Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
Патент на изобретение №2452772

(19)

RU

(11)

2452772

(13)

C1

(51) МПК C12Q1/02 (2006.01)

C12Q1/16 (2006.01)

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ Статус: по данным на 27.08.2012 - действует Пошлина:

(21), (22) Заявка: 2011114777/10, 14.04.2011

(24) Дата начала отсчета срока действия патента:

14.04.2011

Приоритет(ы):

(22) Дата подачи заявки: 14.04.2011

(45) Опубликовано: 10.06.2012

(56) Список документов, цитированных в отчете о

поиске: Nicas Т. et al. "The contribution of exoproducts to virulence of Pseudomona aeruginosa", Can. J. Microbiol, 1985, v.31, p.387-392. RU 2401864 C2, 20.10.2010. RU 2181886 C2, 27.04.2002.

Адрес для переписки:

614990, г.Пермь, ул. Петропавловская, 26, ГОУ ВПО ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера Росздрава, патентный отдел

(72) Автор(ы):

Карпунина Тамара Исаковна (RU),

Кузнецова Марина Валентиновна (RU),

Масленникова Ирина Леонидовна (RU),

Николаева Нина Владимировна (RU)

(73) Патентообладатель(и):

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Пермская государственная медицинская академия имени академика Е.А. Вагнера Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" (RU),

Учреждение Российской академии наук Института экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН (RU)

(54) СПОСОБ ОЦЕНКИ СТЕПЕНИ ПАТОГЕННОСТИ ШТАММОВ Pseudomonas aeruginosa

(57) Реферат:

Для оценки степени патогенности штаммов Pseudomonas aeruginosa берут цельные экзометаболиты ночной культуры Pseudomonas aeruginosa, замораживают при минус 18°С в течение не менее 1 часа, оттаивают и смешивают с регидратированным сенсором - тест-культурой Е. coli lux+. Смесь выдерживают 30 мин при 20°С и по степени подавления биолюминесценции тест-культуры вычисляют индекс потенциальной патогенности (ИПП) по формуле ИПП=(Ik-Io)/Ik·100%, где Ik - интенсивность люминесценции контрольной пробы, Io - интенсивность биолюминесценции опытной пробы. При величине ИПП 30% определяют низкую степень патогенности штаммов Р. aeruginosa, при величине ИПП от 30% до 70% - умеренную степень патогенности, при значении ИПП>70% - высокую степень патогенности штаммов Р. aeruginosa. Технический результат, достигаемый при использовании способа по изобретению, - унификация, сокращение времени и упрощение процедуры исследования при высокой точности. 3 пр.

Изобретение относится к области медицины, а именно клинической микробиологии.

Известен способ оценки патогенности Р. aeruginosa in vitro по совокупности ее проявлений (Nicas Т., Iglewski B.H. The contribution of exoproducts to virulence of Pseudomonas aeruginosa // Can. J. Microbiol. 1985; V.31. - P.387-392; Hamood A.N., Griswold J.A., Duhan C.M. Production of extracellular virulence factors by Pseudomonas aeruginosa isolates obtained from tracheal, urinary tract, and wound infections // J. Surg. Res. 1996. - V.61(2). - P.425-432.)

Недостатки прототипа: трудоемкость при учете широкого набора факторов патогенности, продолжительность во времени, отсутствие стандартных критериев оценки.

Технический результат: унификация, сокращение времени и упрощение процедуры исследования при высокой точности.

Сущность метода заключается в том, что цельные экзометаболиты ночной культуры Р. aeruginosa после замораживания при -18°С в течение не менее 1 ч и оттаивания смешивают с регидратированным сенсором - тест-культурой Е. coli lux+, смесь выдерживают 30 мин при 20°С и по степени подавления биолюминесценции бактериальной тест-культуры вычисляют индекс потенциальной патогенности - ИПП, который распределяет культуры следующим образом: I группа ИПП 30% - штаммы с низкой степенью патогенности, II группа 30%<ИПП 70% - умеренно патогенные штаммы, III группа 70%<ИПП - высоко патогенные штаммы, возможно госпитальные.

Способ осуществляют следующим образом.

Клинические и референтный штаммы Р. aeruginosa ATCC 27853, выращенные на LB-бульоне (Луриа-Бертани, рН 7,0) доводят стерильным LB-бульоном до 2,0 по стандарту МакФарленд (6×10 8 КОЕ/мл), затем разводят в 5 раз в LB-бульоне и статически выращивают 18 ч при 37°С.

18-часовые супернатанты Р. aeruginosa получают после центрифугирования 1 мл бульонной культуры в пробирках «Эппендорфф» при 13000 об/мин 10 мин на микроцентрифуге. Надосадочную жидкость используют после замораживания при -18°С на время не менее 1 ч.

Регидратацию лиофилизированного сенсора - тест-культуры Е. coli lux+ (МИТ) (Пшеничнов Р.А., Масленникова И.Л., Никитина Н.М. Микробиолюминесценция (оптимизация сенсоров и расширение сферы использования реакции) - Пермь, 2005. - 74 с.) проводят охлажденной H 2 O (1 мл на ампулу) 30 мин при 4°С. Затем взвесь сенсора разводят 0,9% NaCl до рабочего объема и выдерживают 30 мин при +20°С.

К 50 мкл регидратированного сенсора, предварительно разлитого в лунки белого (для люминесценции) 96-луночного полистиролового планшета, добавляют по 50 мкл экзометаболитов или LB-бульона (в контрольные лунки). Смесь выдерживают 30 мин при 20°С. Анализ проводят на планшетных спектрофотометрах с люминесценцией (например «Tecan», Австрия; «Luminoscan Ascent», Финляндия).

Оценку потенциальной патогенности выражают в виде ИПП - индекса потенциальной патогенности, вычисляемого по формуле ИПП=(Ik-Io)/Ik·100%, где Ik - интенсивность люминесценции контрольной (LB-бульон) пробы, Io - интенсивность биолюминесценции опытной (экзометаболиты) пробы. ИПП выражает процент ингибирования свечения опытной пробы по сравнению с контролем.

Значения ИПП с учетом показателя умеренно-патогенного Р. aeruginosa АТСС 27853 позволяют распределить штаммы на три категории: I группа ИПП 30% - штаммы с низкой степенью патогенности, II группа 30<ИПП 70 - умеренно патогенные штаммы, III группа 70<ИПП - высоко патогенные штаммы.

Примеры конкретного применения.

Пример 1. Из раневого отделяемого больного С., находившегося в отделении реанимации и интенсивной терапии Краевой клинической больницы (ОРИТ ККБ), изолирован штамм Р. aeruginosa 801. При оценке потенциальной патогенности предлагаемым способом данный штамм был отнесен к высокопатогенным (ИПП составил 98,63%). При проведении традиционного бактериологического исследования установлено, что штамм обладал широким спектром факторов патогенности (продуцировал пиоционин, альгинат, обладал высокой гемолитической, фосфолипазной активностью).

Пример 2. Клинический штамм Р. aeruginosa ИТТ был выделен из мокроты больного Б. торакального отделения ККБ. Индекс потенциальной патогенности составил 39,97%, что позволило отнести штамм к группе умеренно патогенных. При бактериологическом анализе установлено: штамм обладал слабовыраженной гемолитической и фосфолипазной активностью, не продуцировал пиоционин, что соответствует невысокому патогенному потенциалу изолята.

Пример 3. Из кишечного содержимого больного К., находившегося в отделении экстренной хирургии Городской клинической больницы 4, изолирован штамм Р. aeruginosa 3-6. Индекс потенциальной патогенности, определенный предлагаемым способом, составил 19,27%. Изолят был отнесен к I группе штаммов (с низкой патогенностью). Традиционным бактериологическим методом обнаружено, что штамм не продуцировал фосфолипазу, пиоционин и альгинат, обладал слабой гемолитической активностью, то есть характеризовался низкой степенью патогенности.

Положительный эффект заявляемого способа состоит в следующем: способ позволяет прогнозировать тяжесть течения инфекционного процесса с учетом происхождения возбудителя: внебольничный или госпитальный штамм.

Формула изобретения

Способ оценки степени патогенности штаммов Pseudomonas aeruginosa, заключающийся в том, что берут цельные экзометаболиты ночной культуры P.aeruginosa, замораживают при минус 18°С в течение не менее 1 ч, оттаивают, смешивают с регидратированным сенсором - тест-культурой E.coli lux+, смесь выдерживают 30 мин при 20°С, и по степени подавления биолюминесценции тест-культуры вычисляют индекс потенциальной патогенности (ИПП) по формуле ИПП=(Ik-Iо)/Ik·100%, где

Ik - интенсивность люминесценции контрольной пробы,

Io - интенсивность биолюминесценции опытной пробы,

и при величине ИПП 30% определяют низкую степень патогенности штаммов P.aeruginosa, при величине ИПП от 30% до 70% - умеренную степень патогенности, при значении ИПП>70% - высокую степень патогенности штаммов P.aeruginosa.