Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
СОЕДИНЕНИЕ САХАРА
СОЕДИНЕНИЕ САХАРА

СОЕДИНЕНИЕ САХАРА

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Изобретение относится к химической и биотехнологической промышленности. Соединение сахара получено путем воздействия на фукоидан эндофукоиданлиазы. Данное соединение обладает биологической активностью и его применение позволяет анализировать структуру фукоидана. 9 з.п. ф-лы, 42 ил., 2 табл.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2193039
Класс(ы) патента: C07H11/00, C12N9/24, C12N1/20, C12P19/14
Номер заявки: 97119864/13
Дата подачи заявки: 22.04.1996
Дата публикации: 20.11.2002
Заявитель(и): ТАКАРА СУЗО КО., ЛТД. (JP); РИСЕРЧ ИНСТИТЬЮТ ФОР ГЛИКОТЕКНОЛОДЖИ (JP)
Автор(ы): САКАИ Такеси (JP); КИМУРА Хитоми (JP); КОДЗИМА Каору (JP); НАКАНИСИ Йосикуни (JP); КАТО Икуносин (JP); ИКАИ Кацусиге (JP); АКИЙОСИ Сумико (JP)
Патентообладатель(и): ТАКАРА СУЗО КО., ЛТД. (JP); РИСЕРЧ ИНСТИТЬЮТ ФОР ГЛИКОТЕКНОЛОДЖИ (JP)
Описание изобретения: Изобретение относится к соединениям сахара, полезным в области исследований углеводов, полисахаридлиазе, применяемой при производстве этих соединений сахара, и к микроорганизмам, принадлежащим к роду Fucoidanobacter, полезным при производстве соединений сахара.
Предпосылки изобретения
Сообщалось о том, что фукоидан, который представляет собой сульфатированный полисахарид, содержащийся в бурых водорослях (Phaeophyta), обладает различными биологическими активностями, включая антикоагуляционное действие, снижение количества липидов в крови, противоопухолевое, ингибирующее образование раковых метастазов действие, а также противодействие вирусной инфекции СПИД. Таким образом, фукоидан является важным компонентом в качестве лекарственного средства.
Однако в случае применения фукоидана как такового в качестве лекарственного средства возникают проблемы антигенности, однородности, антикоагуляционной активности и т.д., так как фукоидан представляет сульфатированный полисахарид с очень большим молекулярным весом. Соответственно, часто возникает необходимость до некоторой степени разрушить фукоидан.
Поэтому необходимо определить структуру фукоидана и выявить ее связь с его биологической активностью. Фукоидан представляет собой высокомолекулярное соединение, содержащее множество боковых цепей и различные составляющие сахара. Более того, его сульфатные группы находятся в различных положениях. Эти особенности делают чрезвычайно затруднительным анализ структуры фукоидана. Для того чтобы проанализировать структуру полисахарида, известен способ, включающий обработку полисахарида ферментом, способным его расщеплять, и проведение анализа структур образующихся при этом олигосахаридов. Однако до сих пор не было коммерчески доступных ни фукоидан расщепляющих ферментов, которые давали бы продукты с известной структурой сахарной цепи, ни чего-либо, что могло бы служить стандартом фукоиданового олигосахарида, среди до сих пор известных.
Вот почему были необходимы соединения сахара с известными структурами, фермент, расщепляющий полисахарид и использующийся в получении этих соединений сахара, и микроорганизм, пригодный для продуцирования соединений сахара.
Целью настоящего изобретения является создание соединений сахара, которые можно было бы использовать при анализе структуры фукоидана, идентифицируя продукты энзиматического разложения фукоидана и определяя их биологические активности, новая эндо-фукоидан-лиаза, полезная при исследовании фукоидана, например, при получении олигосахаридов фукоидана, и новый микроорганизм, пригодный для продуцирования соединений сахара.
Первой целью настоящего изобретения являются соединения сахара, представленные следующей общей формулой (1) или (2), в которых, по крайней мере, одна спиртовая гидроксильная группа была сульфатирована, или их соли (см. в конце описания), где X представляет водород или группу, представленную формулой (3) (см. в конце описания), У представляет водород или группу, представленную формулой 4 или 5 (см. в конце описания), при условии, что Х и У не представляют водород одновременно; и Z представляет водород, или группу, представленную формулой (6) (см. в конце описания).
Примеры соединений, представленных приведенными ранее формулами (1) или (2), приведены далее в виде формул (7)-(15) (см. в конце описания).
Второй целью настоящего изобретения является эндо-фукоидан-лиаза, отличающаяся следующими физикохимическими свойствами:
I) Функция: действует на фукоидан, и при этом высвобождает, по крайней мере, соединения, представленные ранее формулами (7) и (8).
II) Оптимальные значения рН: в интервале рН от 6 до 10.
III) Оптимальная температура: в интервале от 30 до 40oС.
Третьей целью настоящего изобретения является бактерия, принадлежащая к роду Fucoidanobacter, которая является новым микроорганизмом, который используют в производстве соединений сахара в соответствии с первым разделом настоящего изобретения, содержащих менахинон в цепи передачи электронов и содержащих 60% GC.
В формулах (1), (2), (4)-(15) и (17)-(25), здесь представленных, знак "~ " означает, что как манноза, так и галактоза существуют в виде α- и β-аномеров.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что соединения сахара настоящего изобретения можно получить, обрабатывая фукоидан ферментом, который составляет вторую цель настоящего изобретения, или клеточным экстрактом или надосадочной жидкостью культуры бактерий в соответствии с третьей целью настоящего изобретения, в результате чего осуществляется настоящее изобретение.
Краткое описание чертежей
Фиг.1 представляет картину элюирования соединения сахара (а), представляющего пиридил-(2)-аминированный (РА-а), которое элюируется из L-колонки.
Фиг.2 представляет картину элюирования соединения сахара (b), представляющего пиридил-(2)-аминированный (РА-b), которое элюируется из L-колонки.
Фиг.3 представляет картину элюирования соединения сахара (с), представляющего пиридил - (2)-аминированный (РА-с), которое элюируется из L-колонки.
Фиг.4 представляет картину элюирования соединения сахара (d), представляющего пиридил-(2)-аминированный (PA-d), которое элюируется из L-колонки.
Фиг.5 представляет картину элюирования соединения сахара (е), представляющего пиридил-(2)-аминированный (РА-e), которое элюируется из L-колонки.
Фиг.6 представляет картину элюирования соединения сахара (f), представляющего пиридил-(2)аминированный (РА-f), которое элюируется из L-колонки.
Фиг.7 представляет картину элюирования соединения сахара (g), представляющего пиридил-(2)-аминированный (РА-g), которое элюируется из L-колонки.
Фиг.8 представляет картину элюирования соединения сахара (h), представляющего пиридил-(2)-аминированный (РА-h), которое элюируется из L-колонки.
Фиг.9 представляет картину элюирования соединения сахара (i), представляющего пиридил-(2)-аминированный (PA-i), которое элюируется из L-колонки.
Фиг.10 представляет масс-спектр (отрицательное измерение) соединения сахара (а).
Фиг.11 представляет масс-спектр (отрицательное измерение) соединения сахара (b).
Фиг.12 представляет масс-спектр (отрицательное измерение) соединения сахара (с).
Фиг.13 представляет масс-спектр (отрицательное измерение) соединения сахара (d).
Фиг.14 представляет масс-спектр (отрицательное измерение) соединения сахара (е).
Фиг.15 представляет масс-спектр (отрицательное измерение) соединения сахара (f).
Фиг.16 представляет масс-спектр (отрицательное измерение) соединения сахара (g).
Фиг.17 представляет масс-спектр (отрицательное измерение) соединения сахара (h).
Фиг.18 представляет масс-спектр (отрицательное измерение) соединения сахара (i).
Фиг. 19 представляет масс-масс-спектр (отрицательное измерение) соединения сахара (а).
Фиг. 20 представляет масс-масс-спектр (отрицательное измерение) соединения сахара (b).
Фиг.21 представляет масс-масс-спектр соединения сахара (с) (отрицательные измерения).
Фиг.22 представляет масс-масс-спектр соединения сахара (d) (отрицательные измерения).
Фиг.23 представляет масс-масс-спектр соединения сахара (е) (отрицательные измерения).
Фиг.24 представляет масс-масс-спектр соединения сахара (f) (отрицательные измерения).
Фиг.25 представляет масс-масс-спектр соединения сахара (g) (отрицательные измерения).
Фиг.26 представляет масс-масс-спектр соединения сахара (h), (отрицательные измерения).
Фиг.27 представляет масс-масс-спектр соединения сахара (i) (отрицательные измерения).
Фиг.28 представляет 1H ЯМР спектр соединения сахара (a).
Фиг.29 представляет 1Н-ЯМР спектр соединения сахара (b).
Фиг.30 представляет 1H-ЯМР спектр соединения сахара (c).
Фиг.31 представляет 1Н-ЯМР спектр соединения сахара (d).
Фиг.32 представляет 1Н-ЯМР спектр соединения сахара (e).
Фиг.33 представляет 1Н-ЯМР спектр соединения сахара (f).
Фиг.34 представляет 1H-ЯМР спектр соединения сахара (g).
Фиг.35 представляет 1H-ЯМР спектр соединения сахара (h).
Фиг.36 представляет 1H-ЯМР спектр соединения сахара (i).
Фиг. 37 представляет график зависимости относительной активности (%) фермента в соответствии со второй целью изобретения от величины рН.
Фиг. 38 представляет график зависимости относительной активности (%) фермента в соответствии со второй целью изобретения от температуры (oC).
Фиг. 39 представляет график зависимости остаточной активности фермента (%) в соответствии со второй целью изобретения от величины рН при обработке.
Фиг. 40 представляет график зависимости остаточной активности (%) фермента в соответствии со второй целью настоящего изобретения от температуры (oС) при обработке.
Фиг.41 представляет картину элюирования соединений сахара (а)-(i), выделенных за счет DEAE - Sepharose FF.
Фиг.42 представляет картины элюирования соединений сахара (h) и (i), выделенных за счет DEAE-Sepharose FF.
Далее настоящее изобретение будет раскрыто более подробно.
Штамм, который следует использовать в соответствии со вторым разделом настоящего изобретения, может быть произвольным, если только он принадлежит к роду Flavobacterium и способен продуцировать эндо-фукоидан-лиазу настоящего изобретения. В качестве конкретного примера штамма, способного продуцировать эндо-фукоидан-лиазу, можно указать Flavobacterium sp. SA-0082 штамм. Соединения сахара первой цели настоящего изобретения можно получить, обрабатывая фукоидан эндо-фукоидан-лиазой, полученной из этого штамма.
Этот штамм, который был обнаружен впервые авторами настоящего изобретения из морской воды в Aomori, обладает следующими микологическими свойствами.
1. Flavobacterium sp. SA-0082 штамм
а. Морфологические свойства
1) короткая палочка; ширина: 0,8-1,0 мкм,
длина: 1,0-1,2 мкм
2) Споры: нет
3) Окрашивание по Граму: -
b. Физиологические свойства
1) Температурный интервал роста: способен расти при 37oС или ниже, подходящая температура для роста в интервале от 15 до 28oС.
2) Отношение к кислороду: аэробный
3) Каталаза: +
4) Оксидаза: +
5) Уреаза: слабый +
6) Образование кислоты
D-глюкоза: +
лактоза: +
мальтоза: +
D - маннит: +
сахароза: -
трегалоза: -
7) Гидролиз
крахмал: -
желатин: +
казеин: -
эскулин: +
8) Восстановление нитрата: -
9) Образование индола: -
10) Образование сероводорода: -
11) Отверждение молока: -
12) Потребность в натрии: +
13) Потребности в солях
Рост в среде без NaCl: -
Рост в среде с 1% NaCl: -
Рост в морской воде: +
14) Хинон: менахинон 6
15) GC содержание во внутриклеточной ДНК: 32%
16) OF-тест: О
17) Цвет колоний: желтый
18) Подвижность: нет
19) Скольжение: нет
Можно утверждать, что этот штамм является штаммом бактерии, аналогичной Flavobacterium aguatile u Flavobacterium meningosepticum, описанной в Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol.1(1984) и в Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Vol. 9(1994). Однако этот штамм отличается от первого тем, что не способен образовывать кислоту за счет метаболизма сахарозы, не способен разлагать кезиин, способен разлагать эскулин, способен ожижать желатин и позитивен по отношению к уреазе, а от последнего отличается тем, что не способен разлагать казеин и медленно растет при 37oС. Соответственно, этот штамм определен как штамм бактерии, принадлежащей к роду Flavobacterium и назван Flavobacterium sp. SA-0082.
Вышеуказанный штамм обозначен как Flavobacterium sp. SA-0082 и депонирован в National Institute of Bioscien-ce and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (адрес: 1-3, Higashi 1-chome,Tsaukuba, Ibaragi, 305 JAPAN) под регистрационным номером FERM P-14872 с марта 29, 1995 и депонирован в National Institute of Bioscience and Human Technology, как указано выше, под регистрационным номером FERM BP-5402 (перенос в международный депозитарий зарегистрирован 15 февраля 1996 г.).
Что касается питательных веществ, которые необходимо добавлять в среду для инкубирования штамма, который используют в соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения, то они могут быть любыми, если только используемый штамм может потреблять их с тем, чтобы продуцировать эндо-фукоидан-лиазу второго аспекта изобретения. Подходящие примеры источников углерода включают фукоидан, порошок морских водорослей, альгининовую кислоту, фукозу, маннит, глицерин сахарозу, мальтозу, лактозу и крахмал, тогда как соответствующие примеры источников азота включают дрожжевой экстракт, пептон, казаминовую кислоту, жидкость от замачивания кукурузы, мясной экстракт, обезжиренную сою, сульфат аммония и хлорид аммония. Кроме того, среда может содержать неорганические вещества и такие соли металлов, как соли натрия, фосфаты, соли калия, соли магния и соли цинка.
Этот штамм хорошо растет также в морской воде или в искусственной морской воде, содержащей вышеуказанные питательные вещества.
При инкубировании штамма, продуцирующего эндо-фукоидан-лиазу в соответствии со второй целью настоящего изобретения, выход фермента варьируется в зависимости от условий инкубирования. Обычно предпочтительно, чтобы температура в процессе инкубирования менялась от 15 до 30oС, а величина рН среды была от 5 до 9. Выход эндо-фукоидан-лиазы достигает максимума при инкубированими штамма в условиях аэрации и при перемешивании в течение 5-72 часов. На самом деле, условия инкубирования выбирают в соответствии с используемым штаммом, составом среды и т.д., с тем чтобы достичь максимального выхода.
Эндо-фукоидан-лиаза в соответствии со второй целью настоящего изобретения содержится как в клетках, так и в надосадочной жидкости.
Вышеуказанный Flavobacterium sp. SA-0082 инкубируют в подходящей среде, и клетки собирают и разрушают способами, которые обычно используют для разрушения клеток, например, ультразвуком. Таким образом получают не содержащий клеток экстракт.
Затем этот экстракт очищают способами, которые обычно используют специалисты, получая в результате очищенный препарат фермента. Так, например, такую очистку можно осуществить за счет высаливания, с помощью ионообменной хроматографии, хроматографически с гидрофобно связывающей колонкой, за счет гель-фильтрации или т.п., получая в результате эндо-фукоидан-лиазу второго раздела настоящего изобретения, не содержащую каких-либо других разрушающих фукоидан ферментов.
Надосадочная жидкость культуральной среды, полученная после удаления клеток из вышеуказанной культуральной среды, также содержит большое количество фермента (внеклеточный фермент), который можно очистить таким же способом, что и тот, который используют для очистки внутриклеточного фермента.
Эндо-фукоидан-лиаза в соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения обладает следующими химическими и физикохимическими свойствами. Внеклеточный фермент идентичен внутриклеточному по своим свойствам, кроме молекулярного веса.
I) Функции: действует на фукоидан таким образом, что вызывает высвобождение, по крайней мере, соединений сахара, представленных вышеуказанными формулами (7) и (8).
II) Оптимальные значения рН: в интервале от рН 6 до рН 10 (фиг.37), а именно, фиг.37 представляет график зависимости относительной активности этого фермента от величины рН, где по оси ординат отложена относительная активность (%), а по оси абсцисс - величина рН.
III) Оптимальная температура: в интервале от 30 до 40oС (фиг.38), а именно, фиг. 38 представляет график зависимости относительной активности фермента от температуры, где по оси ординат отложена относительная активность (%), тогда как по оси абсцисс отложена температура (oС).
IV) Стабильность рН: стабилен в интервале значений рН от 6 до 11,5 (фиг. 39), а именно, фиг.39 представляет график зависимости остаточной активности этого фермента от величины рН при обработке, где по оси ординат отложена остаточная активность (%), тогда как по оси абсцисс отложена величина рН.
V) Температурная стабильность: стабилен в интервале температур около 30oС или менее (фиг.40), а именно, фиг.40 представляет график зависимости остаточной активности этого фермента от температуры при обработке, где по оси ординат отложена остаточная активность (%), а по оси абсцисс отложена температура (oС).
VI) Молекулярный вес: молекулярный вес этого фермента по данным гельфильтрации, измеренный на Sephacryl S-200 (модиф. Pharmacia) составляет около 70000 в случае внеклеточного фермента штамма Flavobacterium Sp. SA-0082 или около 460000 в случае внутриклеточного фермента этого штамма.
VII) Способ определения энзиматической активности.
Активность эндо-фукоидан-лиазы в соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения определяют следующим образом.
50 мкл 2,5% раствора фукоидана, полученного из Kjell-maniella crassifolia, 10 мкл эндо-фукоидан-лиазы второго раздела настоящего изобретения и 60 мкл 83 мМ фосфатного буфера (рН 7,5), содержащего 667 мМ хлорида натрия, смешивают вместе и подвергают взаимодействию при 37oС в течение 3 часов. Затем 105 мкл реакционной смеси смешивают с 2 мл воды при перемешивании и измеряют поглощение (AT) на длине волны 230 нм. В качестве контролей используют реакционную смесь, полученную таким же способом, но заменяя эндо-фукоидан-лиазу второго раздела настоящего изобретения одним только вышеуказанным буфером, который использовали для растворения фермента, и другую реакционную смесь, полученную таким же способом, но с заменой фукоиданового раствора одной только водой, и также измеряя их поглощение (АВ1 и АВ2).
Количество фермента, за счет которого происходит расщепление гликозидной связи между маннозой и уроновой кислотой (1 мкмоль) в течение одной минуты принимают за единицу (U). Расщепленную таким образом связь определяют, принимая миллимолярный молекулярный коэффициент экстинкции ненасыщенной уроновой кислоты, образующейся в реакции элиминирования, за 5,5. Активность фермента определяют в соответствии со следующим уравнением:
Активность (U/мл)=(АТ-АВ1-АВ2)(2,105•120/(5,5•105•0,01•180);
2,105: объем (мл) образца, поглощение которого предстоит измерить;
120: объем (мкл) ферментной реакционной смеси;
5,5: миллимолярный молекулярный коэффициент экстинкции (коэффициент (мМ) ненасыщенной уроновой кислоты на 230 нм;
105: объем (мкл) реакционной смеси, используемой для разбавления;
0,01: объем (мл) фермента; и
180: время реакции (мин).
Количество протеина определяют, измеряя поглощение ферментного раствора на 280 нм, и рассчитывают, принимая поглощение 1 мг/мл раствора протеина за 1,0.
В настоящем изобретении определили механизм действия эндо-фукоидан-лиазы второго аспекта настоящего изобретения следующим образом.
1) Получение Kjellmaniella crassifolia фукоидана
Сухую Kjellmaniella crassifolia измельчают с помощью мельницы модель М-2 (произв. Nara Kikai Seisakusho) и обрабатывают 10 кратным объемом 85% метанола при 70oС в течение 2 часов. Затем фильтруют, а остаток обрабатывают далее в 10 кратном объеме метанола при 70oС в течение 2 часов. После фильтрования добавляют 20 кратный объем воды к остатку. Затем смесь обрабатывают при 100oС в течение 3 часов и фильтруют, в результате чего получают экстракт. Концентрацию солей в экстракте доводят до уровня, соответствующего 400 мМ раствору хлорида натрия. К этому добавляют цетилпиридинийхлорид до тех пор, пока уже больше не образуется осадка. После центрифугирования осадок тщательно промывают этанолом, полностью удаляя тем самым цетилпиридинийхлорид. Затем все это обессоливают и удаляют низкомолекулярные вещества, используя ультрафильтр (ультрафильтрационная мембрана с исключением по молекулярному весу: 100000 произв. Amicon). Полученный при этом осадок удаляют центрифугированием. Надосадочную жидкость высушивают замораживанием, получая очищенный Kjellmaniella crassifolia фукоидан. Выход продукта составляет около 4% в расчете на вес сухого порошка Kjellmaniella crassifolia.
2) Расщепление фукоидана эндо-фукоидан-лиазой и выделение продуктов расщепления.
Очищенный фукоидан, полученный из Kjellmaniella crassifolia, обрабатывают эндо-фукоидан-лиазой настоящего изобретения, в результате чего получают в большом количестве продукты расщепления.
А именно, 600 мл 5% раствора фукоидана, полученного из Kjellmaniella crassifolia, 750 мл 100 мл фосфатного буфера (рН 8,0), 150 мл 4 М хлорида натрия и 3,43 мл 1750 мU/мл раствора эндо-фукоидан-лиазы настоящего изобретения смешивают вместе и оставляют реагировать при 25oС в течение 144 часов. Затем реакционную смесь подвергают диализу, используя мембрану для диализа с размером пор 3500, и отбирают фракцию с молекулярным весом 3500 или менее. После обессоливания с помощью Micro Acilyzer G3 (изг. Asahi Chemical Industry Co, Ltd). Эту фракцию разделяют на девять фракций (а), (b), (с), (d), (е), (f), (g), (h), (i) с помощью DEAE-Sepharose FF. Фиг.41 представляет картину элюирования этих фракций, где по оси абсцисс отложен номер фракции; ось ординат слева и черные кружки относятся к содержанию сахара в образце, определенному по методу с использованием фенола-серной кислоты и представленному как поглощение на 480 нм; ордината справа и пустые кружки относятся к содержанию ненасыщенной глюкуроновой кислоты в образце, представленному как поглощение при 235 нм, а еще правее ордината и пунктирная линия относятся к концентрации ацетата аммония (М) в элюате. Номера фракций и соответствующие фракции следующие:
а) от 42 до 43; (b) от 84 до 91; (с) от 51 до 52; (d) 79; (с) от 102 до 103; (f) от 62 до 63; (д) 45; (h) 75 и (i) 77.
Что касается фракции (h) и (i), то вышеуказанные фракции 64-78 объединяют и повторно очищают с помощью DEAE-Sepharose FF. Фиг.42 представляет картину элюирования этих фракций, где по оси абсцисс отложен номер фракции, ордината слева и черный кружок относятся к содержанию сахара в образце, определенному методом с использованием фенола-серной кислоты, выражненному как поглощение на 480 нм, ордината справа и пустые кружки относятся к содержанию ненасыщенной глюкуроновой кислоты в образце, выраженному как поглощение при 235 нм, а еще правее ордината и пунктирная линия представляют концентрацию ацетата аммония (М) в элюате. Номера фракций для этих фракций соответственно следующие: (h) от 92 до 96 и (i) от 99 до 103.
3) Анализ структуры продукта ферментной реакции
Подтверждение однородности каждой фракции
Часть каждой из вышеуказанных девяти фракций (а), (b), (с), (d), (е), (f), (g), (h) и (i) пиридил-(2)-аминируют (РА) по восстанавливающему концу, используя Gly-coTAG и GlycoTAG набор реагентов /произв. Takara Shuzo Co., Ltd. / до получения таким образом РА сахаридов (РА-а), (РА-b), (РА-с), (PA-d), (РА-е), (PA-f), (PA-g), (РА-h) и (РА-i), которые затем анализируют с помощью ВЭЖХ. Таким образом подтверждается, что каждый из (РА-а), (РА-b), (РА-с), (PA-d), (PA-e), (PA-f), (PA-g), (PA-h) и (PA-i) представляет однородное вещество.
Условия осуществления анализа с помощью ВЭЖХ:
Прибор: Model L-6200(Hitachi, Ltd.).
Колонка: L-колонка (4,6х250 мм) (Kagaku Yakuhin Kensa Kyokai (Foundation)).
Элюент: 50 мМ уксусная кислота-триэтиламин (рН 5,5) для веществ вышеуказанных формул (7), (8) и (9) /т.е. (РА-а), (РА-b) и (РА-с)/;
100 мМ уксусная кислота-триэтиламин (рН 5) для веществ вышеуказанных формул (10), (12), (13) и (15) /т.е. (PA-d), (PA-f), (PA-g) и (PA-i)/;
200 мМ уксусная кислота-триэтиламин (рН 3,8) от 0 до 10 минут и 200 мМ смесь уксусной кислоты - триэтиламина (рН 3,8), содержащая 0,5% тетрагидрофурана, от 10 до 60 минут при линейном изменении отношения первого к последнему от 100:0 до 20:80 для вещества формулы (11) /т.е. (РА-е)/;
и 200 мМ уксусная кислота-триэтиламин (рН 3,8) и 200 мМ уксусная кислота-триэтиламин (рН 3,8), содержащая 0,5% тетрагидрофурана от 0 до 60 минут при линейном изменении отношения первого к последнему с 80:20 до 50:50 для вещества формулы (14) /т.е. (PA-h)/.
Детектирование: Флуорометрический детектор F-1150 (Hitachi, Ltd), длина волны возбуждения: 320 нм, флуоресцентная длина волны 400 нм.
Скорость потока: 1 мл/мин.
Температура колонки: 40oС.
Анализ восстанавливающего конца сахара и нейтральная сахарная композиция продукта ферментной реакции
РА - сахара (РА-а), (РА-b), (Ра-с), (Pa-d), (РА-е), (PA-f), (Ра-g), (РА-h) и (Pa-i) каждый гидролизуют, обрабатывая 4Н соляной кислотой при 100oС в течение 3 часов, и восстанавливающий конец сахара исследуют с помощью ВЭЖХ.
Затем восстанавливающие концы этих гидролизатов пиридил-(2)-аминируют (РА), используя GlycoTAG и GlycoTAG реагентный набор /каждый изгот. Takara Shuzo Co., Ltd./ и нейтральные сахарные композиции анализируют с помощью ВЭЖХ. Условия проведения ВЭЖХ:
Прибор: Model L-6200 (Hitachi, Ltd).
Колонка: PALPAK Type A (4,6 мм х 150 мм, Takara Shuzo, Co, Ltd.)
Элюент: 700 мМ боратный буфер (рН 9,0): ацетонитрил = 9:1.
Детектирование: Флуорометрический детектор F-1150 /Hitachi, Ltd. /, возбуждение на длине волны 310 нм, флуоресценция на 380 нм;
Скорость потока: 0,3 мл/мин и
Температура колонки: 65oС.
В результате было обнаружено, что (РА-а), (РА-b), (РА-с), (РА-d), (РА-е), (PA-f) и (PA-i) все имеют маннозу в качестве восстанавливающего конца сахара. Что касается нейтральной сахарной композиции, то (РА-а), (РА-b), (РА-с), (РА-е), (РА-f) и (PA-i) содержат маннозу и фукозу в эквимолярных количествах, тогда как (РА-d) содержит маннозу и фукозу в отношении 2:1.
(РА-g) и (Pa-h) каждый содержат галактозу в качестве восстанавливающего конца сахара. Что касается нейтральной сахарной композиции, то (РА-g) содержит галактозу и фукозу в отношении 1:2, тогда как (РА-h) содержит галактозу и фукозу в отношении 2:1.
Далее конфигурацию маннозы, которая является одной из составляющих сахаров, исследуют следующим образом: используя F наборы глюкоза/фруктоза и фосфоманнозоизомеразу (все Boehringer Mannheim - Yamanouchi), создают реакционную систему, с помощью которой можно определить одну D-маннозу, в соответствии с рекомендациями изготовителей. Отдельно, по 100 мкг соединений сахара (а), (b), (с), (d), (е), (f) и (i) гидролизуют 2 н. соляной кислотой при 100oС в течение 3 часов и после нейтрализации осуществляют определение в этой реакционной системе. В результате, D -маннозу детектируют во всех соединениях сахара (а), (b), (с), (d), (е), (f) и (i). Таким образом доказано, что соединения сахара (а), (b), (с), (d), (е), (f) и (i) все содержат D-маннозу в качестве составляющего сахара.
Далее конфигурацию галактозы, которая является одной из составляющих сахаров (g) и (h), исследуют, используя F набор лактоза/галактоза (Boehringer Mannheim-Yamanouchi), с помощью которого можно детектировать одну D-галактозу. А именно, порции по 100 мкг (g) и (h) каждую гидролизуют 2 н. соляной кислотой при 100oС в течение 3 часов и после нейтрализации осуществляют детектирование в этой реакционной системе. В результате галактозу детектируют в (g) и (h). Таким образом, доказано, что (g) и (h) оба содержат D-галактозу в качестве составляющей сахара.
Далее, конфигурацию фукозы, которая является следующим составляющим сахаром, исследуют следующим образом. В соответствии с методом, описанным в Clinical Chemistry 36, 474-476 (1990), порции по 100 мкг соединений (а), (b), (с), (d), (e), (f), (g), (h) и (i) гидролизуют 2 н. соляной кислотой при 100oС в течение 3 часов и после нейтрализации осуществляют детектирование в этой реакционной системе, с помощью которой можно определить одну только L-фукозу. В результате оказывается, что L-фукоза детектируется в соединениях сахара (а): (b), (с), (d), (e), (f), (g), (h) и (i).
Анализ молекулярного веса продуктов ферментной реакции.
Далее соединения сахара (а), (b), (с), (d), (e), (f), (g), (h) и (i) исследуют с помощью масс-спектрометрии, используя API-111 масс-спектрограф (Perkin-Elmer Science). Так, было обнаружено, что эти вещества имеют молекулярный вес 564, 724, 1128, 1062, 1448, 644, 632, 1358 и 1288 соответственно. В (b) и (с) основные сигналы дают двухвалентные анионы. Одновалентный ион, одновалентный ион с присоединенным к нему натрием и двухвалентный ион определены для (d). Двухвалентный ион с присоединенными к нему четырьмя ионами натрия, трехвалентный ион с присоединенными к нему тремя ионами натрия и четырехвалентный ион с присоединенным к нему ионом натрия и т.д. определены для (е). Одновалентный ион с присоединенными к нему двумя ионами натрия определен для (f). Одновалентный ион, одновалентный ион с присоединенным к нему ионом натрия и двухвалентный ион определены для (g). Одновалентный, двухвалентный, трехвалентный и четырехвалентный ионы соответственно с четырьмя, тремя, двумя и одним ионом натрия соответственно и т.д. детектированы для (h). Одновалентный ион, из которого были элиминированы две сульфатные группы и к которому присоединен ион натрия, и двухвалентный ион, из которого были элиминированы две сульфатные группы, был детектирован для (i).
С помощью масс-масс /МС/МС/ спектрометрии с отрицательными ионами было определено для (а) одновалентный сульфатный ион (молекулярный вес 97), одновалентный ион (молекулярный вес 157), в котором молекула воды и ион водорода были элиминированы из ненасыщенной гексуроновой кислоты, одновалентный ион (молекулярный вес 175), в котором ион водорода был элиминирован из ненасыщенной гексуроновой кислоты, одновалентный ион (молекулярный вес 225), в котором были элиминированы молекула воды и ион водорода из сульфатированной фукозы, одновалентный ион (молекулярный вес 243), в котором
из сульфатированной фукозы был элиминирован ион водорода, одновалентный ион (молекулярный вес 319), в котором были элиминированы молекула воды и ион водорода из ненасыщенной гексуроновой кислоты, связанной с маннозой, и одновалентный ион (молекулярный вес 405), в котором был элиминирован ион водорода из сульфатированной фукозы, связанной с маннозой.
С помощью МС/МС спектрометрии с использованием отрицательных ионов проводилось детектирование для (b) аналогичным образом: получены: одновалентный сульфатный ион (молекулярный вес 97), одновалентный ион (молекулярный вес 175), в котором был элиминирован ион водорода из ненасыщенной гексуроновой кислоты, одновалентный ион (молекулярный вес 243), в котором водородный ион был элиминирован из сульфатированной фукозы, двухвалентный ион (молекулярный вес 321), в котором два иона водорода были элиминированы из ненасыщенной гексуроновой кислоты и сульфатированной фукозы, связанной с сульфатированной маннозой, одновалентный ион (молекулярный вес 405), в котором ион водорода был элиминирован из сульфатированной фукозы, связанной с маннозой, или фукозы, связанной с сульфатированной маннозой, и одновалентный ион (молекулярный вес 417), в котором водородный ион был элиминирован из ненасыщенной гексуроновой кислоты, связанной с сульфатированной маннозой.
С помощью МС/МС спектрометрии с использованием отрицательных ионов проводилось детектирование для (с) и определены: одновалентный сульфатный ион (молекулярный вес 97), одновалентный ион (молекулярный вес 175), в котором ион водорода был элиминирован из ненасыщенной гексуроновой кислоты, одновалентный ион (молекулярный вес 225), в котором молекула воды и ион водорода были исключены из сульфатированной фукозы, одновалентный ион (молекулярный вес 243), в котором ион водорода был исключен из сульфатированной фукозы, двухвалентный ион (молекулярный вес 371), в котором два иона водорода были элиминированы из сульфатированной фукозы, связанной с маннозой, связанной с гексуроновой кислотой, связанной с маннозой, одновалентный ион (молекулярный вес 405), в котором водородный ион был элиминирован из сульфатированной фукозы, связанной с маннозой, и одновалентный ион (молекулярный вес 721), в котором вода и ион водорода был элиминирован из сульфатированной фукозы и ненасыщенной гексуроновой кислоты, связанной маннозой, связанной с гексуроновой кислотой.
С помощью МС/МС спектрометрии с использованием отрицательных ионов проводилось детектирование двухвалентных ионов (d) и определены: одновалентный сульфатный ион (молекулярный вес 97) одновалентный ион (молекулярный вес 175), в котором ион водорода был элиминирован из ненасыщенной гексуроновой кислоты, одновалентный ион (молекулярный вес 225), в котором молекула воды и ион водорода были элиминированы из сульфатированной фукозы, одновалентный ион (молекулярный вес 243), когда ион водорода был элиминирован из сульфатированной фукозы, одновалентный ион (молекулярный вес 405), образовавшийся за счет элиминирования атома водорода из сульфатированной фукозы, связанной с маннозой, двухвалентный ион (молекулярный вес 450), в котором две сульфатные группы и два атома водорода были элиминированы из (d), двухвалентный ион (молекулярный вес 490), образовавшийся за счет элиминирования сульфатной группы и двух ионов водорода из (d).
С помощью МС/МС спектрометрии с использованием отрицательных ионов проводилось детектирование (е) и получены: одновалентный сульфатный ион (молекулярный вес 97), одновалентный ион (молекулярный вес 225), полученный за счет элиминирования молекулы воды и водородного иона из сульфатированной фукозы, одновалентный ион (молекулярный вес 243), полученный за счет элиминирования иона водорода из сульфатированной фукозы, одновалентный ион (молекулярный вес 345), в котором два иона водорода были элиминированы, был присоединен и ион натрия к дисульфатированной фукозе, трехвалентный ион (молекулярный вес 450), полученный за счет элиминирования двух сульфатных групп, присоединения трех натриевых ионов и элиминирования шести ионов водорода из (е), трехвалентный ион (молекулярный вес 476), полученный за счет элиминирования сульфатной группы и шести водородных ионов из (е), и присоединения трех натриевых ионов, одновалентный ион (молекулярный вес 563), полученный за счет элиминирования иона водорода из ненасыщенной гексуроновой кислоты и сульфатированной фукозы, связанной с маннозой, и одновалентный ион (молекулярный вес 705), полученный за счет элиминирования молекулы воды и иона водорода из ненасыщенной гексуроновой кислоты и дисульфатированной фукозы, связанной с сульфатированной маннозой.
С помощью МС/МС спектрометрии с использованием отрицательных ионов проводилось детектирование (f), получены: одновалентный сульфатный ион (молекулярный вес 97), одновалентный ион (молекулярный вес 243), полученный за счет элиминирования иона водорода из сульфатированной фукозы, одновалентный ион (молекулярный вес 421), в котором вода и два иона водорода были элиминированы и присоединен ион натрия к ненасыщенной гексуроновой кислоте, связанной с сульфатированной маннозой.
С помощью МС/МС спектрометрии с использованием отрицательных ионов проводилось детектирование (g); получены: одновалентный ион (молекулярный вес 405) полученный за счет элиминирования водородного иона из сульфатированной фукозы, связанной с галактозой, и одновалентный ион (молекулярный вес 551), полученный за счет элиминирования водородного иона из сульфатированной фукозы, связанной с фукозой, связанной с галактозой, или фукозы, связанной с сульфатированной фукозой, связанной с галактозой.
С помощью МС/МС спектрометрии с использованием отрицательных ионов проводилось детектирование вещества, в котором три натриевых иона были присоединены к (h), и пять водородных ионов были элиминированы из него, одновалентный сульфатный ион (молекулярный вес 97), одновалентный ион (молекулярный вес 225), в котором молекула воды и ион водорода были элиминированы из сульфатированной фукозы, и одновалентный ион (молекулярный вес 1197), в котором ион водорода и две сульфатные группы были элиминированы из (h).
С помощью МС/МС спектрометрии с использованием отрицательных ионов проводилось детектирование двухвалентного иона, полученного за счет элиминирования двух сульфатных групп и двух водородных ионов из (i); получен одновалентный сульфатный ион (молекулярный вес 97), одновалентный ион (молекулярный вес 345), полученный за счет элиминирования двух водородных ионов из присоединения натриевого иона к дисульфатированной фукозе.
Анализ композиции сахара в продукте ферментной реакции
Как свидетельствуют приведенные результаты масс-спектрометрии, существует большая вероятность того, что соединения сахара (а), (b), (с), (d), (е), (f) и (i) каждое может содержать в своей молекуле ненасыщенную гексуроновую кислоту.
Поэтому проводят следующий эксперимент для доказательства того, что в результате этих ферментных реакций получают продукты, каждый из которых содержит гексуроновую кислоту, содержащую в своей молекуле ненасыщенную связь. Известно, что высокое поглощение в интервале 230-240 нм объясняется наличием в молекуле ненасыщенной связи. Поэтому измеряют поглощение водных растворов каждого из очищенных олигосахаридов (а), (b), (с), (d), (е), (f), (g), (h) и (i) в интервале длин волн 230-240 нм. Оказалось, что каждый из водных растворов (а), (b), (с), (d), (е), (f) и (i) демонстрирует сильное поглощение, что предполагает наличие в молекуле ненасыщенной связи. Подтверждено также, что поглощение в интервале 230-240 нм повышается по мере разрушения фукоидана этим ферментом. Эти факты в значительной степени свидетельствуют о том, что этот фермент расщепляет гликозидную связь между маннозой и гексуроновой кислотой или галактозой и гексуроновой кислотой в фукоидане за счет реакции элиминирования.
Большинство продуктов энзиматической реакции содержат ненасыщенную гексуроновую кислоту у невосстанавливающего конца и содержат маннозу у восстанавливающего конца, что дает возможность предположить, что полученный фукоидан включает типы молекул, состоящие из чередующихся, связанных между собой гексуроновой кислоты и маннозы.
Так как основной составляющей сахарида является содержащаяся в нем фукоза, фукоидан более подвержен разложению под действием кислот, нежели обычные полисахариды. С другой стороны, известно, что связи гексуроновой кислоты и маннозы относительно высокоустойчивы к кислотам. Авторы настоящего изобретения предприняли попытку идентифицировать гексуроновую кислоту в цепи сахара, которая состоит из чередующихся звеньев гексуроновой кислоты и маннозы, связанных друг с другом и содержащихся в фукоидане, полученном из Kjellmaniella crassifolia следующим образом (со ссылкой на способ, описанный в Carbohydrate Researh, 125, 283-290 (1984). Вначале фукоидан растворяют в 0,3 М щавелевой кислоте и обрабатывают при 100oС в течение 3 часов. Затем его фракционируют по молекулярным весам и фракции с молекулярным весом 3000 или более объединяют. Затем происходит обработка на анионообменной смоле, и абсорбированное вещество собирают. Полученное таким образом вещество гидролизуют 4 н. соляной кислотой. После доведения рН до 8 его пиридил-(2)-аминируют, и уроновую кислоту определяют с помощью ВЭЖХ. Условия для ВЭЖХ:
Прибор: Model L-6200 (Hitachi, Ltd).
Колонка: PALPAK тип (4,6 мм х 250 мм, Takara Shuzo CO., Ltd.).
Элюент: 200 мМ уксусная кислота-триэтиламиновый буфер (рН 7.3): ацетонитрил = 25:75.
Детектирование: флуорометрический детектор F1150 (Hitachi, Ltd.).
Длина волны возбуждения 320 нм, длина волны флуоресценции: 400 нм.
Скорость потока: 0,8 мл/мин.
Температура колонки: 40oС.
В качестве стандартов для РА гексуроновых кислот используют соединения, полученные в результате пиридил-(2)-аминирования глюкуроновой кислоты, изготовленной Sigma Chemical Co., галактуроновой кислоты, изготовленной Wako Pure Chemical Industries, Ltd., идуроновую кислоту, полученную за счет гидролиза 4-метилумбеллиферил-α-L-идуронида, изготовленного Sigma Chemical Co., и маннуроновую кислоту и гулуроновую кислоту, полученные при гидролизе альгининовой кислоты (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) no способу, раскрытому в Acta Chemica Scandinavicaj., 15, 1397-1398 (1961) с последующим разделением на анионообменной смоле.
В результате было обнаружено, что только одна глюкуроновая кислота содержится как гексуроновая кислота в вышеуказанных типах молекул фукоидана.
Далее, глюкуроновую кислоту в гидролизате вышеуказанных типов молекул отделяют от D-маннозы, используя анионообменную смолу, сушат вымораживанием. Затем измеряют удельное вращение. Таким образом, выясняется, что глюкуроновая кислота является правовращающим соединением, т.е. является D-глюкуроновой кислотой.
Далее, фукоидан, получениый из Kjellmaniella crassifolia, обрабатывают эндо-фукоидан-гидролазой по второму разделу настоящего изобретения, а затем гидролизуют, используя щавелевую кислоту, как указано ранее. Однако в этом случае не обнаружено полимера, содержащего чередующиеся D-глюкуроновую кислоту и D-маннозу. На основании этих результатов выяснено, что фермент настоящего изобретения расщепляет в результате реакции элиминирования типы молекул, структура скелета которых представляет чередующиеся, связанные между собой звенья D-глюкуроновой кислоты и D-маннозы.
Далее, полимер, полученный в результате гидролиза за счет щавелевой кислоты, исследуют с помощью ЯМР спектрометрии, определяя аномерную конфигурацию сайтов связывания D-глюкуроновой кислоты и D-маннозы, и гликозидной связи.
Получены следующие ЯМР спектры полимера. Химические сдвиги в 1H ЯМР спектрах выражают, принимая химический сдвиг метильной группы триэтиламина за 1,13 ppm, а химические сдвиги в спектрах 13С ЯМР выражают, принимая химический сдвиг метильной группы в триэтиламине за 9,32 ppm.
lН-ЯМP (Д2О)δ: 5,25 (1Н, шир.с, 1-Н), 4,32 (1Н, д, J=7,6 Гц, 1'-Н), 4,00 (1Н, шир.с, 2-Н), 3,7l (1H, м, 5'-Н), 3,69 (1Н, м, Н из 5-СН), 3,68 (1Н, м, 3-Н), 3,63 (1Н, м, Н из 5-СН), 3,63 (1Н, м, 4'-Н), 3,57 (1Н, м, 4-Н), 3,54 (1Н, м, 3'-Н), 3,53 (1Н, м, 5-Н), 3,25 (1Н, т, J=8,5 Гц, 2'-Н)
13С-ЯМР (Д2О)δ: 175,3 (С из 5'-СООН), 102,5 (l'-C), 99,6 (1-C), 78,5 (2-С), 77,9 (4'-С), 77,0 (3'-С) 76,7 (5'-С), 73,9 (5-С), 73,7 (2'-С), 70,6 (3-С), 67,4 (4-С), 61,0 (С из 5-СН2ОН).
Эти пики можно приписать соответствующим образом к положениям, указанным цифрами в формуле (16) (см. в конце описания).
Что касается конфигурации в положении l-D-глюкуроновой кислоты, то оно определено как β-D-глюкуроновая кислота, так как его вицинальная константа взаимодействия составляет 7,6 Гц.
Что касается конфигурации в положении 1-D-маннозы, то оно определено как α-D-манноза, так как ему соответствует химический сдвиг 5,25 ррm.
Типы связывания составляющих сахаров анализируют способом НМВС, т.е. многоядерный многоквантовый когерентный протонный спектр, детектируемый через много связей.
При отнесении сигналов в 1Н-ЯМР спектрах используют программы DQF - COSY и НОНАНА, тогда как для отнесения сигналов в 13С-ЯМР спектрах используют программу HSQC. В спектре НМВС наблюдаются перекрестные пики между 1-Н и 4'-С с перекрестными пиками между 4'-Н и 1-С, и между 1'-Н и 2-С с между 2-Н и 1'-С. Эти факты показывают, что D-глюкуроновая кислота связана с 2-положением D-маннозы за счет β-связи, тогда как D-манноза связана с 4-положением D-глюкуроновой кислоты за счет α-связи.
Анализ характера связывания сахаров и сайтов связывания сульфатных групп в продуктах ферментной реакции.
Для исследования характера связывания составляющих сахаров и сульфатных групп продукты ферментной реакции анализируют с помощью ЯМР спектрометрии, используя спектрометр магнитного резонанса. Модель JNM-α500 (500 МгГц, JEOL Ltd.). Полученные аналитические данные указывают на то, что соединения сахара (а), (b), (с), (d), (е), (f), (g), (h) и (i) представлены соответственно вышеприведенными формулами (7), (8), (9), (10), (11), (12), (13), (14) и (15). Таким образом, соединение сахара (а) имеет структуру, в которой ненасыщенная D-глюкуроновая кислота и L-фукоза с присоединной к ней сульфатной группой, присоединены к D-маннозе, которая представляет восстанавливающий концевой остаток. Соединение сахара (b) имеет структуру, в которой ненасыщенная D-глюкуроновая кислота и L-фукоза, содержащая присоединенные к ней две сульфатные группы, присоединены к D-маннозе, которая представляет восстанавливающий концевой остаток, содержащий связанную с ним сульфатную группу. Соединение сахара (с) имеет структуру, в которой D-глюкуроновая кислота и L-фукоза, содержащая связанную с ней сульфатную группу, присоединены к D-маннозе, которая представляет восстанавливающий концевой остаток, причем D-манноза присоединена далее к D-глюкуроновой кислоте и ненасыщенная D-глюкуроновая кислота и L-фукоза, содержащая связанную с ней сульфатную группу, присоединены далее к D-маннозе. Соединение сахара (d) имеет структуру, в которой сульфатная группа, D-глюкуроновая кислота и L-фукоза, содержащая две сульфатные группы, с ней связанные, присоединены к D-маннозе, которая представляет восстанавливающий концевой остаток, причем D-манноза присоединена далее к D-глюкуроновой кислоте, а ненасыщенная глюкуроновая кислота присоединена, кроме того, к D-маннозе. Соединение сахара (е) имеет структуру, в которой сульфатная группа, D-глюкуроновая кислота и L-фукоза, содержащая связанные с ней две сульфатные группы, присоединены к D-маннозе, которая представляет восстанавливающий концевой остаток, причем D-манноза с присоединенной к ней сульфатной группой, присоединена, кроме того, к D-глюкуроновой кислоте, а L-фукоза с двумя связанными с ней сульфатными группами и ненасыщенная D-глюкуроновая кислота присоединены, кроме того, к D-маннозе. Соединение сахара (f) имеет структуру, в которой ненасыщенная глюкуроновая кислота и L-фукоза с присоединенной к ней сульфатной группой, присоединены к D-маннозе, которая представляет восстанавливающий концевой остаток со связанной с ним сульфатной группой. Соединение сахара (g) имеет структуру, в которой L-фукоза с присоединенной к ней сульфатной группой, присоединена к D-галактозе, которая представляет восстанавливающий концевой остаток, а L-фукоза с присоединенной к ней сульфатной группой связана, кроме того, с L-фукозой. Соединение сахара (h) имеет структуру, состоящую из двух разветвленных цепочек, начиная с D-галактозы, которая представляет восстанавливающий концевой остаток со связанной с ним сульфатной группой, где L-фукоза со связанной с ней сульфатной группой присоединена к D-галактозе, а L-фукоза с присоединенной к ней сульфатной группой присоединена далее к L-фукозе в одной из цепочек сахара, тогда как D-галактоза с присоединенной к ней сульфатной группой присоединена к D-галактозе с присоединенной к ней сульфатной группой в другой сахарной цепочке. Соединение сахара (i) имеет структуру, в которой сульфатная группа, D-глюкуроновая кислота и L-фукоза с присоединенной к ней сульфатной группой присоединены к D-маннозе, которая представляет восстанавливающий концевой остаток, а D-манноза присоединена далее к D-глюкуроновой кислоте, а L-фукоза с присоединенными к ней двумя сульфатными группами и ненасыщенная D-глюкуроновая кислота присоединены, кроме того, к D-маннозе.
Соединения настоящего изобретения получают, обрабатывая фукоидан эндо-фукоидан-лиазой второго аспекта настоящего изобретения. Затем будут описаны физические свойства соединений, представленных формулами (7), (8), (9), (10), (11), (12), (13), (14) и (15), т.е. соединения сахара (а), (b), (с), (d), (е), (f), (g), (h) и (i), которые являются примерами соединения сахара настоящего изобретения.
На фиг. 1-9 представлены картины ВЭЖХ элюирования пиридил-(2)-аминированных соединений сахара (РА-а), (РА-b), (РА-с), (PA-d), (РА-е), (РА-f), (РА-g), (РА-h) и (РА-i) соответственно. На каждом из чертежей по оси ординат отложена относительная интенсивность флуоресценции, тогда как по оси абсцисс отложено время удерживания (мин). Далее, на фиг.10-18 представлены масс-спектры соединений сахара (а), (b), (с), (d), (е), (f), (g), (h) и (i) соответственно, а на фиг.19-27 представлены масс масс-спектры соединений сахара (a)-(i) соответственно. На каждом из чертежей по оси ординат отложена относительная интенсивность (%), а по оси абсцисс отложены величины m/z. Кроме того, на фиг. 28-36 представлены 1Н-ЯМР спектры соединений сахара (a)-(i) соответственно. На каждом чертеже по оси ординат отложена интенсивность сигнала, а по оси абсцисс - химический сдвиг (мд). Химические сдвиги в 1Н-ЯМР спектрах выражены в мд (мд-->ррm), причем химический сдвиг НОД принят за 4,65 мд.
Физические свойства соединения (а):
Молекулярный вес 564.
МС m/z: 563 (М-Н+)-.
МС/МС m/z: 97(HSO4)-, 157 (ненасыщенная D-глюкуроновая кислота - Н2О-Н+)-, 175 (ненасыщенная D-глюкуроновая кислота -H+)- 225 (сульфатированная L-фукоза Н2О-Н+)- 243 (сульфатированная L-фукоза Н+)-, 319 (ненасыщенная D-глюкуроновая кислота, связанная с D-маннозой -Н2О-Н+)-, 405 М - ненасыщенная D-глюкуроновая кислота -H+)-, 483 (М-SО3+)-.
1H-ЯМР (Д2О)δ: 5,78 (1Н, д, J=3,7 Гц, 4"-Н), 5,26 (1Н, д, J=1,2 Гц, 1-Н), 5,12 (1Н, д, J=4,0 Гц, 1'-Н), 5,03 (1Н, д, J=6,1 Гц, 1"-Н), 4,47 (1Н, д-д, J=3,4, 10,4 Гц, 3'-Н), 4,21 (1Н, шир.с, 2-Н), 4,12 (1Н, м, 5'-Н), 4,10 (1Н, д-д, J=3,7, 5,8 Гц, 3"-Н), 4,03 (1Н, д, J=3,4 Гц, 4'-Н), 3,86 (1Н, м, 3-Н), 3,83 (1Н, д-д, J=4,0, 10,4 Гц, 2'-Н), 3,72 (1Н, м, 4-Н), 3,72(1Н, м, 5-Н), 3,70(2Н, м, H2 из 5-СН2), 3,65 (1Н, д-д, J=5,8, 6,1 Гц, 2"-Н), 1,08(3Н, д, J=6,7 Гц, Н3 из 5'-СН3).
Состав сахара:
L-фукоза: ненасыщенная D-глюкуроновая кислота: D-манноза =1:1:1 (для каждой молекулы).
Сульфатная группа:
Одна молекула (в 3-положении L-фукозы).
Пики в 1H-ЯМР спектрах можно отнести в соответствии с положениями, представленными цифрами в формуле (17) (см. в конце описания).
Физические свойства соединения b:
Молекулярный вес: 724
МС m/z: 723 (М-Н+)-, 361(М-2Н+)2-.
МС/МС m/z: 97 (HSО4)-, 175 (ненасыщенная D-глюкуроновая кислота -Н+)-, 243 (сульфатированная L-фукоза -H+)-, 321 (М-SО3-2Н+)2-, 405 (М-ненасыщенная D-глюкуроновая кислота - 2SO3-H+)-, 417 (М-L-фукоза-2SO3+)-.
1H-ЯMP (Д2О)δ: 5,66 (1Н, д, J=3,4 Гц, 4"-Н), 5,27 (1Н, д, J=7,3 Гц, 1"-Н), 5,25 (1Н,д, J=1,8; Гц, 1-Н), 5,21 (1Н,д, J=3,7 Гц, 1'-Н), 4,50 (1Н, д, J= 3, l Гц, 4'-Н), 4,32 (1Н, кв, J=6,7 Гц, 5'-Н), 4,27 (1Н, д-д, J=3,7, 10,4 Гц, 2'-Н), 4,21 (1Н, д-д, J=3,4, 6,7 Гц, 3"-Н), 4,18 (1Н, д-д, J=1,8, 11,0 Гц, Н из 5-СН), 4,15 (1Н, шир.с, 2-Н), 4,10 (1Н, д-д, J=5,8, 11,0 Гц, Н из 5-СН), 3,99 (1Н, д-д, J=3,1, 10,4 Гц, 3'-Н), 3,90 (1Н, м, 5-Н), 3,82 (1Н, м, 3-Н), 3,82 (1Н, м, 4-Н), 3,54 (1Н, шир.т., J=7,3 Гц, 2"-Н), 1,11 (3Н, д, J=6,7 Гц, Н3 из 5'-СН3).
Состав сахара:
L-фукоза: ненасыщенная D-глюкуроновая кислота: D-манноза = 1:1:1 (для каждой молекулы)
Сульфатная группа:
три молекулы (в 2- и 4-положениях L-фукозы и в 6-положе-нии D-маннозы)
Пики 1Н-ЯМР спектрах можно отнести в соответствии с положениями, отмеченными цифрами в формуле (18) (см. в конце описания).
Физические свойства соединения (с):
Молекулярный вес: 1128
МС m/z: 1127 (м-Н+)-.
МС/МС m/z: 97 (HSО4)-, 175(ненасыщенная D-гексуроновая кислота -Н+)-, 225(сульфатированная L-фукоза -Н2О-Н+)-, 243(сульфатированная L-фукоза -Н+)-, 371(М-ненасыщенная D-глюкуроновая кислота L-фукоза -SО3 -2Н+)2-, 405(сульфатированная фукоза, связанная с D-маннозой - Н+)-, 721(M-D-манноза-L-фукоза-SО32О-Н+)-.
1H-ЯMP (D2O)δ: 5,69 (1H, д, J=3,7 Гц, (4)"-Н), 5,34 (1Н, с, (1)-Н), 5,16 (1Н, с, 1-Н), 5,10 (1Н, д, J=4,0 Гц, (1)'-Н), 5,05 (1H, д, J=3,7 Гц, 1'-Н), 4,93 (1Н, д, J=6,4 Гц, (1)"-Н), 4,50 (1Н, д-д, J=3,4, 10,7 Гц, 3'-Н), 4,47 (1Н, д-д, J=3,4, 10,4 Гц, (3)'-Н), 4,39 (1Н, д, J=7,9 Гц, 1"-H), 4,33 (1Н, шир. с, (2)-Н), 4,14 (1Н, м, 2-Н), 4,12 (1Н, м, (3)"-Н), 4,12 (1Н, м, 5'-Н), 4,12 (1Н, м, (5)'-Н), 4,04 (1Н, м, 4'-Н), 4,03 (1Н, м, (4)'-Н), 3,85 (1Н, м, 2'-Н), 3,85 (1Н, м, (2)'-Н), 3,82 (1Н, м, 3-Н), 3,82 (1Н, м, (3)-Н), 3,73 (1Н, м, 4-Н), 3,73 (1Н, м, 5-Н), 3,73 (1Н, м, (4)-Н), 3,70 (2Н, м, Н2 из 5-СН2), 3,70 (2Н, м, H2 из (5)-СН2), 3,67 (1Н, м, 5"-Н), 3,62 (1Н, м, 4"-Н), 3,62 (1Н, м, (2)"-Н), 3,62 (1Н, м, (5)-Н), 3,51 (1Н, т, J=8,9 Гц, 3"-Н), 3,28 (1Н, т, J=7,9 Гц, 2"-Н), 1,09 (3Н, д, J=6,7 Гц, Н3 из (5)'-СН3), 1,07 (1Н, д, J=6,7 Гц, Н3 из 5'-СН3).
Состав сахара: L-фукоза: ненасыщенная D-глюкуроновая кислота: D-глюкуроновая кислота: D-манноза = 2:1:1:2) (L-фукоза и D-манноза: каждых по 2 молекулы, ненасыщенная D-глюкуроновая кислота и D-глюкуроновая кислота: каждых по одной молекуле).
Сульфатная группа:
Две молекулы (в положении 3 - в каждой L-фукозе).
Пики в 1Н-ЯМР спектрах можно отнести в соответствии с положениями, указанными цифрами в формуле (19) (см. в конце описания).
Физические свойства соединения (d):
Молекулярный вес: 1062
МС m/z: 1061 (М-Н+)-.
МС/МС m/z: 97 (HSO4)-, 175 (ненасыщенная гексуроновая кислота - Н+)-, 225 (сульфатированная L-фукоза -Н2О-Н+)-,
243 (сульфатированная L-фукоза -H+)-, 405 (сульфатированная L-фукоза, связанная с D-маннозой -Н+)- или (L-фукоза, связанная с сульфатированной D-маннозой -Н+)-, 450 (M-2SО3-2H+)2-, 490 (M-SО3-2H+)2-.
1H-ЯMP (D2О)δ: 5,67 (1Н, д, J=3,7 Гц, (4)"-Н), 5,32 (1Н, шир. с, (1)-Н), 5,17 (1Н, д, J=3,5 Гц, 1'-Н), 5,17 (1Н, шир.с, 1-Н), 4,93 (1Н, д, J=6,4 Гц, (1)"-Н), 4,71 (1Н, м, 1"-Н), 4,53 (1Н, д, J=3,4 Гц, 4'-Н), 4,33 (1Н, кв, J= 6,7 Гц, 5'-Н), 4,28 (1Н, д-д, J=3,5, 11,0 Гц 2'-Н), 4,18 (1Н, м, Н из 5-СН2), 4,13 (1Н, м, (2)-Н), 4,12 (1Н,м, (3)"-Н), 4,08 (1Н, м, Н из 5-СН2), 4,07 (1Н, м, 2-Н), 3,98 (1Н, д-д, J=3,4, 11,0 3'-Н), 3,88 (1Н, м, 5-Н), 3,82 (1Н, м, 4"-Н), 3,78 (1Н, м, 3-Н), 3,78 (1Н, м, 4-Н), 3,78 (1Н, м, (3)-Н), (2H, м, H2 из (5)-СН2), 3,63 (1Н, м, (2)"-Н), 3,60 (1Н, м, 3"-Н), 3,59 (1Н, м, 5"-Н), 3,57 (1Н, м, (4)-Н), 3,57 (1Н, м, (5)-Н), 3,16 (1Н, т, J= 7,9 Гц, 2"-Н), 1,10 (3Н, д, J=6,7Гц, Н3 из 5'-СН3)
Состав сахара:
L-Фукоза: ненасыщенная D-глюкуроновая кислота: D-глюкуроновая кислота: D-манноза = 1: 1: 1:2 (L-фукоза, ненасыщенная D-глюкуроновая кислота и D-глюкуроновая кислота: каждой по одной молекуле, D-манноза: две молекулы).
Сульфатная группа:
Три молекулы (в 2- и 4- положениях L-фукозы и в 6-положении с восстанавливающего конца D-маннозы).
Пики в спектрах 1H-ЯМР можно отнести в соответствии с положениями, представленными цифрами в формуле (20) (см. в конце описания).
Физические свойства соединения (е):
Молекулярный вес: 1448
МС m/z: 767 (M+4Na+ -6H+)2-, 503,7 (м+3Nа+-6Н+)3- и 366,5 (M+Na+-5H+)4-.
МС/МС m/z: 97 (HSО4)-, 225 (сульфатированная L-фукоза-Н2О-H+)-, 243 (сульфатированная L-фукоза-Н+)-, 345 (дисульфатированная L-фукоза+Na+ - 2Н+)-, 450 (м+3Na+ - 2SО3 - 6H+)3-, 477 (M+ 3Na+-SO3 -6Н+)3-, 563 (ненасыщенная D-глюкуроновая кислота и сульфатированная L-фукоза, связанные с D-маннозой -Н+)- или (ненасыщенная D-глюкуроновая кислота и L-фукоза, связанная, с сульфатированной D-маннозой - Н+)-, 705(ненасыщенная D-глюкуроновая кислота и дисульфатированная L-фукоза, связанная с сульфатированной D-маннозой -Н2О-Н+]-.
1H-ЯMP (Д2О)δ: 5,58 (1Н, д, J=3,4 Гц, (4)"-Н), 5,35 (1Н, шир. с, (1)-Н) 5,22 (1Н, д, J=6,7 Гц, (1)"-Н), 5,19 (1Н, д, J=3,7 Гц, 1'-Н), 5,19 (1Н, д, J= 3,7 Гц, (1)'-Н), 5,16 (1Н, д, J=l,8 Гц, 1-Н), 4,62 (1Н, д, J=7,6 Гц, 1"-Н), 4,50 (1Н, м, 4'-Н), 4,50 (1Н, м, (4)'-Н), 4,30 (1Н, м, 5'-Н), 4,30 (1Н, м, (5)'-Н), 4,30 (1Н, м, Н из (5)-СН2), 4,25 (1Н, м, 2'-Н), 4,25 (1Н, м, (2)-Н), 4,25 (1Н, м, (2)'-Н), 4,20 (1Н, м, Н из (5)-СН2), 4,18 (1Н, м, Н из 5-СН2), 4,16 (1Н, м, (3)"-Н), 4,08 (1Н, м, Н из 5-СН2), 4,07 (1Н, м, 2-Н), 4,02 (1Н, м, 3'-Н), 4,02 (1Н, м, (3)'-Н), 3,85 (1Н, м, 5-Н), 3,85 (1Н, м, (5)-Н), 3,78 (1Н, м, 3-Н), 3,78 (1Н, м, (3)-Н), 3,76 (1Н, м, 4"-Н), 3,76 (1Н, м, 5"-Н), 3,75 (1Н, м, 4-Н), 3,75 (1Н, м, (4)-Н), 3,58 (1Н, м, 3"-Н), 3,55 (1Н, м, (2)"-Н), 3,18 (1Н, т, J=8,2 Гц, 2"-Н), 1,10 (3Н, д, J=6,7 Гц, Н3 из (5)'-СН3), 1,09 (3Н, д, J=6,7 Гц, Н3 из 5'-СН3).
Состав сахара:
L-фукоза: нененасыщенная D-глюкуроновая кислота: D-глюкуроновая кислота: D-манноза= 2: 1: 1:2 (L-фукоза и D-манноза: каждой по две молекулы, ненасыщенная D-глюкуроновая кислота и D-глюкуроновая кислота: каждой по одной молекуле).
Сульфатная группа:
Шесть молекул (в 2- и 4-положениях каждой из L-фукоз и в 6-положении каждой из D-манноз). Пики в спектрах 1H-ЯМР можно отнести в соответствии с положениями, представленными цифрами в формуле (21) (см. в конце описания).
Физические свойства соединения (f):
Молекулярный вес: 644.
МС m/z: 687 (М+ 2Na+-3Н+)-
МС/МС m/z: 97(HSO4)-, 243 (сульфатированная L-фукоза-Н+)-, 421 (ненасыщенная D-глюкуроновая кислота, связанная с сульфатированной D-маннозой +Na+2O -2H+)-.
1H -ЯМР (Д2О)δ: 5,60 (1Н, д, J=3,4 Гц, 4" -Н), 5,24 (1Н, шир.с, 1Н), 5,08 (1Н, д, J=4,0 Гц, 1'-Н), 4,94 (1Н, д, J=6,7 Гц, 1" -Н), 4,45 (1Н, д-д, J= 3,1, 10,4 Гц, 3'-Н), 4,20 (1Н, шир.с, 2-Н), 4,14 (2Н, м, Н2 из 5-СН2), 4,14 (1Н, м, 5'-Н), 4,09 (1Н, м, 3"-Н), 4,01 (1Н, д, J=3,1 Гц, 4'-Н), 3,91 (1Н, м, 5-Н), 3,85 (1Н, м, 3-Н), 3,85 (1Н, м, 2'-Н), 3,75 (1Н, т, J=9,8 Гц, 4-Н), 3,59 (1Н, т, J=6,7 Гц, 2"-Н), 1,06 (3Н, д, J=6,4 Гц, Н3 из 5'-СН3)
Состав сахара:
L-фукоза: ненасыщенная D-глюкуроновая кислота: D-манноза=1:1:1 (L-фукоза, D-манноза и ненасыщенная D-глюкуроновая кислота: каждой по одной молекуле).
Сульфатная группа:
Две молекулы (в 3-положении L-фукозы и в 6-положении D-маннозы).
Пики в 1Н спектрах можно отнести в соответствии с положениями, представленными цифрами в формуле (22) (см. в конце описания).
Физические свойства соединения (g):
Молекулярный вес: 632
МС m/z: 631 (М-H+)-.
МС/МС m/z: 405 (сульфатированная L-фукоза, связанная с D-галактозой - Н+)-, 551 (L-фукоза, связанная с сульфатированной L-фукозой, связанной с D-галактозой-Н+)- или (сульфатированная L-фукоза, связанная с L-фукозой, связанной с D-галактозой -Н+)- или (М- SО3+)-,
1H-ЯМР (Д2О)δ: 5,15 (1Н, д, J=4,3 Гц, F1 1-Н), 4,93 (1Н, д, J=3,7 Гц, F21-H), 4,53 (1H, д-д, J= 2,4, 10,4 Гц, F13-H), 4,49 (1H, д, J=7,6 Гц, G11-H), 4,46 (1H, д-д, J= 3,1, 10,7 Гц, F23-H), 4,36 (1H, кв, J=6,7 Гц, F25-H), 4,14 (1H, кв, J=6,7 Гц, F15-H), 4,09 (1H, д, J=2,4 Гц, F14-H), 4,03 (1H, д, J=3,1 Гц, F24-H), 3,97 (1H, д-д, J=4,3, 10,4 Гц, F12-H), 3,90 (1H, шир. с, G14-H), 3,81 (1Н, д-д, J=3,7 10,7 Гц, F22-Н), 3,59 (1Н, м, G13-H), 3,59 (1H, м, G15-H), 3,59 (2Н, м, Н2 из G15-CH2), 3,56 (1H, м, G12-H), 1,19 (3H, д, J=6,7 Гц, Н3 из F15-СН3), 1,14 (3Н, д, J=6,7 Гц, Н3 из F25-СН3).
Состав сахара:
L-фукоза: D-галактоза= 2:1 (две молекулы L-фукозы и одна молекула D-галактозы) Сульфатная группа:
Две молекулы (в 3-положении каждой и L-фукозы).
Пики в спектре 1Н-ЯМР можно отнести в соответствии с положениями, представленными цифрами в формуле (23) (см. в конце описания).
Физические свойства соединения (h):
Молекулярный вес: 1358
МС m/z: 1445 (М + 4Na+ - 5H+)-.
МС/МС m/z: 97 (HS04)-, 225 (сульфатированная L-фукоза -Н20 - H+)-, 1197 (M-2SO3-H+)-.
1H-ЯMP (D2O) δ: 5,19 (1Н, д, J=4,3 Гц, F11-H), 4,93 (1Н, д, J =3,7 Гц, F21-H), 4,62 (1Н, м, G21-H), 4,59 (1Н, м, G11-Н), 4,54 (1Н, д-д, J=2,7, 10,6 Гц, F13-Н), 4,46 (1Н, м, F13-Н), 4,46 (1Н, д, J=7,6 Гц, G31-Н), 4,41 (1Н, шир. с, G14-H), 4,41 (1Н, д, J= 7,6 Гц, G41-H), 4,37 (1Н, кв, J=6,4 Гц, F25-H), 4,27 (1Н, м, G13-Н); 4,24 (1Н, шир.с, G34-Н), 4,21 (1Н, м, G33-Н), 4,19 (1Н, м, G43-H), 4,15 (1Н, шир. с, G44-H), 4,13 (1Н, кв, J=6,7 Гц, F15-H), 4,09 (1Н, д, J=2,7 Гц, F14-H), 4,04 (1Н, д, J=2,8 Гц, F24-Н), 3,98 (1Н, м, Н из G15-СН3), 3,96 (1Н, д-д, J=4,3, 10,6 Гц, F12-Н), 3,88 (1Н, шир. с, G24-Н), 3,93 (1H, м, Н из G35-СН2), 3,86 (1H, м, G15-H), 3,81 (1H, м, F22-H), 3,81 (1H, м, Н из G15-CH2), 3,80 (1Н, м, G35-Н), 3,80 (1Н, м, Н из G35-СН2), 3,66 (1H, м G23-H), 3,65 (1H, м, G12-H), 3,64 (1H, м, Н из G25-CH2), 3,64 (1H, м, Н из G45-CH2), 3,61 (1Н, м, G45-H), 3,58 (1Н, м, G22-H), 3,56 (1H, м, Н из G25-CH2, 3,56 (1H, м, Н из G45-CH2), 3,55 (1H, м, G42-H), 3,54 (1H, м, G25-CH2), 3,54 (1H, м, G32-Н), 1,20 (3Н, д, J=6,7 Гц, Н3 из F15-СН3), 1,14 (3Н, д, J=6,4 Гц, Н3 из F25-CH3С)
Состав сахара:
L-фукоза, D-галактоза= 1: 2 (две молекулы L-фукозы и 4 молекулы D -галактозы).
Сульфатная группа:
Пять молекул ( в 3 -положении каждой L-фукозы, в 3-положении D-галактозы восстанавливающего конца, и в 3-положении D-галактозы, связанной с 6-положением D-галактозы восстанавливающего конца, и в 3-положении D-галактозы, связанной с 6-положением вышеуказанной D-галактозы).
Пики в спектре 1Н-ЯМР можно отнести в соответствии с положениями, представленными цифрами в формуле (24) (см. в конце описания).
Физические свойства соединения (i):
Молекулярный вес: 1288
МС m/z: 1149 (М + Na+ -2SO3 - 2Н+)-.
МС/МС m/z: 97 (HSO4)-, 345 (дисульфатированная L-фукоза +Na-2H+)-.
1H-ЯMP (D2O) δ: 5,68 (1H, д, J=3,4 Гц, (4)"-Н), 5,34 (1Н, шир.с, (1)-H), 5,19 (1Н, м, 1-Н), 5,19 (1H, м, (1)' 1-Н), 4,94 (1Н, м, 1'-Н), 4,94 (1Н, д, J= 6,4 Гц, (1)"-Н), 4,72 (1Н, д, J=7,9 Гц, 1"-Н), 4,54 (1Н, м, (4)'-Н), 4,48 (1Н, д-д, J=3,3, 10,6 Гц, 3'-Н), 4,38 (1Н, кв, J=6,4 Гц, 5'-Н), 4,34 (1H, кв J=6,7 Гц, (5)'-Н), 4,29 (1Н, м, (2)'-Н), 4,20 (1Н, м, Н из 5-СН2), 4,14 (1H, м, (2)-Н), 4,13 (1Н, м, (3)"-Н), 4,09 (1Н, м, Н из 5-СН2), 4,08 (1Н, м, 2-Н), 4,05 (1Н, д, J=3,3 Гц, 4'-Н), 3,99 (1Н, м, (3)'-Н), 3,89 (1Н, м, 5-Н), 3,83 (1Н, м, 4"-Н), 3,81(1Н, м, 2'-Н), 3,80 (1Н, м, 4-Н), 3,78 (1H, м, 3-Н), 3,78 (1Н, м, (3)-Н) 3,68 (2H, м, Н2 из (5)-СН2), 3,62 (1Н, м, (2)"-Н), 3,60 (1H, м, 3"-Н), 3,60 (1Н, м, 5"-Н), 3,58 (1Н, м, (5)-Н), 3,56 (1Н, м, (4)-Н), 3,17 (1Н, т, J= 7,9 Гц, 2"-Н), 1,15 (3Н, д, J=6,4 Гц, Н3 из 5'-CH3), 1,11 (3Н, д, J=6,7 Гц, Н3 из (5)'-СН3)
Состав сахара:
L-фукоза: ненасыщенная D-глюкуроновая кислота: D-глюкуроновая кислота: D-манноза = 2: 1: 1: 2 (L-фукоза и D-манноза: по две молекулы каждой, ненасыщенная D-глюкуроновая кислота и D-глюкуроновая кислота: по одной молекуле каждой)
Сульфатная группа:
Четыре молекулы (в положении 3-L-фукозы, связанной с D-маннозой восстанавливающего конца, в 2- и 4-положениях другой L-фукозы и в 6-положении D-маннозы со стороны восстанавливающего конца).
Пики в спектре 1H-ЯМР можно отнести, в соответствии с положениями, представленными цифрами в формуле (25) (см. в конце описания).
Кроме того, соединения в соответствии с первой целью настоящего изобретения можно получить, обрабатывая фукоидан клеточным экстрактом или культуральной надосадочной жидкостью бактерий в соответствии с третьим аспектом настоящего изобретения, принадлежащих к роду Fucoidanobacter.
Штамм в соответствии с третьим аспектом настоящего изобретения может быть любым, если только он представляет штамм настоящего изобретения, принадлежащий к роду Fucoidanobacter. В качестве конкретного примера можно указать Fucoidanobacter marinus SI-0098 штамм.
Этот штамм, Fucoidanobacter marinus SI-0098, который был впервые обнаружен авторами изобретения в морской воде Aomori, обладает следующими микологическими свойствами:
2. Fucoidanobacter marinus SI-0098 штамм
а. Морфологические характеристики
1) короткая палочка (иногда диплококковая);
ширина: 0,5-0,7 мкм, длина: 0,5-0,7 мкм
(2) Споры: нет
(3) Окрашивание по Граму: -
b. Физиологические свойства
1) Температурный интервал для роста: способен расти при 37oС, подходящая для роста температура в интервале от 15 до 28oС.
2) Отношение к кислороду: аэробный
3) Каталаза: +
4) Оксидаза: -
5) Уреаза: -
6) Гидролиз крахмала: +
желатина: -
казеина: -
эскулина: +
7) Восстановление нитрата: -
8) Образование индола: -
9) Образование сероводорода: +
10) Отверждение молока: -
11) Потребности в натрии: +
12) Потребности в солях
Рост в среде без NaCl: -
Рост в среде с 1% NaCl: -
Рост в морской воде: +
13) Хинон: менахинон 7
14) Содержание GC во внутриклеточной ДНК: 61%
15) Диаминопимеловая кислота в стенках клеток: -
16) Тест с гликолилом: -
17) Присутствие жирной гидроксикислоты: +
18) Тест OF: О
19) Цвет колоний: не образует характеристической окраски
20) Подвижность: да
21) Скольжение: нет
22) Жгутик: полярный монотрихоз.
В соответствии с классификацией, приведенной в Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 9 (1994), этот штамм попадает в группу 4 (Грам-отрицательные аэробные бациллы и кокки). Однако этот штамм сильно отличается от принадлежащих к 4 группе бактерий тем, что содержит менахинон в цепи передачи электронов и содержит 61% GC. Главное, что Грам-отрицательные бактерии содержат убихинон в цепи передачи электронов, а Грам-положительные бактерии содержат менахинон.
Хотя Грам-отрицательные бактерии, принадлежащие к роду Flavobacterium u Cytophaga, содержат исключительно менахинон в цепи переноса электронов, они сильно отличаются по GC содержанию от вышеуказанного штамма, так, Cytophaga arvensicola, представляющая собой почвенную бактерию, содержит от 43 до 46% GC, и Cytophaga diffluens С. fermentans, С.marina и с. Uliginosa, которые представляют морские бактерии, и каждая из них содержит 42% GC. Если этот штамм сравнивать по гомологичности в 16 SrДНК последовательности со штаммом, который был идентифицирован, даже самый гомологичный из них (Verrucomicrobium spinosum) демонстрирует гомологичность с ним на 76,6%. Известно, что две бактерии с гомологичностью 90% или менее относятся к различным родам. Соответственно, авторы решили, что этот штамм является новой бактерией, не принадлежащей ни к одному из существующих родов, и назвали его Fucoidanobacter marinus SI-0098.
Вышеуказанный штамм, обозначенный как Fucoidanobacter marinus SI-0098, был депонирован в National Institute of Bioscience and Human-Technology (1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaragi, 305 JAPAN) под регистрационным FERM BP-5403 (первоначальное депонирование 29 марта 1995 г. и перенос в международный депозитарий 15 февраля 1996 г.).
Микроорганизм в соответствии с третьим аспектом настоящего изобретения может принадлежать к роду Fucoidanobacter, который инкубируют в среде, фукоидан обрабатывают клеточным экстрактом или культуральной надосадочной жидкостью с тем, чтобы высвободить соединения сахара в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения. Использовать можно произвольный микроорганизм, если только он принадлежит к роду Fucoidanobacter и если он способен приводить к образованию соединений сахара в соответствии с первым разделом изобретения, когда фукоидан обрабатывают его клеточным экстрактом или культуральной надосадочной жидкостью. В качестве конкретного примера штамма можно предложить Fucoidanobacter marinus SI-0098 штамм.
Питательные вещества, которые нужно добавлять к среде бактериального штамма, принадлежащего к роду Fucoidanobacter, могут быть произвольными, если только при их утилизации используемый штамм приводит к получению клеточного экстракта или культуральной надосадочной жидкости, за счет которых можно получить соединения сахара в соответствии с первым разделом настоящего изобретения. Подходящими примерами источников углерода могут служить фукоидан, порошок морских водорослей, альгининовая кислота, фукоза, глюкоза, маннит, глицерин, сахароза, мальтоза, лактоза и крахмал, тогда как примерами подходящих источников азота могут служить дрожжевой экстракт, обезжиренная соя, пептон, казаминовая кислота, жидкость от замачивания кукурузы, мясной экстракт, сульфат аммония и хлорид аммония. Кроме того, среда может содержать такие неорганические вещества и соли металлов, как соли натрия, фосфаты, соли калия, соли магния и соли цинка.
Этот штамм также хорошо растет в морской воде или в искусственной "морской" воде, содержащей вышеуказанные источники питания.
Для инкубирования бактерий, принадлежащих к роду Fucoidanobacter, в соответствии с третьим разделом настоящего изобретения, обычно предпочтительно, чтобы температура при инкубировании была в интервале значений от 15 до 30oС, а величина рН среды - в интервале значений от 5 до 9. Активность эндо-фукоидан-лиазы в клеточном экстракте и культуральной надосадочной жидкости достигает максимума, если этот штамм инкубируют при аэрации и перемешивании в течение 5-72 часов. На практике условия инкубирования соответствующим образом выбирают в зависимости от используемого штамма, состава среды и т.д., с тем чтобы достичь максимальной активности эндо-фукоидан-лиазы внутриклеточного экстракта и культуральной надосадочной жидкости.
Штамм Fucoidanobacter marinus SI-0098 инкубируют в соответствующей среде, и после завершения инкубирования культуральную среду центрифугируют, получая в результате клетки и культуральную надосадочную жидкость. Далее клетки, собранные таким образом, разрушают, используя средства, которые обычно используют для разрушения клеток, например ультразвук. В результате центрифугирования разрушенных клеток можно получить клеточный экстракт.
Затем культуральную надосадочную жидкость или клеточный экстракт концентрируют за счет ультрафильтрации и смешивают с фосфатным буфером, содержащим хлорид натрия. Затем добавляют фукоидан, и протекает реакция.
После завершения реакции реакционную смесь фракционируют, используя колонку для фракционирования по молекулярным весам. Таким образом, можно получить соединения сахара в соответствии с первым разделом настоящего изобретения.
Соединения сахара в соответствии с первым разделом настоящего изобретения можно использовать в качестве реагентов для сахарной цепной технологии. За счет пиридил-(2)-аминирования (РА) этих соединений в соответствии со способом, раскрытым в патентной публикации Японии 65108/1993, можно получить РА соединения, которые весьма удобны в качестве реагентов для сахарной цепной технологии. Кроме того, ожидают, что физиологические активности соединений сахара настоящего изобретения делают их применимыми в качестве противораковых, противовирусных и ингибирующих метастазы лекарств.
Предпочтительный вариант осуществления изобретения:
Нижеследующие примеры представляют собой иллюстративные примеры способа получения соединений сахара в соответствии с первой целью изобретения, но следует учитывать, что настоящее изобретение ими не ограничивается.
Пример 1
Flavobacterium sp. SA-0082 (FERM BP-5402) инокулируют в 600 мл среды; содержащей искусственную морскую воду (рН 7,5 изг. Jamarin Laboratory), содержащую 0,1% глюкозы, 1,0% пептона и 0,05% дрожжевого экстракта, которая была введена через пипетку в двухлитровые колбы Эрленмейера и стерилизована при 120oС в течение 20 минут. Затем штамм инкубируют при 24 oС в течение 20 часов, получая таким образом культуру для посева. В тридцатилитровый ферментер загружают 20 л среды, содержащей искусственную морскую воду (рН 7,5 от Jamarin Laboratory), содержащую 0,3% фукоидана, полученного из Kjellmaniella crassifolia, 0,5% пептона, 0,01% дрожжевого экстракта и 0,01% противовспенивающего агента (КМ70 изгот. Shin-Etsu-Chemical Co., Ltd.) и стерилизуют при 120oС в течение 20 минут. После охлаждения среду инокулируют 600 мл полученной ранее культурой для посева, и все это инкубируют при 24oС в течение 20 часов при аэрации со скоростью 10 л/мин и при перемешивании со скоростью 125 об/мин. После завершения инкубирования культуральную среду центрифугируют, получая клетки и культуральную надосадочную жидкость.
Культуральную надосадочную жидкость концентрируют ультрафильтрацией (мембрана с исключением по молекулярному весу: 10000 изгот. Amicon) и анализируют эндо-фукоидан-лиазу настоящего изобретения. Определяют при этом активность 6 мU/мл культуральной среды.
Отдельно, клетки, полученные при основном инкубировании, суспендируют в 20 мМ ацетат-фосфатном буфере (рН 7,5), содержащем 200 мМ хлорида натрия, разрушают ультразвуком и центрифугируют, получая клеточный экстракт. Если анализируют эндо-фукоидан-лиазу настоящего изобретения в этом клеточном эстракте, определяют активность 20 мU/мл культуральной среды.
К вышеуказанному концентрату культуральной надосадочной жидкости добавляют сульфат аммония так, чтобы в конце достичь 90% насыщения. После растворения за счет перемешивания полученную смесь центрифугируют, а осадок суспендируют в том же буфере, что и вышеуказанный, в котором были суспендированы клетки. Затем суспензию тщательно диализуют против 20 мМ ацетат-фосфатного буфера (рН 7,5), содержащего 50 мМ хлорида натрия. После удаления осадка, образующегося при диализе, за счет центрифугирования, его адсорбируют в DEAE-Sepharose FF колонке, которая была уравновешена 20 мМ ацетат-фосфатным буфером (рН 7,5), содержащим 50 мМ хлорида натрия. Затем адсорбированное вещество хорошо промывают тем же буфером и выделяют за счет элюирования с линейным градиентом хлорида натрия от 50 мМ до 600 мМ. Активные фракции объединяют и добавляют хлорид натрия до конечной концентрации 4 М. Затем это адсорбируют в колонке Phenyl Sepharose CL-4B, которая была уравновешена 20 мМ фосфатным буфером (рН 8,0), содержащим 4 М хлорид натрия. Затем адсорбированное вещество хорошо промывают тем же буфером и выделяют за счет элюирования с линейным градиентом хлорида натрия с 4М до 1М. Активные фракции объединяют и концентрируют на ультрафильтре (Amicon).
Затем осуществляют гель-фильтрацию, используя Sephacryl S-200 гель, который был уравновешен 10 мМ фосфатным буфером, содержащим 50 мМ хлорида натрия. Активные фракции объединяют и добавляют хлорид натрия до конечной концентрации 3,5 М. Затем это адсорбируют на колонке Phenyl Sepharose HP, которая была уравновешена 10 мМ фосфатным буфером (рН 8), содержащим 3,5 М хлорида натрия. Затем адсорбированное вещество промывают тем же буфером и выделяют за счет элюирования с линейным градиентом хлорида натрия от 3,5 М до 1,5 М. Активные фракции объединяют, получая очищенный энзим. Молекулярный вес фермента, определенный по времени удерживания в Sephacryl S-200, составляет примерно 70000. В табл.1 суммированы вышеописанные стадии очистки.
Пример 2
Flavobacterium sp. SA-0082 (FERM BP-5402) инокулируют в 600 мл среды, содержащей искусственную морскую воду (рН 7,5, изгот. Jamarin Laboratory), содержащую 0,25% глюкозы, 1,0% пептона и 0,05% дрожжевого экстракта, которая была введена пипеткой в 2 л колбу Эрленмейера и стерилизована при 120oС в течение 20 минут. Затем штамм инкубируют при 24oС в течение 24 часов в этой колбе, получая в результате культуру для посева. В тридцатилитровый ферментер загружают 20 л среды, содержащей искусственную морскую воду (рН 7,5, изготов. Jamarin Laboratory), с 0,25% глюкозы, 1,0% пептона, 0,05% дрожжевого экстракта и 0,01% противовспенивающего агента (КМ70, изготов. Shin-Etsu-Chemical Co. , Ltd) и стерилизуют при 120oС в течение 20 минут. После охлаждения среду инокулируют 600 мл вышеуказанной культуры для посева, и все это затем инкубируют при 24oС в течение 24 часов в условиях аэрации со скоростью 10 л/мин при перемешивании со скоростью 125 об/мин. После завершения инкубирования культуральную среду центрифугируют, получая в результате клетки и культуральную надоса-точную жидкость.
Культуральную надосаточную жидкость концентрируют ультрафильтрацией (мембрана с исключением по молекулярному весу 10000, изгот. Amicon) и анализируют эндо-фукоидан-лиазу настоящего изобретения. Так определена активность культуральной среды в 1 мU/мл.
Отдельно, суспендируют клетки, полученные при основном инкубировании, в 20 мМ ацетат-фосфатном буфере (рН 7,5), содержащем 200 мМ хлорида натрия, разрушают ультразвуком и центрифугируют, получая в результате клеточный экстракт. Когда эндо-фукоидан-лиазу настоящего изобретения анализируют в этом клеточном экстракте, определяют активность культуральной среды 5 мU/мл.
К этому экстракту добавляют сульфат аммония до достижения в конце 90% насыщения. После растворения при перемешивании смесь центрифугируют, и осадок суспендируют в том же буфере, что и ранее, в том, в котором были суспендированы клетки. Затем суспензию тщательно диализуют против 20 мМ ацетат-фосфатного буфера (рН 7,5), содержащего 50 мМ хлорида натрия. После удаления образующегося при диализе остатка за счет центрифугирования его адсорбируют на DEAE-Sepharose FF колонке, которая была уравновешена 20 мМ ацетат-фосфатным буфером (рН 7,5), содержащим 50 мМ хлорида натрия. Затем адсорбированное вещество тщательно промывают тем же буфером и выделяют за счет элюирования с линейным градиентом хлорида натрия от 50 мМ до 600 мМ. Активные фракции объединяют и добавляют хлорид натрия до конечной концентрации 4 М. Затем это адсорбируют на Phenyl Sepharose CL-4B колонке, которая была уравновешена 20 мМ фосфатного буфера (рН 8,0), содержащего 4 М хлорид натрия. Затем адсорбированное вещество хорошо промывают тем же буфером и выделяют за счет элюирования с линейным градиентом хлорида натрия от 4 М до 1 М. Активные фракции объединяют и концентрируют на ультрафильтре. Далее это обрабатывают с помощью гельфильтрации, используя Sephacryl S-300, которая была уравновешена 10 мМ фосфатного буфера, содержащего 50 мМ хлорида натрия. Активные фракции объединяют. Молекулярный вес фермента, определенный по времени удерживания в Sephacryl S-300, составляет 460000. Затем активные фракции подвергают диализу против 10 мМ фосфатного буфера (рН 7), содержащего 250 мМ хлорида натрия. Ферментный раствор адсорбируют на Mono Q HR5/5 колонке, которая была уравновешена 10 мМ фосфатного буфера (рН 7), содержащего 250 мМ хлорида натрия. Адсорбированное вещество хорошо промывают тем же буфером и выделяют за счет элюирования с линейным градиентом хлорида натрия от 250 мМ до 450 мМ. Активные фракции объединяют, в результате чего получают очищенный фермент. В табл.2 суммированы указанные стадии очистки.
Пример 3
Очищенный фукоидан, полученный из Kjellmaniella crassifolia, обрабатывают эндо-фукоидан-лиазой настоящего изобретения, полученной в примере 1 [внутриклеточный фермент), получая таким образом его продукты разложения.
А именно, 16 мл 2,5% фукоиданового раствора, 12 мл 50 мМ фосфатного буфера (рН 7,5), 4 мл 4 М раствора хлорида натрия и 8 мл 32 мU/мл раствора эндо-фукоидан-лиазы настоящего изобретения смешивают вместе и оставляют реагировать при 25oС в течение 48 часов.
Затем реакционную смесь фракционируют по молекулярным весам, используя Cellulofine GCL-300 колонку (изготовл. Seikagaku Kogyo), и отбирают фракцию с молекулярным весом не более 2000. После обессоливания с помощью Micro Acilyzer G3 (изгот. Asahi Chemical Industry Co., Ltd.) эту фракцию разделяют на три фракции с помощью DEAE-Sepharose FF, получая 41 мг, 69 мг и 9,6 мг указанных соединений (а), (b) и (с) соответственно.
Пример 4
Очищенный фукоидан, полученный из Kjellmaniella Crassifolia, обрабатывают эндо-фукоидан-лиазой настоящего изобретения, полученной в примере 2 (внутриклеточный фермент), получая таким образом продукты его разложения.
А именно, 16 мл 2,5% фукоиданового раствора, 12 мл 50 мМ фосфатного буфера (рН 7,5), 4 мл 4 М раствора хлорида натрия и 8 мл 32 мU/мл раствора эндо-фукоидан-лиазы настоящего изобретения смешивают вместе и оставляют реагировать при температуре 25oС в течение 48 часов.
Затем реакционную смесь фракционируют по молекулярным весам, используя колонку Cellulofine GCL-300 (изгот. Seikagaku Kogyo), и отбирают фракцию с молекулярным весом не более 2000. После обессоливания с помощью Micro Acilyzer G3 (Asahi Chemical Industry Co., Ltd) эту фракцию разделяют на три фракции с помощью DEAE-Sepharose FF и сушат вымораживанием, получая в результате 40 мг, 65 мг и 9,2 мг вышеуказанных соединений (а), (b) и (с) соответственно.
Пример 5
Штамм Fucoidanobacter marinus SI-0098 (FERM BP-5403) инокулируют в 600 мл среды, состоящей из искусственной морской воды (рН 7,5 изгот. Jamarin Laboratory), содержащей 0,3% фукоидана, полученного из Kjellmaniella crassifolia, 0,5% пептона, 0,05% дрожжевого экстракта и 0,01% противовспенивающего агента (КМ70 изгот. Shin-Etsu-Chemical Co. , Ltd.), которая была введена пипеткой в двухлитровую колбу Эрленмейера и стерилизована при 120oС в течение 20 минут. Затем этот штамм инкубируют при 25oС в течение 48 часов при перемешивании со скоростью 120 об/мин. После завершения инкубирования культуральную среду центрифугируют, получая клетки и культуральную надосадочную жидкость.
Эту культуральную надосадочную жидкость концентрируют методом ультрафильтрации (мембрана с отсечением по молекулярному весу 10000 произв. Amicon) и анализируют эндо-фукоидан-лиазу настоящего изобретения. Таким образом, определяют активность культуральной среды 0,2 мU/мл.
Отдельно клетки, полученные в основном инкубировании, суспендируют в 20 мМ ацетат-фосфатном буфере (рН 7,5), содержащем 200 мМ хлорида натрия, разрушают их ультразвуком и центрифугируют, получая клеточный экстракт. Когда анализируют эндо-фукоидан-лиазу настоящего изобретения в этом клеточном экстракте, определяют активность культуральной среды 20 мU/мл культуральной среды.
Пример 6
Очищенный фукоидан, полученный из Kjellmaniella crassifolia, обрабатывают внутриклеточным энзимом Fucoi-danobacter marinus SI-0098 штамма настоящего изобретения, полученного в примере 5, в результате чего получают его продукты разложения.
А именно, 16 мл 2,5% фукоиданового раствора, 20 мл 100 мМ фосфатного буфера (рН 8,0), содержащего 800 мМ хлорида натрия и 4 мл 20 мU/мл раствора внутриклеточного фермента Fucoidanobacter marinus SI-0098 штамма настоящего изобретения, полученного в примере 5, смешивают вместе и оставляют реагировать при 25oС в течение 48 часов.
Затем реакционную смесь фракционируют, используя колонку Cellulofine GCL-300, и отбирают фракцию с молекулярным весом не более 2000. После обессоливания за счет Micro Acilyzer G3 эту фракцию разделяют на три фракции за счет DEAE-Sepharose FF и сушат вымораживанием, получая в результате 38 мг, 60 мг и 8,2 мг вышеуказанных соединений (а), (b) и (с) соответственно.
Таким образом, в настоящем изобретении получена новая эндо-фукоидан-линза, которая может быть использована при анализе структуры фукоидана, при идентификации продуктов разложения фукоидана и при исследованиях, касающихся фукоидана, например соединений сахара, которые можно использовать при определении биологических активностей фукоидана, частичного разложения фукоидана и для получения олиго-сахаридов фукоидана.
Формула изобретения: 1. Соединение сахара, представленное следующими общими формулами 1 или 2, в котором, по крайней мере, одна спиртовая гидроксильная группа сульфатирована, или его соль(см. графическую часть),
где Х обозначает водород или группу, представленную следующей формулой 3 (см. графическую часть),
Y обозначает водород или группу, представленную следующими формулами 4 или 5(см. графическую часть),
при условии, что Х и Y одновременно не обозначают водород;
Z обозначает водород или группу, представленную следующей формулой 6(см. графическую часть).
2. Соединение по п. 1, представленное формулой 7 (см. графическую часть),
или его соль.
3. Соединение по п. 1, представленное следующей формулой 8 (см. графическую часть),
или его соль.
4. Соединение по п. 1, представленное следующей формулой 9 (см. графическую часть),
или его соль.
5. Соединение по п. 1, представленное следующей формулой 10 (см. графическую часть),
или его соль.
6. Соединение по п. 1, представленное следующей формулой 11 (см. графическую часть),
или его соль.
7. Соединение по п. 1, представленное следующей формулой 12 (см. графическую часть),
или его соль.
8. Соединение по п. 1, представленное следующей формулой 13 (см. графическую часть),
или его соль.
9. Соединение по п. 1, представленное следующей формулой 14 (см. графическую часть),
или его соль.
10. Соединение по п. 1, представленное следующей формулой 15 (см. графическую часть),
или его соль.