Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
Патент на изобретение №2452959

(19)

RU

(11)

2452959

(13)

C1

(51) МПК G01N33/493 (2006.01)

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ Статус: по данным на 27.08.2012 - действует Пошлина: не взимаются - статья 1366 ГК РФ

На основании пункта 1 статьи 1366 части четвертой Гражданского кодекса Российской Федерации патентообладатель обязуется заключить договор об отчуждении патента на условиях, соответствующих установившейся практике, с любым гражданином Российской Федерации или российским юридическим лицом, кто первым изъявил такое желание и уведомил об этом патентообладателя и федеральный орган исполнительной власти по интеллектуальной собственности.

(21), (22) Заявка: 2011109583/15, 14.03.2011

(24) Дата начала отсчета срока действия патента:

14.03.2011

Приоритет(ы):

(22) Дата подачи заявки: 14.03.2011

(45) Опубликовано: 10.06.2012

(56) Список документов, цитированных в отчете о

поиске: HERGET-ROSENTAL S. Et al. Prognostic Value of Tubular Proteinuria and Enzymuria in Nonoliguric Acute Tubular Necrosis // ClinChem. 2004, vol. 50, p.552-558. RU 2270608 C1, 27.02.2006. EP 0001266961 A1, 18.12.2002. ОЛЬХОВА Е.Б. и др. Ультразвуковая оценка хронического пиелонефрита у детей с пузырно-мочеточниковым рефлюксом // Нефрология и диализ, 2001, 2, с.229.

Адрес для переписки:

410012, г.Саратов, ГСП, ул. Б. Казачья, 112, Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского, патентный отдел

(72) Автор(ы):

Морозов Дмитрий Анатольевич (RU),

Морозова Ольга Леонидовна (RU),

Лакомова Дарья Юрьевна (RU)

(73) Патентообладатель(и):

Морозов Дмитрий Анатольевич (RU)

(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ПОВРЕЖДЕНИЯ ПОЧЕЧНОЙ ПАРЕНХИМЫ У ДЕТЕЙ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, а именно к детской уронефрологии, и может быть использовано для диагностики повреждения почечной паренхимы у детей. Для этого в моче определяют количественные показатели -глутатион-s-трансферазы ( -GST), и при ее значении выше 0,86 мкг/л диагностируют повреждение почечной паренхимы. Способ позволяет диагностировать повреждения почечной паренхимы на ранних стадиях при отсутствии признаков ее повреждения по данным стандартного комплекса обследования при его неинвазивности, точности и простоте. 2 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, и может быть использовано в урологии и нефрологии.

Несмотря на большое количество работ, посвященных изучению патогенеза тубулоинтерстициального фиброза, остается ряд нерешенных вопросов, касающихся, прежде всего, малоинвазивных методов диагностики нефросклероза.

Касательно диагностики склеротических изменений в почках, арсенал методов невелик. Причем каждый из методов имеет свои недостатки, которые необходимо учитывать, особенно для пациентов младшей возрастной группы.

Хорошо известен способ экскреторной урографии, основанный на рентгенологической оценке состояния функционирующей паренхимы, однако чувствительность этого метода очень низка в оценке степени нефросклероза. Кроме того, данный метод является инвазивным, а аллергические и токсические реакции на введение йодсодержащих препаратов, ограничивают использование этого способа [Roth К., Коо Н., Spottswood S., Chan J. Obstructive uropathy: an important cause of chronic renal failure in children /К. Roth, H. Koo, S. Spottswood, J. Chan // Clin. Pediatr. - 2002. - Vol.41(5). - Р.309-314]. В исследовании Захаркиной E.B. показано, что при использовании различных по осмолярности рентгеноконтрастных средств имеется их существенное влияние на тубулярный эпителий, которое сопровождается повышением выделения мембраносвязанных ферментов (N-ацетил- -D-глюкозаминидазы) [Захаркина, Е.В. Влияние рентгеноконтрастных препаратов на функцию почек при пиелонефрите у детей. / Е.В.Захаркина // Педиатрия. - 2008. - Т.87, 4. - С.27-31].

Благодаря своей относительной безопасности, быстроте проведения, экономичности, высокой точности ультразвуковое исследование (УЗИ) широко используется у детей для выявления структуры и размеров паренхимы и собирательной системы почек [Becker A.M. Postnatal evaluation of infants with an abnormal antenatal renal sonogram / A.M. Becker // Current Opinion in Pediatrics. - 2009. - Vol.21. - Р.207-213]. Однако УЗИ позволяет улавливать склеротические изменения в почках, когда они достаточно выражены [Gallo F., Schenone М., Giberti С. Ureteropelvic Junction Obstruction: Which Is the Best Treatment Today? / F.Gallo, M.Schenone, C.Giberti // J. Laparoendoscopic advanced surgical techniques. - 2009. - Vol.19(5). - Р.657-662].

УЗИ почек в режиме цветного допплеровского картирования позволяет определить индекс резистентности (ИР) на междолевых артериях, тем самым указывая на склеротические изменения в паренхиме [Врублевский С.Г. Диагностика и тактика лечения детей с расширением чашечно-лоханочной системы // Вопросы практической педиатрии. - 2008. - Т.3. - 3. - с.35-39]. Однако в работах последних лет показано, что у пациентов с тяжелой степенью рефлюксной нефропатии (РН), сопровождающейся значимым уменьшением размеров почки и количества функционирующей паренхимы, отмечается значительное разнообразие резистивных показателей ренального кровотока. Ожидаемое повышение ИР у детей со склеротическими изменениями паренхимы почек имеет место не всегда. Этот феномен связан с артериовенозным шунтированием крови как универсальным патофизиологическим механизмом, который является средством патологической компенсации повышенного периферического сопротивления, что и определяет отсутствие прямой зависимости между степенью склероза почечной паренхимы и показателями периферического сопротивления артериального ренального кровотока [Ольхова Е.Б. Ультразвуковая оценка хронического пиелонефрита у детей с пузырномочеточниковым рефлюксом. / Е.Б.Ольхова, Е.М.Крылова, И.И.Ефремова // Нефрология и диализ. - 2001. - 2. - С.299]. Кроме того, у пациентов с обструктивными уропатиями скоростные характеристики почечного кровотока существенно изменяются и трактуются неправильно, что не позволяет достоверно диагностировать рубцы. Эти методы являются субъективными, зависят от квалификации специалиста, выполняющего их, и не дают информации о функциональном состоянии почек.

Радиоизотопные методы диагностики позволяют определить степень и объем функционирующей паренхимы по индексу интегрального захвата радиофармпрепарата [Хворостов И.Н., Зоркий С.Н. Смирнов И.Е. Тактика лечения пузырно-мочеточникового рефлюкса у детей // Бюллетень Волгоградского научного центра РАМН 4/2009; Фомин Д.К. Диагностика обструктивных уропатий у детей методами ядерной медицины: Автореф. дис. докт. мед. наук. - М., 2008. - 44 с.]. Недостатками данного способа являются инвазивность, высокая степень лучевого повреждения других органов, а также дороговизна использования изотопного оборудования. Кроме того, для детей младшей возрастной группы требуется анестезиологическое пособие. Все это ограничивает использование данного способа для диагностики рубцовых изменений в почке.

Метод чрезкожной пункционной биопсии почечной паренхимы с последующим гистологическим исследованием биоптата позволяет увидеть разрастание коллагеновых волокон в интерстиции. Отрицательным моментом этого способа является, прежде всего, инвазивность, сложность, высокая опасность травматизации, осложнения, отсутствие точного выбора участка ткани. Этими недостатками и определяется ограниченность этого метода в диагностике склеротических изменений в почке.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ определения повреждения почечной паренхимы путем исследования микроальбуминурии. Микроальбуминурия - уровень альбумина в моче 30-300 мг/сут, который не определяется при помощи классических методов исследования. По имеющимся литературным данным сведения относительно определения уровня повреждения нефрона по наличию альбумина в моче неоднозначны. Ряд авторов установили, что уровень альбумина в прделах 30-300 мг/сут является ранним и доступным маркером повреждения проксимальных канальцев и сделали заключение: выявление микроальбуминурии позволяет диагностировать ранние стадии нефросклероза, которые не определяются другими доступными методами [Herget-Rosental S., Poppen D., et al. Prognostic Value of tabular Proteinuria and Enzymuria in nNonoliguric Acute Tubular Necrosis. / S.Herget-Rosental, D.Poppen, et al. //Clin. Chem. - 2004. - Vol. - 50. - P.552-558]. Необходимо отметить, что альбумин - среднемолекулярный белок (молекулярная масса - 66 кДа). Появление его в моче свидетельствует о повреждении прежде всего клубочков почек. Повреждение клубочков развивается как компенсаторный механизм в ответ на гибель значительного количества нефронов. Гиперфильтрация оставшихся клубочков ведет к появлению диагностически значимого уровня данного белка в моче. Таким образом, микроальбуминурия указывает на выраженное повреждение паренхимы почек и появляется на поздних этапах нефропатии. Представленные данные других авторов показали высокую чувствительность теста на определение уровня микроальбуминурии 19,1 мг/л и более для диагностики РН как основного маркера фиброза [Махачев Б.М., Корсунский А.А и соавт. Клиническое значение определения белков в моче для ранней диагностики рефлюкс-нефропатии у детей // «Нефрология и диализ». - 2005. - Т7, 1. - С.88-93]. Следует отметить, что при ретроградном токе мочи первичным является повреждение дистальных канальцев с последующим вовлечением клубочкового аппарата, что свидетельствует о появлении микроальбуминурии лишь при грубых изменениях в почечной паренхиме. Также, необходимо заметить, что микроальбуминурия возможна и при отсутствии патологического процесса в почках. Так, ее появление может быть обусловлено потреблением большого количества белка либо физическими нагрузками. В ходе другого исследования было установлено, что уровень микроальбуминурии 15,1±0,23 мг/л/24 часа характерен для пациентов с ПМР, но без нефросклероза, тогда как при наличии признаков РН этот уровень находился в пределах 31,7±0,62 мг/л/24 [Зорин И.В., Вялкова А.А. Параметры микроальбуминурии у пациентов с ПМР и рефлюкс-нефропатией // Материалы Международной школы и научно-практической конференции по детской нефрологии «Актуальные проблемы детской нефрологии».-Оренбург. - 2010. - С.301-302]. Остается нерешенным вопрос о том, как оценивать уровень микроальбуминурии, находящийся в интервале от 14,87 мг/л/24 до 32,32 мг/л/24. Проанализировав работы по определению мочевой экскреции альбумина, остается неясным тот уровень альбумина, начиная с которого можно говорить о признаках нефросклероза. Кроме того, ряд исследователей доказали, что определение микроальбуминурии не позволяет выделить ее в качестве раннего маркера РН [Konda R., Sato Н., Sakai К., et al. Urinary excretion of vascular endothelial growth factor is increased in children with reflux nephropathy. / R.Konda, H.Sato, K.Sakai, et al. // Nephron Clin Pract. - 2004. - Vol.98(3). - P.73-8].

Таким образом, сведения относительно мочевой экскреции альбумина, претендующего на рассмотрение его в качестве раннего маркера повреждения почечной паренхимы, неоднозначны.

Задачей данного изобретения является разработка неинвазивного, точного, простого способа ранней диагностики повреждения почечной паренхимы у детей.

В результате проведенного нами исследования впервые было выполнено количественное определение в моче -глутатион-s-трансферазу ( -GST) у практически здоровых детей и детей с обструктивными уропатиями. Было установлено, что -GST напрямую связан с повреждением почечной паренхимы у детей.

-GST - многофункциональное семейство ферментов глютатион-8-трансферазы, которое играет существенную роль в катализе канцерогенов, липидов, продуктов оксидативного стресса, генотоксических метаболитов путем конъюгации и нейтрализации их электрофильных участков SH-группой глютатиона. В результате каталитической реакции образуются водорастворимые компоненты с их последующей элиминацией из клетки. Такая детоксикация играет важную роль в обеспечении резистентности клеток к перикисному окислению липидов, алкилированию белков. -GST является индикатором повреждения дистальных канальцев в ответ на действие различных факторов. Данный фактор вырабатывается в ответ на минимальную гипоксию, которая может формироваться в результате различных патологических состояний [McMahon, Blaithin A. Urinary glutathione S-transferases in the pathogenesis and diagnostic evaluation of acute kidney injury following cardiac surgery: a critical review. / McMahon, A.Blaithin // Current Opinion in Critical Care. - 2010. - Vol.l6(6). - P.550-555].

В основе нашего исследования положен анализ уровня мочевой экскреции -GST у 20 практически здоровых детей, не имеющих патологии со стороны мочевыделительной системы, а также у 63 детей с обструктивными уропатиями. Средний возраст всех детей составил 2,6±2,5 лет.

Всем пациентам проводилось исследование -GST методом твердофазного иммуноферментного анализа с помощью тест-систем «ARGUTUS MEDICAL» (Ирландия, Дублин) на иммуноферментном анализаторе Stat Fax 2010 (Stat Fax США). Забор мочи производился до начала лечения. Образцы мочи центрифугировали при 5000 об./мин в течение 15 минут, а надосадочную жидкость замораживали и хранили при температуре -18 градусов Цельсия до проведения анализа. Аналогично было проведено замораживание образцов мочи контрольной группы.

Статистический анализ результатов проведен с использованием пакета прикладных программ Statistica 8.0 for Windows корпорации StatSoft-Russia (2009).

Проанализировав результаты исследования, нами впервые были определены количественные показатели -GST у практически здоровых детей, которые были следующими: М=0,48 мкг/л, SD=0,25. Значения колебались в пределах от 0,01 до 0,86 мкг/л.

Нами были обследованы 63 ребенка с обструктивными уропатиями. Всем пациентам проводилось комплексное клинико-лабораторное и рентгенурологическое обследование.

Скрининтовым методом диагностики патологии мочевыделительной системы считалось УЗИ почек и мочевого пузыря. Для выявления рефлюкса применялась микционная цистоуретрография. Для оценки морфофункционального состояния почек применялась экскреторная урография. С четырех лет для оценки функции почек использовался метод динамической нефросцинтиграфии с определением скорости клубочковой фильтрации. Всем пациентам проводилась оценка почечного кровотока при помощи УЗИ почек в режиме цветного допплеровского картирования. Необходимо отметить, что у трети пациентов с обструктивными уропатиями признаков повреждения почечной паренхимы по данным стандартного комплекса обследования выявлено не было. Как правило, эти дети обследовались в связи с атаками пиелонефрита в анамнезе. Однако у всех пациентов с обструктивными уропатиями, в том числе и у пациентов с отсутствием данных за повреждение паренхимы почек по результатам стандартного комплекса обследования, значения -GST были достоверно выше 0,86 мкг/л.

Полученные данные могут быть включены в алгоритм обследования пациентов с обструктивными уропатиями для объективной оценки повреждения почечной паренхимы с помощью неинвазивного, точного, простого и раннего метода, что чрезвычайно важно для педиатрической практики.

Клинический пример:

1. Феклистов Дмитрий, 5 лет, поступил в детское плановое хирургическое отделение с диагнозом: Паховая грыжа слева. Исходные клинико-лабораторные данные: OAK: эритроциты - 4,79×10 12 /л, гемоглобин - 114 г/л, гематокрит - 32,1, лейкоциты 7,1×10 9 /л, палочкоядерные - 4%, сегментоядерные - 57%, эозинофилы - 1%, лимфоциты - 30%, моноциты - 7%, тромбоциты - 287×10 9 /л, ЛИИ=0,05, ИЯС=0,09, ЛИ=0,48, ИИР=4,4; биохимический анализ крови: общий белок - 82 г/л, альбумино-глобулиновый коэффициент - 0,97; ОАМ: реакция - кислая, плотность - 1012, эритроциты 0 в поле зрения, лейкоциты 0-1 в поле зрения, белок отрицательный. Уровень мочевой экскреции маркеров повреждения почечной паренхимы: -GST - 0,84 мкг/л. По данным УЗИ почек и мочевого пузыря размеры почек и полостных систем в пределах возрастной нормы.

Из приведенного примера видно, что у ребенка отсутствует патология со стороны мочевыделительной системы. Это подтверждается отсутствием изменения значений л-GST в моче.

2. Коротенко Екатерина, 7 мес, поступила в детское урологическое отделение с диагнозом: Врожденный порок развития мочевыделительной системы. Двусторонний активный и пассивный пузырно-мочеточниковый рефлюкс III степени. Хронический обструктивный пиелонефрит, неактивная фаза. Фоновая патология: лимфатико-гипопластический диатез. Рахит II, подострое течение. Сопутствующая патология: полидефицитная анемия легкой степени. Исходные клинико-лабораторные данные: OAK: эритроциты - 3,9×10 12 /л, гемоглобин - 95 г/л, гематокрит - 38,9, лейкоциты 7,3×10 9 /л, палочкоядерные - 1%, сегментоядерные - 27%, эозинофилы - 0%, лимфоциты - 67%, моноциты - 2%, тромбоциты - 254×10 9 /л, ЛИИ=0,2, ИЯС=0,04, ЛИ=3,3, ИИР=35; биохимический анализ крови: общий белок - 62,2 г/л, альбумино-глобулиновый коэффициент - 0,97; ОАМ: реакция - слабокислая, плотность=1015, эритроциты 0 в поле зрения, лейкоциты 1-2 в поле зрения, белок отрицательный. Уровень мочевой экскреции маркеров повреждения почечной паренхимы: -GST - 12,1 мкг/л. При выполнении микционной цистоуретрографии выявлен двусторонний пассивный и активный рефлюкс с обеих сторон III степени с расширением дистального отдела мочеточника справа до 0,8 мм, слева до 0,5 мм. По данным УЗИ почек и мочевого пузыря размеры почки слева 55.9 мм×26.0 мм, паренхима - 9.6 мм, размеры лоханки - 2.3 мм×2.4 мм; справа размеры почки 54.4 мм×25.2 мм, паренхима - 9.3 мм, размеры лоханки - 5.7 мм×6.2 мм. По данным допплерометрического исследования сосудов почек гемодинамически значимых нарушений нет. По данным экскреторной урографии - выведение контраста замедлено с обеих сторон.

В приведенном примере показано, что несмотря на значимую степень рефлюкса с двух сторон признаков повреждения почечной паренхимы по данным УЗИ почек с допплерометрией выявлено не было. Лишь по данным экскретрной урографии отмечается замедление эвакуаторной функции. Уровень -GST был 12,1 мкг/л, что значительно выше верхней границы данного фактора у практически здоровых детей, что указывает на повреждение почечной паренхимы.

Таким образом, как видно из описания способа и приведенных примеров, предлагаемый способ является неинвазивным, простым, точным и ранним в диагностике повреждения почечной паренхимы. Впервые даны значения -GST у практически здоровых детей, колеблющиеся от 0,01 до 0,86 мкг/л и доказано, что значения в моче -GST выше 0,86 мкг/л свидетельствуют о повреждении почечной паренхимы. Полученные нами данные позволяют выявить изменения в почечной паренхиме у детей с обструктивными уропатиями на ранних стадиях, объективно оценить проводимое лечение, улучшить результаты лечения детей с уропатиями и предотвратить формирование почечной недостаточности в раннем детском возрасте, а уточнение механизмов инициации нефросклероза даст возможность открыть новые направления и перспективы в лечении больных с врожденными анатомическими и функциональными нарушениями мочевыводящих путей.

Формула изобретения

Способ диагностики повреждения почечной паренхимы у детей, включающий определение белковых фракций в моче, отличающийся тем, что определяют в моче -глутатион-s-трансферазу ( -GST) и при ее значении выше 0,86 мкг/л диагностируют повреждение почечной паренхимы.