сосуда во врем€ промывки или других операций перед возвращением растворов в сосуд, детекторные средства дл€ обнаружени€ продуктов манипул€ций нуклеиновой кислоты и средства контрол€ за подачей растворов в сосуд и отвода из сосуда в слив или на хранение и к средствам обнаружени€.
23. ”стройство по п. 22, отличающеес€ тем, что проточный сосуд представл€ет собой колонку.
24. ”стройство по п.22 или 23, отличающеес€ тем, что система твердого носител€ включает частицы.
25. ”стройство по п.24, отличающеес€ тем, что частицы имеют размер от 100 до 200 мкм.
26. ”стройство по п.24 или 25, отличающеес€ тем, что частицы €вл€ютс€ непористыми.
27. ”стройство по п.24, отличающеес€ тем, что частицы €вл€ютс€ диоксидом кремни€.
28. ”стройство по любому из пп.22-27, отличающеес€ тем, что олигонуклеотиды €вл€ютс€ ковалентно св€занными с твердым носителем посредством ковалентных св€зей, которые стабильны в течение 2 ч в 38% NH4OH при 55o—.
29. ”стройство по любому из пп.22-28, отличающеес€ тем, что система твердого носител€ обеспечиваетс€ поперечно-сшитой силоксановой матрицей, с которой ковалентно св€заны указанные олигонуклеотиды дл€ обеспечени€ кислотного и основного стабильного св€зывани€ олигонуклеотидов с системой твердого носител€.
30. ”стройство по любому из пп.22-29, отличающеес€ тем, что сосуд имеет объем от 150 до 250 мкл.
31. ѕроточный сосуд, имеющий вход и выход и содержащий систему твердого носител€, содержащую ковалентно св€занные с ней посредством основных стабильных св€зей одноцепочечные олигонуклеотиды, имеющие последовательность оснований, комплементарную части последовательности данной нуклеиновой кислоты-мишени, имеющей большее число оснований, чем олигонуклеотид, причем указанный олигонуклеотид €вл€етс€ специфичным дл€ указанной нуклеиновой кислоты-мишени и указанный сосуд содержит пористые задерживающие элементы дл€ сохранени€ указанных частиц в сосуде.
32. —осуд по п.31, отличающийс€ тем, что представл€ет собой колонку.
33. —осуд по п.31 или 32, отличающийс€ тем, что тверда€ система носител€ включает частицы.
34. —осуд по п.33, отличающийс€ тем, что частицы имеют размер от 100 до 200 мкм.
35. —осуд по п.33 или 34, отличающийс€ тем, что частицы €вл€ютс€ непористыми.
36. —осуд по любому из пп.33-35, отличающийс€ тем, что частицы представл€ют собой диоксид кремни€.
37. —осуд по любому из пп.31-36, отличающийс€ тем, что олигонуклеотиды €вл€ютс€ ковалентно св€занными с системой твердого носител€ посредством ковалентных св€зей, которые стабильны в течение 2 ч в 38% NH4OH при 55o—.
38. —осуд по любому из пп.31-37, отличающийс€ тем, что частицы обеспечены поперечно сшитой силоксановой матрицей, с которой ковалентно св€заны олигонуклеотиды, дл€ обеспечени€ указанного кислотного и основного стабильного св€зывани€ олигонуклеотидов с указанными частицами.
39. —осуд по любому из пп.32-38, отличающийс€ тем, что сосуд имеет объем от 150 до 250 мкл.
40. “вердый носитель дл€ иммобилизации последовательности нуклеиновой кислоты, где указанный носитель содержит поперечно-сшитую силоксановую матрицу, содержащую реакционноспособные группы, способные образовывать основные стабильные ковалентные св€зи с нуклеиновой кислотой дл€ иммобилизации посредством этого нуклеиновой кислоты на носителе.
41. Ќоситель по п.40, отличающийс€ тем, что реакционноспособные группы представл€ют собой эпоксигруппы.
42. Ќоситель по п.40 или 41, отличающийс€ тем, что представл€ет собой непористый диоксид кремни€.
43. Ќоситель по любому из пп.40-42, отличающийс€ тем, что включает частицы, имеющие размер от 100 до 200 мкм.
44. “вердый носитель, включающий поперечно-сшитую силоксановую матрицу, содержащую одноцепочечные олигонуклеотиды, ковалентно св€занные с ней посредством основных стабильных св€зей, где олигонуклеотиды имеют последовательность оснований, комплементарную части последовательности данной нуклеиновой кислоты-мишени, котора€ содержит большее число оснований, чем олигонуклеотиды, причем указанные олигонуклеотиды €вл€ютс€ специфичными дл€ нуклеиновой кислоты-мишени.
45. “вердый носитель по п.44, отличающийс€ тем, что твердый носитель дополнительно включает непористый диоксид кремни€.
46. “вердый носитель по п.45, отличающийс€ тем, что непористый диоксид кремни€ имеет размер частиц от 100 до 200 мкм.
47. —пособ получени€ носител€ дл€ иммобилизации последовательности нуклеиновой кислоты, отличающийс€ тем, что включает взаимодействие твердого носител€, содержащего свободные гидроксильные группы, с исходным веществом силоксановой матрицы, котора€ реактивна с указанными свободными гидроксильными группами, и которое содержит группу, способную образовывать основную стабильную ковалентную св€зь с последовательностью нуклеиновой кислоты дл€ иммобилизации таким образом последовательности нуклеиновой кислоты на носителе, и нагревание продукта дл€ получени€ силоксановой матрицы.
ѕриоритет по пунктам:
24.12.1991 по пп.1-8, 11-28, 31-37, 41-46;
08.12.1992 по пп. 9,29,38,40,47;
23.12.1992 по пп.10.30.39.