Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
Патент на изобретение №2457669

(19)

RU

(11)

2457669

(13)

C2

(51) МПК A01G7/00 (2006.01)

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ Статус: по данным на 27.08.2012 - действует Пошлина: учтена за 3 год с 14.11.2012 по 13.11.2013

(21), (22) Заявка: 2010146375/13, 13.11.2010

(24) Дата начала отсчета срока действия патента:

13.11.2010

Приоритет(ы):

(22) Дата подачи заявки: 13.11.2010

(45) Опубликовано: 10.08.2012

(56) Список документов, цитированных в отчете о

поиске: RU 2366153 C1, 10.09.2009. RU 2368127 C1, 27.09.2009. НОВИКОВА Т.И. и др. Сохранение редких и полезных растений в коллекции IN VITRO Центрального сибирского ботанического сада [он-лайн], статья, Вестник ВОГиС, т.12, 4, 2008, [найдено 30.12.2010]. Найдено в Интернет: . EP 1020114 A1, 19.07.2000. WO 2007014974 A1, 08.02.2007.

Адрес для переписки:

142290, Московская обл., г. Пущино, а/я 7, ООО НПП "МИКРОКЛОН", К.А. Шестибратову

(72) Автор(ы):

Шестибратов Константин Александрович (RU),

Салмова Маргарита Анатольевна (RU),

Алпатова Анна Александровна (RU),

Азарова Анна Борисовна (RU)

(73) Патентообладатель(и):

Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственное предприятие "МИКРОКЛОН" (RU)

(54) СПОСОБ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ СИРЕНИ IN VITRO

(57) Реферат:

Изобретение относится к области биотехнологии растений. Способ включает культивирование одноузловых сегментов на среде мультипликации, содержащей макро-, микроэлементы, хелат железа, витамины по прописи Murashige & Skoog (MS) или Quorin & Lepoivre, или Woody Plant Medium, или Driver & Kuniyuki, 30-40 г/л сахарозы, 8-9 г/л агар-агара, 0,2-2,0 мг/л 6-бензиламинопурина и/или 0,2-2,0 мг/л зеатина, или 0,5-1,5 мг/л кинетина и антибиотики (пенициллин (50-1000 мг/л) и/или ампициллин (50-1000 мг/л), и/или цефотаксим (50-1000 мг/л), и/или тикарциллин (10-500 мг/л), и/или стрептомицин (5-500 мг/л), и/или тетрациклин (10-1000 мг/л), и/или ванкомицин (1-100 мг/л)). Полученные пробирочные микрорастения повторно черенкуют на апикальную часть и серединные одноузловые сегменты. Одноузловые сегменты повторно выращивают на среде мультипликации, а апикальные высаживают на среду укоренения. Она содержит 1/2 макроэлементов, полные микроэлементы, хелат железа и витамины по прописи MS, 10-30 г/л сахарозы, 8-9 г/л агар-агара, перечисленные выше антибиотики, 0,1 мг/л индолилмасляной кислоты, а также 0,01 мг/л -нафтилуксусной кислоты или 0,1 мг/л индолилуксусной кислоты. Культивирование проводят на светокультуральных стеллажах при освещении белыми люминесцентными лампами общей интенсивностью 2000-4000 люкс с 16-часовым фотопериодом и температурой 21-25°С. Изобретение позволяет повысить выход нормально сформированных корнесобственных микрорастений, улучшить рост и развитие эксплантов. 1 з.п. ф-лы, 3 ил., 3 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии растений, в частности цветоводству, и может быть использовано для оздоровления и микроразмножения растений сирени in vitro.

Известен способ микроразмножения сирени, включающий черенкование выращиваемых in vitro растений на одноузловые сегменты, посадку черенков на питательную среду для мультипликации, содержащую микроэлементы, хелат железа и витамины по прописи Мурасиге и Скуга (MS) [2], 1,5 концентрацию макроэлементов MS, 35 г/л сахарозы, 8 г/л Difco бакто-агара и 1 мг/л 2-изопентениладенина (2ip), получение пробирочных микрорастений, повторное их черенкование и высадку полученных регенерантов на среду укоренения с ауксинами (R.L.M.Pierik; H.H.M.Steegmans; A.A.Elias; O.T.J.Stiekema; A.J.van der Velde. Vegetative propagation of Syringa vulgaris L. in vitro. // Acta Hort., 226 (1988) 195-204.).

Недостатком данного способа размножения является то, что растения по окончанию этапа размножения получаются утолщенными и укороченными со скрученными листьями вдоль центральной жилки (витрифицированными) (Рисунок 1). Эти микропобеги плохо укореняются (Рисунок 2). Укорененные микрорастения такого качества неспособны адаптироваться к условиям ex vitro.

Технический результат изобретения заключается в повышении выхода нормально сформированных корнесобственных микрорастений, улучшении роста и развитии эксплантов при положительном влиянии оптимальных концентраций минеральных и органических компонентов питательной среды, регуляторов роста растений и антибиотиков.

Сущность изобретения заключается в том, что одноузловые сегменты выращиваемых in vitro растений помещают на среду для мультипликации, содержащую макро-, микроэлементы, хелат железа и витамины по прописи Мурасиге и Скуга (MS) (Murashige Т. & Skoog F., A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. // Physiol. Plant, 15 (1962) 473-497) или или Кворина-Лепорье (1977) (QL) (Quorin M. & Lepoivre P., Elude de milieux adaptes aux cultures in vitro de Prunus. // Acta Hort., 78 (1977) 437-442) или Вуди Плант Медиум (WPM) (Lloyd G. & McCown В., Commercially feasible micropropagation of mountain laurel, Kalmia latifolia, by shoot tip culture. // Comb. Proc. Int. Plant Prop.Soc, 30 (1980) 421-427) или Драйвер и Куниюки (DKW) (Driver J.A., Kuniyuki A.H., In vitro propagation of Paradox walnut rootstock. // Hort. Science, 19 (4), August (1984).), 30-40 г/л сахарозы, 8-9 г/л агар-агара, 0,2-2,0 мг/л 6-бензиламинопурина (БАП) и/или 0,2-2,0 мг/л зеатина (Z) и/или 0,5-1,5 мг/л кинетина (kin) и антибиотики (пенициллин (50-1000 мг/л) и/или ампициллин (50-1000 мг/л) и/или цефотаксим (50-1000 мг/л) и/или тикарциллин (10-500 мг/л) и/или стрептомицин (5-500 мг/л) и/или тетрациклин (10-1000 мг/л) и/или ванкомицин (1-100 мг/л)). Культивирование проводят на светокультуральных стеллажах при освещении белыми люминесцентными лампами общей интенсивностью 2000-4000 люкс при 16-часовом фотопериоде и температуре 21-25°C. Полученные пробирочные микрорастения повторно черенкуют на апикальную часть и серединные одноузловые сегменты. Одноузловые сегменты повторно выращиваются на среде мультипликации, а апикальные высаживают на среду укоренения. Она содержит ½ макроэлементов, полные микроэлементы, хелат железа и витамины по прописи MS, 10-30 г/л сахарозы, 8-9 г/л агар-агара, перечисленные выше антибиотики, 0,1 мг/л ИМК, а также 0,01 мг/л НУК или 0,1 мг/л ИУК.

Добавление сахарозы в питательные среды в концентрациях более 40 г/л снижает интенсивность роста растений и приводит к их витрификации. Добавление в питательные среды регуляторов роста и антибиотиков в предложенных концентрациях наиболее оптимально подходят для роста эксплантов и не оказывают токсического воздействия и эффекта угнетения культуры.

Предлагаемый способ клонального микроразмножения сирени реализуется следующим образом:

1. В нестерильных условиях готовится питательная среда. В нее добавляются необходимые количества макро-, микроэлементов, хелата железа, мио-инозита, объем доводится дистиллированной водой, pH 5,6-5,8. После этого растворяется навеска агара. Среда разливается по колбам, укупоривается фольгой и бумагой, завязывается банковской резинкой. Автоклавирование проводится при 1 ати (=1 изб. атм) в течение 25 минут. В остывшую до 55°C среду в ламинар-боксе добавляются стерильные растворы витаминов, регуляторов роста и антибиотиков. Полученный раствор разливается по стерильным культуральным сосудам.

Все манипуляции с растительным материалом производится в стерильных условиях ламинар-бокса. На всех этапах культивирования число эксплантов в сосудах составляет 15-25 штук.

2. Размножение растительного материала проводят на средах мультипликации, приготовленных по прописи MS или QL или WPM или DKW, дополненных сахарозой (30-40 г/л), агар-агаром (8-9 г/л), БАП и/или зеатином (0,2-2,0 мг/л) или кинетином (0,5-1,5 мг/л) и антибиотиками (пенициллин (50-1000 мг/л) и/или ампициллин (50-1000 мг/л) и/или цефотаксим (50-1000 мг/л) и/или тикарциллин (10-500 мг/л) и/или стрептомицин (5-500 мг/л) и/или тетрациклин (10-1000 мг/л) и/или ванкомицин (1-100 мг/л)). При этом наиболее оптимальными минеральными композициями являются MS и QL. Для цитокининов наиболее удачны концентрации 0,2-1,0 мг/л как для БАП, так и для зеатина, для кинетина - 0,9-1,1 мг/л, а для антибиотиков - пенициллин (50-100 мг/л) и/или ампициллин (50-100 мг/л) и/или цефотаксим (50-200 мг/л) и/или тикарциллин (10-50 мг/л) и/или стрептомицин (5-50 мг/л) и/или тетрациклин (10-100 мг/л) и/или ванкомицин (1-15 мг/л).

3. Полученные микропобеги черенкуются на апикальную часть и серединные одноузловые сегменты. Серединные сегменты повторно переносятся на среды мультипликации. Апикальные части высаживают на среду укоренения. В качестве среды для укоренения используется редуцированная до ½ по макросолям среда MS, дополненная сахарозой (10-30 г/л), агар-агаром (8-9 г/л), антибиотиками (перечень и концентрации указаны в п.2).

Эффективность укоренения оценивается долей укорененных хорошо сформированных микрорастений от числа всех эксплантов, выраженной в процентах.

В таблицах 1-3 представлены результаты исследований по влиянию на укореняемость микропобегов условий предшествующего этапа культивирования, а именно: концентрация цитокининов (БАЛ, зеатин и кинетин), минеральный состав питательной среды (MS, QL, WPM и DKW), наличие антибиотиков в среде. В качестве контрольного варианта использовались среда и концентрация цитокинина (2-изопентениладенин), описанные в прототипе.

Таблица 1

Процент укорененных хорошо сформированных микрорастений на питательных средах с различным содержанием сахарозы в зависимости от концентраций фитогормонов, применяемых на этапе мультипликации (при использовании среды MS)

Среда укоре

нения

Среда мультипликации

Прото

тип

Z

0,5 мг/л

БАП

0,2 мг/л

Z

0,2 мг/л; БАП

0,5 мг/л

Z

0,5 мг/л;

БАП

0,2 мг/л

БАП

1,0 мг/л

БАП

2,0 мг/л

Z

1,0 мг/л

Z

2,0 мг/л

kin

0,5 мг/л

kin

1 мг/л

kin

1,5 мг/л

Примроуз

R 10*

45

60

43

63

50

60

37

95

79

53

57

39

R20*

51

43

40

72

30

63

42

95

77

50

63

43

R30*

47

45

39

57

35

60

40

90

81

46

53

30

Богдан Хмельницкий

R10

54

75

40

90

50

80

61

84

74

54

81

28

R20

51

95

35

93

95

85

57

97

79

62

92

30

R30

62

80

35

89

70

82

63

94

83

63

76

35

Надежда

R10

48

65

50

65

88

73

64

93

83

61

60

58

R20

48

70

50

62

92

76

71

87

85

67

64

61

R30

45

70

45

70

87

74

59

78

79

67

68

66

* - где R - редуцированная по макросолям до ½ среда MS, цифровой индекс после R означает концентрацию сахарозы в среде в граммах на 1 литр (Здесь и далее)

Таблица 2

Процент укорененных хорошо сформированных микрорастений на различных питательных средах с различным содержанием сахарозы в зависимости от типа питательной среды

Среда укоренения

Минеральный состав среды на этапе мультипликации

MS

QL

WPM

DKW

Цитокинин (концентрация 1 мг/л)

Z

БАП

Kin

Z

БАП

Kin

Z

БАП

Kin

Z

БАП

Kin

R10

95

60

57

90

90

65

80

75

69

89

67

65

R20

95

63

63

97

93

71

79

73

70

92

72

64

R30

90

60

53

95

95

70

75

77

68

94

70

65

Результаты представлены на примере сорта Примроуз.

Таблица 3

Процент укорененных хорошо сформированных микрорастений на питательных средах с различным содержанием сахарозы в зависимости от типа питательной среды и наличия антибиотика, применяемых на этапе мультипликации

Среда укоренения

Среда мультипликации

MS; Z 1,0 мг/л

MS; Z 1,0 мг/л; CEF

QL; Z 1,0 мг/л;

QL; Z 1,0 мг/л; CEF

R10

75

80

80

85

R20

70

75

68

81

R30

80

95

84

100

Результаты представлены на примере сорта Президент Греви. Статистически достоверные различия отсутствуют в вариантах питательных сред, где цевотаксим содержится в концентрациях от 50 до 150 мг/л.

При добавлении индивидуальных антибиотиков в среду культивирования в следующих концентрациях: ванкомицин 1-15 мг/л и/или цефотаксим 50-150 мг/л и/или тикарциллин 10-50 мг/л и/или пенициллин 50-100 мг/л и/или ампициллин 50-100 мг/л и/или стрептомицин 5-50 мг/л и/или тетрациклин 10-100 мг/л - статистически достоверных различий не выявлено (данные не представлены).

Добавление НУК или ИУК в заявленных концентрациях не вызывало статистически достоверных различий процента укоренения (данные не представлены).

Использование перечисленных концентраций фитогормонов позволяют увеличить эффективность укоренения микропобегов сирени в культуре in vitro относительно прототипа до 2 раз.

Формула изобретения

1. Способ клонального микроразмножения сирени in vitro, включающий микрочеренкование пробирочных растений на одноузловые сегменты, высадку их на питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы, хелат железа, витамины, сахарозу, агар-агар и цитокинины, получение микропобегов, их черенкование и укоренение на среде, содержащей ауксины, отличающийся тем, что высадку одноузловых сегментов осуществляют на питательную среду Quorin & Lepoivre или Woody Plant Medium, или Driver & Kuniyuki с добавлением 0,2-2,0 мг/л 6-бензиламиноурина, и/или 0,2-2,0 мг/л зеатина, и/или 0,5-1,5 мг/л кинетина, 50-1000 мг/л антибиотика из группы -лактамных антибиотиков, и/или 5-500 мг/л антибиотика из группы аминогликозидов, и/или 10-1000 мг/л антибиотика из группы тетрациклинов, и/или 1-100 мг/л антибиотика из группы циклических гликопептидов, а укоренение осуществляют на среде, содержащей 1/2 концентрации микросолей по прописи Murashige & Skoog с добавлением 50-1000 мг/л антибиотика из группы -лактамных антибиотиков, и/или 5-500 мг/л антибиотика из группы аминогликозидов, и/или 10-1000 мг/л антибиотика из группы тетрациклинов, и/или 1-100 мг/л антибиотика из группы циклических гликопептидов, 0,1 мг/л индолилмасляной кислоты, 0,01 мг/л -нафтилуксусной кислоты или 0,1 мг/л индолилуксусной кислоты.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в питательную среду в качестве антибиотика группы -лактамных антибиотиков добавляют пенициллин, или ампициллин, или цефотаксим, или тикарциллин, в качестве антибиотика из группы аминогликозидов - стрептомицин, в качестве антибиотика из группы тетрациклинов - тетрациклин, в качестве антибиотика из группы циклических гликопептидов - ванкомицин.

РИСУНКИ