Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
Патент на изобретение №2455703

(19)

RU

(11)

2455703

(13)

C1

(51) МПК G09B23/28 (2006.01)

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ Статус: по данным на 27.08.2012 - действует Пошлина:

(21), (22) Заявка: 2011100352/14, 11.01.2011

(24) Дата начала отсчета срока действия патента:

11.01.2011

Приоритет(ы):

(22) Дата подачи заявки: 11.01.2011

(45) Опубликовано: 10.07.2012

(56) Список документов, цитированных в отчете о

поиске: GÜRER A, et al. Tissue oxidative stress level and remote organ injury in two-hit trauma model of sequential bum injury and peritoneal sepsis are attenuated with N-acetylcysteine treatment in rats. Ulus Travma Acil Cerrahi Derg. 2009 Jan; 15(1):1-6. RU 2394281 C1, 10.07.2010. RU 2353369 C1, 27.04.2009. RU 2232995 C1, 20.07.2004. BY 11160 C1,30.10.2008. US 20070269834 A1, 22.11.2007. CN 201239137 Y, 20.05.2009. ПАСЕЧНИК И.Н. Окислительный стресс как компонент формирования критических состояний у хирургических больных. Автореф. дис. на соиск. учен. степ. д-ра мед. наук, 2004, с.15-25. КРАВЧЕНКО Л.В. Характеристика острого токсического действия четыреххлористого углевода как модели окислительного стресса. - Токсикологический вестник, 2009, 1, с.12-18. SEEHOFER D, et al. Curcumin attenuates oxidative stress and inflammatory response in the early phase after partial hepatectomy with simultaneous intraabdominal infection in rats. J Surg Res. 2010 Mar; 159 (1):497-502.

Адрес для переписки:

350063, г.Краснодар, ул. Седина, 4, КГМУ, гл. патентоведу Т.А. Дорониной

(72) Автор(ы):

Басов Александр Александрович (RU),

Быков Илья Михайлович (RU),

Федосов Сергей Ростиславович (RU),

Малышко Вадим Владимирович (RU)

(73) Патентообладатель(и):

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Кубанский государственный медицинский университет" (ГОУ ВПО КГМУ) (RU),

Басов Александр Александрович (RU),

Быков Илья Михайлович (RU),

Федосов Сергей Ростиславович (RU),

Малышко Вадим Владимирович (RU)

(54) СПОСОБ ХИРУРГИЧЕСКОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА У ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ

(57) Реферат:

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к моделированию окислительного стресса с целью изучения закономерностей его протекания и оценки эффективности антиоксидантной терапии. Моделирование проводят путем создания острого и хронического повреждения организма. После обработки операционного поля спиртовым раствором, под местной анестезией раствором новокаина 0,5% - 20-200 мл, вызывают острый процесс - абсцесс мягких тканей. Для этого производят разрез кожи, рассекают подкожную клетчатку, поверхностную и пояснично-спинную фасции, собственную фасцию мышцы выпрямителя спины. В рану вводят стерильный марлевый шарик, пропитанный суточной культурой патогенного штамма бактерий концентрацией 10 3 /мл-10 8 /мл или пропитанный 1 мл жидкости, полученной растворением 1 грамма фекалий животного в 1-10 мл 0,9% раствора хлорида натрия. Затем рану закрывают путем сшивания краев кожи кисетным швом. Через 72-120 часов с момента проведения имплантации инфицированного инородного тела переводят процесс в хронический - формируют гнойную рану. Для этого снимают кожные швы, удаляют инородное тело и выполняют санацию полости абсцесса. Способ обеспечивает регулируемую по тяжести и длительности, двухфазную по характеру экспериментальную модель окислительного стресса, позволяющую с высокой эффективностью вызывать необходимый дисбаланс между прооксидантной и антиоксидантной системами и имеющую направленную на выздоровление динамику течения. 3 ил., 1 пр.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к моделированию патофизиологического состояния у экспериментальных животных, и может быть использовано для создания окислительного стресса с целью изучения закономерностей его протекания и оценки эффективности антиоксидантной терапии.

Одним из ключевых механизмов, сокращающих продолжительность активной жизнедеятельности человека, принято считать дисбаланс в системах перекисного окисления тканевых субстратов и антиоксидантной защиты в сторону усиления прооксидантного потенциала [Скулачев В.П. Феноптоз: запрограммированная смерть организма // Биохимия. - 1999. - Т.64, 12. - С.1679-1688, Дубинина Е.Е. Роль активных форм кислорода в качестве сигнальных молекул в метаболизме тканей при состояниях окислительного стресса // Вопросы медицинской химии. - 2001. - Т.47, 6. - С.561-581, Владимиров Ю.А. Активные формы кислорода и азота: значение для диагностики профилактики и терапии // Биохимия. - 2004. - Т.69, вып.1. - С.5-7]. Свободные радикалы могут возникать в организме в избыточном количестве вследствие радиоактивного и ультрафиолетового облучения, курения, избыточного потребления жиров и углеводов, при гиподинамии с ее низким уровнем биологического ферментативного окисления, а также под воздействием электромагнитного поля, различных внешних химических веществ, загрязнения воздуха, гипероксии и других факторов. Избыточное количество свободных радикалов наблюдается при снижении поступления антиоксидантов, таких как токоферол, аскорбиновая кислота, флавоноиды, и уменьшении активности антиоксидантных ферментов, что встречается при врожденных энзимопатиях антиоксидантных систем. Важное значение в предупреждении явлений, связанных с нарушением функционирования антиоксидантных систем организма, имеет своевременное и дозированное применение эффективных антиоксидантных средств (витаминов, липоевой кислоты, глутатиона, комбинированных антиоксидантных комплексов) [Балаболкин М.И., Креминская В.М., Клебанова Е.М. Роль окислительного стресса в патогенезе диабетической нейропатии и возможность его коррекции препаратами -липоевой кислоты. // Проблемы эндокринологии. -2005. - Т.51, 3. - С.22-33, Ивашкин В.Т., Драпкина О.М., Шульпекова Ю.О. Диагностика и лечение неалкогольной жировой болезни печени. // Российские медицинские вести. - 2009. - Т.XIV, 3. - С.1-12].

Проведенные за последние два десятилетия исследования убедительно доказали, что смещение баланса в системе антиоксидантно-прооксидантного равновесия сопровождает многие физиологические и большинство патологических процессов. В частности, рядом авторов доказано, что раневой процесс неизбежно связан с активацией прооксидантной системы [Захаров В.В., Мамедов Л.А., Николаев А.В., Гудзь Т.И., Кудряшов Ю.Б., Гончаренко Е.Н., Рагимов Ч.Р., Городовикова Е.Н., Ковш И.В. Состояние анти- и прооксидантных систем при заживлении асептических и инфицированных ран в эксперименте // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1988. - 6. -С.686-689; Grief R., Akca 0., Horn E.P, Kurz A., Sessler D.I. Supplemental perioperative oxygen to reduce the incidence of surgical-wound infection // New England Journal of Medicine. - 2000. - 342. - P.161-167; Kivisaari J., Vihersaari Т., Renvall S., Niinikoski J. Energy metabolism of experimental wounds at various oxygen environments // Annals of Surgery. - 1975. - 181. - P.823-828, Gordillo G.M., Sen C.K. Revisiting the essential role of oxygen in wound healing // Am. J. Surg. - 2003. - 186. - P.259-263].

Известен способ моделирования окислительного стресса [А.А.Овсепян, Н.И.Венедиктова, М.В.Захарченко, Р.Е.Казаков, М.Н.Кондрашова, Е.Г.Литвинова, И.Р.Саакян, Т.В.Сирота, И.Г.Ставровская, П.М.Шварцбург. Антиоксидантное и иммунопротекторное действие экстракта личинок восковой моли при окислительном стрессе у крыс, вызванном потреблением корма, обогащенного железом // Вестник новых медицинских технологий. - 2010. - 1 (электронное издание)], основанного на пищевой перегрузке железом. Длительное потребление животными корма, обогащенного железом в дозах, близких к принятым в ветеринарии, приводит к развитию окислительного стресса, а также нарушениям иммунных и митохондриальных функций. В частности, для выполнения модели на крысах последним вместе с основным рационом перорально дают препарат железа (1 мл/жив/сут).

Указанный способ имеет следующие недостатки:

а) моделирование окислительного стресса занимает длительное время (10-12 недель), что требует дополнительных материальных затрат на содержание животных и выполнение научно-исследовательской работы;

б) формируемая модель носит хронический вялотекущий характер за счет медленного развития окислительного стресса, что не позволяет исследовать процессы при патологических состояниях с острым течением и апробировать эффективность препаратов с антиоксидантными свойствами, применяемых при неотложной терапии;

в) затруднительно регулирование выраженности окислительного стресса в связи с медленным накоплением и выведением провоцирующего агента (железа), что не позволяет прогнозировать степень нарушений окислительного метаболизма в опытной группе на стадии планирования эксперимента;

г) возможны широкая вариабельность получаемых результатов, обусловленная дозированием провоцирующего препарата в связи с тем, что последний вводят вместе с частью рациона, что может приводить к получению большего количества ложных результатов в опытной группе.

Способ недостаточно эффективен из-за указанных недостатков.

За ближайший аналог принят способ [Н.В.Довженко, А.В.Куриленко, Н.Н.Бельчева, В.П.Челомин. Окислительный стресс, индуцируемый кадмием, в тканях двустворчатого моллюска Modiolus Modiolus // Биология моря. - 2005. - т.31 ( 5) - с.358-62], который заключается в том, что используют взрослых особей двустворчатого моллюска Modiolus modiolus, отобранных по размеру (7-10 см), перед опытами выдерживают в аквариумах не менее 7 суток. Затем в аквариумы с экспериментальной группой животных добавляют раствор CdCl 2 до концентрации 100 мкг/л. Воду в аквариумах меняют через сутки. Контрольную группу моллюсков содержали в таких же условиях, что и экспериментальную, но без добавления соли металла. Авторами метода установлено, что в данной модели окислительный стресс индуцируется через дезорганизацию антиоксидантной системы. Снижение способности антиоксидантной системы инактивировать свободные радикалы можно рассматривать как вероятную причину формирования окислительного стресса и накопления продуктов перекисного окисления липидов.

Указанный способ имеет следующие недостатки:

а) формируемая модель носит хронический вялотекущий характер за счет медленного развития окислительного стресса, связанного с предварительным хроническим ингибированием активности антиоксидантных ферментов, что может приводить к получению неоднородной опытной группы по интенсивности свободнорадикального окисления, обусловленного различной степенью ингибирования активности ферментов антирадикальной защиты;

б) используется вид животного, который не размножается в неволе и для проведения опытов должен вылавливаться в естественной среде, что затрудняет циклическое проведение лабораторных экспериментов;

в) затягивается время эксперимента в связи с тем, что требуется выполнение карантинных мероприятий, приводящее к повышению расходов на выполнение научно-исследовательской работы;

г) оценка эффективности способов лечения на данной модели затруднена в связи с единственным способом доставки препаратов - путем их растворения в среде обитания моллюска, такой подход оценки антиоксидантной активности зависит в большей степени от растворимости и биодоступности препарата (косвенные показатели), чем от его прямой антиоксидантной активности.

Способ отличается высокой ресурсоемкостью и низкой эффективностью из-за указанных недостатков.

Задача - разработка способа хирургического моделирования окислительного стресса у лабораторных животных, позволяющего с высокой эффективностью вызывать регулируемый дисбаланс между прооксидантной и антиоксидантной системами, имеющего направленную на выздоровление динамику течения модельной патологии, а также являющегося легковоспроизводимым и несложным в техническом выполнении.

Сущностью изобретения является способ хирургического моделирования окислительного стресса у лабораторных животных, включающий введение животному инициирующего окислительный стресс патогенного фактора, отличающийся тем, что после обработки операционного поля спиртовым раствором, под местной анестезией раствором новокаина 0,5% - 20-200 мл вызывают острый процесс - абсцесс мягких тканей - производят разрез, рассекают подкожную клетчатку, поверхностную и пояснично-спинную фасции, собственную фасцию мышцы выпрямителя спины, в рану вводят стерильный марлевый шарик, пропитанный суточной культурой патогенного штамма концентрацией 10 3 /мл-10 8 /мл или 1 мл жидкости, полученной растворением 1 грамма фекалий животного в 1-10 мл 0,9% раствора хлорида натрия, затем рану закрывают путем сшивания краев кожи кисетным швом, через 72-120 часов с момента проведения имплантации инфицированного инородного тела переводят процесс в хронический - формируют гнойную рану - снимают кожные швы, удаляют инородное тело: и выполняют санацию полости абсцесса.

Техническим результатом изобретения является:

1) обеспечение моделирования окислительного стресса с естественной направленностью на выздоровление, включающего в себя острую и хроническую фазы танатогенеза;

2) возможность регулировать тяжесть развивающегося окислительного стресса от легкой до крайне тяжелой (вплоть до потенциально летальной) с помощью штаммов, отличающихся вирулентностью, и внесением различного количества микробного инфекта;

3) высокая степень воспроизводимости окислительного стресса - возможность одновременного получения модели на многих лабораторных животных, с использованием многих штаммов бактерий;

4) технически несложные манипуляции с лабораторными животными для создания модели окислительного стресса (не требует общего наркоза, реанимационных приспособлений, при элементарном знании основ хирургических манипуляций).

Способ осуществляют следующим образом

Лабораторному животному накануне срезают и выбривают шерсть на средней и нижней третях спины. На следующий день после двукратной обработки операционного поля (выбритой зоны) спиртовым раствором под местной анестезией раствором новокаина 0,5% - 20-200 мл производят разрез длиной 1-5 см в зависимости от размера животного. Рассекают подкожную клетчатку, поверхностную и пояснично-спинную фасции, собственную фасцию мышцы выпрямителя спины. В образовавшуюся рану вводят стерильный марлевый шарик диаметром около 10 мм, пропитанный 1 мл жидкости с суточной культурой патогенного штамма, например, Staphylococcus aureus, концентрация 10 3 /мл-10 8 /мл, или 1 мл жидкости, полученной растворением 1 грамма фекалий животного в 1-10 мл 0,9% раствора хлорида натрия. Затем рану закрывают путем сшивания краев кожи над шариком кисетным швом, то есть проводят генерацию с помощью инородного тела острого гнойного заболевания мягких тканей - абсцесса (острая фаза окислительного стресса). Возможно выполнение нескольких ран на одном животном. Через 72-120 часов с момента проведения имплантации инфицированного инородного тела снимают кожные швы, удаляют инородное тело и выполняют санацию полости абсцесса. В результате происходит трансформация абсцесса в хронический гнойный процесс - гнойную рану (хроническая фаза окислительного стресса), которая может подвергаться лечению путем ежедневных перевязок с использованием асептического материала и мазевых препаратов.

Техническим результатом является регулируемая по тяжести и длительности двухфазная по характеру экспериментальная модель окислительного стресса, позволяющая с высокой эффективностью вызывать необходимый дисбаланс между прооксидантной и антиоксидантной системами и имеющая направленную на выздоровление динамику течения.

Технология способа хирургического моделирования окислительного стресса заключается в том, что у лабораторного животного создают абсцесс мягких тканей (острая фаза окислительного стресса), который после снятия швов и удаления инородного тела переводят в гнойную рану (хроническая фаза окислительного стресса).

Обоснование полученных результатов.

Апробацию модели окислительного стресса производили на лабораторных кроликах (24 штуки), контрольную группу составили сопоставимые по возрасту и весу лабораторные кролики, получающие обычный рацион и не подвергшиеся хирургическому вмешательству (11 штук). Кровь из ушной вены забиралась на 1, 3, 5, 7 и 10 сутки от начала эксперимента. Выраженность окислительного стресса определяли по изменению интенсивности хемилюминесценции и способности окисляться под воздействием постоянного электрического тока.

Антиокислительная активность плазмы крови, измеренная амперометрическим методом [Басов А.А., Федосов С.Р., Канус И.С., Еремина Т.В., Пшидаток Д.В., Малышко В.В. Современные способы стандартизации антиоксидантных лекарственных средств и биологически активных добавок // Современные проблемы науки и образования. - 2006. - 4. - Приложение 1, с.149], с 1 до 5 сутки уменьшалась на 38%, с 5 по 7 сутки стабилизировалась, после 7 суток возрастала на 7%.

Динамику процессов свободнорадикального окисления определяли при помощи лабораторной системы [Павлюченко И.И., Басов А.А., Федосов С.Р. Система лабораторной диагностики окислительного стресса. Патент на полезную модель 54787. - Заявл. 19.01.2006; опубл. 27.07.2006 - Б.21] со специальным программным обеспечением [Павлюченко И.И., Федосов С.Р., Басов А.А. Программа регистрации сигналов хемилюминотестера ЛТ-1. Свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ 2006611562. - Заявл. 2006610783 от 16.03.2006] по максимуму и площади люминол-зависимой Н 2 O 2 -индуцированной хемилюминесценции. В ходе экспериментов установлено, что показатели максимума быстрой вспышки хемилюминесценции плазмы крови характеризовались относительным постоянством: наибольшие значения были отмечены до санации полости абсцесса (повышение на 162%), постоянное их снижение - после санации полости абсцесса (на 3-8% в сутки).

По совокупности оцениваемых показателей можно оценить предлагаемую модель окислительного стресса как функционально пригодную со следующими основными показателями: двухфазность, регулируемость тяжести течения, возможность быстрого создания необходимой рабочей модели.

Пример 1. До введения в эксперимент кролика 3 показатель максимума вспышки хемилюминесценции плазмы крови составил 0,481, показатель площади - 9,830, показатель антиокислительной активности - 2907 единиц.

Было выполнено хирургическое моделирование острой фазы окислительного стресса, первый этап которого продемонстрирован на рисунке 1, где показано как в образовавшуюся в ходе операции рану вводят стерильный марлевый шарик диаметром около 10 мм, пропитанный 1 мл жидкости с суточной культурой патогенного штамма (0 сутки начала эксперимента).

После формирования абсцесса мягких тканей (острая фаза окислительного стресса) на 5 сутки показатель максимума вспышки хемилюминесценции плазмы крови составил 1,175 (+124% к исходным показателям), показатель площади - 55,02 (+460% к исходным показателям), показатель антиокислительной активности - 1591 (- 55% от исходных показателей).

На рисунке 2 показано полное раскрытие абсцесса мягких тканей в стадии разрешения в острую фазу окислительного стресса (5 сутки эксперимента).

К моменту санации гнойного процесса в ране на 12 сутки показатель максимума вспышки хемилюминесценции плазмы крови составил 0,815 (+69% к исходным показателям), показатель площади - 40,82 (+315%), показатель антиокислительной активности -1783 (-39%).

На рисунке 3 показана хроническая фаза окислительного стресса в стадии разрешения - гнойная рана очищается (12 сутки эксперимента).

Данное изобретение позволяет:

- моделировать окислительный стресс у лабораторных животных достаточного размера, любого вида и в необходимых (больших) количествах;

- снизить затраты на введение животного в эксперимент за счет сокращения сроков на формирование патологического процесса с окислительным стрессом в среднем на 35%;

- исследовать особенности течения окислительного стресса по фазам его развития: в острую фазу (до вскрытия абсцесса) и хроническую фазу (после вскрытия абсцесса и формирования гнойной раны), что определяет двухфазный характер экспериментальной модели на одном и том же лабораторном животном, снижая возможность получения ложных результатов при сравнении показателей в процессе дальнейшего анализа и статистической обработки;

- определять эффективность медикаментозного лечения окислительного стресса в зависимости от фазы его развития, что позволит дифференцировать необходимость применения отдельных препаратов с антиоксидантными свойствами в острой или хронической фазе развития окислительного стресса, а следовательно, сделать схемы лечения более рациональными для практического использования.

Практическим результатом предложения является возможность исследовать фазы течения окислительного стресса и эффективность его медикаментозного лечения.

Формула изобретения

Способ хирургического моделирования окислительного стресса у лабораторных животных, включающий введение животному инициирующего окислительный стресс патогенного фактора, отличающийся тем, что после обработки операционного поля спиртовым раствором под местной анестезией раствором новокаина 0,5% - 20-200 мл, вызывают острый процесс - абсцесс мягких тканей, для этого производят разрез, рассекают подкожную клетчатку, поверхностную и пояснично-спинную фасции, собственную фасцию мышцы выпрямителя спины, в рану вводят стерильный марлевый шарик, пропитанный суточной культурой патогенного штамма концентрацией 10 3 /мл - 10 8 /мл или 1 мл жидкости, полученной растворением 1 г фекалий животного в 1-10 мл 0,9%-ного раствора хлорида натрия, затем рану закрывают путем сшивания краев кожи кисетным швом, через 72-120 ч с момента проведения имплантации инфицированного инородного тела переводят процесс в хронический - формируют гнойную рану, для чего снимают кожные швы, удаляют инородное тело и выполняют санацию полости абсцесса.

РИСУНКИ