Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
ШТАММ И КУЛЬТУРА ШТАММА Streptococcus equi TW 928 ДЛЯ ВАКЦИНАЦИИ ЛОШАДЕЙ
ШТАММ И КУЛЬТУРА ШТАММА Streptococcus equi TW 928 ДЛЯ ВАКЦИНАЦИИ ЛОШАДЕЙ

ШТАММ И КУЛЬТУРА ШТАММА Streptococcus equi TW 928 ДЛЯ ВАКЦИНАЦИИ ЛОШАДЕЙ

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Изобретение относится к штамму Streptococcus equi TW 928, депонированному под номером CBS 813.95, вызывающему острое заболевание верхних дыхательных путей у лошадей, микробиологически чистой культуре, включающей бактерии, соответствующие депонированному штамму Streptococcus equi TW 928, живой вакцине для борьбы с Streptococcus инфекцией у лошадей, которая содержит бактерии указанного штамма, а также к способу получения вакцины, заключающемуся в смешивании штамма бактерий Streptococcus equi TW 928 и фармацевтически приемлемого носителя. Представленный штамм содержит в своем геноме делецию, которая составляет приблизительно 1 kb, благодаря чему реверсия бактерий штамма к вирулентности весьма незначительна, однако штамм все же сохраняет свою капсулу. 4 с. и 3 з.п.ф-лы, 7 табл.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2194752
Класс(ы) патента: C12N1/20, A61K39/09, C12N1/20, C12R1:46
Номер заявки: 97101084/13
Дата подачи заявки: 24.01.1997
Дата публикации: 20.12.2002
Заявитель(и): ДЗЕ ПРОВОСТ ФЕЛЛОУС ЭНД СКОЛАРС ОФ ДЗЕ КОЛЛЕДЖ ОФ ДЗЕ ХОЛИ АНДИВАЙДЕД ТРИНИТИ ОФ КВИН ЭЛИЗАБЕТ НЕАР ДУБЛИН (IE)
Автор(ы): ХАРТФОРД Орла Мари (IE); ФОСТЕР Тимоти Джеймс (IE); ЯКОБС Антониус Арнодус Кристиаан (NL)
Патентообладатель(и): ДЗЕ ПРОВОСТ ФЕЛЛОУС ЭНД СКОЛАРС ОФ ДЗЕ КОЛЛЕДЖ ОФ ДЗЕ ХОЛИ АНДИВАЙДЕД ТРИНИТИ ОФ КВИН ЭЛИЗАБЕТ НЕАР ДУБЛИН (IE)
Описание изобретения: Изобретение относится к новому штамму Streptococcus equi и вакцине, включающей данный штамм.
Streptococcus equi известен в течение длительного времени как причина острого заболевания верхних дыхательных путей у лошадей (Sweeney et al.. Compendium Equine 9: 689-693 (1987)). Данное очень заразное заболевание характеризуется лихорадочным состоянием, слизисто-гнойными назальными выделениями, лимфоденапатией и последующим абсцессом лимфоузлов головы и шеи (Sweeney et al.. Compendium Equine 9: 845-851 (1987)).
Набухание лимфоузлов часто является настолько сильным, что дыхательные пути становятся непроходимыми. Это явление объясняет общее название заболевания: удушье.
Данное заболевание является смертельным лишь в небольшом количестве случаев, как описано Sigmund (Sigmund, O.H. and Fraser, C.M. eds: The Merck Veterinary Manual, 5th Ed. Merck and Company Inc., Rahway, N.J.: 313-315 (1979)).
В противоположность этому смертность обычно высока и может достигать 100% у восприимчивых популяций.
Вакцины против данного заболевания известны на протяжении длительного времени (Basely, P. L. , Austr. Vet. J. 16: 243 (1940)) and (Basely, P.L., Austr. Vet. J. 18: 141-155 (1942)).
До настоящего времени имеются в распоряжении только два типа вакцин: а) вакцины на основе классических бактеринов и b) субъединичные вакцины на основе М-белка, иммуногенного белка.
Оба типа вакцин имеют свои серьезные недостатки. Бактерины печально известны своими неблагоприятными реакциями и, как известно, обеспечивают относительно малую защиту (Subcommittee on the Efficacy of Strandles Bacterin, Report, American Association of equine Practitioners). М-белок считается слабым антигеном, который обеспечивает удовлетворительный иммунный ответ лишь после многократных инъекций (Shrlvastava, S.K. and Barnum, D.A.: Can. J. Соmр. -Med. 49: 351-356 (1985)) (Woolcock, J.B.: Austr. Vet. J. 51: 554-559 (1975)).
Кроме того, продолжительность полученного с помощью этих вакцин иммунитета относительно коротка, дополнительные повторные вакцинации должны проводиться, по крайней мере, раз в год (Sweeney et al., Compendium Equine 9: 845-851 (1987)).
Классические вакцины на основе бактеринов или субъединиц доступны, например, от Forth Dodge Laboratories and Coopers Animal Health. Кроме того, Mobay Company является владельцем, например, пат. США 4944942, раскрывающим бактерин.
В том случае, когда лошади инфицируются естественным путем живым вирулентным Streptococcus equi полевым штаммом, у них развивается длительный иммунитет. Это имеет место, даже когда инфекция проходит без клинических симптомов (Woolcock, J.B.: Austr. Vet. J. 51: 554-559 (1975)). Это означает, что в принципе вакцинация живым ослабленным штаммом имела бы сильное преимущество над вакцинацией обычно используемыми неактивированными вакцинами или субъединичными вакцинами.
Однако, несмотря на этот факт, в настоящее время живая ослабленная вакцина промышленно недоступна.
Известен только один патент (ЕП 0230456), в котором заявлена вакцина на основе специфического живого ослабленного Streptococcus equi. Никаких коммерческих или промышленных вакцин на основе этого патента еще нет на рынке, хотя запатентованный штамм существует вот уже в течение 10 лет.
Вакцина патента ЕП 0230456 хотя и лучше, чем существующий бактерин и субъединичные вакцины, имеет несколько недостатков:
a) ослабленный характер основан на химически вызванных, неустановленных мутациях в геноме вакцинного штамма. Эти мутации несомненно являются точечными мутациями вследствие используемых мутагенов: нитрозогуанидин. Точечные мутации склонны к обратной мутации и, таким образом, к реверсии к вирулентности. Ослабленный штамм, в котором ослабление вызывается вполне установленной необратимой делецией значительного размера и, таким образом неспособный ревертировать вирулентность, был бы, следовательно, наиболее предпочтительным;
b) вакцина основана на неинкапсулированном штамме:
проводился скриннинг для неинкапсулированных колоний. Потеря их вирулентности является основой для вакцины. Как следствие, вакцина, основанная на нем, таким образом, обычно не защищает от очевидного фактора вирулентности, т.е. капсулы.
Следовательно, была бы предпочтительна живая вакцина, все еще содержащая капсулу и обеспечивающая таким образом более полную защиту.
с) вакцина не является полностью безопасной для жеребцов. Поскольку, однако, жеребцы наиболее восприимчивы к заболеванию, их следует вакцинировать в очень юном возрасте. Поэтому вакцина, которая полностью безопасна для жеребцов, должна быть наиболее предпочтительной.
Неожиданно обнаружено, что новый штамм, полученный из полевого изолята дикого типа, обладает вышеупомянутыми благоприятными характеристиками.
Данный новый штамм получают из вирулентного полевого штамма, штамм TW, который выделяют из клинически больных лошадей.
Новый штамм выбран на основании того, что он содержит огромную делецию в своем геноме, вызывающую его ослабленный характер по сравнению с исходным TW штаммом. Поскольку делеция составляет приблизительно 1 kb, шансы, что происходит реверсия к вирулентности, весьма незначительны. Штамм все же сохраняет свою капсулу. Кроме того, он безопасен для жеребцов, как показано в примерах.
Данное изобретение представляет штамм Streptococcus equi TW 928, депонированный в Нидерландах под номером CBS 813.95 в Centraalbureau voor Schimmelcultures, P.O. box 273, 3740 AG Baam, The Netherlands.
Кроме того, изобретение относится к микробиологической чистой культуре, включающей бактерии, соответствующие депонированному штамму. Само собой разумеется, что также включены следующие генерации бактерий от депонированного штамма.
Культуру можно, например, получить путем выращивания указанных бактерий при температуре между 30 и 41oС. Бактерии могут выращиваться, например, в М17 среде (1 л содержит 5 г Триптозы, 5 г нейтрализованного соевого пептона, 2,5 г дрожжевого экстракта, 5 г мясного экстракта, 10 г глюкозы, 0,5 г аскорбиновой кислоты, 19 г Na2(В-)глицерофосфата, 0,25 г MgSO4(7H2O), pH 7,0-7,2).
Кроме того, изобретение предоставляет живую вакцину для борьбы с Streptococcus инфекцией у лошадей. Такая вакцина включает ослабленные живые бактерии штамма Streptococcus equi TW 928, депонированного под номером CBS 813.95 в Centraalbureau voor Schimmelcultures, at Baam, The Netherlands, и фармацевтически приемлемый носитель. Таким носителем может быть просто вода, но он может также включать культуральную жидкость, в которой выращиваются бактерии. Еще одним подходящим носителем является, например, солевой раствор физиологической концентрации.
Вакцину согласно изобретению можно назначать для приема в различных формах. Ее можно применять, например, парентерально, внутримышечно, подкожно или интрадермально, ее можно также давать орально или она может вводиться внутриназально.
Назальная слизистая оболочка представляет собой обычный путь входа Streptococcus equi инфекции. Поэтому нос является наиболее естественным местом для применения живой ослабленной вакцины согласно изобретению. Кроме того, этот участок применения имеет то преимущество, что он легко достижим, и что вакцину можно ввести, например, путем распыления. Таким образом, в предпочтительной форме вакцина данного изобретения является подходящей для внутриназального применения.
Вакцина может содержать любую дозу бактерий, достаточную для того, чтобы вызвать иммунный ответ. Дозы в диапазоне от 103 до 109 бактерий, например, являются весьма подходящими дозами.
Благодаря ослабленным характеристикам, вакцину можно использовать для защиты лошадей любого возраста, включая новорожденных лошадей. По практическим соображениям вакцину обычно следует давать в раннем возрасте, например в возрасте от 1 до 12 месяцев.
Существует несколько способов хранения живых организмов. Хранение в холодильнике, например, представляет хорошо известный способ. Также часто используется хранение при -70oС в буфере, содержащем глицерин. Бактерии могут также храниться в жидком азоте. Сушка вымораживанием представляет еще один путь консервации. Бактерии, высушенные вымораживанием, могут храниться и сохранять жизнеспособность в течение многих лет. Температуры хранения для высушенных вымораживанием бактерий могут быть значительно выше нуля градусов без пагубного воздействия на жизнеспособность. Сушку вымораживанием можно осуществлять согласно хорошо известным стандартным способам сушки вымораживанием. В процессе сушки вымораживанием могут добавляться дополнительные полезные добавки, такие как, например, снятое молоко, трегалоза, желатин или бычий сывороточный альбумин. Поэтому более предпочтительной формой вакцины является ее высушенная вымораживанием форма.
Согласно еще одному варианту воплощения изобретения вакцина данного изобретения дополнительно включает еще один ослабленный патоген или антигенный материал из другого патогена. Таким патогеном может быть, например, другая бактерия или паразит. Он может быть также вирусного происхождения. Обычно другой патоген или его антигенное вещество является патогеном лошади.
Предлагаемая изобретением вакцина, которая включает также дополнительный ослабленный патоген или антигенное вещество из другого патогена, имеет преимущетво, заключающееся в том, что она вызывает защиту от нескольких инфекций в одно и то же время. Лошадиные патогены или их антигенные вещества, которые могут успешно добавляться, представляют, например, возбудитель Potomac лихорадки, Rhodococcus equi, Clostrldium tetanii, Mycobacterrium pseudomallei, везикулярный вирус стоматита, вирус болезни Borna, лошадиный вирус гриппа, вирус болезни Африканских лошадей, лошадиный вирус артрита, вирус лошадиного герпеса 1-4, вирус инфекционной анемии, вирус лошадиного энцефаломиелита и вирус японского В энцефалита.
Вакцина может также включать адъюванты. Адъюванты являются неспецифическими стимуляторами иммунной системы. Они повышают иммунный ответ хозяина на внедряющийся патоген. Примерами адъювантов, известных в данной области, являются полные и неполные адъюванты Freunds, витамин Е, неионные блокполимеры, мурамилдипептиды, ISCOMs (иммунные стимулирующие комплексы, см., например, ЕР 109942), Quill А, минеральное масло, растительное масло и Карбопол (Carbopol) (гомополимер).
Адъювантами, особенно подходящими для применения через слизистую оболочку, являются, например, Е coil, теплолабильный токсин (LT) или токсин холеры (СТ).
Кроме того, вакцина может включать один или более стабилизаторов. Вакцина может также включать один или более эмульгаторов, например Спан (Span) или Твин (Tween).
Кроме того, изобретение предоставляет способы получения вакцины. Эти способы, например, включают смешивание штамма бактерий Streptococcus equi TW 928 и фармацевтически приемлемого носителя.
Кроме того, данное изобретение относится к использованию штамма Streptococcus equi TW 928, депонированного под номером CBS 813.95 в Centraalbureau voor Schimmelcultures at Baam, The Netherlands для получения вакцины для борьбы с Streptococcus инфекцией лошадей.
Пример 1. Выбор мутантного штамма
Полевой штамм Streptococcus equi выделялся из лошади с клиническими признаками удушья.
Данный штамм выращивался на протяжении ночи аэробно при 37oС на кровяном агаре и затем инокулировался в М17 среду (1 л содержит 5 г Триптозы, 5 г нейтрализованного соевого пептона, 2,5 г дрожжевого экстракта, 5 г мясного экстракта, 10 г глюкозы, 0,5 г аскорбиновой кислоты, 19 г Na2(В-)глицерофосфата, 0,25 г MgSO4(7H2O), pH 7,0-7,2) и подвергался различным приемам ДНК мутации. Классические приемы мутации описаны, например, Cariton, B. C. and Brown, B. J. в Manual of Methods for General Bacterology (Eds. Gerhardt et al.) American Society for Microbiology, Washington D.C., p. 226 (1981).
Приемы мутации, основанные на рекомбинантной ДНК технологии, описаны Maniatis (Manlatis, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, ISBN 0-87969-309-6 (1969)).
Отбирались мутантные штаммы, имеющие делении, поддающиеся определению в стандартном электрофорезе в полиакриламидном геле по рестрикционному фрагменту (хорошо известном в данной области техники, например, Manlatis) по сравнению с исходным TW штаммом.
Штамм с 1 kb делецией отбирался, обозначался TW 928 и испытывался на его ослабленный характер, как описано в нижеследующих примерах.
Пример 2. Приготовление вакцины
Штамм Streptococcus equi TW 928 и исходный TW штамм дикого типа выращивался на протяжении ночи аэробно при 37oС на кровяном агаре и затем инокулировался в М17 среде.
Для исследований вакцинация/провокационная проба (провокационное заражение) штаммы культивировались в течение 6 часов при 37oС и pH 7,4 в 100 мл M17 среды, центрифугировались и повторно суспендировались в PBS (фосфатно-буферном растворе). Общее количество определялось в счетной камере, и количество жизнеспособных микроорганизмов определялось с помощью подсчета на пластине. Культуры, используемые для вакцинации/провокационной пробы, содержали приблизительно 109 бактерий/мл или их десятикратные разбавления.
Пример 3. Тест на безопасность вакцинного штамма TW 928 на мышах
В данном примере степень ослабленности S.equi мутанта TW 928 по сравнению со штаммом TW дикого типа испытывалась на мышах. Различные концентрации CFU (колониеобразующие единицы) мутантного штамма, а также исходного TW штамма дикого типа вводились мышам внутриназально или внутрибрюшинно и регистрировалась их смертность.
Животные
Для данного эксперимента использовались BALB/c мыши в возрасте 8 недель, полученные от IFFA-Credo.
Обработка
В возрасте 8 недель 1 группу из 19 мышей подвергали провокационному заражению внутриназально (50 мкл) штаммом S. equi TW и 1 группу из 20 мышей обрабатывали внутриназально штаммом S. equi TW 928 (смотри таблицу 1).
В возрасте 8 недель 6 групп по 10 мышей каждая подвергали провокационному заражению внутрибрюшинно 250 мкл при 10-кратных разбавлениях культуры штамма S. equi TW и 6 групп по 10 мышей каждая подвергали заражению внутрибрюшинно 250 мкл при 10-кратных разбавлениях культуры штамма S. equi TW 928 (смотри таблицу 1). После обработок регистрировалась смертность на протяжении 35 дней.
Культуры для вакцинации/провокационной пробы
Как штамм S. equi TW, так и штамм S. equi TW 928 выращивали на протяжении ночи аэробно при 37oС на кровяном агаре и затем инокулировади в М17 среде. Для вакцинации/провокационной пробы использовали свежие культуры (5-6 часовые), содержащие около 109 бактерий/мл или их 10-кратные разбавления. Общее количество определяли в счетной камере, а количество жизнеспособных микроорганизмов определяли с помощью подсчета на пластине. Фактическая доза для вакцинации/провокационной пробы представлена в таблице 1.
Результаты
В таблице 2 представлены результаты после внутрибрюшинного и внутриназального провокационного заражения мышей в возрасте 8 недель штаммом TW или штаммом TW 928. LD50 мутантного штамма после внутрибрюшинного заражения была приблизительно в 104 раз выше по сравнению со штаммом дикого типа. Аналогично после внутриназального применения мутантный штамм был существенно ослабленным по сравнению со штаммом дикого типа. При высоких дозах обоих штаммов мыши погибали в пределах 24 часов вероятно из-за передозировки токсичных веществ. При более низких дозах штамма дикого типа большинство мышей погибало на 5-9 день после заражения предположительно вследствие инфекции (таблица 2). В противоположность этому, при более низких дозах мутантного штамма почти ни одна мышь не погибла спустя 2 дня и позднее после заражения (кроме 3 из 60 мышей), что указывает на то, что мутантный штамм в большинстве случаев не вызывает инфекции, приводящей к смерти (и является менее заразным по сравнению со штаммом дикого типа). После внутриназального заражения штаммом дикого типа большинство мышей погибало между 5 и 8 днями после обработки вследствие инфекции, поскольку у всех этих мышей наблюдались тяжелые неврологические симптомы. В противоположность этому, после внутриназального провокационного заражения мутантным штаммом только 3 из 20 мышей погибли в течение 24 часов, вероятно вследствие передозировки токсических веществ, а не инфекции (таблица 2).
Пример 4. Защитное испытание вакцинного штамма TW 928 на мышах
В данном примере потенциальную иммуногенность мутанта S.equi испытывали на мышах. Иммунитет, вызванный мутантным штаммом после внутриназальной вакцинации, провоцировался летальной внутриназальной дозой исходного штамма TW дикого типа.
Различные концентрации CFU мутантного штамма, а также исходного штамма TW дикого типа вводили мышам внутриназадьно и регистрировали смертность.
Иммунитет, вызванный двумя внутриназальными вакцинациями штаммом TW 928, провоцировался штаммом TW дикого типа (1 неделя после вторичной вакцинации).
Животные
В данном эксперименте использовались BALB/c мыши в возрасте 6 недель, полученные от IFFA-Credo.
Содержание животных
За неделю до начала эксперимента мышей содержали в клетках (10 мышей/клетка) в изоляторах с пониженным давлением для акклиматизации. Одну группу из 21 мыши содержали в чистом помещении до достижения возраста 9 недель (день провокационного заражения) - невакцинированная контрольная группа.
Обработка
В возрасте 6 недель 4 группы по 10 мышей обрабатывали внутриназально 50 мкл различных препаратов штамма S. equi TW: 1) полная культура, 2) полная культура, 10-кратно разбавленная в культуральной среде, 3) клетки (крепость культуры), суспендированные в PBS или 4) клетки в PBS, 10-кратно разбавленном относительно крепости культуры (смотри таблицу 3). Та же процедура проделывалась для штамма S. equi TW 928 за исключением того, что для клеток в PBS при крепости культуры использовали 30 мышей (смотри таблицу 3). Группу из 21 мыши (содержавшуюся отдельно в чистом помещении) оставляли необработанной. После обработки регистрировали смертность на протяжении 14 дней. В возрасте 8 недель выживших мышей из групп, обработанных штаммом TW 928, снова обрабатывали (вторично) внутриназально мутантным штаммом, как описано для первичной обработки свежеприготовленными препаратами. После вторичной обработки смертность регистрировалась в течение 7 дней. В возрасте 9 недель (одна неделя после вторичной обработки) выживших мышей подвергали провокационному заражению внутриназально штаммом S. equi TW вместе с необработанной контрольной группой и регистрировали смертность на протяжении 14 (смотри таблицу 3).
Культуры для вакцинации/провокационной пробы
Два штамма S. equi выращивали на протяжении ночи аэробно при 37oС на кровяном агаре и затем инокулировали в М17 среде. Для вакцинации/провокационного заражения использовали свежие культуры (в возрасте 5-6 часов) или (свежецентрифугированные) клетки, суспендированные в PBS при крепости культуры, содержащие около 109 бактерий/мл или их 10-кратные разбавления. Общее количество определяли в счетной камере, а количество жизнеспособных микроорганизмов определяли при помощи подсчета на пластине. Фактическая доза для вакцинации/провокационного заражения представлена в таблице 3.
Результаты
В таблице 4 представлены результаты после внутриназальной обработки штаммом дикого типа или мутантным штаммом. Практически все мыши, зараженные различными препаратами TW дикого типа, погибали, в то время как только 7 из 60 (все, кроме одной, в течение 24 часов) мышей погибли после внутриназальной обработки мутантным штаммом TW 928 (таблица 4). Спустя две недели после первичной обработки выживших мышей из групп, обработанных мутантным штаммом, повторно вакцинировали. Все вторично вакцинированные мыши выжили до провокационного заражения, кроме 3 мышей из группы TW 928-b-PBS. Спустя одну неделю после вторичной вакцинации выживших мышей, а также в возрасте 21, и источник спаренных контрольных мышей провокационно заражали внутриназально штаммом дикого типа. После заражения все контрольные мыши погибли, в то время как различные вакцинированные группы показали различные степени защиты вплоть до 91% (таблица 5). Защита кажется зависимой от дозы, поскольку мыши, вакцинированные 10-кратно разбавленными препаратами, показали меньшую защиту. Две недели спустя после заражения более, чем половина вакцинированных выживших мышей не содержала штамма провокационного заражения в горле, и в большинстве случаев головной мозг оказался стерильным (таблица 6).
Заключение
Из результатов примеров 3 и 4 можно заключить, что штамм S. equi TW 928 является существенно ослабленным по сравнению с исходным штаммом TW дикого типа при испытании на мышах (внутриназальный путь, а также внутрибрюшинный путь). Кроме того, дважды проведенная внутриназальная вакцинация мутантным штаммом вызывает защиту от летального внутриназального провокационного заражения штаммом дикого типа.
Пример 5. Тест на безопасность вакцинного штамма TW 928 на лошадях
Штамм Streptococcus equi TW 928 испытывают на безопасность на шести серологически негативных лошадях.
Животные
Использовали шесть лошадей возраста 7-8 месяцев, не страдавших удушьем.
Вакцинация/провокационное заражение
При Т= 0 все шесть лошадей подвергали воздействию непрерывного аэрозоля штамма TW 928, используя Devilbiss распылитель (работающий при установке на максимум), снабженный адаптером для рта. Каждую лошадь подвергали действию аэрозоля на протяжении 10 минут (для каждой лошади использовали приблизительно 20 мл разбавленной 6-часовой культуры, содержащей 109 CFU/мл). После этого культуру применяли внутриназально (5 мл/ноздря), используя силиконовую трубку (около 25 см) и 10-мл шприц. Культура состояла из 6-часовой культуры в М17 среде, содержащей 2,3•109 CFU/мл, которую непосредственно перед использованием разбавляли в 3 раза стерильным NaCl. Это разбавление необходимо для получения хорошего аэрозоля. В течение 10 мин приблизительно 23 мл этой культуры вводили в виде аэрозоля.
Клиническое исследование
Перед вакцинацией и дважды в неделю после вакцинации лошадей подвергали клиническому обследованию.
Посмертное исследование
При Т=4 недели после вакцинации всех лошадей умерщвляли и подвергали посмертному исследованию. У каждой лошади брали мазки для бактериологического исследования из глоточного мешка, гортани, трахеи, подчелюстных лимфоузлов, ретрофарингеальных лимфоузлов, околоушных лимфоузлов и трахео-бронхиальных лимфоузлов и, кроме того, из всех участков отклонений от нормы (повреждений), типичных или нетипичных для удушья. Непосредственно берут мазки из глоточного мешка, гортани и трахеи и делают посев штрихом на кровяном агаре. Тканевые пробы (т.е. лимфоузлы) прижигают, делают надрез, используя стерильные скальпели, вводят тампон и этим материалом делают посев штрихом на кровяном агаре. Пластины с кровяным агаром инкубируют аэробно при 37oС в течение 18 - 24 часов. Несколько гемолитических колоний (различных морфологических типов, если присутствуют) клонируют и испытывают в API-стреп (аналитическая политестовая система энзимоидентификации стрептококков) в 4 пробирках с сахаром: сорбит, рибоза, лактоза и трегалоза. Тканевые пробы для гистологического исследования брались из глоточного мешка, подчелюстных лимфоузлов, ретрофарингеальных лимфоузлов, околоушных лимфоузлов и трахео-бронхиальных лимфоузлов и, кроме того, из ткани трахеи и легочной ткани в случае отклонений от нормы.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Клинические симптомы
В тест-модели на аэрозольную безопасность с использованием исходного TW штамма дикого типа у восприимчивых лошадей развиваются типичные симптомы удушья в пределах 5-7 дней, характеризующиеся внезапным повышением температуры (>40oС) и абсцессом нижнечелюстных и фарингеальных лимфоузлов. Никаких таких симптомов не наблюдалось у лошадей данного эксперимента после вакцинации. Температуры не превышали 39,5oС за исключением лошади 97, у которой температура составляла 39,7oС через 18 дней после вакцинации. Подчелюстные лимфоузлы всех лошадей оказались нормальными во время эксперимента кроме лошади 101, у которой левый подчелюстной лимфоузел оказался слегка увеличенным через 2 дня и 16 дней после вакцинации и у которой правый подчелюстной лимфоузел оказался слегка увеличенным через 11 дней после вакцинации. В противоположность подчелюстным лимфоузлам ретрофарингеальные лимфоузлы могут пальпироваться только косвенным путем. Кроме лошади 98 ретрофарингеальная область всех лошадей оказалась от слегка до умеренно увеличенной в течение нескольких дней.
Бактериальная изоляция из назальных промываний
После вакцинации S.equi с трудом выделялся у лошадей. Только у лошадей 100 и 101 бактерии повторно выделялись из назальных промываний во время эксперимента, у лошади 96 только в одном случае (смотри таблицу 7).
Посмертное исследование и бактериология
Спустя четыре недели после вакцинации все шесть лошадей умерщвляли и подвергали посмертному исследованию и бактериологии. Ни у одной из лошадей не наблюдали никаких симптомов удушья, т.е. все лимфоузлы оказались нормальными, и ни у одной из лошадей (кроме назальных промываний в день вскрытия у двух лошадей) не выделялся повторно Streptococcus equi.
Гистологическое исследование
Гистологическое исследование нижнечелюстных, фарингеальных, околоушных и трахео-бронхиальных лимфоузлов подтвердило макроскопические наблюдения: никаких симптомов удушья, т.е. никакого абсцесса. Почти все лимфоузлы, которые были исследованы, были описаны как реактивная лимфоидная ткань со слабой до умеренной фолликулярной (зародышевые центры) гиперплазией, указывающей на антигенную стимуляцию верхних дыхательных путей.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Результаты убедительно указывают на то, что делеционный мутант штамма S. equi TW 928 является безопасным для лошадей.
Формула изобретения: 1. Штамм Streptococcus equi TW 928, депонированный под No CBS 813.95 в Centraalbureau voor Schimmelcultures at Baarn, Нидерланды, для использования в вакцинах для борьбы с инфекцией Streptococcus у лошадей.
2. Микробиологическая чистая культура, включающая бактерии, отличающаяся тем, что культура включает штамм Streptococcus equi TW 928 по п. 1 для использования при получении вакцин.
3. Живая вакцина для борьбы с инфекцией Streptococcus у лошадей, отличающаяся тем, что указанная вакцина включает штамм Streptococcus equi TW 928 по п. 1 и фармацевтически приемлемый носитель.
4. Вакцина по п. 3, отличающаяся тем, что она подходит для интраназального применения.
5. Вакцина по п. 3 или 4, отличающаяся тем, что она находится в высушенной вымораживанием форме.
6. Вакцина по любому из пп. 3-5, отличающаяся тем, что она включает адъювант.
7. Способ получения вакцины по любому из пп. 3-6, отличающаяся тем, что он включает смешение штамма бактерии Streptococcus equi TW 928 и фармацевтически приемлемого носителя.