Forbidden

You don't have permission to access /zzz_siteguard.php on this server.

ШТАММ БАКТЕРИЙ VIBRIO CHOLERAE KM 200 - ПРОДУЦЕНТ ХОЛЕРНОГО ТОКСИНА И ТОКСИН - КОРЕГУЛИРУЕМЫХ ПИЛЕЙ АДГЕЗИИ - Патент РФ 2193598
Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
ШТАММ БАКТЕРИЙ VIBRIO CHOLERAE KM 200 - ПРОДУЦЕНТ ХОЛЕРНОГО ТОКСИНА И ТОКСИН - КОРЕГУЛИРУЕМЫХ ПИЛЕЙ АДГЕЗИИ
ШТАММ БАКТЕРИЙ VIBRIO CHOLERAE KM 200 - ПРОДУЦЕНТ ХОЛЕРНОГО ТОКСИНА И ТОКСИН - КОРЕГУЛИРУЕМЫХ ПИЛЕЙ АДГЕЗИИ

ШТАММ БАКТЕРИЙ VIBRIO CHOLERAE KM 200 - ПРОДУЦЕНТ ХОЛЕРНОГО ТОКСИНА И ТОКСИН - КОРЕГУЛИРУЕМЫХ ПИЛЕЙ АДГЕЗИИ

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в производстве для получения вакцин и диагностических тест-систем. Задачей изобретения является получение штамма холерного вибриона классического биовара серовара Огава с высокой продукцией холерного токсина, токсин-корегулируемых пилей адгезии, не синтезирующего растворимую гемагглютинин/протеазу). Получен штамм Vibrio cholerae KM 200, не синтезирующий гемагглютинин/протеазу - продуцент холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии. Штамм получен методом отбора из природного токсигенного штамма М29, не синтезирующего растворимую гемагглютинин/протеазу. Штамм не синтезирует растворимую гемагглютинин/протеазу, обладает высоким уровнем продукции (14 мкг/мл) холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии, превышающим в 2-3 раза уровень продукции этого антигена у известных производственных штаммов, и может быть использован в производстве для получения более эффективной холерной вакцины холероген-анатоксин путем обогащения ее новыми протективными антигенами (ТСР), приготовления очищенных антигенов холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии, которые могут быть использованы для разработки дешевых диагностических тест-систем с целью выявления природных штаммов холерного вибриона с продукцией СТ и ТСР, для проведения генетических исследований по изучению систем регуляции экспрессии генов вирулентности и иммуногенности холерного вибриона.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2193598
Класс(ы) патента: C12N1/20, A61K35/74, C12N1/20, C12R1:63
Номер заявки: 2001121037/13
Дата подачи заявки: 26.07.2001
Дата публикации: 27.11.2002
Заявитель(и): Федеральное государственное учреждение Российский научно- исследовательский противочумный институт "Микроб"
Автор(ы): Смирнова Н.И.; Заднова С.П.; Топорков А.В.; Челдышева Н.Б.
Патентообладатель(и): Федеральное государственное учреждение Российский научно- исследовательский противочумный институт "Микроб"
Описание изобретения: Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению штамма холерного вибриона классического биовара серовара Огава, эффективно продуцирующего основные протективные антигены - холерный токсин, токсин-корегулируемые пили адгезии и не синтезирующего в среду выращивания растворимую гемагглютинин/протеазу. Штамм может быть использован в производстве для создания высокоэффективных химических холерных вакцин нового поколения, для получения очищенных препаратов холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии, предназначенных для дальнейшего изготовления диагностических тест-систем, а также для проведения генетических исследований по изучению систем регуляции экспрессии генов вирулентности и иммуногенности холерного вибриона.
Известен штамм классического биовара Vibrio cholerae 569(B) серовара Инаба, который используется в зарубежной и отечественной медицине в качестве производственного для получения вакцин (патент РФ 2076734, А 61 К 39/00, 35/76; Ketley J. et all. Infect. Immun., 1990, v.141, p.893-899).
Однако указанный штамм по данным GM1 ELISA продуцирует лишь 8-10 мкг/мл холерного токсина (СТ) в среду выращивания и небольшое количество токсин-корегулируемых пилей адгезии (TCP), выявляемых лишь высокочувствительным методом иммуноблота, но не в реакции самоагглютинации. Данный штамм, как и большинство штаммов холерного вибриона, продуцирует растворимую гемагглютинин/протеазу с наличием токсических свойств, у которой и способностью к разрушению клеточных рецепторов для прикрепления холерных вибрионов связывают остаточную реактогенность и меньшую приживаемость вакцинных препаратов.
Наиболее близким к заявляемому штамму является штамм Vibrio cholerae 2414 серовара Огава (патент РФ N2169187 С12 N1/20), эффективно продуцирующий в среду выращивания холерный токсин, В-субъединица которого является основным иммуногеном (по данным GM1 ELISA 48-60 мкг/мл), синтезирует на поверхности клеток токсин-корегулируемые пили адгезии.
Однако указанный штамм содержит плазмиду, несущую гены устойчивости к антибиотикам, и для эффективной экспрессии протективных антигенов выращивание этого штамма необходимо производить на средах с добавлением тетрациклина или канамицина. Штамм V. cholerae 2414 продуцирует растворимую гемагглютинин/протеазу.
Для создания более эффективных химических вакцин необходимо освобождение от неиммуногенных, непротективных антигенов, одним из которых является растворимая гемагглютинин/протеаза, и использование штаммов холерного вибриона с высокой продукцией основных протективных антигенов - холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии
Задача изобретения - получение штамма холерного вибриона с высокой продукцией холерного токсина, токсин-корегулируемых пилей адгезии и отсутствием растворимой гемагглютинин/протеазы.
Штамм V. cholerae KM 200 характеризуется следующими признаками.
Культурально-морфологические признаки.
Подвижные, слегка изогнутые палочки, не образующие капсул и спор. На твердых питательных средах растет в виде круглых серовато-голубоватых полупрозрачных колоний, при посеве в бульон вызывает равномерное помутнение этой среды. Штамм является ауксотрофным, несет мутацию в гене Pur-.
Патогенные свойства - слабовирулентный, для кроликов-сосунков вирулентен в дозе 107 м.т./мл.
Физиологические свойства
Не лизирует эритроциты барана, не агглютинирует куриные эритроциты, не растет на щелочном агаре с добавлением 50 мкг/мл полимиксина. Агглютинируется до титра холерными диагностическими сыворотками О и Огава. Чувствителен к холерному диагностическому фагу С. Не ферментирует лактозу и арабинозу. До кислоты без газа ферментирует маннозу, сахарозу, маннит, мальтозу.
- Высокий уровень продукции холерного токсина в среду выращивания (14 мкг/мл) и поверхностных токсин-корегулируемых пилей адгезии, превышающий в 2-3 раза уровень продукции этого белка у известных производственных штаммов.
- В хромосоме регистрируется наличие гена hap, но синтез продукта, кодируемого этим геном - гемагглютинин/протеазы, отсутствует.
Штамм хранят в лиофильно высушенном состоянии не менее одного года.
Штамм Vibrio cholerae KM 200 серовара Огава классического биовара получен путем отбора клонов с высокой продукцией TCP из природного штамма V. cholerae M29, продуцирующего только холерный токсин и не синтезирующего растворимую гемагглютинин/протеазу. Штамм V. cholerae KM 200 серовара Огава депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ "Микроб" под номером КМ 200.
Пример 1, иллюстрирующий высокую продуктивность штамма
Высушенную ампульную культуру штамма V. cholerae KM 200 засевают на агар Хоттингена рН 7.6 и инкубируют 18 ч при 37oС. Выросшую культуру рассевают на LB-агар для получения изолированных колоний и последующей проверки наличия токсин-корегулируемых пилей адгезии методом самоагглютинации культуры в бульоне [Chiang S. L. et al. Molecular Microbiology, 1995, v.17, p. 1133-1142] . Через 18 ч ресуспендируют одну выросшую колонию в 1 мл LB бульона и как инокулят вносят 7 мкл этой суспензии в 10 мл казаминового бульона, содержащего 3% казаминовых кислот и 0,5% дрожжевого экстракта, рН 7,6. Культуру выращивают 17-18 ч в шейкере при 30oС. Степень агглютинации учитывают визуально. Штамм V. cholerae KM 200 вызывает видимую самоагглютинацию всех бактериальных клеток в бульоне, что указывает на синтез значительного количества находящихся на поверхности токсин-корегулируемых пилей адгезии. При сравнении со штаммом V. cholerae 569B, используемом при производстве химической холерной вакцины холероген-анатоксин, штамм V.cholerae KM200 превышает уровень синтеза белка TCP в 2-3 раза.
Бульон после самоагглютинации клеток используют для определения холерного токсина иммуноферментным методом [Svennerholm A.M. et al. J. Clin. Microbiol. , 1983, v.17, р.596-601]. Пробы инкубируют в течение двух часов при 37oС в лунках микроплат, блокируют неспецифическую сорбцию инертным белком (бычий сывороточный альбумин). Инкубацию с кроличьей антитоксической противохолерной сывороткой, разведенной 1:200, проводят в течение 1 ч при 37oС. После промывания лунок 0,05 М фосфатным буфером рН 7,2-7,4 добавляют рабочее разведение иммуноферментных конъюгатов, которые представляют собой меченые пероксидазой козьи диагностические антитела против иммуноглобулинов кролика. Реакцию учитывают через 15 минут после добавления субстрата - 0,03% перекиси водорода в цитратном буфере рН 4,0 с 0,1% ABTS [2,2 azino-di-(3-thylbenzthiazoline sulphonate)] . Чувствительность метода ELISA составляет в данной серии опытов 1 мкг/мл. Количество продуцируемого холерного токсина у исследуемого штамма рассчитывают в соответствии с установленной чувствительностью и подсчетом числа выросших микробных клеток. Штамм Vibrio cholerae KM 200 продуцирует 14 мкг/мл холерного токсина.
Пример 2, подтверждающий отсутствие растворимой гемагглютинин/протеазы
Для определения продукции растворимой гемагглютинин/протеазы культуру выращивают на агаре, содержащем 10% обезжиренного молока. Бактерии, синтезирующие указанный фермент, образуют зону лизиса вокруг колонии на фоне мутного агара. Штамм Vibrio cholerae KM 200 не синтезирует растворимую гемагглютинин/протеазу и не образует зон просветления вокруг макроколонии в отличие от положительного контроля, что подтверждает отсутствие растворимой гемагглютинин/протеазы.
Таким образом, штамм Vibrio cholerae KM 200 не синтезирует растворимую гемагглютинин/протеазу и обладает высоким уровнем продукции холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии, превышающим в 2-3 раза уровень продукции этих антигенов у известных производственных штаммов. Штамм может быть использован в производстве для получения более эффективной холерной вакцины холероген-анатоксин путем обогащения ее новыми протективными антигенами (TCP); приготовления очищенных антигенов холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии, которые могут быть использованы для разработки дешевых диагностических тест-систем с целью выявления природных штаммов холерного вибриона с продукцией СТ и TCP; для проведения генетических исследований по изучению систем регуляции экспрессии генов вирулентности и иммуногенности холерного вибриона.
Формула изобретения: Штамм бактерий Vibrio cholerae KM 200 - продуцент холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии.