Forbidden

You don't have permission to access /zzz_siteguard.php on this server.

БАЛЛИСТИЧЕСКИЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ПОДСОЛНЕЧНИКА (HELIANTHUS ANNUUS L.) - Патент РФ 2193066
Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
БАЛЛИСТИЧЕСКИЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ПОДСОЛНЕЧНИКА (HELIANTHUS ANNUUS L.)
БАЛЛИСТИЧЕСКИЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ПОДСОЛНЕЧНИКА (HELIANTHUS ANNUUS L.)

БАЛЛИСТИЧЕСКИЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ПОДСОЛНЕЧНИКА (HELIANTHUS ANNUUS L.)

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Изобретение относится к селекции растений. Для получения трансгенных растений подсолнечника их трансформируют экзогенной ДНК, вводимой в растительные клетки на частицах твердого носителя. Затем из клеток регенерируют побеги. Экзогенная ДНК может быть представлена, например, генами устойчивости к антибиотикам или гербицидам. Использование промотора RTL2 для экспрессии гена, определяющего устойчивость к гигромицину, и селекции трансформированных клеток в жидкой фазе позволяют получить высокий процент трансформантов подсолнечника. 5 з.п.ф-лы, 2 ил., 1 табл.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2193066
Класс(ы) патента: C12N15/82, A01H1/04, A01H4/00
Номер заявки: 2001129129/13
Дата подачи заявки: 30.10.2001
Дата публикации: 20.11.2002
Заявитель(и): Гапоненко Александр Константинович
Автор(ы): Гапоненко А.К.
Патентообладатель(и): Гапоненко Александр Константинович
Описание изобретения: Изобретение относится к селекции растений и может быть использовано для создания растений подсолнечника, устойчивых к биотическим и абиотическим стрессам, а также с измененным составом жирных кислот или запасных белков.
Подсолнечник принадлежит к четырем главным масличным культурам мира. Для России подсолнечник является главной масличной культурой, обеспечивающей в питании населения до 30% потребляемых энергокалорий в виде масла, маргаринов и жиров, произведенных на основе подсолнечного масла.
Высокоурожайные и высокомасличные сорта и линии подсолнечника в настоящее создаются методами традиционной селекции. Однако проблемы потери урожая от неблагоприятных климатических факторов, поражения фитопатогенными микроорганизмами и насекомыми весьма актуальны. Поэтому имеется настоятельная необходимость в радикальном улучшении созданных сортов подсолнечника, увеличении продуктивности в условиях разнообразных биотических и абиотических стрессов.
Для многих важных сельскохозяйственных культур задача получения растений, устойчивых к стрессовым факторам или с измененным качеством продукта, успешно решается путем использования генно-инженерных технологий. В настоящее время трансгенные сорта картофеля, хлопка, риса, кукурузы, устойчивые к насекомым и гербицидам, а также сорта рапса и сои с измененным составом жирных кислот занимают около 40 миллионов гектаров в США, Аргентине, Канаде и Китае. Трансгенные сорта кукурузы, устойчивые к насекомым, начинают распространяться в Европе. Первые работы по генетической трансформации клеток растений были осуществлены на подсолнечнике, но развитие генно-инженерных работ с подсолнечником отстает от других культур. Так, на сегодняшний день в США и странах Европы зарегистрировано около 3000 полевых испытаний трансгенной кукурузы, а подсолнечника - порядка 30. Поскольку для России подсолнечник является наиболее рентабельной и основной масличной культурой, создание растений подсолнечника, устойчивых к разнообразным неблагоприятным условиям среды и с измененным качеством масла, представляется важной экономической задачей.
Впервые методика получения трансгенного подсолнечника была опубликована в 1990 г. (В.Schrammeijer et al., Plant Cell Report, 9: 55-60, 1990), в котором использовалась методика агробактериального переноса генов в апикальную меристему проростков. Стабильно воспроизводимая агробактериальная технология трансформации подсолнечника была получена позже, чем для других сельскохозяйственных культур. Полевые испытания трансгенного подсолнечника были начаты в 1991 г. В дальнейшем методика, основанная на агробактериальной инфекции, была улучшена (D.Bidney et al., Plant Mol. Biol., 18: 301-303, 1992) за счет того, что перед сокультивацией с агробактерией эксплант подвергался поранению бомбардированием микроскопическими частицами металла. Эффективность трансформации была доведена до 2-4%.
Существует альтернативный способ генетической трансформации растений. К 1988 году был разработан способ прямого ввода генов (Т.Klein, J.Sanford et al. , Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85: 4305-4309, 1988). Авторы назвали свой способ "биологической баллистикой" (biolistic), его также называют "методом бомбардмента" или "методом генной пушки". Баллистический метод имеет ряд преимуществ над агробактериальным способом - он позволяет вводить одновременно несколько генов в одно растение. Например, описан случай одновременного введения 9, 10 и даже 13 генов в рис (Lili Chen et al., Nature Biotechnology, 16: 1060-1063, 1998). Такой результат невозможно получить при использовании агробактерии. Кроме того, баллистический метод позволяет трансформировать виды растений, устойчивые к агробактериальной инфекции.
Способ заключается в следующем: на золотые или вольфрамовые частицы размером в десятые доли микрона прецепитируются ДНК, содержащие генные конструкции. В специальном устройстве (существуют электрические, пневматические, гелиевые и пороховые) частицы с нанесенной на них ДНК разгоняются в вакууме до скоростей, достаточных для проникновения в клетки-мишени клеточных культур и многоклеточных эксплантатов, компетентных к регенерации растений in vitro, которые помещают в вакуумной камере под источником частиц. После такого "обстрела" необходимо выделить на селективных средах трансформированные клетки и получить из них растения-регенеранты.
Известны многочисленные случаи применения способа баллистической трансформации на пшенице (V.Vasil et al. (1992) Bio/Technology 10(6): 667-674), сое (P. Christou et al. (1990) Trends Biotech. 8: 145-151), рисе (P. Christou et al. (1994) Bio/Technology 9: 957-962), кукурузе (T.Klein et al. (1989) Plant Pysiol. 91: 440-444), хлопчатнике (Finer et al. (1990) Plant Cell Reports 8: 586-589) и других видах. Попытки применения баллистического способа для генетической трансформации подсолнечника проводились в лаборатории Gunter Hanner (Reiner Hunold et al. (1995) Plant Science 105: 95-109). Эти работы не увенчались успехом, и авторы не сумели получить трансгенных растений. Подводя итог многолетним исследованиям, другие разработчики в данной области (напр. , Pioneer Hi-Bred International - см. пат. US 6229078) также констатируют, что подсолнечник почти не поддается баллистической трансформации.
Поэтому нами была поставлена задача разработать воспроизводимую технологию баллистической трансформации подсолнечника, которая оказалась бы достаточно эффективной.
Сущность изобретения заключается в том, что в способе получения трансгенных растений подсолнечника, включающем трансформацию клеток ткани подсолнечника введением в них экзогенной ДНК, селекцию трансформированных клеток из ткани и регенерацию из них побегов, были сделаны следующие улучшения, которые позволили придать ткани повышенную способность к трансформации (т.е. увеличить частоту трансформации ее клеток):
1. Использовав метод культивирования, регенерации и вторичной индукции эмбриоидов подсолнечника in vitro, по модифицированной нами методике Freyssnet, мы впервые в мире успешно применили баллистический способ доставки генов в компонентные к регенерации клетки и получению из них трансгенной ткани подсолнечника и разработали новый способ селекции этой ткани в жидкой фазе с последующей регенерацией и клонированном трансгенных растений.
2. Создан и использован оригинальный метод обработки незрелых зародышей пониженными температурами в течение суток (при to +4Сo), повышающий частоту транзиентной экспрессии гетерологичных генов и генетической трансформации.
3. Экспериментально отработаны оптимальные условия доставки генных конструкций в незрелые зародыши методом бомбардмента при помощи баллистической установки PIG (Particle Inflow Gun (Finer et al., Plant Cell Report, 1992, 11: 323-328)).
4. Найден эффективный промотор (RTL2) для регуляции экспрессии селективного гена Hgh, определяющего устойчивость к антибиотику гигромицину, для селекции in vitro трансформированных клеток.
5. Создана оригинальная система селекции трансформированных тканей в жидкой среде на модифицированной нами культуральной среде Chraibi [Chraibi et al., Plant Cell Report (1992), 10: 617-620].
6. Создана система выделения и микроклонирования трансгенной ткани.
7. Укоренение трансгенных растений проводили методом прививок на 7-дневные проростки подсолнечника.
Далее изобретение раскрывается более подробно со ссылками на чертежи.
На фиг.1 показана конструкция плазмиды RTL2.
На фиг.2 показан результат ПЦР анализа наличия введенного гена гигромицин фосфотрансферазы (hgh) в ДНК семян трансгенного подсолнечника сорта Передовик улучшенный.
Далее в примерах раскрыт оптимальный вариант изобретения.
Пример 1. Получение культуры незрелых зародышей подсолнечника in vitro
1.1 Получение растительного материала
Донорные растения могут быть выращены в поле или в оранжерее при освещении ртутными и натриевыми лампами, обеспечивающими освещенность не менее 40000 люкс, при фотопериоде 15/9 часов, при температуре 26oС и 70% влажности. Еженедельно растения подкармливают добавочно KNO3 и микроэлементами. В условиях оранжереи еженедельно ведется опрыскивание ядохимикатами для предотвращения размножения белокрылки. Донорные растения опыляются ручным способом щеткой или корзинкой об корзинку.
1.2. Выделение и культивирование незрелых зародышей
Корзинки донорных растений, срезанных днем на 7-12 день после опыления, хранят до следующего утра при температуре +4oС. Семена проверяются на оптимальный размер зародышей разрезанием корзинки на две половины и исследуется размер зародышей в каждом ряду. Цветение начинается с наружного края корзинки к центру и длится около недели, поэтому только один-два ряда имеют размер зародышей 1-1,5 мм, которые используют для трансформации. Семена подходящего размера стерилизуют в 25%-м растворе Clorox (коммерческий отбеливатель), добавляя 3-4 капли Twen-80, затем промывают 3 раза стерильной дистиллированной водой. Все операции выполняют в условиях ламинарного бокса, обеспечивающего асептические условия. Незрелые зародыши размером 1-1,5 мм выделяют, отрезая верхнюю 1/3 семени и осторожно выдавливая зародыш на поверхность чашки Петри тупой стороной скальпеля. Зародыши помещают на модифицированную добавкой 500 мг/л гидролизата казеина среду SFRI для индукции эмбриоидов (Freyssinet et al., патент US 5017491, 1991), содержащую 0,5-1 мг/л ВАП, рН 5,7. Зародыши культивируют в темноте при температуре 27oС. В результате ткань эмбриоидов существенно увеличивает способность к трансформации экзогенной ДНК.
Пример 2. Условия бомбардмента эксплантов
Зародыши размещают в виде кольца на той же среде в чашках Петри, наружный диаметр которого составляет 5 см, внутренний - 1 см. Зародыши раскладывают на среде, помещая одну из семядолей в среду, обеспечивая перпендикулярность поверхности гипокотиля направлению потока частиц с нанесенной на них ДНК (см. ниже пример 3), которыми она будет бомбардироваться.
Для бомбардировки могут быть использованы частицы любого подходящего твердого материала, например вольфрама, золота, платины и др. В приведенном примере осуществления изобретения были использованы микрочастицы вольфрама.
После 2-4 дней прекультивирования на среде SFRI незрелые зародыши подвергали бомбардированию частицами вольфрама размера 0,7-2,5 микрон, используя PIG [Particle Inflow Gun (Finer et al., Plant Cell Reports, 11: 323-328, 1992)]. Перед бомбардированием чашки с зародышами оставляли открытыми на один - два часа для легкого подсыхания зародышей, обеспечивающего плазмолиз в клетках-мишенях, который также обусловлен высоким осмотическим давлением среды, содержащей 9% сахарозы и высокую концентрацию аминокислот. Расстояние от источника частиц составляло 12 см, давление Гелия - 6 атм, вакуум в камере - 0,3 атм. Между источником частиц и эксплантами помещалась предохранительная сетка с размером ячейки 0,5 мм. Каждый зародыш после первого бомбардмента переворачивался на другую сторону и подвергался вторичному бомбардаменту.
Пример 3. Генные конструкции для баллистической трансформации подсолнечника
Баллистическая трансформация может осуществляться одной плазмидой, несущей необходимые для трансформации гены - селективные: ген nptII устойчивости к антибиотику канамицину, или ген hph устойчивости к антибиотику гигромицину, или ген bar устойчивости к гербициду Basta, или ген EPSP synthase устойчивости к гербициду Glyphosate; репортерные: ген β-glucuronidase [uidA или (GUS)] или GFP (green fluorescent protein); и гены, представляющие интерес для улучшения агрономических свойств растения.
Возможно использовать и смесь нескольких плазмид, каждая из которых несет один из указанных видов генов. При использовании смеси двух плазмид в соотношении 1:1 вероятность их коинтеграции составляет от 30 до 75%.
В данном случае использовалась плазмида pRT-TL-Hyg, несущая ген устойчивости к гигромицину hph, в котором кодирующая часть гена находится под управлением промотора RTL2, содержащего двойной промотор 35S из вируса мозаики цветной капусты и TL энхансер из вируса табака. В качестве терминатора транскрипции использован терминатор вируса мозаики цветной капусты.
Пример 4. Технология нанесения ДНК на частицы вольфрама
50 мг частиц стерилизовались в 500 мкл 95% этанола в течение 20 минут. Частицы осаждались центрифугированием, затем ресуспендировались в 500 мкл стерильной воды. Эта операция повторялась трижды. К 25 мкл ресуспендированных в пробирке частиц добавлялись 5 мкл ДHК, смешивались пипеткой. Далее добавлялось 25 мкл проавтоклавированного раствора 2,5 М CaCl2, все смешивалось и к смеси быстро добавлялось 10 мкл 100 mМ спермидина. После смешивания раствор-суспензия и помещалась на 5 минут на лед. После этого 50 мкл супернатанта удалялось, а оставшаяся суспензия частиц с прецепитированной ДНК использовалась в течение 15 минут. На каждый выстрел расходовалось по 2-3 мкл взвеси микрочастиц.
Пример 5. Селекция на среде с гигромицином
Обработанные зародыши культивировали в течение 5 дней в темноте на модифицированной среде SFRI. После этого для селекции трансформированной ткани экспланты переносили в 250-миллилитровые колбы Эрленмейера емкостью 250 мл, содержащие 35 мл среды LBM (Chraibi et al., 1992). Среда содержала 3% сахарозы, 1 мг/л БАП, 1 мг/л НУК и 15 мг/л гигромицина. Колбы помещали на ротационный шейкер, частота колебаний составляла около 137 мин-1. Селекцию проводили при освещении и температуре 27oС. Среду меняли каждые 5-7 дней. Селекцию осуществляли в течение 3-4 недель.
Пример 6. Регенерация трансгенных побегов
После 2-3 недель селекции основная ткань эксплантов некротизировалась, приобретая коричневый и черный цвет. Экспланты переносились в чашки Петри и проверялись на наличие растущей зеленой ткани. При наличии таковой экспланты переносились в жидкую среду без селективного агента на два-три дня, после чего зеленую ткань, растущую в области гипокотиля, вырезали и помещали на среду SFRI и культивировали на свету, меняя среду каждые 7 дней. Ткани с регенерационными зонами переносили на среду SFRII, содержащую 3% сахарозы и БАП в концентрации 0,5-1 мг/л. Для удлинения развивающихся побегов последние переносили на среду с концентрацией БАП менее 0,2 мг/л или на среду, не содержащую БАП. Полученные клоны могут быть размножены при культивировании на среде SFRI и SFRII в течение двух месяцев.
Пример 7. Укоренение на среде для укоренения или методом прививки на побеги подсолнечника
Для получения взрослых фертильных растений использовали среды для укоренения и метод прививания побегов длиной 3-5 мм на 7-дневные проростки подсолнечника в культуре in vitro. Использовали побеги, достигшие 3-5 мм длины и имеющие пазушную почку. У выращенных в асептических условиях проростков подсолнечника удаляли семядоли и апекс побега. Скальпелем в гипокотиле, на расстоянии 5-7 мм от верхней части, проводили сквозной вертикальный разрез, и в образовавшуюся щель вставляли побег. Привитые проростки культивировали в пробирках при температуре 27oС при фотопериоде 16/8 часов. Через две-три недели растения из пробирок переносили в горшки с почвой и обеспечивали создание "влажной камеры". Далее растения пересаживали в большие горшки и выращивали в условиях теплицы. Частота выживания прививок, достигших цветения, составляла до 70%.
Пример 8. Анализ природы полученных растений методом ПЦР
Доказательство встраивания вводимого гена в геном трансгенных растений осуществляли по стандартной методике полимеразой цепной реакции (Mullis К.В. & Faloona F. A. Meth. Enzymol, 155, 335, 1987). На фиг.2 показан результат ПЦР анализ наличия введенного гена гигромицин фосфотрансферазы (hgh) в ДНК семян трансгенного подсолнечника сорта Передовик улучшенный. Дорожки 1 и 16 - молекулярный маркер - фагλ; дорожки 2 и 3 - ДНК нетрансформированного подсолнечника, негативный контроль; дорожка 15 - плазмида с геном hgh; дорожки - с 4 по 14 ДНК из растений - трансформантов.
Пример 9. Частота трансформации
Частота трансформации, полученная при использовании разработанного метода, вычислялась как отношение количества трансгенных побегов, для которых показано встраивание гетерологичного гена в геном методом ПЦР, к количеству обстрелянных чашек с эксплантами или числу использованных для трансформации эксплантов. Данные ряда независимых опытов представлены в таблице.
Формула изобретения: 1. Способ получения трансгенных растений подсолнечника, включающий трансформацию клеток ткани подсолнечника введением в них экзогенной ДНК, селекцию трансформированных клеток из среды и регенерацию из них побегов, отличающийся тем, что в процессе подготовки клеток ткани к трансформации им придают повышенную способность к трансформации, экзогенную ДНК вводят в клетки ткани на частицах твердого носителя, а селекцию трансформированных клеток ведут в жидкой фазе.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для трансформации используют клетки незрелых зародышей подсолнечника.
3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что зародыши при подготовке к трансформации хранят при пониженной температуре.
4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что при подготовке к трансформации используют среду SFRI, модифицированную добавлением гидролизата казеина.
5. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что экзогенная ДНК включает, по крайней мере, ген nptII устойчивости к антибиотику канамицину, или ген hph устойчивости к антибиотику гигромицину, или ген bar, определяющий устойчивость к гербициду Basta, или ген EPSP synthase, определяющий устойчивость к гербициду Glyphosate, и репортерный ген uidA (GUS) или GFP.
6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что экзогенная ДНК включает ген hph, определяющий устойчивость к гигромицину, в котором кодирующая часть гена находится под управлением промотора RTL 2.