Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
Патент на изобретение №2451936

(19)

RU

(11)

2451936

(13)

C1

(51) МПК G01N33/48 (2006.01)

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ Статус: по данным на 27.08.2012 - действует Пошлина:

(21), (22) Заявка: 2011109872/15, 16.03.2011

(24) Дата начала отсчета срока действия патента:

16.03.2011

Приоритет(ы):

(22) Дата подачи заявки: 16.03.2011

(45) Опубликовано: 27.05.2012

(56) Список документов, цитированных в отчете о

поиске: RU 2190853 C2, 10.10.2002. RU 2390773 C2, 27.05.2010. RU 2384846 C1, 20.03.2010. CATLIN D.H. et al. Control of Doping with Anabolic Agents. Proceedings of the Scientific Meeting of the 4 Permanent world Conference on Anti-Doping in Sport, London, 1993, p.2. КОЧНОВА E.A. и др. Хромато-масс-спектрометрический анализ стероидного профиля спортсмена // Заводская лаборатория, 2010, т.76, 8, с.20-25.

Адрес для переписки:

105005, Москва, Елизаветинский пер., 10, ФГУП "Антидопинговый центр", Е.А. Кочновой

(72) Автор(ы):

Кочнова Елизавета Александровна (RU),

Соболевский Тимофей Геннадьевич (RU),

Прасолов Илья Сергеевич (RU),

Родченков Григорий Михайлович (RU)

(73) Патентообладатель(и):

Федеральное государственное унитарное предприятие "Антидопинговый центр" (RU)

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЪЮГИРОВАННЫХ КСЕНОБИОТИКОВ ПРИ ДОПИНГОВОМ КОНТРОЛЕ СПОРТСМЕНОВ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины, а точнее к клинической химии, и описывает способ определения конъюгированных ксенобиотиков при допинговом контроле спортсменов, включающий приготовление анализируемой пробы мочи путем гидролиза ферментом в присутствии буферного раствора и внутреннего стандарта, отделение гидролизата, дериватизацию его с последующим хромато/масс-спектральным анализом пробы и регистрацией полученных результатов и определения наличия стероидов, где при приготовлении анализируемой пробы гидролиз образца мочи осуществляют смесью двух ферментов: -глюкуронидазы E.coli и арилсульфатазы H.pomatia при соотношении объемов от 1:1 до 1:3, а в качестве буфера используют цитратный буферный раствор. Способ обеспечивает снижение порога чувствительности определения ксенобиотиков при одновременном расширении номенклатуры определяемых соединений. 2 пр., 4 табл., 6 ил.

Изобретение относится к области медицины, а точнее к клинической химии, в частности к способам определения уровня содержания ксенобиотиков в организме, и может быть использовано, например, при допинговом контроле спортсменов.

Известен способ определения ксенобиотиков, например стероидов, методами колориметрического анализа [1].

Способ этот относится к методам качественного анализа и соответственно позволяет определить только наличие стероидов, без определения их структурных характеристик и, собственно, природы. К тому же по указанному способу возможно анализировать объекты только с очень высоким содержанием стероидов.

Известны также способы определения ксенобиотиков методом газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией [2-4].

Общим недостатком таких методов является трудоемкая и продолжительная во времени стадия получения летучих производных, что существенно усложняет ход анализа, увеличивает его продолжительность и удорожает проведение процесса.

Наиболее близким по своей технической сущности и достигаемому результату к заявляемому способу является ГХ-МС способ определения конъюгированных ксенобиотиков, в т.ч. стероидов, в моче человека методом газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (ГХ-МС) [5].

По указанному способу в образец мочи добавляют фосфатный буферный раствор, внутренний стандарт, а также фермент ( -глюкуронидаза E.coli). Смесь перемешивают и инкубируют и после гидролиза добавляют карбонатный буферный раствор и диэтиловый эфир, далее органический слой отделяют после центрифугирования, упаривают досуха, дериватизируют и анализируют методом ГХ/МС. Основным недостатком указанного способа является низкая степень достоверности определения ксенобиотиков и высокий порог чувствительности (например, для эпитестостерона до 25-50 нг/мл), поскольку указанный стероид выводится в мочу в виде как глюкуронидов, так и сульфатов, а анализу подвергаются только глюкурониды.

Техническим результатом, на достижение которого направлено создание данного изобретения, является повышение степени достоверности определения ксенобиотиков за счет снижения порога чувствительности определения и расширения номенклатуры определяемых ксенобиотиков (КБ).

Поставленный технический результат достигается тем, что в процессе пробоподготовки гидролиз анализируемого образца мочи ведут смесью двух ферментов: -глюкуронидазы E.coli и арилсульфатазы H.pomatia в объемном соотношении от 1:1 до 1:3, и в качестве буферного раствора используют цитратный буферный раствор.

Известно, что при ГХ/МС анализе КБ необходимо провести несколько стадий пробоподготовки, поскольку выведение КБ в мочу происходит после фазы II метаболизма, а именно конъюгирования, во время которого образуются сложные эфиры соединений, причем КБ выводятся в мочу в виде глюкуронидов и сульфатов. Некоторые КБ образуют наиболее долгоживущие метаболиты именно в сульфатной фракции, поэтому их можно обнаружить в биологической жидкости в течение, например, не 8 часов, а в течение 18 или 24 часов, что должно повысить достоверность подтверждения приема допинга спортсменом. Тем не менее в настоящее время концентрации КБ, в том числе и стероидов, по нормативам WADA рассчитывают исходя из глюкуронидов соответствующих соединений [6].

При реализации заявляемого изобретения в качестве аппаратурного оформления процесса может быть использован, например, хроматограф Agilent 6890, соединенный с масс-селективным детектором Agilent 5973N с электронной ионизацией (70 eV), колонка Restek Rxi - 1ms (длина 12 м, внутренний диаметр 0.20 мм, толщина неподвижной фазы 0.33 мкм).

Температурная программа может быть установлена со следующими параметрами: подъем от 188 до 232°C со скоростью 2°C/мин, далее от 232 до 300°C по 12°C/мин, изотерма 5.33 мин при объеме вводимой пробы 2 мкл в режиме деления потока (1:20), температура инжектора - 280°С. Газ-носитель - гелий (0.6 мл/мин). Температура источника ионов - 230°С, температура переходной линии - 290°С, квадруполя - 150°С, скорость сканирования - 1.69 циклов/сек, диапазон масс в режиме полного сканирования - 50-600 а.е.м.

В качестве реагентов и материалов могут быть использованы, например N -метил- N -(триметилсилил)-трифторацетамид (МСТФА), -глюкуронидаза из H.pomatia, арилсульфатаза из H.pomatia и ацетат натрия (Sigma-Aldrich, США); стандартные образцы тербуталина, форместана, карведиолола, морфина, тимолола, андростендиона, эпиандростерона и станозолола (Steraloids, Newport, США); метанол, соляная кислота и уксусная кислота (Merck, ФРГ); дигидрофосфат калия, гидрофосфат натрия и йодид аммония (Riedel-de-Haën, ФРГ); карбонат калия, гидрокарбонат калия и сульфат натрия (ХимМед, РФ); диэтиловый эфир (МедХимПром, РФ); 1,4-дитио-DL-триэтол (ДТТ), имидазол (Fluka, Швейцария); цитрат калия (Alfa Aesar, США); внутренний стандарт - метилтестостерон (МТ), D4-андростерон-глюкуронид и D5-этиохоланолон (LGC Standards, Великобритания); деионизированная вода (MilliQ, ФРГ).

Разумеется, могут быть использованы оборудование, материалы и реактивы других производителей, однако с тем условием, что по качественным характеристикам они будут обеспечивать воспроизводимость результатов исследования в объеме заявляемых патентных притязаний.

В качестве вспомогательного оборудования могут быть использованы: автоматический шейкер фирмы Glas-Col ® , США для ЖЖЭ; центрифуга марки Rotina 46R фирмы Hettich (ФРГ) для получения контрастной поверхности раздела между органической и водной фазами; упариватель фирмы Barnstead Inc. (США), совмещенный с генератором азота марки Mistral-4 фирмы Schmidlin-DBS AG (Чехия) для упаривания органического экстракта. В качестве экстрагента для ЖЖЭ может быть использован метилтретбутиловый эфир (МТБЭ). В качестве регуляторов рН могут быть использованы гидрокарбонат натрия и карбонат калия.

Изобретение может быть осуществлено следующим образом.

Готовят образцы мочи, добавляют в них буферный раствор, внутренний стандарт (метилтестостерон, для конечной концентрации 500 нг/мл мочи), точные количества фермента или смеси ферментов. Смесь далее перемешивают и инкубируют при повышенной температуре в течение 1,0 -1,5 ч. По окончании гидролиза в смесь добавляют карбонатный буферный раствор (рН 10,4) и диэтиловый эфир, встряхивают в течение 3-10 мин, центрифугируют, отделяют органический слой и упаривают его досуха и дериватизируют раствором МСТФА/NH 4 I/ДТТ при нагревании в течение 20-40 минут, дериватизат переносят в виалу и анализируют методом ГХ/МС. Снимают и регистрируют хроматографические и масс-спектрометрические характеристики веществ-эталонов, а также всех растворов и проб (детектируют не менее трех характеристических ионов каждого эталонного вещества, определяют время удержания, молекулярную массу, прекурсор-ионы, характеристичные ионы, нижний предел обнаружения) и полученные результаты вводят в программное обеспечение, например ChemStation фирмы Agillent, США.

Для лучшего понимания изобретение может быть проиллюстрировано, но не исчерпано следующими примерами его конкретного осуществления.

Пример 1

Готовят стандартные растворы аналитов (1 мг/мл), в частности тербуталина, форместана, карведиолола, морфина, тимолола, андростендиона, эпиандростерона и станозолола. Рабочие растворы готовят растворением точной навески ксенобиотиков - эталонов в метаноле. Далее получают рабочие растворы разбавлением стандартных растворов до содержания 10 мкг/мл. Стандартные растворы каждого из КБ (1 мг/мл) готовят растворением точной навески в точном объеме метанола. К 3 мл мочи (из приготовленных ранее образцов) добавляют 1 мл буферного раствора, 30 мкл внутреннего стандарта (МТ, для конечной концентрации 500 нг/мл мочи), точные количества смеси ферментов. Смесь перемешивают и инкубируют при 55°С 1 час 10 минут. После гидролиза добавляют 1 мл карбонатного буферного раствора (рН 10.4) и 5 мл диэтилового эфира. Встряхивают в течение пяти минут, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин; органический слой отделяют, упаривают досуха при 70°C в течение 40 минут и проводят дериватизацию - 50 мкл раствора МСТФА/NH 4 I/ДТТ (1000:3:2) при нагревании до 70°С в течение 30 минут, раствор переносят в виалу и анализируют далее методом ГХ/МС (параметры аналитической процедуры приведены выше).

С разрешения этической комиссии и согласия добровольцев (5 человек) ими были приняты допинг (андростендион и тербуталин - 1-й; форместан и карведиолол - 2-й; морфин - 3-й; тестостерон - 4-й и станозолол - 5-й). Пробоподготовку образцов мочи допированных добровольцев проводят в описанном выше порядке (добавляют буферный раствор, внутренний стандарт, точные количества фермента или смеси ферментов, далее смеси перемешивают и инкубируют при повышенной температуре в течение 1,0 -1,5 ч) и далее проводят ГХ/МС анализ. КБ в пробах мочи определяют в том же порядке и при тех же параметрах, что и в стандартных растворах. Результаты анализов представлены в Таблице 1.

Таблица 1

Образец мочи

фермент

Буфер

Найденные КБ, концентрация, нг/мл

1

E.coli + helix pomatia

цитратный

Андростендион, 120

Тербуталин, 430

2

E.coli + helix pomatia

цитратный

Форместан, 260

Карведиолол, 120

3

E.coli + helix pomatia

цитратный

Морфин, 1450

4

E.coli + helix pomatia

цитратный

Тестостерон, 279

5

E.coli + helix pomatia

цитратный

Станозолол, 153

Одновременно эти же образцы мочи исследуют по методике, предписанной в прототипе (фермент E. Coli, фосфатный буфер). Результаты анализов представлены в Таблице 2.

Таблица 2

Образец мочи

фермент

Буфер

Найденные КБ, концентрация, нг/мл

1

E.coli

фосфатный

Андростендион не обнаружен

Тербуталин, 180

2

E.coli

фосфатный

Форместан, 100

Карведиолол, 120

3

E.coli

фосфатный

Морфин, 500

4

E.coli

фосфатный

Тестостерон, 240

5

E.coli

фосфатный

Станозолол, 140

Из представленных в Таблице 1 результатов становится очевидным, что использование для гидролиза смеси ферментов E.coli + helix pomatia в цитратном буфере позволяет расширить номенклатуру определяемых КБ, а также существенно понизить порог определения указанных соединений.

В частности, это видно из сопоставления полученных результатов в Таблице 2 (количество определенных в пробе КБ - нг/мл).

Для сравнения проводят анализы образцов мочи, подвергнутых гидролизу при различных сочетаниях ферментов и буферов (см. Таблицу 3).

Таблица 3

1

Фермент E.coli

Буфер фосфатный

По WADA

2

Смесь ферментов Е.coli + helix pomatia

Буфер цитратный

По изобретению

3

Фермент E.coli

Буфер цитратный

Для сравнения

4

Фермент helix pomatia

Буфер фосфатный

Для сравнения

5

Фермент helix pomatia

Буфер цитратный

Для сравнения

На рис.1-5 представлены результаты анализов для исследованной серии КБ в зависимости от природы фермента(ов) и буфера.

Из представленных иллюстративных материалов вытекает, что при использовании в качестве гидролизующей среды смеси ферментов (Е.coli + helix pomatia) в цитратном буфере нижний предел обнаружения исследованных КБ по сравнению с известным (единица, или 100%) понижается по меньшей мере до 0,8-0,35 (т.е. в 1,2-1,65 раза)

Пример 2

Готовят образец мочи, добавляют в него буферный раствор, внутренний стандарт (МТ, для конечной концентрации 500 нг/мл мочи), точные количества фермента или смеси ферментов. Смесь далее перемешивают и инкубируют при повышенной температуре в течение 1,0-1,5 ч и далее процедуру проводят, как в Примере 1, включая технику и условия проведения ГХ/МС анализа, за исключением того, что образец мочи разделяют на пять аликвот и каждую аликвоту подвергают гидролизу при следующих условиях (Таблица 4):

Таблица 4

Аликвота

Фермент Е.coli (мл)

Helix pomatia (мл)

Примечание

1

1,0

0,7

2

1,0

1,0

3

1,0

2,0

4

1,0

3,0

5

1,0

3,5

На рис.6 приведены результаты определения карведиолола в зависимости от соотношения объемов смеси используемых ферментов.

Из рис.6 следует, что оптимальное соотношение объемов используемых ферментов составляет 1:2 - 1:3. Выход соотношения за заявленные пределы снижает ожидаемый результат определения ЭС.

Как видно из описания и приведенных примеров осуществления способа и сравнительных примеров, изобретение обеспечивает снижение порога чувствительности определения ЭС, а также расширение номенклатуры определяемых соединений.

Источники информации

1. RU 2190853 С2, G01N 33/74, 2002 г.

2. Хим. фарм. Журнал, 1988, т.22, с.622.

3. RU 2313086 C2, G01N 30/72, 2007.

4. J.Anal. Toxicol., 2005, v.29, 4, p.217.

5. WADA Technical Document - TD2004EAAS - прототип.

6. Wada Prohibited List, Version 5.0, 2010.

Формула изобретения

Способ определения конъюгированных ксенобиотиков при допинговом контроле спортсменов, включающий приготовление анализируемой пробы мочи путем гидролиза ферментом в присутствии буферного раствора и внутреннего стандарта, отделение гидролизата, дериватизацию его с последующим хромато/масс-спектральным анализом пробы и регистрацией полученных результатов и определения наличия стероидов, отличающийся тем, что при приготовлении анализируемой пробы гидролиз образца мочи осуществляют смесью двух ферментов: -глюкуронидазы E.coli и арилсульфатазы H.pomatia при соотношении объемов от 1:1 до 1:3, а в качестве буфера используют цитратный буферный раствор.

РИСУНКИ