Forbidden

You don't have permission to access /zzz_siteguard.php on this server.

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ОПУХОЛИ У ПАЦИЕНТОВ С РАКОМ ЛЕГКОГО К ТЕРАПИИ ГЕФИТИНИБОМ
Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
Патент на изобретение №2454464

(19)

RU

(11)

2454464

(13)

C2

(51) МПК C12Q1/68 (2006.01)

G01N33/573 (2006.01)

G01N33/561 (2006.01)

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ Статус: по данным на 27.08.2012 - действует Пошлина: учтена за 3 год с 13.07.2012 по 12.07.2013

(21), (22) Заявка: 2010128465/15, 12.07.2010

(24) Дата начала отсчета срока действия патента:

12.07.2010

Приоритет(ы):

(22) Дата подачи заявки: 12.07.2010

(43) Дата публикации заявки: 10.04.2012

(45) Опубликовано: 27.06.2012

(56) Список документов, цитированных в отчете о

поиске: OHNISHI H. et al. A simple and sensitive method for detecting major mutations within the tyrosine kinase domain of the epidermal growth factor receptor gene in non-small-cell lung carcinoma. Diagn. Mol. Pathol. 2006, Jun; 15(2), p.101-108. KZ 19877 А, опубл. 15.08.2008. CN 1661107 А, опубл. 31.08.2005. BANKOVIC J. et al. Identification of genesassociated with non small-cell lung cancer promotion and progression. Lung Cancer. 2010 Feb; 67(2), p.151-159. Epub. 2009, May, 26. Найдено из БД, PubMed PMID: 19473719. ГЛУЗМАН Д.Ф. и др. Молекулярные технологии в диагностике злокачественных новообразований. Журнал "DOCTOR", 4, 2003 г. Найдено из БД Google, www.cancer.ic.ck.ua/index_5_9.htm.

Адрес для переписки:

197758, Санкт-Петербург, пос. Песочный, ул. Ленинградская, 68, ФГБУ "НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова" Минздравсоцразвития России, отдел планирования и координации научных исследований

(72) Автор(ы):

Того Александр Викторович (RU),

Иевлева Аглая Геннадьевна (RU),

Соколенко Анна Петровна (RU),

Суспицын Евгений Николаевич (RU),

Митюшкина Наталья Владимировна (RU),

Янус Григорий Аркадьевич (RU),

Городнова Татьяна Владимировна (RU),

Зайцева Ольга Александровна (RU),

Яцук Ольга Станиславовна (RU),

Моисеенко Федор Владимирович (RU),

Проценко Светлана Анатольевна (RU),

Иванцов Александр Олегович (RU),

Мацко Дмитрий Евгеньевич (RU),

Левченко Евгений Владимирович (RU),

Моисеенко Владимир Михайлович (RU),

Имянитов Евгений Наумович (RU)

(73) Патентообладатель(и):

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт онкологии имени Н.Н. Петрова" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (RU),

Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научный центр "Научно-исследовательский институт органических полупродуктов и красителей" (ФГУП "ГНЦ "НИОПИК") (RU)

(54) МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ОПУХОЛИ У ПАЦИЕНТОВ С РАКОМ ЛЕГКОГО К ТЕРАПИИ ГЕФИТИНИБОМ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины, в частности к молекулярной онкологии, и может быть использовано для молекулярно-генетической диагностики чувствительности опухоли у пациентов с раком легкого на терапию гефитинибом. Способ включает определение в 19 экзоне гена EGFR путем полимеразной цепной реакции (ПЦР) при помощи прямого 5'-CTGTCATAGGGACTCTGGAT-3' и обратного 5'-CAGCAAAGCAGAAACTCACAT-3' праймеров с последующим определением длины амплифицированного фрагмента с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. При этом для детекции замены L858R в 21 экзоне гена используют аллель-специфическую ПЦР с использованием 5'-CACCCAGCAGTTTGGCCA-3', 5'-CACCCAGCAGTTTGGCCC-3' и 5'-GCATGAACTACTTGGAGGAC-3' праймеров. При выявлении у пациентов любой из двух типов мутаций в гене EGFR назначают им терапию гефитинибом. Изобретение обеспечивает высокую информативность и надежность определения чувствительности опухоли у пациентов с раком легкого на терапию гефитинибом при простоте и доступности способа. 2 ил.

Изобретение относится к области медицины, в частности к молекулярной онкологии, молекулярной диагностике.

Предложенный тест направлен на отбор пациентов с высокой чувствительностью опухоли к терапии Ирессой путем детекции наиболее частых мутации EGFR. Обоснованный отбор больных на лечение позволит сократить безрезультатное использование исключительно дорогостоящего препарата (стоимость 1 месяца лечения гефитинибом составляет примерно 100000 рублей).

На сегодняшний день описан ряд способов детекции интрагенных мутаций EGFR. Наиболее часто для поиска генетических нарушений EGFR используется прямое секвенирование 18-21 экзонов гена, позволяющее выявить весь спектр известных мутаций [Tokumo et al. The relationship between epidermal growth factor receptor mutations and clinicopathologic features in non-small cell lung cancers, Clin. Cancer Res. 2005 Feb 1; 11(3): 1167-73]. Данный метод имеет несколько существенных недостатков, препятствующих его широкому использованию в клинической практике. Во-первых, это относительно низкая чувствительность, обусловленная частой контаминацией опухолевых образцов нормальной тканью, не содержащей мутаций. Для обнаружения мутации при помощи секвенирования необходимо, чтобы образец содержал не менее 30% мутантной ДНК [Bosari et al. Detection of p53 mutations by single-strand conformation polymorphisms (SSCP) gel electrophoresis. A comparative study of radioactive and nonradioactive silver-stained SSCP analysis. Diagn Mol Pathol. 1995 Dec; 4(4): 249-55]. Во-вторых, данная методика достаточно дорогостоящая и трудоемкая.

Другой подход к выявлению генетических дефектов EGFR заключается в использовании разнообразных модификаций полимеразной цепной реакции (ПЦР): ПЦР с применением олигонуклеотидов с модифицированными основаниями (PNA-LNA PCR clamp) [Nagai et al. Genetic heterogeneity of the epidermal growth factor receptor in non-small cell lung cancer cell lines revealed by a rapid and sensitive detection system, the peptide nucleic acid-locked nucleic acid PCR clamp. Cancer Res. 2005 Aug 15; 65(16): 7276-82], TaqMan-зондов [Suzuki et al. Expression and mutation statuses of epidermal growth factor receptor in thymic epithelial tumors. Jpn J Clin Oncol. 2006 Jun; 36(6): 351-6], Scorpion-праймеров [Kimura et al. Detection of epidermal growth factor receptor mutations in serum as a predictor of the response to gefitinib in patients with non-small-cell lung cancer. Clin Cancer Res. 2006 Jul 1; 12(13): 3915-21], ПЦР с обогащением мутантного варианта ДНК (mutant-enriched PCR) [Asano et al. Detection of EGFR gene mutation in lung cancer by mutant-enriched polymerase chain reaction assay. Clin Cancer Res. 2006 Jan 1; 12(1): 43-8] и др. Эта группа методов нацелена на поиск отдельных, наиболее часто встречающихся повреждений EGFR. Указанные методики обладают более высокой чувствительностью, но требуют использования комбинаций дорогих флюоресцентно-меченых олигонуклеотидов или дополнительных процедур анализа (рестрикционный анализ при mutant-enriched PCR).

Еще один вариант детекции мутаций EGFR - плавление ДНК с высоким разрешением (high resolution melting) [Heideman et al. A panel of high resolution melting (HRM) technology-based assays with direct sequencing possibility for effective mutation screening of EGFR and K-ras genes. Cell Oncol. 2009; 31(5): 329-33] - характеризуется высокой чувствительностью, но не может быть рекомендовано для рутинного использования ввиду высокой стоимости и небольшого распространения в нашей стране аппаратуры для проведения анализа.

Также, среди методов, основанных на ПЦР, необходимо отметить метод, описанный Pan et al., 2005 [Pan et al. Rapid polymerase chain reaction-based detection of epidermal growth factor receptor gene mutations in lung adenocarcinomas. J Mol Diagn. 2005 Aug; 7(3): 396-403]. Метод Pan позволяет обнаружить весь спектр делеций в 19 экзоне, но для детекции замены L858R предлагается дополнительно использовать этап рестрикционного анализа.

В качестве прототипа среди известных аналогов изобретения предлагается наиболее близкий способ выявления в образце опухоли наиболее частой делеций в 19 экзоне EGFR (delE746-A750) и миссенс-мутации L858R в 21 экзоне, описанный в работе OHNISHI H. et al. A simple and sensitive method for detecting major mutations within the tyrosine kinase domain of the epidermal growth factor receptor gene in non-small-cell lung carcinoma. Diagn Mol Pathol. 2006 Jun; 15(2): 101-8. Заявленный способ отличается от известного тем, что для определения делеций в 19 экзоне используют ПЦР с последующим определением длины амплифицированного фрагмента с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, а для детекции замены L858R в 21 экзоне гена используют аллель-специфичную ПЦР. При выявлении у больного любой из двух типов мутаций в гене EGFR назначают терапию гефитинибом.

Техническим результатом заявленного изобретения является повышение информативности и надежности детекции мутаций в гене EGFR у больных раком легкого, что позволяет определить чувствительность опухоли к терапии гефитинибом.

Изобретение направлено на отбор пациентов с раком легкого на терапию гефитинибом. Указанная цель достигается путем тестирования двух типов нарушений: всех возможных делеций в 19 экзоне и замены L858R в 21 экзоне EGFR. Эти мутации составляют 80-90% всех встречающихся при раке легкого повреждений EGFR. Детекция делеций в 19 экзоне осуществляется при помощи ПЦР с последующим разделением продуктов амплификации в полиакриламидном геле, а обнаружение варианта L858R-методом аллель-специфической ПЦР. Благодаря небольшому размеру используемых ПЦР-фрагментов предлагаемый тест может быть эффективно использован для определения статуса EGFR в архивных патоморфологических образцах опухолевой ткани.

Изобретательский уровень предлагаемого диагностического теста подтверждается, во-первых, спектром детектируемых повреждений EGFR, и, во-вторых, использованием сочетания двух недорогих и простых ПЦР-методик для выявления мутаций.

Описание изобретения

Тестирование рекомендовано всем пациентам с аденокарциномой легкого, а также может быть использовано у больных с другими гистологическими вариантами опухолей легкого.

Детекция делеций в 19 экзоне EGFR осуществляется путем ПЦР-амплификации всей последовательности экзона при помощи прямого 5'-CTGTCATAGGGACTCTGGAT-3' и обратного 5'-CAGCAAAGCAGAAACTCACAT-3' праймеров с последующим электрофоретическим разделением продуктов ПЦР. Реакционная смесь состоит из 1 мкл раствора ДНК (10-100 нг ДНК) и 9 мкл смеси для ПЦР. Смесь для ПЦР содержит 1-кратный ПЦР-буфер, 2.5 мМ MgCb, 200 мкМ дЦТФ, 200 мкМ дТТФ, 200 мкМ дГТФ, 200 мкМ дАТФ, 1 мкМ каждого праймера (конечная концентрация - 0.1 ОЕ/л или 0.5 пмоль/мкл) и 0,5 ед. "hot-start" ДНК-полимеразы. ПЦР-реакция начинается с 10-минутной активации ДНК-полимеразы при 95°С; для накопления ПЦР-продукта проводится 45 циклов амплификации (денатурация: 15 сек при 95°C; отжиг: 30 сек при 57°С; синтез: 30 сек при 72°С). Каждый сет амплификации должен включать контрольный образец с делецией, а также негативный контроль. Полученный продукт разделяют методом электрофореза в 10% полиакриламидном геле (ПААГ) в вертикальной камере. Аллелю дикого типа соответствует фрагмент 127 п.о., а в случае делении наблюдается дополнительный фрагмент меньшего размера (размер дополнительного фрагмента определяется типом делеции). На рисунке 1 приведены примеры детекции делеции EGFR.

Тестирование миссенс-мутации EGFR L858R в 21 экзоне проводится методом аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени с использованием следующих праймеров: 5'-CACCCAGCAGTTTGGCCA-3' (праймер, специфичный для последовательности дикого типа), 5'-CACCCAGCAGTTTGGCCC-3' (праймер, специфичный для последовательности с мутацией), и 5'-GCATGAACTACTTGGAGGAC-3' (общий праймер) (размер ПЦР-продукта - 120 п.о.). ПЦР в режиме реального времени ("real-time PCR") проводится на оборудовании iCycler iQ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Hercules) и состоит из 50 циклов амплификации (денатурация: 15 сек при 95°С; отжиг: 30 сек при 63°С; синтез: 30 сек при 72°С). Смесь для ПЦР (суммарный объем 20 мкл) содержит 1 мкл раствора ДНК (10-100 нг ДНК), 1,0 ед. ДНК-полимеразы, 1-кратный ПЦР-буфер (pH 8.3), 2.5 мМ MgCl 2 , 200 мкМ каждого из нуклеотидтрифосфатов, 0,3 мкМ каждого праймера, SYBR green I в концентрации 0,2х (исходный раствор 10 000х; Molecular Probes). Каждый сет амплификации должен включать контрольный образец (гетерозигота по исследуемой мутации), а также негативный контроль.

Для контроля специфичности фрагментов используется анализ кривых плавления. На рисунке 2 приведены примеры детекции мутации EGFR L858R.

Детекция замены L858R основана на динамике амплификации фрагментов с олигонуклеотидами, специфичными к нормальному и мутантному аллелям, что находит отражение в определенном значении Ct (Cycle threshold, точка пересечения пороговой линии) кривых амплификации, соответствующих нормальному (wt) и мутантному (mt) аллелям. Генотип исследуемого образца устанавливается по формуле: Ct=Ct(mt)-Ct(wt). В случае, если образец гомозиготен по нормальному аллелю, Ct составляет 6 циклов и более, в случае гетерозиготы по мутации Ct l. Промежуточные значения Ct свидетельствуют о неоптимальных условиях ПЦР.

Преимуществами предлагаемого теста являются простота в исполнении, доступность, а также высокая информативность и надежность. При помощи двух несложных методик (обычная ПЦР в сочетании с электрофорезом и аллель-специфическая ПЦР) удается детектировать до 90% встречающихся мутаций EGFR. Использование коротких ПЦР-фрагментов позволяет применять данный тест для поиска мутаций в архивных патоморфологических образцах опухолей легкого.

Формула изобретения

Молекулярно-генетический способ определения чувствительности опухоли у пациентов с раком легкого на терапию гефитинибом, включающий исследование опухолевой ткани, отличающийся тем, что для определения делении в 19 экзоне гена EGFR используют полимеразную цепную реакцию (ПНР) при помощи прямого 5'-CTGTCATAGGGACTCTGGAT-3' и обратного 5'-CAGCAAAGCAGAAACTCACAT-3' праймеров с последующим определением длины амплифицированного фрагмента с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, а для детекции замены L858R в 21 экзоне гена используют аллель-специфическую ПЦР с использованием 5'-CACCCAGCAGTTTGGCCA-3', 5'-CACCCAGCAGTTTGGCCC-3' и 5'-GCATGAACTACTTGGAGGAC-3' праймеров, и при выявлении у пациентов любой из двух типов мутаций в гене EGFR назначают им терапию гефитинибом.

РИСУНКИ