Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
Патент на изобретение №2452727

(19)

RU

(11)

2452727

(13)

C1

(51) МПК C07C309/15 (2006.01)

A61K31/185 (2006.01)

A61P7/02 (2006.01)

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ Статус: по данным на 27.08.2012 - действует Пошлина: учтена за 3 год с 25.12.2012 по 24.12.2013

(21), (22) Заявка: 2010152781/04, 24.12.2010

(24) Дата начала отсчета срока действия патента:

24.12.2010

Приоритет(ы):

(22) Дата подачи заявки: 24.12.2010

(45) Опубликовано: 10.06.2012

(56) Список документов, цитированных в отчете о

поиске: RU 2382764 C1, 27.02.2010. SU 1834659 A3, 15.08.1993. RU 1172225 С, 30.03.1994. JP 8298590 А, 13.08.1996.

Адрес для переписки:

119435, Москва, ул. Малая Пироговская, 1а, ФГБУН НИИ ФХМ ФМБА России, в.н.с. М.А. Муриной

(72) Автор(ы):

Мурина Марина Алексеевна (RU),

Рощупкин Дмитрий Иванович (RU),

Сергиенко Валерий Иванович (RU)

(73) Патентообладатель(и):

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства" (ФГБУН НИИ ФХМ ФМБА России) (RU),

Мурина Марина Алексеевна (RU),

Рощупкин Дмитрий Иванович (RU),

Сергиенко Валерий Иванович (RU)

(54) СОЕДИНЕНИЕ, РЕАГИРУЮЩЕЕ С ТИОЛЬНОЙ ГРУППОЙ АТОМОВ И УГНЕТАЮЩЕЕ ФУНКЦИИ ТРОМБОЦИТОВ

(57) Реферат:

Изобретение относится к соединению общей формулы

, где R представляет собой насыщенную линейную или разветвленную углеводородную цепь атомов. Соединение характеризуется химической избирательностью в отношении тиольных групп атомов и угнетает агрегацию тромбоцитов. Техническим результатом изобретения является получение новых антиагрегантов, обладающих способностью путем химической реакции угнетать функции тромбоцитов. 2 н.п. ф-лы, 5 ил., 2 табл., 7 пр.

Изобретение относится к медицине, к соединениям, которые оказывают противотромботическое действие, а именно к соединениям, угнетающим функции тромбоцитов. В медицине существует потребность в веществах, препятствующих тромбообразованию в артериях, опосредованному тромбоцитами.

Известна антиагрегантная активность ацетилсалициловой кислоты, аспирина (Siller-Matula J.M., Krumphuber J., Jilma B. Pharmacokinetic, pharmacodynamic and clinical profile of novel antiplatelet drugs targeting vascular diseases. British Journal of Pharmacology, 2010, vol.159, pp.502-517). Ацетилсалициловая кислота необратимо угнетает функции тромбоцитов посредством химической реакции, заключающейся в ацилировании циклооксигеназы 1 (синтазы простагландина Н 2 ). В тромбоците происходит ослабление образования тромбоксана А 2 , выступающего в качестве вторичного стимулятора тромбоцитов. Антиагрегантное и тем самым противотромботическое действие ацетилсалициловой кислоты имеет место только в ситуациях, когда активация тромбоцитов протекает с участием циклооксигеназы.

Известны ингибиторы функций тромбоцитов, антиагрегантные соединения тиенопиридиновой природы: прасугрел, клопидогрел (Guerre D.R., Tcheng J.E. Prasugrel: Clinical Development and Therapeutic Application. Adv. Ther. 2009, vol.26, No.11, pp.999-1011). Эти соединения являются предшественниками активного соединения, в кровяном русле антиагрегантную активность проявляет их метаболит, содержащий химически активную тиольную группу. Метаболит благодаря этой группе инактивирует на поверхности тромбоцита пуриновый рецептор за счет химической реакции и таким образом необратимо подавляет агрегацию, вызываемую аденозиндифосфорной кислотой (АДФ). Применение тиенопиридиновых антиагрегантов осложнено тем, что их антиагрегантная активность проявляется в результате метаболических превращений.

Известна группа антиагрегантных соединений, которые представляют собой хлорзамещенные фрагменты белков, а именно N-хлорпроизводные пептидов, аминокислот, иминокислот и некоторых родственных соединений. Химически активной частью этих соединений является хлораминовая или хлориминовая группа атомов (Мурина М.А., Сергиенко В.И., Рощупкин Д.И. Средство для снижения агрегации тромбоцитов. Патент СССР 1834659). Эти вещества образуются в организме при активации фагоцитов. Недостатком указанных веществ является способность взаимодействовать с несколькими серосодержащими активными группами белков тромбоцитов, а также низкая устойчивость, так что срок хранения составляет несколько часов.

Имеется изобретение (Мурина М.А., Рощупкин Д.И., Сергиенко В.И. Вещество, угнетающее функции тромбоцитов. Патент РФ 2382764), в котором описано антиагрегантное соединение, относящееся к N-алкильным производным N-хлор-2-аминоэтансульфоновой кислоты. Оно обладает повышенной устойчивостью и выраженной способностью необратимо угнетать функции тромбоцитов за счет химической модификации плазматической мембраны тромбоцитов в результате взаимодействия с серосодержащими группами атомов поверхностных белков. Это соединение имеет недостаток, состоящий в том, что обладает недостаточной химической избирательностью, реагирует эффективно и с тиольными группами остатков цистеина белков, и с тиоэфирными группами остатков метионина. Это приводит к тому, что в крови это вещество способно реагировать с сывороточным альбумином.

Задача изобретения состоит в разработке нового соединения, которое характеризуется более высокой скоростью реакции с тиольной группой атомов по сравнению с тиоэфирной группой и которое эффективно угнетает активность тромбоцитов.

Ниже приведены определения терминов, которые использованы в описании изобретения. "Насыщенное" органическое соединение - соединение, в котором атомы углерода связаны между собой одинарными связями. "Алкил" обозначает насыщенный радикал, полученный удалением атома водорода из С-Н связи. Он представляет собой линейную или разветвленную углеводородную цепь атомов. Разветвленная углеводородная цепь - это цепь, которая имеет один или несколько низших алкильных заместителей. "Ацил" обозначает остаток карбоновой кислоты, имеющей насыщенную линейную или разветвленную углеводородную цепь атомов.

Задача изобретения, во-первых, решается тем, что создают соединение, которое родственно ацил-производному N-хлор-2-аминоэтансульфоновой кислоты (ацил-производному хлорамина таурина), относящейся к веществам биологического происхождения. Общая формула заявленного соединения следующая:

.

Здесь символ R означает алкил.

Заявленное соединение синтезируют путем введения водного раствора исходного вещества общей формулы

в водный раствор гипохлорита натрия. Смешивание проводят из расчета не более 1 моль активного хлора на 1 моль исходного вещества. Примеры полученного соединения: N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновая кислота (синонимы: 2-ацетамидоэтансульфоновая кислота, N-ацетил-N-хлортаурин) (формула 1), N-хлор-N-пропионил-2-аминоэтансульфоновая кислота (синонимы: 2-пропионамидоэтансульфоновая кислота, N-пропионил-N-хлортаурин) (формула 2).

1.

,

2.

.

В заявленном соединении химически активной является N-хлорамидная группа атомов (-N(Cl)C(O)-). Группа -С(O)- обеспечивает повышенный парциальный электрический заряд атома хлора. Благодаря этому заявленное соединение в отличие от N-алкильного производного N-хлортаурина обладает химической избирательностью: реагирует с тиольными атомными группами намного быстрее, чем с тиоэфирной или дисульфидной группами.

Задача изобретения также решается тем, что созданное соединение используют в качестве антиагреганта. Благодаря наличию N-хлорамидной атомной группы, в которой атом хлора способен участвовать в реакциях окисления тиольных атомных групп в белках тромбоцита, заявленное соединение угнетает функции тромбоцитов в крови.

На фиг.1 дана иллюстрация спектра поглощения N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновой кислоты и спектра поглощения N-хлор-N-пропион-ил-2-аминоэтансульфоновой кислоты; на фиг.2 дана иллюстрация спектра поглощения смеси N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновой кислоты и 1,4-димеркаптобутан-2,3-диола и спектра поглощения 1,4-димеркаптобутан-2,3-диола; на фиг.3 - иллюстрация степени агрегации тромбоцитов, вызванной аденозиндифосфатом, в смеси с плазмой крови при разных концентрациях N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновой кислоты и степени агрегации тромбоцитов, вызванной аденозиндифосфатом, в смеси с плазмой крови при разных концентрациях N-хлор-N-пропионил-2-аминоэтансульфоновой кислоты; на фиг.4 - иллюстрация степени агрегации тромбоцитов, вызванной коллагеном и хлоридом кальция, в смеси с плазмой крови при разных концентрациях N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновой кислоты и степени агрегации тромбоцитов, вызванной коллагеном и хлоридом кальция, в смеси с плазмой крови при разных концентрациях N-хлор-N-пропионил-2-аминоэтансульфоновой кислоты; на фиг.5 - иллюстрация степени агрегации тромбоцитов в крови при разных концентрациях N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновой кислоты и степени агрегации тромбоцитов в крови при разных концентрациях N-хлор-N-пропионил-2-аминоэтансульфоновой кислоты.

Создание заявленного соединения, характеризующегося повышенной скоростью взаимодействия с тиольными атомными группами и обладающего способностью угнетать агрегационную функцию тромбоцитов, подтверждается следующими примерами.

Пример 1

Путем введения в водный раствор гипохлорита натрия водного раствора исходного соединения N-ацетил-2-аминоэтансульфоновой кислоты либо N-пропионил-2-аминоэтансульфоновой кислоты получили соответственно N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновую кислоту и N-хлор-N-пропионил-2-аминоэтансульфоновую кислоту. Смешивание проводили из расчета не более 1 моля активного хлора на 1 моль исходного вещества. Измерили зависимости оптической плотности (D) от длины волны, т.е. спектры поглощения образовавшихся соединений на спектрофотометре DU-720 (Beckman-Coulter, США) (фиг.1, кривая 1 - спектр поглощения N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновой кислоты, кривая 2 - спектр поглощения N-хлор-N-пропионил-2-аминоэтансульфоновой кислоты). В каждом спектре имеется полоса поглощения 190-230 нм, характерная для N-хлорамидной группы атомов. Максимум этой полосы поглощения располагается при 195-199 нм. Молярные коэффициенты поглощения в максимуме полосы поглощения N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновой кислоты, N-хлор-N-пропионил-2-аминоэтансульфоновой кислоты равны соответственно 4760±76 и 4700±99 л/(моль·см).

Пример 2

Получили N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновую кислоту, как описано в примере 1. Смешали водные растворы N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновой кислоты и 1,4-димеркаптобутан-2,3-диола (сокращенно дитиотреитол). Конечные концентрации обоих соединений после смешивания были равны 0,5 мМ. Через 5 минут для этой смеси измерили на спектрофотометре DU-720 спектр поглощения в области длин волн 230-330 нм; для сравнения измерили спектр поглощения водного раствора дититреитола в концентрации 0,5 мМ (фиг.2, кривая 1 - спектр поглощения смеси N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновой кислоты и дитиотреитола, кривая 2 - спектр поглощения дитиотреитола). В смеси N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновой кислоты и дитиотреитола содержался 1,2-дитиан-4,5-диол (шестичленный циклический дисульфид) с характерным максимумом поглощения 282-284 нм; он образовался в реакции окисления тиольной группы дитиотреитола под действием N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновой кислоты. Таким образом, заявленное соединение обладает способностью реагировать с тиольными группами атомов органических соединений.

Пример 3

Получили N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновую кислоту и N-хлор-N-пропионил-2-аминоэтансульфоновую кислоту, как описано в примере 1. Для сравнения получили N-хлорглицин путем введения в водный раствор гипохлорита натрия водного раствора глицина; смешивание проводили из расчета не более 1 моля активного хлора на 1 моль глицина. Смешали водные растворы N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновой кислоты и дитиотреитола в конечной концентрации 0,5 мМ. Для этой смеси измерили на спектрофотометре DU-720 зависимость от времени (t) оптической плотности при 283 нм, которая прямо пропорциональна концентрации 1,2-дитиан-4,5-диола. Провели такие же измерения для смеси дитиотреитола и других соединений: N-хлор-N-пропионил-2-аминоэтансульфоновая кислота, N-хлорглицин. Во всех случаях происходило быстрое возрастание оптической плотности вследствие образования 1,2-дитиан-4,5-диола в реакции содержащих активный хлор соединений с тиольной группой дитиотреитола. Для точного количественного описания скорости взаимодействия заявленного соединения с дитиотреитолом определили константы скорости (k) бимолекулярной реакции по данным увеличения оптической плотности после начала реакции. Расчет проводили по формуле

; ,

где C 1 и C 2 обозначают концентрацию заявленного соединения и тиольных групп дитиотреитола; D и C - изменение за период t оптической плотности и соответствующее ей изменение концентрации дитиана; - молярный коэффициент поглощения дитиана; l - толщина образца раствора. Использовали данные начального изменения оптической плотности в пределах не более 15% от максимального. N-Хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновая кислота, N-хлор-N-пропионил-2-аминоэтансульфоновая кислота характеризуются высокими константами

Таблица 1

Заявленное соединение

Константа скорости реакции с тиольной группой 1,4-димеркаптобутан-2,3-диола, М -1 с -1

N-Хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновая кислота

356±4

N-Хлор-N-пропионил-2-аминоэтансульфоновая кислота

296±4,4

N-Хлорглицин

108±3

скорости реакции с тиольной группой, реагируют с тиольной группой с константой скорости, примерно в три раза более высокой, чем аминокслотный хлорамин N-хлорглицин (табл.1). Таким образом, заявленное соединение обладает повышенной способностью реагировать с тиольными группами атомов.

Пример 4

Получили описанным в примере 1 способом N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновую кислоту и N-хлор-N-пропионил-2-аминоэтансульфоновую кислоту. Для установления способности заявленного соединения реагировать с тиольной группой N-ацетилцистеина, представляющего собой компонент белков, смешали водные растворы N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновой кислоты, дитиотреитола и N-ацетилцистеина в конечной концентрации 0,5 мМ. В этой смеси протекала реакция N-ацетилцистеина с N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновой кислотой, конкурирующая с реакцией дитиотреитола с N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновой кислотой. Для сравнения смешали водные растворы N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновой кислоты и дитиотреитола в конечной концентрации 0,5 мМ. Через 5 минут для этих смесей измерили на спектрофотометре DU-720 спектры поглощения в области длин волн 250-330 нм. Точно так же приготовили смесь N-хлор-N-пропионил-2-аминоэтансульфоновой кислоты, дитиотреитола и N-ацетилцистеина и измерили ее спектр поглощения. Рассчитали степень торможения, происходящего вследствие конкурентного взаимодействия N-ацетилцистеина с заявленным соединением, образования дитиана из дитиотреитола; расчет провели по формуле (D c -D)/D c , где D c и D - оптические плотности при 283 нм (пропорциональные концентрации дитиана) соответственно смеси заявленного соединения и дитиотретола и смеси заявленного соединения, дитиотреитола и N-ацетилцистеина. Точно такие же измерения и расчеты проведены для смеси, содержащей заявленное

Таблица 2

Заявленное соединение

Степень торможения образования дитиана из дитиотреитола, %

N-Ацетилцистеин

Восстановленный глютатион

Метионин

Окисленный глютатион

N-Хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновая кислота

27±1,3

22±5,4

2±1,3

-5±4

N-Хлор-N-пропионил-2-аминоэтансульфоновая кислота

31±1,3

18±3,5

4±1,7

-1±4

соединение, дитиотреитол и либо восстановленный глютатион, либо метионин, либо окисленный глютатион (табл.2). Реакция заявленного соединения с дитиотреитолом сильно тормозилась N-ацетилцистеином или восстановленным глютатионом, молекулы которых имеют тиольную группу атомов, так что образование дитиана снижалось на 20-30%. Торможение реакции заявленного соединения с дитиотреитолом практически не происходило в присутствии метионина или окисленного глютатиона, молекулы которых содержат соответственно тиоэфирную (-CH 2 SCH 3 ) или дисульфидную (-CH 2 SSCH 2 -) группы атомов. Таким образом, заявленное соединение обладает химической избирательностью по отношению к тиольным группам атомов в компонентах белков: реагирует с тиольными атомными группами намного быстрее, чем с тиоэфирной или дисульфидной группами.

Пример 5

Получили кровь кролика из краевой вены уха, стабилизированную 3,8% раствором цитрата натрия (9:1 по объему), и центрифугировали при 460g в течение 15 мин. Супернатант, представляющий собой смесь тромбоцитов и плазмы (богатая тромбоцитами плазма - сокращенно БТП) крови, использовали для исследования агрегации тромбоцитов. Для этого применяли турбидиметрический агрегометр фирмы Chrono-Log (США). Измерили кинетическую кривую агрегации тромбоцитов в виде зависимости коэффициента светопропускания (Т) от времени в контроле и аналогичные кинетические кривые агрегации при действии N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновой кислоты в трех концентрациях: 0,25, 0,50, 1,00 мМ; ее получили, как описано в примере 1. Агрегацию вызывали аденозиндифосфорной кислотой (АДФ) в конечной концентрации 4,27 мкг в 1 мл. N-Хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновуюй кислоту инкубировали 5 мин с богатой тромбоцитами плазмой до введения АДФ. Провели такие же измерения с введением в богатую тромбоцитами плазму крови N-хлор-N-пропионил-2-аминоэтансульфоновой кислоты в трех концентрациях. Это соединение получили, как описано в примере 1. Количественным показателем агрегации тромбоцитов служило изменение коэффициента светопропускания образца БТП через 5 мин после введения АДФ. Степень агрегации тромбоцитов при действии заявленного соединения характеризовали величиной Т/ Т 0 , где T и Т 0 - изменение коэффициента светопропускания соответственно богатой тромбоцитами плазмы, содержащей заявленное соединение, и контрольного образца. N-Хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновая кислота, введенная в богатую тромбоцитами плазму в конечных концентрациях 0,25, 0,50 и 1,00 мМ, значительно снижала агрегационную активность тромбоцитов: степень агрегации составляла соответственно 86±3,3, 79±5, 29±7,6% от контроля (фиг.4, кривая 1). Приблизительно такое антиагрегантное действие оказывала N-хлор-N-пропионил-2-аминоэтансульфоновая кислота (фиг.4, кривая 2). Таким образом, заявленное соединение обладает антиагрегантной активностью в тесте с богатой тромбоцитами плазмой крови при стимуляции клеток агонистом АДФ.

Пример 6

Получили смесь тромбоцитов и плазмы и измерили кинетическую кривую агрегации тромбоцитов в контроле и при введении заявленного соединения, как описано в примере 5. Агрегацию вызывали последовательным введением коллагена в конечной концентрации 14 мкг в 1 мл и затем хлорида кальция в конечной концентрации 2 мМ. Рассчитали степень агрегации тромбоцитов при действии заявленного соединения согласно процедуре, описанной в примере 5. N-Хлор-N-пропионил-2-аминоэтансульфоновая кислота, введенная в богатую тромбоцитами плазму в конечных концентрациях 0,25, 0,50 и 1,00 мМ, значительно снижала агрегационную активность тромбоцитов: степень агрегации составляла соответственно 61±4,1, 44±10,7 и 31±24,8% от контроля (фиг.5, кривая 2). Приблизительно такое антиагрегантное действие оказывала N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновая кислота (фиг.5, кривая 1). Таким образом, заявленное соединение обладает антиагрегантной активностью в тесте с богатой тромбоцитами плазмой крови в условиях стимуляции клеток коллагеном.

Пример 7

Получили кровь кролика способом, описанным в примере 5. Разбавили ее в 2 раза физиологическим раствором и использовали для анализа агрегации тромбоцитов с помощью импедансного агрегометра фирмы Chrono-Log (США). Измерили кинетическую кривую агрегации тромбоцитов в виде зависимости сопротивления переменному току Z крови от времени в контроле и аналогичные кривые агрегации при действии N-хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновой кислоты в трех конечных концентрациях: 0,25, 0,50 и 1,00 мМ; ее получили, как описано в примере 1. N-Хлор-N-ацетил-2-аминоэтансульфоновую кислоту инкубировали с кровью 5 мин до введения коллагена и хлорида кальция. Провели такие же измерения с добавкой в кровь N-хлор-N-пропионил-2-аминоэтансульфоновой кислоты. Это соединение получили, как описано в примере 1. Количественным показателем агрегации тромбоцитов служило максимальное изменение электрического сопротивления образца крови через 6 мин после введения хлорида кальция. Степень агрегации тромбоцитов при действии заявленного соединения характеризовали величиной Z/ Z 0 , где Z и Z 0 - изменение импеданса соответственно крови, содержащей заявленное вещество, и контрольного образца. N-Хлор-N-ацетил-2-этансульфоновая кислота, введенная в кровь в конечных концентрациях 0,25, 0,50 и 1,00 мМ, значительно снижала агрегационную активность тромбоцитов, степень агрегации составляла соответственно 83±6,9, 54±6,6, 39±3,1% от контроля (фиг.5, кривая 1). Приблизительно такое антиагрегантное действие оказывала N-хлор-N-пропионил-2-аминоэтансульфоновая кислота при введении в кровь (фиг.5, кривая 2). Таким образом, заявленное соединение обладает антиагрегантной активностью в образцах крови.

Формула изобретения

1. Соединение общей формулы

,

где R означает насыщенную разветвленную или линейную углеводородную цепь атомов.

2. Применение соединения по п.1 для угнетения агрегации тромбоцитов.

РИСУНКИ