Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
Патент на изобретение №2452964

(19)

RU

(11)

2452964

(13)

C1

(51) МПК G01N33/53 (2006.01)

G01N33/543 (2006.01)

C07K14/705 (2006.01)

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ Статус: по данным на 27.08.2012 - действует Пошлина:

(21), (22) Заявка: 2011114851/10, 15.04.2011

(24) Дата начала отсчета срока действия патента:

15.04.2011

Приоритет(ы):

(22) Дата подачи заявки: 15.04.2011

(45) Опубликовано: 10.06.2012

(56) Список документов, цитированных в отчете о

поиске: RU 2356576 C1, 27.05.2009. WO 2010086337 A1, 05.08.2010. RU 2402540 C2, 27.10.2010. TW 200831510 A, 01.08.2008.

Адрес для переписки:

121552, Москва, ул. 3-я Черепковская, 15а,ФГБУ "РКНПК", патентный отдел, пат. пов. О.И.Куприяновой

(72) Автор(ы):

Афанасьева Ольга Ильинична (RU),

Клесарева Елена Александровна (RU),

Сидорова Мария Владимировна (RU),

Палькеева Марина Евгеньевна (RU),

Беспалова Жанна Дмитриевна (RU),

Левашов Павел Андреевич (RU),

Покровский Сергей Николаевич (RU),

Кипор Светлана Геннадиевна (RU)

(73) Патентообладатель(и):

Федеральное государственное учреждение "Российский кардиологический научно-производственный комплекс" Министерства здравоохранения и социального развития (ФГУ "РКНПК" Минздравсоцразвития России) (RU)

(54) СПОСОБ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АУТОАНТИТЕЛ К 1-АДРЕНОРЕЦЕПТОРУ В ПЛАЗМЕ И СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

(57) Реферат:

Изобретение предназначено для определения аутоантител, специфичных к 1 -адренорецептору, в плазме и сыворотке крови человека. Изобретение раскрывает способ твердофазного иммуноферментного анализа, в котором в качестве антигена на пластик иммобилизована эквимолярная смесь синтетических пептидов: нонапептида (положение 125-133), тридекапептида (положение 208-218) аминокислотной последовательности молекулы 1 -адренорецептора человека и химерная конструкция из этих же пептидов, связанных между собой дисульфидной связью. Предложенный способ обладает принципиально большей чувствительностью при определении наличия аутоантител к 1 -адренорецептору в плазме и сыворотке крови больных дилатационной кардиомиопатией. Изобретение может быть также применено для диагностики больных с различными сердечно-сосудистыми заболеваниями. 1 табл., 1 ил., 4 пр.

Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии и медицине и может быть применено для определения аутоантител, специфичных к 1 -адренорецептору в плазме и сыворотке крови человека.

Показано, что наличие повышенного титра аутоантител к 1 -адренорецептору может быть одним из факторов развития тяжелых сердечно-сосудистых заболеваний, таких как дилатационная кардиомиопатия, тахиаритмия и острая сердечная недостаточность [1-3].

Дилатационная кардиомиопатия (ДКМП) - заболевание сердечной мышцы (миокарда) неизвестной этиологии, приводящее к увеличению размеров, изменению толщины стенок, дилатацией полостей, снижению фракции выброса, а также нарушению проводимости и ритма сердца [4]. Смертность от ДКМП составляет 1 на 10000 человек среди мужчин молодого и среднего возраста (от 35-55 лет) [5], пятилетняя выживаемость среди европейской расы составляет 31,4% [6]. Прогноз течения заболевания очень плохой и многие больные нуждаются в пересадке сердца. В крови больных ДКМП выявляются различные аутоантитела, которые являются антителами против собственных антигенов, таких как миозин, адениннуклеотидный транслокатор, сарколемальный ламинин, 1 -адренорецептор, белок мускаринового М2-рецептора, рибосомальных и митохондриальных белков и др. Это может служить свидетельством причастности аутоиммунных нарушений к патогенезу заболевания [7].

Молекула 1 -адренорецептора относится к семейству G белков, имеет 7 трансмембранных доменов и несколько экстраклеточных петель. Встречаемость повышенного титра аутоантител к 1 -адренорецептору у больных с ДКМП варьирует в различных исследованиях в широком диапазоне, однако литературные данные однозначно говорят о том, что эти аутоантитела, равно как и аутоантитела к мускариновому М2 рецептору - наиболее часто встречающиеся аутоантитела у больных с ДКМП [8, 9]. На опытах с кроликами показано, что введение синтетического пептида, соответствующего последовательности второй экстраклеточной петли молекулы 1 -адренорецептора, приводит к развитию ДКМП [3], а комбинированная иммунизация пептидами, соответствующими 1 -адренорецептору и мускариновому М2-рецептору, вызывает гипертрофию сердечной мышцы [9].

Для определения титра аутоантител к 1 -адренорецептору используют способ твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) на основе синтетических пептидов, поскольку данный подход является более простым, технологичным, воспроизводимым и перспективным для возможного последующего внедрения в клиническую диагностику. В литературе описано несколько способов ИФА с использованием пептида, соответствующего внеклеточному участку (197-222) 2-й петли 1 -адренорецептра [8, 10]. В группе обследованных больных, у 18 из которых был поставлен диагноз ДКМП, у 14 - ИБС, было проведено определение уровня аутоантител к 1 -адренорецепторам способом ИФА с использованием вышеописанного пептида (197-222) [11]. При этом только у 3 пациентов из 18 (16,6%) с диагнозом ДКМП и у 3 пациентов из 14 (21,4%) с диагнозом ИБС был обнаружен достоверный положительный ответ (превышение сигнала в ИФА в 2 и более раз относительно фона здоровых доноров n=20) [10].

Другой описанный способ ИФА позволяет определять наличие аутоантител к 1 -адренорецептору и мускариновому М2-рецептору с использованием пептидов, представляющих собой участок (169-192) 2-й внеклеточной петли мускаринового ацетилхолинового рецептора-2 и участок (197-222) 2-й петли 1 -адренорецептора. Частота получения положительного ответа в группе больных ДМКП и здоровых доноров достоверно не отличалась и составила: 5 из 36 (14%) больных и 4 из 36 здоровых доноров (12%) [8].

Аналогом предложенного иммуноферментного анализа является способ, описанный Magnusson Y. [11]. В качестве антигена также использовался пептид, представляющий собой участок (197-222) 2-й петли 1 -адренорецептора. Частота выявления аутоантител к 1 -адренорецептору у больных ДКМП, определяемых данным способом, составляла 13 положительных ответов из 42 больных (30%), тогда как на популяции здоровых доноров доля положительных ответов - 12% [11].

Таким образом, чувствительность диагностического метода, определяемая как процент положительных результатов теста при наличии диагностируемого заболевания (ДКМП), для описанных способов с использованием пептида (197-222) 2-й петли 1 -адренорецептора не превышает 30%.

Собственные исследования показали, что у больных ДКМП выявляются аутоантитела против как 1-й или 2-й петли, так и комплекса этих двух петель, связанных в нативной молекуле 1 -адренорецептора дисульфидной связью [12].

Таким образом, ограниченная антигенная специфичность используемого пептида может, в свою очередь, объяснять заниженную чувствительность описанных способов ИФА у больных ДКМП.

Прототипом предложенного способа ИФА является анализ аутоантител с использованием синтетического антигена - химерной молекулы, представляющего собой индивидуальное химическое соединение, в котором пептиды последовательности (125-133) 1-й петли и (206-218) 2-й петли 1 -адренорецептора соединены дисульфидной связью [12]. Использование данной химерной молекулы позволило увеличить чувствительность определения аутоантител к 1 -адренорецептору до 44% [13].

В связи со сложностью постановки диагноза и тяжестью заболевания ДКМП определение уровня аутоантител к 1 -адренорецептору является чрезвычайно значимым для возможной дифференциальной диагностики сердечно-сосудистых заболеваний и, в частности, ДКМП. В связи с этим чувствительность способа должна быть более высокой.

Задачей настоящего изобретения является разработка иммунологического метода, позволяющего с высокой чувствительностью определять аутоантитела к 1 -адренорецептору.

Поставленная задача решается использованием в качестве антигена эквимолярной смеси синтетических пептидов, представляющих собой - нонапептид (125-133) 1-й петли, тридекапептид (208-218) 2-й петли последовательности 1 -адренорецептора и синтетический антиген, включающий в себя нонапептид и тридекапептид, соединенные между собой дисульфидной связью.

Синтез пептидов последовательности (125-133) 1-й внеклеточной петли 1 -адренорецептора (нонапептид) и последовательности (206-218) 2-й петли молекулы 1 -адренорецептора (тридекапептид) осуществляли по стандартной технологии синтеза на твердой фазе с использованием Fmoc * -методологии на полимере Ванга. В работе использовали производные L-аминокислот фирмы «Bachem» (Швейцария), DIC, HOBT, TIBS фирмы «Fluka» (Швейцария). Для синтеза применяли N-метилпирролидон, дихлорметан, пиперидин, метанол и трифторуксусную кислоту («Applied Biosystems», США). DMF очищали перегонкой над нингидрином и окисью бария. Для блокирования функциональных групп боковых цепей аминокислот применяли следующие защиты: трет-бутильную для карбоксильных групп аспарагиновой и глутаминовой кислот, гидроксильной функции серина и тирозина; трет-бутилоксикарбонильную (Вос) - защиту для -аминогруппы лизина; тритильную (Trt) - группу для карбоксамидной функции аспарагина и Pmc - для гуанидиновой функции аргинина.

О защите цистеиновых остатков см. примеры 1 и 2. Аминокислотную цепь наращивали по одной аминокислоте, начиная с С-конца, с использованием карбодиимидного метода с добавкой 1-гидроксибензотриазола.

Пример 1. Синтез нонапептида последовательности (125-133) 1-й петли 1 -адренорецептора H-Glu-Tyr-Gly-Ser-Phe-Phe-Cys-Glu-Leu-OH (предшественник I).

Синтез проводили на автоматическом пептидном синтезаторе «Applied Biosystems» модель 431А по стандартной программе для однократной конденсации Fmoc-аминокислот. В каждом случае исходили из 0,25 ммоль Fmoc-аминоацилполимера («Bachem», Швейцария). Для твердофазного синтеза использовали сополимер стирола с 1% дивинилбензола с гидроксиметилфеноксиметильной якорной группой, с размером частиц 200-400 меш фирмы «Bachem» (Швейцария). Стандартный протокол твердофазного синтеза включает следующие стадии:

Протокол твердофазного синтеза

Операция

Реагент

Время обработки

1

Промывка

5×NMP

3 мин

2

Деблокирование -аминогрупп

20% Pip/NMP

10 мин

3

Промывка

5×NMP

3 мин

4

Активация

1 ммоль Fmoc-аминокислоты + 1 ммоль HOBt + 1 ммоль DIC в NMP

20 мин

5

Конденсация

1 ммоль активированного производного Fmoc-аминокислоты в NMP

90 мин

6

Промывка

5×NMP

3 мин

* Список сокращений: Вос - трет-бутилоксикарбонил; Acm - ацетамидометильная; АсОН - уксусная кислота; Bu t - трет-бутил; DIC - N,N 1 -диизопропилкарбодиимид; DCM - дихлорметан; DMF - N,N-диметилформамид; DMSO-d6 - дейтерированный диметилсульфоксид; Fmoc - 9-флуоренилметоксикарбонил; НОВТ - 1-гидроксибензотриазол; NMP - N-метилпирролидон; Pmc - 2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6-сульфонил; Pip - пиперидин; TIBS - триизобутилсилан; TFA - трифторуксусная кислота; ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография; ТФС - твердофазный синтез пептидов

Отщепление и деблокирование пептидов осуществляли действием трифторуксусной кислоты со специальными добавками, предотвращающими побочные реакции. Деблокирование сульфгидрильных групп цистеиновых остатков осуществляли действием ацетата ртути. Линейные нонапептид и тридекапептид очищали с помощью препаративной ВЭЖХ до 97-98% чистоты. Препаративную ВЭЖХ проводили на приборе «Beckman» (США), пептиды детектировали при 226 нм. Пептиды элюировали градиентом концентрации ацетонитрила в 0,1% TFA. Для ВЭЖХ использовали ацетонитрил фирмы «Technopharm» (РФ). Аналитическую ВЭЖХ проводили на колонках Ultrasphere ODS («Beckman», США), (5 мкм, 4,6×250 мм); на хроматографе фирмы «Gilson» (Франция). В качестве элюентов использовали буфер А - 0,1% TFA, pH 2,0, буфер Б - 80% ацетонитрила в буфере А, элюция градиентом концентрации буфера Б в буфере А со скоростью потока 1 мл/мин.

Синтезированные пептиды характеризовали данными 1 H-ЯМР-спектроскопии 1 Н-ЯМР-спектры снимали на спектрометре WH-500 «Bruker» 500 МГц (ФРГ) в DMSO-d при 300 K, концентрация пептидов составляла 2-3 мг/мл. Химические сдвиги измерялись относительно тетраметилсилана), масс-спектрометрии (Масс-спектры регистрировали на приборе PC-Kompact MALDI, «Kratos», Англия).

Стадия 1. Твердофазный синтез H-Glu-Tyr-Gly-Ser-Phe-Phe-Cys(Acm)-Glu-Leu-OH (предшественник I Acm ) проводили, исходя из 0,34 г Fmoc-Leu-полимера, содержащего 0,25 ммоль стартовой аминокислоты, в соответствии с вышеприведенным стандартным протоколом. Сульфгидрильную группу остатка цистеина защищали ацетамидометильной защитой.

Заключительное деблокирование и отщепление нонапептида (I Acm ) от полимера проводили в одну стадию путем обработки соответствующего нонапептидилполимера смесью 10 мл TFA и 0,5 мл Н 2 О в течение 2 ч. Затем полимер отфильтровывали, промывали 2×2 мл деблокирующей смеси, фильтрат упаривали и к остатку прибавляли сухой эфир. Осадок отфильтровывали, промывали дихлорметаном (3×3 мл), эфиром (3×5 мл), сушили в вакуум-эксикаторе. Получено 0,25 г сырого продукта (I Acm ), содержащего по данным ВЭЖХ 94% целевого пептида.

Очистку пептида проводили с помощью препаративной ВЭЖХ на приборе «Beckman» (США), используя колонку Диасорб-С16 130Т (25×250 мм), размер частиц сорбента - 10 мкм. В качестве элюентов использовали: буфер А - 0,1% водный раствор TFA и буфер Б - 80% ацетонитрила в воде, элюцию проводили градиентом 0,5% в минуту буфера Б от 100% буфера А, скорость потока 10 мл/мин. Пептиды детектировали при длине волны 226 нм. Фракции, содержащие целевой продукт, объединили и лиофилизовали. В итоге получено 0,15 г (51% в расчете на стартовую аминокислоту, присоединенную к полимерному носителю) трифторацетата пептида (I Acm ). Гомогенность продукта, определенная с помощью аналитической ВЭЖХ, составила 98%. Аминокислотный состав по данным 1 H-ЯМР-спектроскопии: Glu 2, Ser 1, Gly 1, Leu 1, Phe 2, Tyr 1, Cys 1.

Масс-спектр, m/z: 1165,5 [М+Н] + , вычислено 1164,7, для C 54 H 72 N 10 O 17 S 1 .

Стадия 2. Получение нонапептида H-Glu-Tyr-Gly-Ser-Phe-Phe-Cys-Glu-Leu-OH (предшественник I).

0,05 г (0,043 ммоль) H-Glu-Tyr-Gly-Ser-Phe-Phe-Cys(Acm)-Glu-Leu-OH (I Acm ) растворяли в 5 мл 30% АсОН, добавляли 0,03 г (0,09 ммоль) ацетата ртути в 1,5 мл 30% АсОН, так как пептид плохо растворим, доводили концентрацию раствора до 50% АсОН и перемешивали 1,5 ч при 20°С, затем пропускали ток сероводорода в течение 30 мин. Осадок отфильтровывали, промывали 2×5 мл 30% АсОН. Фильтрат упаривали до объема ~2 мл и хроматографировали на колонке (25×250 мм) с Диасорбом. Элюцию проводили градиентом буфера Б (0,5% в мин, от 20 до 80%) в буфере А со скоростью потока 10 мл/мин. Фракции, соответствующие целевому продукту, объединяли, упаривали, остаток растворяли в воде и лиофилизовали. Выход 0,038 г (80,0%). Масс-спектр, m/z: 1095,2 ([М+Н + ]), вычислено 1094,2 для C 51 H 67 N 9 O 16 S.

Пример 2. Синтез тридекапептида последовательности (206-218) 2-й петли 1 -адренорецептора H-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys-Asp-Phe-OH (предшественник II)

Стадия 1. Твердофазный синтез H-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys(Acm)-Asp-Phe-OH (предшественник II Acm ) проводили, исходя из 0,37 г Fmoc-Phe-полимера, содержащего 0,25 ммоль стартовой аминокислоты, в соответствии с вышеприведенным стандартным протоколом. Сульфгидрильные группы остатков Cys 4 и Cys 10 цистеина защищали тритильной защитой, а Cys 11 - ацетамидометильной.

Заключительное деблокирование и отщепление тридекапептида (II Acm ) от полимера проводили в одну стадию путем обработки соответствующего тридекапептидилполимера смесью 10 мл TFA, 0,25 мл Н 2 О и 0,25 мл TIBS в течение 2 ч. Затем полимер отфильтровывали, промывали (2×2 мл) деблокирующей смесью, фильтрат упаривали и к остатку прибавляли сухой эфир. Осадок отфильтровывали, промывали дихлорметаном (3×3 мл), эфиром (3×5 мл), сушили в вакуум-эксикаторе. Получали 0,42 г сырого продукта (II Acm ), содержащего по данным ВЭЖХ 60% целевого пептида.

После этого проводили очистку пептида с помощью препаративной ВЭЖХ так же, как в примере 1. В итоге получали 0,13 г (32% в расчете на стартовую аминокислоту, присоединенную к полимерному носителю) трифторацетата пептида (II Acm ). Гомогенность продукта, определенная с помощью аналитической ВЭЖХ, составляла 98%. Аминокислотный состав по данным 1 H-ЯМР-спектроскопии: Asn 1, Asp 2, Ala 1, Phe 1, Tyr 1, Lys 1, Arg 2, Pro 1, Cys 3. Масс-спектр, m/z: 1661,2 [M+H] + , вычислено 1661,9, для C 68 H 104 N 22 O 21 S 3 .

Стадия 2. Получение тридекапептида H-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys-Asp-Phe-OH (предшественник II).

Деблокирование остатка цистеина Cys 11 в тридекапептиде H-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys(Acm)-Asp-Phe-OH (II Acm ) проводили действием ацетата ртути, как описано в примере 1. Выход тридекапептида 0,027 г (90,0%). Масс-спектр: m/z 1591,9 ([М+Н + ]), вычислено 1590,8 для C 65 H 99 N 21 O 20 S 3 .

Пример 3. Синтетический антиген, включающий в себя нонапептид (125-133) и тридекапептид (208-218) последовательности 1 -адренорецептора, соединенные дисульфидной связью.

0,007 г (0,006 ммоль) нонапептида (участок 125-133 1 -адренорецептора) и тридекапептида (участок 208-218 1 -адренорецептора) 0,009 г (0,006 ммоль) растворяли в 20 мл 10% водного диоксана, добавляли 1 мл 5% водного аммиака до pH 8,0. Вносили в смесь 0,1 мл 3% водной перекиси водорода и перемешивали в течение 10 мин. Полноту окисления SH-групп контролировали с помощью реагента Эллмана (бесцветный раствор). По окончании реакции целевой продукт хроматографировали на колонке 25×600 мм с сефадексом G-25, уравновешенной 2% раствором уксусной кислоты, с целью удаления низкомолекулярных примесей. Фракции, содержащие целевой продукт, объединяли и лиофилизовали. Получено 0,013 г синтетического антигена (81%). Масс-спектр: 2679,8 ([М+Н + ]), вычислено 2680,9, для C 116 H 162 N 30 O 36 S 4 .

Пример 4. Твердофазный иммуноферментный анализ аутоантител к 1 -адренорецептору в образцах плазмы и сыворотки крови человека, использующий в качестве антигена эквимолярную смесь синтетических пептидов - нонапептид (125-133), тридекапептид (208-218) и синтетический антиген (см. пример 3) последовательности 1 -адренорецептора.

В состав набора реагентов для определения аутоантител входили следующие компоненты: 96-луночный планшет для иммуноанализа, фирма «Costar»; смесь синтетического антигена (см. пример 3) и пептидов (см. примеры 1 и 2); буфер 0,1 М Na 2 CO 3 pH 9,6 для разведения пептидов; блокирующий раствор и раствор для отмывки планшетов - буферная смесь 0,01М NaH 2 PO 4 -NaOH pH 7,2, содержащая 0,15М NaCl, 3% обезжиренное сухое молоко и бактериостатик катон CG 2,0 мл/л (ФСБМ); раствор для разведения образцов и конъюгатов - 0,01М NaH 2 PO 4 -NaOH pH 7,2, содержащий 0,15 М NaCl, 3% обезжиренное сухое молоко, бактериостатик катон CG 2,0 мл/л и 0,1% Твин-20 (ФСБМ-Т); конъюгат - реагент для анализа: мышиные моноклональные антитела против IgG человека, меченые биотином; конъюгат стрептавидин-пероксидаза; раствор тетраметилбензидина (ТМБ), 1 мМ в диметилформамиде; субстратный буферный раствор - натрий цитрат 5,5-водный, 26 г/л; лимонная кислота 6,92 г/л, натрия перборат 1,1 г/л и катон CG 2,0 мл/л; стоп-реагент - фосфорная кислота 5%.

Протокол анализа

Перед проведением анализа компоненты набора выдерживали при температуре 20°С в течение 60 мин. Для иммобилизации антигена на планшетах для проведения ИФА использовали смесь (4,5 нмоль/лунку) трех пептидов в эквимолярном соотношении (1,5:1,5:1,5 нмоль/лунку), которые разводили в 0,1 М Na 2 CO 3 pH 9,6 и вносили в лунки планшетов по 100 мкл, затем инкубировали при температуре 37°C в течение 2 часов. Для удаления несвязанных антигенов лунки планшета промывали 4 раза по 250 мкл ФСБМ. Исследуемые образцы плазмы/сыворотки, положительный и отрицательный контроли разводили в ФСБМ-Т в 20 и 50 раз, вносили пипеткой в соответствующие лунки по 100 мкл, инкубировали при температуре 4°C в течение 20 часов. Лунки планшета промывали 4 раза по 250 мкл ФСБМ. Рабочий раствор конъюгата в ФСБМ-Т с концентрацией 0,26 мгл/мл вносили в лунки планшета по 100 мкл и инкубировали при температуре 20°C в течение 60 минут со встряхиванием. Лунки планшета промывали 4 раза по 250 мкл ФСБМ. Конъюгат Str-ПХ разводили в ФСБМ-Т 1:50 и немедленно вносили в лунки планшета по 100 мкл, инкубировали при температуре 20°С в течение 30 минут со встряхиванием. Лунки планшета промывали 4 раза по 250 мкл субстратным буферным раствором. Готовили раствор субстратной смеси (7 объемов субстратного буфера и 1 объем ТМБ) и немедленно вносили в лунки планшета по 100 мкл, закрывали крышкой и инкубировали при температуре 20°С в течение 15 минут без встряхивания. В лунки планшета вносили по 100 мкл стоп-реагента в той же последовательности и тем же методом, каким вносили субстратную смесь. В течение 5 минут после добавления стоп-реагента регистрировали оптическую плотность в планшете на спектрофотометре для ИФА при длине волны 450 нм.

Результаты.

Чувствительность и специфичность предлагаемого способа ИФА для определения аутоантител к 1 -адренорецептору в сыворотке и плазме крови человека.

Определение аутоантител к 1 -адренорецептору проводили в сыворотках и плазмах, полученных от больных с клиническим диагнозом ДКМП (группа 1, n=42), в группе больных ишемической болезнью сердца (ИБС) без ДКМП и аритмий (группа 2, n=15) и в группе здоровых доноров (группа 3, n=41).

О наличии в сыворотке аутоантител к 1 -адренорецептору (положительный ответ в анализе) судили по превышению сигнала оптической плотности (ОП) в исследуемом образце над ОП крит в соответствующем разведении.

Критическую оптическую плотность (ОП крит. ) рассчитывали по формуле:

ОП крит =2×ОП отрицательного контроля.

В качестве отрицательного контроля использовали плазму обследованного здорового донора с доказанным отсутствием аутоантител, определенных независимым способом.

% превышения над ОП крит. рассчитывали по формуле:

% превышения=(ОП образец /ОП крит. -1)×100

Согласно принятым определениям, чувствительность диагностического теста рассчитывается как процент лиц с заболеванием, у которых наблюдаются положительные результаты теста, а специфичность - как процент лиц без заболевания, имеющих отрицательные результаты теста.

Результаты выявления положительных и отрицательных ответов ИФА при определении аутоантител к 1 -адренорецептору в образцах плазмы/сыворотки крови пациентов исследуемых групп и здоровых доноров приведены в таблице 1.

Таблица 1

Результаты ИФА для пациентов с ДКМП и здоровых доноров

Тестируемые образцы

Положительный ответ

Отрицательный ответ

Пациенты с ДКМП (n=42)

33 (79%)

9 (21%)

Здоровые доноры (n=41)

11 (26%)

30 (74%)

В группе больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями, но без диагноза тахиаритмии и ДКМП доля положительных ответов составляла 26% (4 из 15), доля отрицательных 74% (1 из 15), что было сравнимо с результатами, полученными в группе здоровых доноров.

Таким образом, чувствительность и специфичность данного способа для выявления аутоантител к 1 -адренорецептору составляет 79% и 74% соответственно. Положительная предсказательная ценность данного способа для определения ДКМП (вероятность наличия заболевания при положительном результате ИФА) составляет 75%, отрицательная предсказательная ценность (процент лиц с отрицательными результатами ИФА, у которых не имеется ДКМП) - 77%. Следовательно, предлагаемый способ ИФА для определения аутоантител к 1 -адренорецептору позволяет с высокой предсказательной точностью выявлять больных ДКМП.

Сравнительный анализ чувствительности предложенного способа ИФА с прототипом.

Сравнение чувствительности заявляемого способа иммуноферментного анализа с прототипом, описанным в собственном патенте RU 2356576 и использующим только синтетический антиген, представляющий собой нонапептид (125-133) и тридекапептид (208-218) последовательности 1 -адренорецептора, соединенные дисульфидной связью, проводили на 26 образцах плазмы и сыворотки крови больных ДКМП. Методика и условия постановки ИФА были аналогичными и соответствовали описанным в разделе «Протокол анализа».

При анализе одних и тех же образцов плазмы и сыворотки больных ДКМП, с использованием в качестве антигена - синтетического антигена (прототип) или эквимолярной смеси пептидов и синтетического антигена количество положительных результатов определения аутоантител к 1 - адренорецептору составило 12 (42%) и 20 (76%) из 26 измеренных образцов, соответственно (рис.1).

Таким образом, предлагаемый способ твердофазного иммуноферментного анализа позволяет с достоверно большей чувствительностью (76% положительных ответов) определять наличие аутоантител к 1 -адренорецептору в плазме и сыворотке больных ДКМП по сравнению с прототипом (42% положительных ответов).

Формула изобретения

Иммуноферментный способ определения аутоантител к 1 -адренорецептору в плазме и сыворотке крови человека с использованием синтетического антигена, представляющего собой нонапептид (125-133) и тридекапептид (208-218) последовательности 1 -адренорецептора человека, связанных дисульфидной связью, отличающийся тем, что антиген дополнительно содержит нонапептид (125-133) и тридекапептид (208-218) при эквимолярном соотношении всех трех компонентов смеси.

РИСУНКИ