Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
Патент на изобретение №2451077

(19)

RU

(11)

2451077

(13)

C1

(51) МПК C12N11/12 (2006.01)

A62D3/00 (2007.01)

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ Статус: по данным на 27.08.2012 - действует Пошлина: учтена за 3 год с 13.01.2013 по 12.01.2014

(21), (22) Заявка: 2011100231/10, 12.01.2011

(24) Дата начала отсчета срока действия патента:

12.01.2011

Приоритет(ы):

(22) Дата подачи заявки: 12.01.2011

(45) Опубликовано: 20.05.2012

(56) Список документов, цитированных в отчете о

поиске: LEJEUNE K.Е., RUSSELL A.J. Biocatalytic nerve agent detoxification in fire fighting foams // Biotechnol Bioeng. 1999; 62(6), pp.659-665. RU 2296164 C1, 27.03.2007. RU 2315103 C1, 20.01.2008. RU 2360967 C1, 10.07.2009. ЕФРЕМЕНКО Е.Н., ВАРФОЛОМЕЕВ С.Д. Ферменты деструкции фосфорорганических нейротоксинов // Успехи биологической химии, т.44, 2004, с.307-340. RU 2261911 C1, 10.10.2005.

Адрес для переписки:

119991, Москва, ГСП-2, Ленинские горы, 1, стр.3, Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, кафедра химической энзимологии, Е.Н. Ефременко

(72) Автор(ы):

Ефременко Елена Николаевна (RU),

Сироткина Мария Сергеевна (RU),

Лягин Илья Владимирович (RU)

(73) Патентообладатель(и):

Химический факультет Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова (RU)

(54) СПОСОБ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ В ПОЧВОГРУНТЕ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ ферментативного гидролиза фосфорорганических соединений в почвогрунтах. В почвогрунт вносят биокатализатор - неочищенный полигистидинсодержащий полипептид со свойствами органофосфатгидролазы, полученный из штамма бактерий Escherichia coli ЦКМИБХ 29 и иммобилизованный на целлюлозосодержащем носителе. Биокатализатор вносят в концентрации 0,5-1,0 г/кг при pH 6,5-10,0 и температуре 15-40°С в почвогрунт, содержащий фосфорорганические соединения в концентрации до 850 мг/кг. Способ обеспечивает 100% разложение широкого спектра ФОС с высокой удельной скоростью гидролиза до 7,4 мг фос /г биокат-ра /ч. 1 ил., 8 пр.

Изобретение относится к способам детоксификации фосфорорганических соединений (ФОС) в почвогрунте под действием биокатализатора в виде фермента с активностью органофосфатгидролазы, иммобилизованного на целлюлозосодержащем носителе, и может быть использовано для биотехнологической очистки почвогрунтов сельскохозяйственного, промышленного, муниципального, складского назначения от ФОС.

ФОС представляют собой эфиры ортофосфорной и алкилфосфоновой кислот, а также их производных. К их числу относятся пестициды, широко применяемые в сельском и приусадебном хозяйстве, а также ингибиторы коррозии, применяемые в теплоэнергетике, нефте- и газодобывающей промышленности, пластификаторы и стабилизаторы, используемые в строительной промышленности, в составе моющих и чистящих средств промышленного назначения, а также высокотоксичные боевые отравляющие вещества нервно-паралитического действия, зоман, зарин, Vx и продукты их разложения (метилфосфоновая кислота и ее эфиры) [Kwong T.C. Organophosphate pesticides: biochemistry and clinical toxicology. // Ther. Drug. Monk., 2002, V.24(1), p.144-149; Юфит С.С. Яды вокруг нас. Вызов человечеству. // М.: Классик Стиль, 2002, 368 с.; Абрамов В.В. и др. (ред. Путилова В.Я.) Современные природоохранные технологии в электроэнергетике: Информационный сборник. // М.: Издат. дом МЭИ, 2007, 388 с. Москвичев Ю.А., Фельдблюм В.Ш. Химия в нашей жизни (продукты органического синтеза и их применение). // Изд-во ЯГТУ, 2007, Ярославль, с.244-250].

Ежегодное применение ФОС в объеме сотен тысяч тонн [Gold, R.S., Wales, M.E., Grimsly, J.K. Green solution for chemical problems. // Disarm. Technol., 2000, V.23, p.263-286] для нужд сельского хозяйства, а также низкие скорости разложения ФОС в условиях окружающей среды приводят к накоплению и обнаружению этих веществ первоначально в почвогрунтах. Далее происходит попадание ФОС в грунтовые и речные воды, продукты питания, табачные и хлопчатобумажные изделия, домашнюю пыль [Obendorf, S.K., Lemley, A.T., Hedge, A., Kline, A.A., Tan, K., Dokuchaeva, Т. Distribution of pesticide residues within homes in central New York state. // Arch. Environ. Contam. Toxicol., 2006, V.50(1), p.31-44; Lemley, A., Hedge, A., Obendorf, S.K., Hong, S., Kim, J., Muss, T.M., Vamer, C.J. Selected pesticide residues in house dust from farmers homes in central New York state. // Bull. Environ. Contamin. Toxicol., 2002, V.69(2), p.155-163].

Нарушение герметичности тары при хранении и транспортировке фосфорорганических пестицидов, а также аварийные розливы на почву растворов фосфорорганических ингибиторов коррозии и промышленных моющих средств, проблемы, связанные с загрязнением территорий, прилегающих к объектам хранения и уничтожения химического оружия, в частности фосфорорганических отравляющих веществ, требуют применения эффективных способов для детоксификации почвогрунтов, контаминированных различными ФОС. Известно, что в большинстве случаев сброс в хозяйственные водоемы фосфонатов, которые рекомендованы и внедряются в промышленность для обработки различной воды как комплексообразователи, приводит к тому, что они накапливаются в почвах, степень их разложения составляет 0,5-7% за год при концентрациях до 10 мг/кг почвы. ФОС, загрязняющие почвы и длительное время присутствующие в почвах без разложения, имеют токсичное воздействие на живые организмы. Эта токсичность имеет кумулятивный характер и приводит к различного рода расстройствам нервной системы [Kwong T.C. Organophosphate pesticides: biochemistry and clinical toxicology. // Ther. Drug. Monk., 2002, V.24(1), p.144-149].

Также ФОС являются сильными мутагенами, вызывающими появление множественных хромосомных аберраций и развитие канцерогенеза [Hong, M.S., Hong, S.J., Barhoumi, R., Burghardt, R.C., Donnelly, K.C., Wild, J.R., Venkatraj, V., Tiffany-Castiglioni, E., Neurotoxicity induced in differentiated SK-N-SH-SY5Y human neuroblastoma cells by organophosphorus compounds. // Toxic. Appl. Pharmac., 2003, V.186(2), p.110-118; Webster, L.R., McKenzie, G.H., Moriarty, H.T. Organophosphate-based pesticides and genetic damage implicated in bladder cancer. // Cancer Genetics Cytogen., 2002, V.133, p.112-117]. В связи с этим эффективные и неагрессивные для человека и окружающей среды способы элиминирования ФОС из почвогрунтов, где накапливается их большая часть, особенно в случае привнесенных сельскохозяйственных пестицидов, представляют собой большой практический интерес [Максименко О. Пестициды: защита для растений или отрава для окружающей среды. Наука и жизнь, 2003, 3, 54-58].

Наиболее целесообразным, с экологической и экономической точки зрения, представляется разложение ФОС в почвах in situ с использованием биологических катализаторов. В качестве основных действующих компонентов подобных биокатализаторов могут применяться ферменты, способные катализировать процессы деструкции токсичных ФОС. Скорости ферментативного гидролиза ряда ФОС в 10-100 раз выше химического щелочного гидролиза, а продукты гидролиза либо нетоксичны, либо относятся к существенно менее токсичному классу соединений. Кроме того, применение ферментных биокатализаторов для деструкции в высоких концентрациях ФОС более эффективно, чем использование целых клеток микроорганизмов, поскольку индивидуальные ферменты менее чувствительны к токсичному воздействию высоких концентраций ФОС, подавляющих метаболическую активность микроорганизмов [Clive A. Edwards. The Impact of Pesticides on the Environment. // The Pesticide Question, Part I, 1993, p.13-46].

Наиболее охарактеризованным на сегодняшний день ферментом, осуществляющим гидролиз различных ФОС, содержащих Р-O, P-S и P-F связи, является органофосфатгидролаза (ОРН) (арилдиалкилфосфатаза, фосфотриэстераза, паратионгидролаза, ЕС 3.1.8.1) [Ефременко Е.Н., Варфоломеев С.Д. Ферменты деструкции фосфорорганических нейротоксинов. // Успехи биол. химии, Т.44, 2004, с.307-340].

Важными характеристиками способа применения ферментных биокатализаторов для биоремедиационной обработки почвогрунтов являются используемые концентрации этих биокатализаторов, выражаемые в количестве (грамм) препарата, наносимого на обрабатываемый почвогрунт (кг). Также важной характеристикой является концентрация ФОС, которая содержится в почвогрунте (мг/кг) и которая может быть разложена за определенный промежуток времени ферментным биокатализатором под действием его определенной активности или количества ферментного биокатализатора. За единицу ферментативной активности при этом принимают количество фермента, которое катализирует гидролиз 1 мкмоль субстрата за 1 минуту

В этой связи главной характеристикой любого способа ферментативного гидролиза ФОС, используемой для сравнительного анализа действия различных ферментных биокатализаторов в почвогрунтах, является удельная скорость процесса разложения ФОС, выражаемая в количестве граммов разлагаемого вещества под действием 1 грамма ферментного биокатализатора в единицу времени (мг фос /г биокат-ра /ч).

Известен способ применения фермента паратионгидролазы для гидролиза фосфорорганического пестицида Диазинона в стерильной почве [Barik S., Munnecke D.M. Enzymatic hydrolysis of concentrated diazinon in soil // Bull. Contam. Toxicology, 1982, v.29, p.235-239]. Раствор неочищенного фермента с активностью 500 ед./г белка , приготовленного на основе 20 мМ карбонатного буфера (pH 9,0), вносят в концентрации 7,5 г белка /кг почвы в стерильную почву со 100% влажностью, содержащую Диазинон в концентрации 2,5 г/кг. Для разложения Диазинона на 100% процесс гидролиза ФОС проводят в течение 24 ч при температуре 37°C.

Несмотря на высокую скорость разложения ФОС, которая достигается этим способом и составляет 13,9 мг фос /г белка /ч, сам способ обладает рядом существенных недостатков, которые заключаются в том, что, во-первых, результат, то есть высокая скорость разложения достигается за счет введения в почвогрунт чрезвычайно высокой ферментной активности, а именно 3750 ед./кг почвогрунта , а во-вторых, способ предполагает обработку почвы при ее постоянном перемешивании, поддержании ее 100% влажности и при 37°С, что практически невозможно в реальных условиях на практике. Также этот способ требует введения высокой концентрации фермента (7,5 г/кг), что делает его экономически малопривлекательным. Кроме того, растворимый фермент при наличии естественных природных осадков может быстро вымываться из почвы в реальных условиях обработки почвогрунтов, что неизбежно должно приводить к снижению эффективности проведения процесса детоксификации почвы.

Применение фермента в иммобилизованном виде позволяет повысить стабильность его каталитического действия в почве, а также увеличить длительность его пребывания в месте введения в почвогрунт за счет удерживания его носителем и продлить таким образом срок его каталитического воздействия на ФОС, что особенно важно в случае применения ферментного препарата на практике при выпадении природных осадков [Nannipieri P., Bollag J.-M. Use of enzymes to detoxify pesticide-contaminated soils and waters. // J. Environ. Qual., 1991, V. 20, p.510-517, p.510-517]. Таким образом, наиболее предпочтительно внесение ферментного биокатализатора в почвогрунт для гидролиза ФОС именно в иммобилизованной форме.

Известен способ разложения фосфорорганического пестицида Параоксона в песке с использованием ОРН, вводимой в составе пожарной пены [LeJeune K.E., Russel A.J. Biocatalytic nerve agent detoxification in fire foams // Biotechnol. Bioeng., 1999, V.62(6), p.659-665], то есть иммобилизованного в составе коллоидной системы. Для получения иммобилизованного ферментного биокатализатора раствор высокоочищенного фермента ОРН смешивают с пенообразующими поверхностно-активными веществами ("First Defense", National Foam, Inc., Exton, PA) и вспенивают полученную смесь с помощью пеногенератора. Активность иммобилизованного биокатализатора, рассчитанная согласно данным авторов [LeJeime K.E., Russel A.J. Biocatalytic nerve agent detoxification in fire foams // Biotechnol. Bioeng., 1999, V.62(6), p.659-665; K.Lai, K.I.Dave, J.R.Wild. Bimetallic Binding Motifs in Organophosphorus Hydrolase Are Important for Catalysis and Structural Organization. // J. Biol. Chem., 1994, 269(24), p.16579-16584], составляет 12,54 ед./г пены . На слой песка, загрязненного фосфорорганическим пестицидом Параоксоном в концентрации 0,63 г/кг песка , наносят пену, содержащую фермент, в концентрации 293 г пены /кг песка . Таким образом вводится 3662,5 ед./кг песка . Способ ферментативного гидролиза ФОС обеспечивает 85%-ное разложение исходного субстрата за 1 ч при комнатной температуре.

Несмотря на достаточно быстрое разложение Параоксона в песке (1 ч), которым характеризуется этот способ, он обладает рядом существенных недостатков. Во-первых, сам иммобилизованный биокатализатор, используемый в этом способе гидролиза ФОС, представляет собой неустойчивую коллоидную систему. Со временем происходит разрушение этой коллоидной системы (эмульсии) с образованием смеси раствора фермента с поверхностно-активными веществами (согласно данным разработчиков этого способа в течение 20 мин после обработки песка 20% эмульсии становится раствором, при этом разрушение эмульсии продолжается). Во-вторых, для получения пены используется высокоочищенный фермент ОРН, что сопряжено с дополнительными затратами, необходимыми для его выделения и очистки, что в случае применения фермента для биоремедиации почв в условиях окружающей среды приводит к снижению экономической привлекательности способа. Высокий расход иммобилизованного биокатализатора, который предусматривает этот способ и который составляет 293 г пены /кг песка , в случае обработки большого количества загрязненных территорий является неприемлемым. Также стоит отметить, что применение разработанного биокатализатора показано только для гидролиза одного пестицида Параоксона в песке, что не позволяет судить о возможности применения этого способа для обработки реальных образцов почв, загрязненных разными ФОС. Кроме того, использование высокой концентрации фермента, иммобилизованного в пене, для гидролиза Параоксона в песке не обеспечивает высокой скорости процесса детоксификации, которая составляет 1,8 мг фос /г биокат-ра /ч.

Данное техническое решение, как наиболее близкое к заявляемому по способу ферментативного гидролиза фосфорорганических соединений в почвогрунте с применением иммобилизованного ферментного биокатализатора с органофосфатгидролазной активностью, принято за прототип.

Задачей предлагаемого изобретения является способ высокоэффективного ферментативного гидролиза широкого спектра фосфорорганических соединений в различных природных почвогрунтах, основанный на введения в почвогрунт высокоактивного полигистидинсодержащего полипептида со свойствами органофосфатгидролазы, иммобилизованного на целлюлозосодержащем биодеградируемом носителе. Заявляемый способ обеспечивает гидролиз ФОС с более высокой удельной скоростью и при использовании меньшего количества ферментного биокатализатора для внесения в почвогрунт, чем в прототипе.

Поставленная задача решается тем, что ферментный биокатализатор в виде неочищенного полигистидинсодержащего полипептида со свойствами органофосфатгидролазы, полученного из штамма бактерий Escherichia coli ЦКМИБХ 29, иммобилизованный на целлюлозосодержащем носителе, вводится в концентрации 0,5-1,0 г/кг в почвогрунт, содержащий фосфорорганические соединения в концентрации до 850 мг/кг при pH 6,5-10,0 и температуре 15-40°С.

Полигистидинсодержащий полипептид со свойствами органофосфатгидролазы является генетически модифицированной формой органофосфатгидролазы, содержащей гексагистидиновую последовательность (His 6 -OPH) на N-конце молекулы белка [Патент РФ 2255975 (2005) Рекомбинантная плазмидная ДНК pTES-His-OPH и продуцент олигогистидинсодержащей органофосфатгидролазы]. Такой полипептид со свойствами органофосфатгидролазы обладает значительно улучшенными каталитическими характеристиками по ряду субстратов по сравнению с генетически немодифицированной ОРН [Efremenko E., Lyagin I., Votchitseva Yu., Gudkov D., Peregudov A., Aliev T., Varfolomeyev S. The influence of length and localization of polyhistidine tag in the molecule of organophosphorus hydrolase on the biosynthesis and behavior effusion protein. In: Biotechnology: state of the art and prospects for development (Ed.G.E.Zaikov), Nova Science Publishers, Inc., 2007, 87-101]. Более высокая эффективность каталитического действия His 6 -ОРН в процессе гидролиза разных ФОС в более широком диапазоне pH и температуры в сравнении с ОРН [Вотчицева Ю.А., Ефременко Е.Н., Алиев Т.К., Варфоломеев С.Д. Свойства гексагистидинсодержащей органофосфатгидролазы // Биохимия, 2006, Т.76 (2), с.216-222] должна обеспечить существенное улучшение показателей процесса детоксификации ФОС и позволить снизить концентрацию вводимого фермента в почвы при реализации заявляемого способа в сравнении с прототипом.

В отличие от прототипа использование в заявляемом способе для гидролиза ФОС неочищенного ферментного препарата (супернатанта после отделения клеточного дебриса) дает возможность упростить процесс получения биокатализатора, тем самым удешевить весь процесс в результате отсутствия необходимости выделения и очистки фермента.

Заявляемый способ ферментативного гидролиза ФОС в почвогрунте предполагает использование в качестве носителей для иммобилизации фермента различных биодеградируемых целлюлозосодержащих отходов промышленности, например деревообрабатывающей, и сельского хозяйства. Такие природные носители экологичны и в то же время обладают невысокой стоимостью, что делает их применение не только экологически, но и экономически привлекательным. Кроме того, подобные носители при введении их в почву для детоксификации ФОС способны также выполнять роль структурообразователей почв, разрыхляющих и улучшающих структуру почв, обеспечивающих лучшее проникновение в почвы влаги и воздуха.

Получение иммобилизованного биокатализатора для реализации заявляемого способа осуществляется путем смешивания с носителем супернатанта, полученного после отделения клеточного дебриса от дезинтегрированных клеток, содержащих полипептид со свойствами органофосфатгидролазы, и последующего экспонирования смеси с целью возникновения взаимодействия между ферментом и носителем. Взаимодействие целлюлозосодержащего носителя с ферментом обусловлено капиллярно-пористой структурой гигроскопичного целлюлозосодержащего материала, способного удерживать влагу в макропорах (в полости растительных клеток - свободная влага) и микропорах (между фибриллами клеточной стенки - связанная или гигроскопичная влага). Для полимерных сорбентов, которыми являются целлюлозосодержащие носители, характерна адсорбция белков на поверхности раздела фаз, а также абсорбция (поглощение) вещества носителем, при которой носитель обычно частично набухает. При сорбции на целлюлозосодержащих материалах оба процесса происходят одновременно и их практически невозможно разграничить [Kotelnikova, S.А. Mikhailova and E.N.Vlasova (2007) Immobilization of proteolytic enzymes Trypsin and chymotrypsin to cellulose matrix // Russian Journal of Applied Chemistry, 2007, V.80(2), p.322-329]. При сорбции носитель взаимодействует с молекулами фермента с образованием множественных межмолекулярных связей, в том числе водородных. В формировании водородных связей принимают участие гидроксильные группы, присутствующие в макромолекулах полисахаридов, образующих данные носители. В этой связи гидрофильность целлюлозосодержащих носителей, которая обуславливается большим числом гидроксильных групп, способствует взаимодействию фермента с носителем. Поскольку лигнин, входящий в состав целлюлозосодержащих материалов, привносит гидрофобность в характеристики носителя, то его удаление из носителя перед иммобилизацией на нем фермента способствует увеличению гидрофильности за счет повышения числа гидроксильных групп. С этой целью возможно проведение делигнификации целлюлозосодержащих носителей, которые после такой подготовки сорбируют большее количество белка и формируют, соответственно, иммобилизованные биокатализаторы с большей ферментативной активностью. Но заявляемый способ может быть реализован с использованием иммобилизованного биокатализатора, полученного как на основе делигнифицированного, так и неделигнифицированного целлюлозосодержащего носителя.

Использование в заявляемом способе фермента, иммобилизованного на целлюлозосодержащем носителе, который может сам удерживать влагу, способствует не только продолжительному удерживанию фермента в месте, где проводится детоксификация почвы, но и удерживанию объемом носителя влаги, присутствие которой необходимо для обеспечения эффективного ферментативного гидролиза ФОС.

Существенным отличием заявляемого изобретения от прототипа является то, что способ основан на применении ранее неизвестного биокатализатора в виде полипептида с активностью ОРН, иммобилизованного на природном целлюлозосодержащем носителе, позволяющем проводить детоксификацию различных фосфорорганических субстратов в широком диапазоне их концентраций, присутствующих в различных типах природных почвогрунтов при pH 6,5-10,0 и температуре 15-40°C.

Существенным техническим результатом заявляемого изобретения является возможность с более высокой удельной скоростью (как минимум, на 30%) и при использовании меньшего количества ферментного биокатализатора (в 293 раза, как минимум), чем в прототипе, использовать способ гидролиза значительно более широкого спектра фосфорорганических соединений, среди которых пестициды, ингибиторы коррозии, продукты деструкции боевых отравляющих веществ в образцах природных почвогрунтов при разных значениях pH и температуры, при этом процесс получения иммобилизованного биокатализатора отличается простотой и экологичностью, не требует выделения и очистки фермента, а сам биокатализатор длительно сохраняет каталитическую активность, находясь в почвогрунте (период полуинактивации до 135 сут), и может быть использован для гидролиза ФОС при вторичном попадании ФОС в почвогрунт.

Ниже приведены конкретные примеры реализации заявляемого технического решения.

Пример 1. Способ ферментативного гидролиза фосфорорганического пестицида Параоксона под действием биокатализатора на основе фермента, иммобилизованного на делигнифицированной рисовой соломе

Делигнифицированную рисовую солому получают путем кипячения 5 г соломы в 150 мл 0,1 М раствора NaOH в течение 4 ч с последующим промыванием соломы до установления pH 6,0-7,0.

Супернатант, содержащий полипептид His 6 -OPH, получают путем дезинтеграции клеток бактерий Е. coli ЦКМИБХ 29 [Патент РФ 2255975 (2005) Рекомбинантная плазмидная ДНК pTES-His-OPH и продуцент олигогистидинсодержащей органофосфатгидролазы] в 50 мМ K-фосфатном буфере (pH 7,5), содержащем 300 мМ NaCl, с последующим отделением клеточного дебриса центрифугированием (20 мин, 10000 g).

Для получения иммобилизованного биокатализатора смешивают 300 мл супернатанта, содержащего полипептид His 6 -OPH и имеющего активность 200 ед./мл, со 100 г делигнифицированной рисовой соломы и выдерживают смесь в течение 20 мин при периодическом перемешивании при 8°C.

Для гидролиза фосфорорганического пестицида Параоксона, присутствующего в песке (pH 7,5, влажность 100%) в концентрации 630 мг/кг почвы , полученный иммобилизованный биокатализатор вводят в почвогрунт в концентрации 0,5 г/кг почвы и тщательно распределяют в обрабатываемом почвогрунте. Такое введение биокатализатора (300 ед./кг) обеспечивает 100% разложение ФОС в течение 170 ч при 22°C. Удельная скорость разложения ФОС при этом составляет 7,4 мг фос /г биокат-ра /ч. Период полуинактивации биокатализатора в почвогрунте при указанных условиях применения способа гидролиза ФОС - 135 сут (Фигура 1).

Пример 2. Способ ферментативного гидролиза фосфорорганического пестицида Диазинона под действием биокатализатора на основе фермента, иммобилизованного на делигнифицированных березовых опилках

Делигнифицированные березовые опилки получают путем кипячения 50 г опилок в 1500 мл 0,1 М раствора NaOH в течение 4 ч с последующим их промыванием до установления pH 6,0-7,0.

Супернатант, содержащий полипептид His 6 -OPH, получают аналогично тому, как это описано в Примере 1. Для получения иммобилизованного биокатализатора смешивают 150 мл супернатанта, содержащего фермент и имеющего активность 200 ед./мл, со 100 г делигнифицированных березовых опилок и выдерживают в течение 10 мин при 10°C с периодическим перемешиванием.

Для гидролиза фосфорорганического пестицида Диазинона, присутствующего в черноземе (pH 7,0, влажность 75%) в концентрации 850 мг/кг почвы , полученный иммобилизованный биокатализатор вводят в почвогрунт в концентрации 0,5 г/кг почвы . Такое введение биокатализатора (150 ед./кг) обеспечивает 100% разложение ФОС в течение 296 ч при 15°C. Удельная скорость разложения ФОС при этом составляет 5,7 мг фос /г биокат-ра /ч. Период полуинактивации биокатализатора в почвогрунте при указанных условиях применения способа гидролиза ФОС - 131 сут (Фигура 1).

Пример 3. Способ ферментативного гидролиза фосфорорганического пестицида Паратиона под действием биокатализатора на основе фермента, иммобилизованного на делигнифицированных еловых опилках

Делигнифицированные еловые опилки получают путем кипячения 5 г опилок в 150 мл 0,1 М раствора NaOH в течение 4 ч с последующим их промыванием до установления pH 6,0-7,0.

Супернатант, содержащий His 6 -OPH, получают аналогично тому, как это описано в Примере 1. Для получения иммобилизованного биокатализатора смешивают 150 мл супернатанта, содержащего фермент и имеющего активность 250 ед./мл, со 100 г делигнифицированных еловых опилок и выдерживают в течение 15 мин при 22°C с периодическим перемешиванием.

Для гидролиза фосфорорганического пестицида Паратиона, присутствующего в серой лесной почве (pH 6,5, влажность 71%) в концентрации 285 мг/кг почвы , полученный иммобилизованный биокатализатор вводят в почвогрунт в концентрации 1 г/кг почвы . Такое введение биокатализатора (375 ед./кг) обеспечивает 100% разложение ФОС в течение 84 ч при 35°C. Удельная скорость разложения ФОС при этом составляет 3,4 мг фос /г биокат-ра /ч. Период полуинактивации биокатализатора в почвогрунте при указанных условиях применения способа гидролиза ФОС - 132 сут (Фигура 1).

Пример 4. Способ ферментативного гидролиза фосфорорганического пестицида Хлорпирифоса под действием биокатализатора на основе фермента, иммобилизованного на делигнифицированных дубовых опилках.

Делигнифицированные дубовые опилки получают путем кипячения 50 г опилок в 800 мл 0,1 М раствора NaOH в течение 4 ч с последующим их промыванием до установления pH 6,0-7,0.

Супернатант, содержащий полипептид His 6 -OPH, получают аналогично тому, как это описано в Примере 1. Для получения иммобилизованного биокатализатора смешивают 200 мл супернатанта, содержащего фермент и имеющего активность 210 ед./мл, со 100 г делигнифицированных дубовых опилок и выдерживают в течение 20 мин при 10°C с периодическим перемешиванием.

Для гидролиза фосфорорганического пестицида Хлорпирифоса, присутствующего в каштановой почве (pH 8,0, влажность 82%) в концентрации 760 мг/кг почвы , полученный иммобилизованный биокатализатор вводят в почвогрунт в концентрации 0,5 г/кг почвы . Такое введение биокатализатора (210 ед./кг) обеспечивает 100% разложение ФОС в течение 480 ч при 30°C. Удельная скорость разложения ФОС при этом составляет 3,2 мг фос /г биокат-ра /ч. Период полуинактивации биокатализатора в почвогрунте при указанных условиях применения способа гидролиза ФОС - 122 сут.

Пример 5. Способ ферментативного гидролиза метилфосфоновой кислоты, являющейся продуктом разложения фосфорорганических отравляющих веществ (зарина, зомана, Vx), а также ингибитором коррозии, под действием биокатализатора на основе фермента, иммобилизованного на неделигнифицированных опилках тополя

Супернатант, содержащий полипептид His 6 -OPH, получают аналогично тому, как это описано в Примере 1. Для получения иммобилизованного биокатализатора смешивают 200 мл супернатанта, содержащего фермент и имеющего активность 400 ед./мл, с 200 г неделигнифицированных опилок тополя и выдерживают в течение 20 мин при 8°C с периодическим перемешиванием.

Для гидролиза метилфосфоновой кислоты, присутствующей в подзолистой почве (pH 10,0, влажность 90%) в концентрации 150 мг/кг почвы , полученный иммобилизованный биокатализатор вводят в почвогрунт в концентрации 0,65 г/кг почвы . Такое введение биокатализатора (260 ед./кг) обеспечивает 100% разложение ФОС в течение 104 ч при 28°C. Удельная скорость разложения ФОС при этом составляет 2,3 мг фос /г биокат-ра /ч. Период полуинактивации биокатализатора в почвогрунте при указанных условиях применения способа гидролиза ФОС - 115 сут.

Пример 6. Способ ферментативного гидролиза 2-гидрокси-2-фосфоноуксусной кислоты, являющейся ингибитором коррозии, а также антинакипином, под действием биокатализатора на основе фермента, иммобилизованного на неделигнифицированных измельченных кукурузных стеблях

Супернатант, содержащий полипептид His 6 -OPH, получают аналогично тому, как это описано в Примере 1. Для получения иммобилизованного биокатализатора смешивают 150 мл супернатанта, содержащего фермент и имеющего активность 400 ед./мл, со 100 г неделигнифицированных измельченных кукурузных стеблей и выдерживают в течение 30 мин при 15°C с периодическим перемешиванием.

Для гидролиза 2-гидрокси-2-фосфоноуксусной кислоты, присутствующей в смеси чернозема и песка (pH 9,0, влажность 93%) в концентрации 50 мг/кг почвы , полученный иммобилизованный биокатализатор вводят в почвогрунт в концентрации 0,5 г/кг почвы . Такое введение биокатализатора (300 ед./кг) обеспечивает 100% разложение ФОС в течение 43 ч при 40°C. Удельная скорость разложения ФОС при этом составляет 2,3 мг фос /г биокат-ра /ч. Период полуинактивации биокатализатора в почвогрунте при указанных условиях применения способа гидролиза ФОС - 108 сут.

Пример 7. Способ ферментативного гидролиза О,О-диметилметилфосфоната, являющегося пластификатором и веществом, снижающим горение волокон, а также продуктом разложения отравляющих фосфорорганических веществ, под действием биокатализатора на основе фермента, иммобилизованного на делигнифицированной пшеничной соломе

Делигнифицированную пшеничную солому получают путем кипячения 50 г соломы в 750 мл 0,1 М раствора NaOH в течение 3 ч с последующим их промыванием до установления pH 6,0-7,0.

Супернатант, содержащий полипептид His 6 -OPH, получают аналогично тому, как это описано в Примере 1. Для получения иммобилизованного биокатализатора смешивают 200 мл супернатанта, содержащего фермент и имеющего активность 450 ед./мл, со 150 г делигнифицированной пшеничной соломы и выдерживают в течение 25 мин при 10°C с периодическим перемешиванием.

Для гидролиза O,O-диметилметилфосфоната, присутствующего в болотной почве (pH 7,5, влажность 87%) в концентрации 150 мг/кг почвы , полученный иммобилизованный биокатализатор вводят в почвогрунт в концентрации 0,75 г/кг почвы . Такое введение биокатализатора (300 ед./кг) обеспечивает 100% разложение ФОС в течение 74 ч при 22°C. Удельная скорость разложения ФОС при этом составляет 2,7 мг фос /г биокат-ра /ч. Период полуинактивации биокатализатора в почвогрунте при указанных условиях применения способа гидролиза ФОС - 112 сут.

Пример 8. Способ ферментативного гидролиза фосфорорганического пестицида Параоксона под действием биокатализатора на основе фермента, иммобилизованного на делигнифицированной рисовой соломе и вторично используемого

В почвогрунт, уже содержащий в концентрации 0,5 г/кгпочвы фермент, иммобилизованный и использованный для гидролиза Параоксона, как описано в Примере 1, вторично вводится фосфорорганический пестицид Параоксон в той же концентрации, что и в Примере 1 (630 мг/кг почвы ). Иммобилизованный биокатализатор к моменту повторного введения пестицида сохраняет 92% своей исходной активности (275 ед./кг, Фигура 1) и обеспечивает 100% разложение ФОС в течение 200 ч при 22°C. Удельная скорость разложения ФОС при этом составляет 6,3 мг фос /г биокат-ра /ч.

Формула изобретения

Способ ферментативного гидролиза фосфорорганических соединений в почвогрунтах, отличающийся тем, что неочищенный полигистидин, содержащий полипептид со свойствами органофосфатгидролазы, полученный из штамма бактерий Escherichia coli ЦКМИБХ 29 и иммобилизованный на целлюлозосодержащем носителе, вводят в концентрации 0,5-1,0 г/кг при pH 6,5-10,0 и температуре 15-40°C в почвогрунт, содержащий фосфорорганические соединения в концентрации до 850 мг/кг.

РИСУНКИ