Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
Патент на изобретение №2453845

(19)

RU

(11)

2453845

(13)

C1

(51) МПК G01N33/49 (2006.01)

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ Статус: по данным на 27.08.2012 - действует Пошлина:

(21), (22) Заявка: 2011107679/15, 28.02.2011

(24) Дата начала отсчета срока действия патента:

28.02.2011

Приоритет(ы):

(22) Дата подачи заявки: 28.02.2011

(45) Опубликовано: 20.06.2012

(56) Список документов, цитированных в отчете о

поиске: RU 2234094 C2, 10.08.2004. RU 2239835 C2, 10.11.2004. RU 2331880 C1, 20.08.2008. RU 2296505 C2, 10.04.2007. RU 2380705 C1, 27.01.2010. RU 2157089 C1, 10.10.2000. RU 2324939 C1, 20.05.2008. RU 2423913 C1, 20.07.2011. ИНЖУТОВА А.И. Молекулярно-клеточные механизмы эндотелиальной дисфункции различного генеза (сообщение 1) // Сибирский медицинский журнал, 2010, 5, с.85-88.

Адрес для переписки:

660022, г.Красноярск, ул. Партизана Железняка, 1, КрасГМУ, патентный отдел

(72) Автор(ы):

Инжутова Алена Ивановна (RU)

(73) Патентообладатель(и):

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации" (RU)

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОСТОЯНИЯ СТЕНКИ КРОВЕНОСНЫХ СОСУДОВ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины. Сущность способа определения состояния стенки кровеносных сосудов заключается в том, что осуществляют забор периферической венозной крови у больного в объеме 10 мл, после центрифугирования 5 мл периферической крови пациента на градиенте плотности =1,077 и ультрацентрифугировании еще 5 мл периферической крови того же пациента. Фракции мононуклеаров и эндотелиальных клеток помещают в соответствующие флаконы для культивирования. Адгезированные к поверхности флаконов клетки диссоциируют и подсчитывают в камере Горяева. Количество клеток делят на количество подсчитанных квадратов, умножают на 1000, что соответствует содержанию первичных эндотелиальных прогениторных клеток или специализированных эндотелиальных прогениторных клеток из расчета на 5 мл крови. При значении количества первичных эндотелиальных прогениторных клеток, превышающих в 20 и более раз количество специализированных эндотелиальных прогениторных клеток, говорят об отсутствии эндотелиальной дисфункции - ЭД 0 . При значении количества первичных эндотелиальных прогениторных клеток, превышающем от 5 до 20 раз количество специализированных эндотелиальных прогениторных клеток, говорят о высокой репаративной способности эндотелия сосудов и сохранной функции эндотелиоцитов - физиологическая дисфункция эндотелия, ЭД ф . При значении количества первичных эндотелиальных прогениторных клеток, превышающем от 2 до 5 раз количество специализированных эндотелиальных прогениторных клеток, говорят о достаточной репаративной способности эндотелия сосудов и относительно сохранной функции эндотелиоцитов - умеренная эндотелиальная дисфункция, ЭД I. При соотношении количества первичных эндотелиальных прогениторных клеток к количеству специализированных эндотелиальных прогениторных клеток, равном 1:1,0-1,4 или 1,5:1, говорят об эндотелиальной дисфункции средней степени тяжести и сохранной способности к репарации эндотелиального слоя - ЭД II. При соотношении количества первичных эндотелиальных прогениторных клеток к количеству специализированных эндотелиальных прогениторных 1: 1,5 клеток, говорят о выраженной эндотелиальной дисфункции с сильным нарушением репаративной способности эндотелия - ЭД III. Использование заявленного способа позволяет не только выявить эндотелиальную дисфункцию, диагностировать степень тяжести, но и определить репаративную способность сосудистой стенки, что имеет важное прогностическое и терапевтическое значение и может быть использовано для подбора адекватного патологическому состоянию метода лечебной коррекции, а также может быть использовано в научных целях для поиска и усовершенствования медицинских технологий лечения сосудистых заболеваний. 2 ил., 3 пр., 1 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, неврологии, терапии, и может быть использовано для выявления эндотелиальной дисфункции и определения репаративной способности сосудистой стенки у пациентов с сосудистыми заболеваниями, а так же использовано для медицинских научных исследований.

Усиление продукции эндотелиальных прогениторных клеток возникает в ответ на повреждение сосудистой стенки и ишемию тканей, направлено на неоваскуляризацию и репарацию эндотелиального слоя сосудистого русла.

Существует распространенный подход к определению количества циркулирующих эндотелиальных прогениторных клеток и оценка по нему эндотелиальной дисфункции.

Выделение эндотелиальных прогениторных клеток

1) Периферическую кровь собирают в туб, содержащий 0,5 мМ EDTA.

2) Фракцию мононуклеаров выделяют из крови на градиенте плотности 1,077.

3) Помещают мононуклеары из расчета 1×10 6 клеток на см 2 в культуральные лунки (или культуральный флакон), содержащие 2% желатин и питательную среду M199 с 20% FBS (fetal bovin serum), 0.05 мг/мл Bovine Pituitary Extract, антибиотики и 10 ЕД/мл гепарина.

4) Культивируют в инкубаторе при нормальных условиях (37°C, 5% CO2) 72 часа.

5) Убирают питательную среду с неадгезированными к поверхности лунки клетками (или поверхности флакона).

6) Добавляют новую питательную среду, как описано в пункте 3, отличающуюся по содержанию 2% FBS.

7) а) производят подсчет клеточности под фазово-контрастным микроскопом,

б) вносят в лунки разведенные согласно инструкции антитела-маркеры эндотелиальных прогениторных клеток, например, (FITC)-conjugated CD31 и производят подсчет с использованием люминесцентной микроскопии,

в) вносят питательную среду с ростовым фактором VEGF для дальнейших экспериментов и инкубируют клетки при 37°C, 5% CO2, 4-7 дней с заменой питательной среды каждые три дня.

Этот способ применяется исследователями (преобладающее большинство работ выполнено за рубежом) с незначительными модификациями питательной клеточной среды, времени инкубации и внесения различных маркеров-антигенов (Hristov M., Weber C. Endothelial progenitor cells in vascular repair and remodeling. Pharmacological Research. 2008; 58: 148-151).

В таблице 1 приведены данные по содержанию эндотелиальных прогениторных клеток при различных заболеваниях на основании работ разных авторов с использованием описанного выше способа.

NYHA = New York Heart Association; ADMA = asymmetric dimethylarginine; CFU = colony-forming units of EPCs; EPC = endothelial progenitor cell; HDL = high-density lipoprotein; KDR = kinase insert domain receptor; LDL = low-density lipoprotein; NO = nitric oxide, ОНМК - острое нарушение мозгового кровообращения, ИБС - ишемическая болезнь сердца, ОИМ - острый инфаркт миокарда, ХСН - хроническая сердечная недостаточность.

Недостатки данного способа определения количества циркулирующих эндотелиальных прогениторных клеток и оценки эндотелиальной дисфункции: отсутствие учета уже специализированных эндотелиальных прогениторных клеток в эндотелиоциты, а значит отсутствие оценки репаративной возможности эндотелиального слоя сосудистого русла и выраженности эндотелиальной дисфункции.

Известен способ оценки эндотелиальной дисфункции по циркулирующим эндотелиоцитам в крови, предложенным Красновой Л.Г. и др. (патент РФ 2234094; G01N 33/49, 08.10.2004), в основе которого лежит определение количества десквамированных эндотелиоцитов в периферической крови способом Hladovec J. (Hladovec, J. Circulating endothelial cells in acute myocardial infarction and angina // Klin Wochenschr. 1978; 56, P.1033-1036) после создания на 4 минуты положительного давление в области плеча, превышающего систолическое артериальное давление на 40-50 мм рт.ст. Недостатком этого способа является отсутствие морфо-функциональной дифференциации циркулирующих эндотелиоцитов и невозможность проведения оценки репаративной способности эндотелиального слоя. Кроме того, создание извне повышенного давления в области плеча (манжеточная проба) является физическим провоцирующим фактором локальной дисфункции эндотелия сосудов в области плеча (синдром сдавления).

Способ оценки степени эндотелиальной дисфункции (патент РФ 2324939; G01N 33/49, 20.05.2008), заключающийся в определении спущенных эндотелиоцитов, мембран-высвобожденных микрочастиц и физико-морфологических параметров мембраны лимфоцитов крови является эффективным средством диагностики эндотелиальной дисфункции с использованием математической формулы и диагностических стандартов, но не предполагает оценку репаративной функции эндотелия сосудов, что является существенным недостатком в прогнозировании течения эндотелиальной дисфункции и выборе методов лечения.

Задачей предлагаемого способа является оценка репаративной способности эндотелия сосудов.

Поставленную задачу осуществляют за счет того, что после центрифугирования 5 мл периферической крови пациента на градиенте плотности =1,077 и ультрацентрифугирования 5 мл периферической крови того же пациента выделяют фракцию мононуклеаров и эндотелиальных клеток, затем помещают в соответствующие флаконы для культивирования; полученные фракции первичных прогениторных эндотелиальных клеток и специализированных прогениторных эндотелиальных клеток, адгезированные к поверхности флаконов, диссоциируют и подсчитывают в камере Горяева в 2 больших квадратах или камере Бюркера в 4 больших квадратах; затем полученное количество клеток делят на 2 для камеры Горяева и на 4 для камеры Бюркера: при значении количества первичных эндотелиальных прогениторных клеток, превышающим в 20 и более раз количество специализированных эндотелиальных прогениторных клеток, говорят об отсутствии эндотелиальной дисфункции - ЭД 0 ; при значении количества первичных эндотелиальных прогениторных клеток, превышающем от 5 до 20 раз количество специализированных эндотелиальных прогениторных клеток, говорят о высокой репаративной способности эндотелия сосудов и сохранной функции эндотелиоцитов - физиологическая дисфункция эндотелия, ЭД ф ; при значении количества первичных эндотелиальных прогениторных клеток, превышающем от 2 до 5 раз количество специализированных эндотелиальных прогениторных клеток, говорят о достаточной репаративной способности эндотелия сосудов и относительно сохранной функции эндотелиоцитов - умеренная эндотелиальная дисфункция, ЭД I; при соотношении количества первичных эндотелиальных прогениторных клеток к количеству специализированных эндотелиальных прогениторных клеток, равном 1:1,0-1,4 или 1,5:1, говорят об эндотелиальной дисфункции средней степени тяжести и сохранной способности к репарации эндотелиального слоя - ЭД II; при соотношении количества первичных эндотелиальных прогениторных клеток к количеству специализированных эндотелиальных прогениторных 1: 1,5 клеток говорят о выраженной эндотелиальной дисфункции с сильным нарушением репаративной способности эндотелия - ЭД III.

Способ осуществляют следующим образом: забор венозной крови в объеме 10 мл проводят толстой иглой из локтевой вены пациента в пластмассовую пробирку с ризками, содержащую 0,03 мл гепарина; затем тщательно перемешивают кровь с гепарином в пробирке. Допустимо хранение пробирки с кровью в холодильнике при +5С° в течение 3-4 часов. В условиях лаборатории проводят повторное ресуспендирование крови в пробирке.

Затем из пробирки, содержащей 10 мл крови, разделяют кровь в лабораторных условиях на 2 пробирки по 5 мл для последующего выделения первичных эндотелиальных прогениторных клеток и специализированных эндотелиальных прогениторных клеток.

Пробирку 1 центрифугируют на градиенте плотности =1,077 для выделения клеток мононуклеарной фракции, которые затем помещают из расчета 1×10 6 клеток в см 2 во флакон для культивирования, содержащий 20 мл питательной среды М199 с 2% FBS (fetal bovin serum, из расчета поддержания жизнеспособности, а не клеточного роста), 0.05 мг/мл Bovine Pituitary Extract, антибиотики, инкубируют в течение 24 часов при нормальных условиях (37°С, 5% CO2), затем убирают питательную среду с клетками, неадгезированными к ростовой поверхности флакона, добавляют 0,25% трипсин/ЭДТА (1 ммоль/л) в объеме 5 мл для диссоциации клеток от ростовой поверхности, производят перемещение клеток с трипсин/ЭДТА в пробирку и доводят до 15 мл PBS, затем центрифугируют при +4°C, 5000 оборотов, 10 минут, к полученному осадку добавляют 1 мл PBS и осуществляют подсчет в камере Горяева в 2 больших квадратах (камере Бюркера в 4 больших квадратах), затем полученное число делят на 2 для камеры Горяева (и на 4 для камеры Бюркера), умножают на 1000, что соответствует содержанию первичных эндотелиальных прогениторных клеток из расчета на 5 мл крови (рисунок 1).

Пробирку 2 центрифугируют при +4°С в течение 20 минут при скорости 395 g, к осадку добавляют 0,2 мл ADP (1 мг/мл раствора), суспендируют в течение 10 минут до полного смешивания, центрифугируют при +4°С в течение 20 минут на скорости 395g (для отделения от тромбоцитарных агрегатов), полученный супернатант центрифугируют при +4°С в течение 20 минут, 2100 g, полученный осадок помещают во флакон для культивирования с питательной средой М199 с 2% FCS (heat inactivated fetal calf serum), антибиотиками и 2 mM L-глутамином, после 24 часов инкубирования (37°C, 5% CO2) убирают питательную среду с эндотелиоцитами (апоптотическими), неадгезированными к ростовой поверхности флакона, во флакон вносят 0,25% трипсин/ЭДТА (1 ммоль/л) в объеме 5 мл для диссоциации клеток от ростовой поверхности, производят перемещение клеток с трипсин/EDTA в пробирку и доводят до 15 мл PBS, затем центрифугируют при +4°С, 5000 оборотов, 10 минут, к полученному осадку добавляют 1 мл PBS и осуществляют подсчет в камере Горяева в 2 больших квадратах (камере Бюркера в 4 больших квадратах), затем полученное число делят на 2 для камеры Горяева (и на 4 для камеры Бюркера), умножают на 1000, что соответствует содержанию специализированных эндотелиальных прогениторных клеток из расчета на 5 мл крови (рисунок 2).

При значении количества первичных эндотелиальных прогениторных клеток, превышающем в 20 и более раз количество специализированных эндотелиальных прогениторных клеток, говорят об отсутствии эндотелиальной дисфункции - ЭД 0 ; при значении количества первичных эндотелиальных прогениторных клеток, превышающем от 5 до 20 раз количество специализированных эндотелиальных прогениторных клеток, говорят о высокой репаративной способности эндотелия сосудов и сохранной функции эндотелиоцитов - физиологическая дисфункция эндотелия, ЭД ф ; при значении количества первичных эндотелиальных прогениторных клеток, превышающем от 2 до 5 раз количество специализированных эндотелиальных прогениторных клеток, говорят о достаточной репаративной способности эндотелия сосудов и относительно сохранной функции эндотелиоцитов - умеренная эндотелиальная дисфункция, ЭД I; при соотношении количества первичных эндотелиальных прогениторных клеток к количеству специализированных эндотелиальных прогениторных клеток, равном 1:1,0-1,4 или 1,5:1, говорят об эндотелиальной дисфункции средней степени тяжести и сохранной способности к репарации эндотелиального слоя - ЭД II; при соотношении количества первичных эндотелиальных прогениторных клеток к количеству специализированных эндотелиальных прогениторных 1: 1,5 клеток, говорят о выраженной эндотелиальной дисфункции с сильным нарушением репаративной способности эндотелия - ЭД III.

Исследование количества первичных и специализированных эндотелиальных прогениторных клеток проведены у больных гипертонической болезнью в сочетании с ишемической болезнью сердца (72 человека) и гипертонической болезнью без ишемической болезни сердца (50 человек), а так же у относительно здоровых пациентов с синдромом панических атак (30 человек), что соответствует нейроциркуляторной дистонии (всего 152 человека). В результате у пациентов, страдающих гипертонической болезнью II стадии, риск 3 определена ЭД II в 61,1%±3,3 случаев (p<0,01); у 38,9%±4.5 (p<0,05) определена ЭД III, из которых у 78%±1,4 (р<0,01) развились сосудистые осложнения в ближайшие полгода от момента исследования. У пациентов, страдающих гипертонической болезнью и ишемической болезнью сердца, стенокардией напряжения II ф.кл. диагностировали ЭД II в 96%±2,3 случаев (p<0,01), у 2 пациентов диагностирована ЭД III, в ближайшие полгода от момента исследования 1 из них был доставлен в стационар с диагнозом - инфаркт миокарда, второй пациент с тромбоэмболией легочной артерии. У 25 (83,3%) пациентов с синдромом панических атак диагностирована ЭДф (p<0,05), у 5 человек (16,7%) - ЭД I (p>0,05).

На рисунке 1 представлена микрофотография культуры эндотелиальных прогениторных клеток, увеличение ×900, верхняя часть рисунка - фазово-контрастная микроскопия, нижняя - люминесцентная.

На рисунке 2 представлена микрофотография культуры специализированных эндотелиальных клеток, увеличение ×900, верхняя часть рисунка - фазово-контрастная микроскопия, нижняя - люминесцентная.

Пример 1

Мужчина 45 лет, страдает в течение 10 лет гипертонической болезнью и в течение 5 лет ишемической болезнью сердца, стенокардией напряжения II ф. кл.

Регулярно получает стандартную сердечно-сосудистую терапию.

В развернутом анализе крови отмечается незначительное повышение СОЭ (12 мм/ч), в биохимическом анализе крови: увеличение содержания общего холестерина (6,2 ммоль/л). Других отклонений не выявлено.

При проведении лабораторных анализов определено, что содержание первичных эндотелиальных прогениторных клеток составило 2000 клеток из расчета на 5 мл образца периферической крови пациента, и 1700 специализированных эндотелиальных клеток из расчета на 5 мл крови. 2000/1700=1,18, что соответствует ЭД II.

Эти результаты свидетельствуют об эндотелиальной дисфункции средней степени тяжести и сохранной способности к репарации эндотелиального слоя.

Пример 2.

Женщина 50 лет, страдающая в течение 20 лет гипертонической болезнью II, риск 3, кризовое течение.

Прием лекарственных препаратов по потребности, несмотря на рекомендации лечащего врача.

В развернутом анализе крови отклонений не выявлено, в биохимическом анализе крови повышена концентрация фибриногена (4,5 г/л), общий холестерин 5,2 ммоль/л.

Лабораторно: 900 первичных эндотелиальных прогениторных клеток из расчета на 5 мл крови и 2152 специализированных эндотелиальных прогениторных клеток из расчета на 5 мл крови. 2152/900=2,39, что соответствует ЭД III и свидетельствует о выраженной эндотелиальной дисфункции с сильным нарушением репаративной способности эндотелия.

Через 1,5 месяца от проведенного исследования пациентка была госпитализирована с диагнозом острое нарушение мозгового кровообращения в левой среднемозговой артерии по ишемическому типу.

Пример 3.

Женщина 32 лет, страдающая в течение 10 лет синдромом панических атак.

Из медикаментозных препаратов периодически получала рибоксин и валериану.

В развернутом и биохимическом анализе крови отклонений не обнаружено.

Лабораторно: первичных эндотелиальных прогениторных клеток 10000 из расчета на 5 мл крови, специализированных эндотелиальных прогениторных клеток 200 из расчета на 5 мл крови. 10000/250=40. Это соответствует ЭД 0 и говорит об отсутствии эндотелиальной дисфункции.

Использование заявляемого способа позволяет не только выявить эндотелиальную дисфункцию, диагностировать ее степень тяжести, но и определить репаративную способность сосудистой стенки, что имеет важное прогностическое и терапевтическое значение, может быть использовано для подбора адекватного патологическому состоянию метода лечебной коррекции, а также может быть использовано в научных целях для поиска и усовершенствования медицинских технологий лечения сосудистых заболеваний.

Формула изобретения

Способ определения состояния стенки кровеносных сосудов, включающий забор периферической венозной крови у больного в объеме 10 мл, после центрифугирования 5 мл периферической крови пациента на градиенте плотности =1,077 и ультрацентрифугирования еще 5 мл периферической крови того же пациента выделяют фракцию мононуклеаров и эндотелиальных клеток, отличающийся тем, что полученные фракции клеток помещают в соответствующие флаконы для культивирования, адгезированные к поверхности флаконов клетки диссоциируют и подсчитывают в камере Горяева, полученное количество клеток делят на количество подсчитанных квадратов, умножают на 1000, что соответствует содержанию первичных эндотелиальных прогениторных клеток или специализированных эндотелиальных прогениторных клеток из расчета на 5 мл крови; при значении количества первичных эндотелиальных прогениторных клеток, превышающем в 20 и более раз количество специализированных эндотелиальных прогениторных клеток, говорят об отсутствии эндотелиальной дисфункции - ЭД 0 ; при значении количества первичных эндотелиальных прогениторных клеток, превышающем от 5 до 20 раз количество специализированных эндотелиальных прогениторных клеток, говорят о высокой репаративной способности эндотелия сосудов и сохранной функции эндотелиоцитов - физиологическая дисфункция эндотелия, ЭД ф ; при значении количества первичных эндотелиальных прогениторных клеток, превышающем от 2 до 5 раз количество специализированных эндотелиальных прогениторных клеток, говорят о достаточной репаративной способности эндотелия сосудов и относительно сохранной функции эндотелиоцитов - умеренная эндотелиальная дисфункция, ЭД I; при соотношении количества первичных эндотелиальных прогениторных клеток к количеству специализированных эндотелиальных прогениторных клеток, равном 1:1,0-1,4 или 1,5:1, говорят об эндотелиальной дисфункции средней степени тяжести и сохранной способности к репарации эндотелиального слоя - ЭД II; при соотношении количества первичных эндотелиальных прогениторных клеток к количеству специализированных эндотелиальных прогениторных 1: 1,5 клеток говорят о выраженной эндотелиальной дисфункции с сильным нарушением репаративной способности эндотелия - ЭД III.

РИСУНКИ