Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
Патент на изобретение №2460527

(19)

RU

(11)

2460527

(13)

C2

(51) МПК A61K31/421 (2006.01)

A61K45/00 (2006.01)

A61K31/428 (2006.01)

A61K31/167 (2006.01)

A61P11/00 (2006.01)

A61P11/08 (2006.01)

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ Статус: по данным на 07.09.2012 - нет данных Пошлина:

(21), (22) Заявка: 2009133261/15, 06.02.2008

(24) Дата начала отсчета срока действия патента:

06.02.2008

Приоритет(ы):

(30) Конвенционный приоритет:

07.02.2007 GB 0702385.6

(43) Дата публикации заявки: 20.03.2011

(45) Опубликовано: 10.09.2012

(56) Список документов, цитированных в отчете о

поиске: WO 01/12167 A2, 22.02.2001. RU 2005108050 A, 20.01.2006. US 2002/0052312 A1, 02.05.2002. EP 0307141 A2, 15.03.1989. WO 97/30994 A1, 28.08.1997. WO 2005/115467 A1, 08.12.2005.

(85) Дата начала рассмотрения заявки PCT на национальной фазе: 07.09.2009

(86) Заявка PCT:

GB 2008/000404 20080206

(87) Публикация заявки PCT:

WO 2008/096126 20080814

Адрес для переписки:

191036, Санкт-Петербург, а/я 24, "НЕВИНПАТ", пат.пов. А.В.Поликарпову, рег. 9

(72) Автор(ы):

ФИНЧ Гарри (GB),

УИЛИ Кэтрин (GB),

ДИКСОН Джон (GB)

(73) Патентообладатель(и):

Арджента Дискавери Лтд (GB),

АстраЗенека АБ (SE)

(54) КОМБИНАЦИЯ АНТАГОНИСТА МУСКАРИНОВОГО РЕЦЕПТОРА И АГОНИСТА БЕТА-2-АДРЕНОРЕЦЕПТОРА

(57) Реферат:

Предложены: фармацевтический продукт для лечения респираторного заболевания, содержащий комбинацию первого активного ингредиента, выбранного мускаринового антагониста, и второго активного ингредиента, агониста 2 -адренорецептора, где каждый активный ингредиент приготовлен в виде препарата для ингаляционного введения; соответствующие набор, фармацевтическая композиция, а также применение указанного продукта для изготовления лекарственного средства для лечения респираторного заболевания и соответствующий способ лечения респираторных заболеваний, таких как хроническая обструктивная болезнь легких и астма. Показано усиление ингибирования заявленной комбинацией индуцированного метахолином тонуса колец трахеи in vitro против самостоятельного введения активных ингредиентов, а также усиление ею бронхопротекции (ингибирования бронхостеноза) in vivo. 5 н. и 7 з.п. ф-лы, 9 ил., 3 табл.

Настоящее изобретение относится к комбинациям фармацевтически активных веществ для применения в лечении респираторных заболеваний, особенно хронической обструктивной болезни легких (COPD) и астмы.

Для выполнения жизненно важной функции легких требуется наличие тонкой структуры, выдерживающей колоссальное воздействие окружающей среды, включая загрязняющие вещества, микробы, аллергены и канцерогены. Хозяйские факторы, являющиеся результатом взаимодействий выбора стиля жизни и генетической структуры, оказывают влияние на реакцию на это воздействие. Повреждение или инфекция легких может приводить к широкому ряду заболеваний дыхательной системы (или респираторным заболеваниям). Ряд этих заболеваний имеет огромную важность для здравоохранения. Респираторные заболевания включают острое повреждение легких, острый респираторный дистресс-синдром (ARDS), профессиональное заболевание легких, рак легких, туберкулез, фиброз, пневмокониоз, пневмонию, эмфизему, хроническую обструктивную болезнь легких (COPD) и астму.

Одним из наиболее распространенных респираторных заболеваний является астма. Астму обычно определяют как воспалительное расстройство дыхательных путей с клиническими симптомами, являющимися следствием периодической обструкции дыхательных путей. Она клинически характеризуется пароксизмами стерторозного дыхания, диспноэ и кашлем. Она представляет собой хроническое приводящее к нетрудоспособности расстройство, распространенность и тяжесть которого, по-видимому, возрастают. Подсчитано, что 15% детей и 5% взрослых среди населения развитых стран страдают от астмы. Поэтому терапия должна быть направлена на контролирование симптомов, чтобы сделать возможной нормальную жизнь и одновременно обеспечить фундамент для лечения лежащего в ее основе воспаления.

COPD - термин, относящийся к большой группе легочных заболеваний, которые могут негативно воздействовать на нормальное дыхание. В современных клинических руководствах COPD определяют как болезненное состояние, характеризующееся ограничением воздушного потока, которое не является полностью обратимым. Обычно ограничение воздушного потока является и прогрессирующим, и ассоциировано с аномальным воспалительным ответом легких на вредные частицы и газы. Наиболее существенным, способствующим источником таких частиц и газов, по меньшей мере в западном мире, является табакокурение. У пациентов с COPD присутствует ряд симптомов, включающих кашель, одышку и повышенное выделение мокроты; такие симптомы являются следствием дисфункции ряда клеточных компартментов, включая нейтрофилы, макрофаги и эпителиальные клетки. Двумя наиболее важными состояниями, охватываемыми термином COPD, являются хронический бронхит и эмфизема.

Хронический бронхит представляет собой продолжительное воспаление бронхов, вызывающее увеличенное продуцирование слизи и другие изменения. Симптомами у таких пациентов являются кашель и отхаркивание мокроты. Хронический бронхит может приводить к более частым и тяжелым респираторным инфекциям, сужению и закупорке бронхов, затруднению дыхания и нетрудоспособности.

Эмфизема представляет собой хроническое легочное заболевание, которое воздействует на альвеолы и/или окончания мелких бронхов. Легкое теряет свою эластичность, и поэтому эти участки легких становятся расширенными. Эти расширенные участки удерживают отработанный воздух, и эффективно не заменяют его свежим воздухом. Это приводит к затрудненному дыханию и может приводить к недостатку кислорода, доставляемого в кровь. Доминирующим симптомом у пациентов с эмфиземой является одышка.

Терапевтические агенты, используемые в лечении респираторных заболеваний, включают 2 -адренорецепторные агонисты. Эти агенты (также известные как бета-2( 2 )-агонисты) могут быть использованы для ослабления симптомов респираторных заболеваний путем расслабления гладких мышц бронхов, уменьшения обструкции дыхательных путей, уменьшения гиперинфляции легких и уменьшения одышки. Соединения, которые в настоящее время проходят оценку в качестве вводимых один раз в сутки 2 -агонистов, описаны в Expert Opin. Investig. Drugs 14 (7), 775-783 (2005).

Другим классом терапевтических агентов, используемых в лечении респираторных заболеваний, являются мускариновые антагонисты. Мускариновые рецепторы являются семейством рецепторов, сопряженных с белком G (GPCR), в состав которого входят пять членов семейства M 1 , M 2 , М 3 , М 4 и М 5 . Известно, что три (М 1 , М 2 и М 3 ) из этих пяти мускариновых подтипов оказывают физиологическое влияние на легочную ткань человека. Парасимпатические нервы являются основным путем рефлекторного бронхостеноза в дыхательных путях человека и опосредуют тонус дыхательных путей путем высвобождения ацетилхолина на мускариновых рецепторах. Тонус дыхательных путей увеличен у пациентов с такими респираторными расстройствами, как астма и хроническая обструктивная болезнь легких (COPD), и по этой причине разработаны антагонисты мускариновых рецепторов для применения в лечении заболеваний дыхательных путей. Антагонисты мускариновых рецепторов, в клинической практике часто называемые антихолинергическими средствами, получили широкое признание в качестве терапии первой линии для индивидуумов с COPD, и их применение было широко освещено в литературе (например, Lee et al., Current Opinion in Pharmacology, 2001, 1, 223-229).

Несмотря на то, что лечение 2 -адренорецепторным агонистом или мускариновым антагонистом может приносить существенную пользу, эффективность этих агентов часто далека от удовлетворительной. Более того, принимая во внимание сложность таких респираторных заболеваний, как астма и COPD, представляется маловероятным, чтобы какой-либо один медиатор сам по себе может успешно лечить это заболевание. Следовательно, существует настойчивая медицинская необходимость в новых терапевтических средствах против респираторных заболеваний, таких как COPD и астма, в частности для терапий с возможностью модификации заболевания.

Согласно настоящему изобретению предложен фармацевтический продукт, содержащий, в комбинации, первый активный ингредиент, представляющий собой мускариновый антагонист, выбранный из:

[2-((S)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(3-фенокси-пропил)-аммониевой соли,

[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(3-фенокси-пропил)-аммониевой соли,

[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(2-фенетилокси-этил)-аммониевой соли,

[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-[3-(3,4-дихлор-фенокси)-пропил]диметил-аммониевой соли,

[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-[2-(3,4-дихлор-бензилокси)-этил]-диметил-аммониевой соли и

[2-(4-хлор-бензилокси)-этил]-[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-аммониевой соли;

и второй активный ингредиент, представляющий собой агонист 2 -адренорецептора.

Полезный терапевтический эффект можно наблюдать в лечении респираторных заболеваний, если мускариновый антагонист по настоящему изобретению используют в комбинации с 2 -адренорецепторным агонистом. Полезный эффект можно наблюдать, когда два активных вещества вводят одновременно (либо в виде одного фармацевтического препарата, либо в виде отдельных препаратов), или последовательно, или раздельно в виде отдельных фармацевтических препаратов.

В настоящем изобретении также предложена фармацевтическая композиция, содержащая первый и второй активные ингредиенты в смеси. Кроме того, в настоящем изобретении предложен набор, содержащий препарат первого активного ингредиента и препарат второго активного ингредиента и возможно инструкции для одновременного, последовательного или раздельного введения данных препаратов пациенту, нуждающемуся в этом.

Первым активным ингредиентом в комбинации по настоящему изобретению является мускариновый антагонист, выбранный из:

[2-((S)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(3-фенокси-пропил)-аммониевой соли,

[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(3-фенокси-пропил)-аммониевой соли,

[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(2-фенетилокси-этил)-аммониевой соли,

[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-[3-(3,4-дихлор-фенокси)-пропил]диметил-аммониевой соли,

[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-[2-(3,4-дихлор-бензилокси)-этил]-диметил-аммониевой соли; и

[2-(4-хлор-бензилокси)-этил]-[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-аммониевой соли.

Мускариновые антагонисты по изобретению выбраны из членов нового класса соединений, описанных в WO 2007/017669 (PCT/GB2006/002956), которые демонстрируют высокую активность в отношении рецептора М 3 . Названия мускариновых антагонистов представляют собой названия ИЮПАК, сгенерированные с использованием плагина Autonom 2000 для программы IsisDraw, версия 2.5, которые поставляются MDL Information Systems Inc., на основании структур, приведенных в примерах, и стереохимии, определенной по системе Канна-Ингольда-Прелога. Например, название [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(3-фенокси-пропил)-аммоний, сгенерировано для структуры

Антагонисты мускариновых рецепторов по настоящему изобретению представляют собой аммониевые соли. Анион такой соли может представлять собой любой фармацевтически приемлемый анион моно- или поливалентной (например, бивалентной) кислоты. В одном воплощении данного изобретения анион соли выбран из хлорида, бромида, иодида, сульфата, бензолсульфоната, толуолсульфоната (тозилата), нападизилата (нафталин-1,5-дисульфоната), эдизилата (этан-1,2-дисульфоната), изетионата (2-гидроксиэтилсульфоната), фосфата, ацетата, цитрата, лактата, тартрата, олеината, мезилата (метансульфоната), малеата ((Z)-3-карбокси-акрилата), фумарата, сукцината (3-карбокси-пропионата), малата ((S)-3-карбокси-2-гидрокси-пропионата), ксинафоата и пара-ацетамидобензоата.

В одном воплощении изобретения антагонист мускариновых рецепторов выбран из

[2-((S)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(3-фенокси-пропил)-аммония бромида,

[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(3-фенокси-пропил)-аммония бромида,

[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(3-фенокси-пропил)-аммония тозилата,

[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(3-фенокси-пропил)-аммония малеата,

[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(3-фенокси-пропил)-аммония сукцината,

[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(3-фенокси-пропил)-аммония малата,

[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(3-фенокси-пропил)-аммония нападизилата,

[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(2-фенетилокси-этил)-аммония бромида,

[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(2-фенетилокси-этил)-аммония нападизилата,

[2-(4-хлор-бензилокси)-этил]-[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-аммония мезилата,

[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-[3-(3,4-дихлор-фенокси)-пропил]диметил-аммония бромида,

[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-[3-(3,4-дихлор-фенокси)-пропил]диметил-аммония нападизилата,

[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-[2-(3,4-дихлор-бензилокси)-этил]-диметил-аммония бромида,

[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-[2-(3,4-дихлор-бензилокси)-этил]-диметил-аммония нападизилата,

[2-(4-хлор-бензилокси)-этил]-[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-аммония бромида,

[2-(4-хлор-бензилокси)-этил]-[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-аммония нападизилата и

[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-[2-(3,4-дихлор-бензилокси)-этил]-диметил-аммония мезилата.

В одном воплощении изобретения антагонист мускариновых рецепторов присутствует в форме бромидной или нападизилатной соли.

В одном воплощении изобретения антагонист мускариновых рецепторов присутствует в форме нападизилатной соли. Когда мускариновый антагонист представляет собой нападизилатную соль, соотношение катион/анион может варьироваться и, например, может составлять 1:1 или 2:1 или иметь значение от 1:1 до 2:1.

В одном воплощении изобретения мускариновый антагонист присутствует в форме нападизилатной соли, где соотношение катион/анион в нападизилатной соли составляет 2:1, т.е. геми-нападизилат. Примеры мускариновых антагонистов, соответствующих этому воплощению, включают

[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(3-фенокси-пропил)-аммония геми-нафталин-1,5-дисульфонат,

[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(2-фенетилокси-этил)-аммония геми-нафталин-1,5-дисульфонат,

[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-[3-(3,4-дихлор-фенокси)-пропил]диметил-аммония геми-нафталин-1,5-дисульфонат,

[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-[2-(3,4-дихлор-бензилокси)-этил]-диметил-аммония геми-нафталин-1,5-дисульфонат и

[2-(4-хлор-бензилокси)-этил]-[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-аммония геми-нафталин-1,5-дисульфонат.

В одном воплощении изобретения антагонист мускариновых рецепторов находится в форме бромидной соли.

Вторым активным ингредиентом в комбинации по настоящему изобретению является агонист 2 -адренорецептора. Агонист 2 -адренорецептора по настоящему изобретению может представлять собой любое соединение или вещество, способное стимулировать 2 -рецепторы и действовать в качестве бронходилататора. В контексте настоящего описания, если не указано иное, любая ссылка на агонист 2 -адренорецептора включает активные соли, сольваты или производные, которые могут быть образованы из указанного 2 -адренергического агониста и любых энантиомеров и их смесей. Примерами возможных солей или производных 2 -адренергического агониста являются соли присоединения кислоты, такие как, например, соли соляной кислоты, бромистоводородной кислоты, серной кислоты, фосфорной кислоты, метансульфоновой кислоты, уксусной кислоты, фумаровой кислоты, янтарной кислоты, молочной кислоты, лимонной кислоты, винной кислоты, 1-гидрокси-2-нафталинкарбоновой кислоты, малеиновой кислоты, и фармацевтически приемлемые сложные эфиры (например, C 1 -С 6 алкиловые эфиры). 2 -Агонисты также могут находиться в форме сольватов, например гидратов.

Примеры 2 -адренергического агониста, который может быть использован в фармацевтическом продукте согласно этому воплощению, включают метапротеренол, изопротеренол, изопреналин, альбутерол, сальбутамол (например, в виде сульфата), формотерол (например, в виде фумарата), сальметерол (например, в виде ксинафоата), тербуталин, орципреналин, битолтерол (например, в виде мезилата), пирбутерол или индакатерол. Агонист 2 -адренорецептора по этому воплощению может представлять собой 2 -агонист длительного действия (т.е. 2 -агонист с активностью, которая сохраняется в течение более 24 часов), например сальметерол (например, в виде ксинафоата), формотерол (например в виде фумарата), бамбутерол (например, в виде гидрохлорида), кармотерол (ТА 2005, химически идентифицированный как 2(1Н)-хинолон, 8-гидрокси-5-[1-гидрокси-2-[[2-(4-метокси-фенил)-1-метилэтил]-амино]этил]-моногидрохлорид, [R-(R*,R*)], также идентифицированный под регистрационным номером Chemical Abstract Service (CAS) 137888-11-0 и раскрытый в патенте США 4579854), индакатерол (CAS 312753-06-3; QAB-149), производные форманилида, например 3-(4-{[6-({(2R)-2-[3-(формиламино)-4-гидроксифенил]-2-гидроксиэтил}амино)-гексил]окси}-бутил)-бензолсульфонамид, как раскрыто в WO 2002/76933, производные бензолсульфонамида, например 3-(4-{[6-({(2R)-2-гидрокси-2-[4-гидрокси-3-(гидрокси-метил)фенил]этил}амино)-гексил]окси}-бутил)бензолсульфонамид, как раскрыто в WO 2002/88167, ариланилиновые агонисты рецепторов, которые описаны в WO 2003/042164 и WO 2005/025555, производные индола, которые описаны в WO 2004/032921, в US 2005/222144, соединения GSK 159797, GSK 159802, GSK 597901, GSK 642444 и GSK 678007.

В одном воплощении настоящего изобретения агонистом 2 -адренорецептора является формотерол. Химическим названием формотерола является N-[2-гидрокси-5-[(1)-1-гидрокси-2-[[(1)-2-(4-метоксифенил)-1-метилэтил]амино]этил]-фенил]-формамид. Получение формотерола описано, например, в WO 92/05147. В одном аспекте этого воплощения агонистом 2 -адренорецептора является формотерола фумарат. Очевидно, что изобретение охватывает применение всех оптических изомеров формотерола и их смесей, включая рацематы. Так, например, термин формотерол включает N-[2-гидрокси-5-[(1R)-1-гидрокси-2-[[(1R)-2-(4-метоксифенил)-1-метилэтил]-амино]этил]фенил]-формамид, N-[2-гидрокси-5-[(1S)-1-гидрокси-2-[[(1S)-2-(4-метоксифенил)-1-метилэтил]амино]этил]-фенил]-формамид и смесь таких энантиомеров, включая рацемат.

В одном воплощении изобретения агонист 2 -адренорецептора выбран из:

N-[2-(диэтиламино)этил]-N-(2-{[2-(4-гидрокси-2-оксо-2,3-дигидро-1,3-бензотиазол-7-ил)этил]амино}этил)-3-[2-(1-нафтил)этокси]пропанамида,

N-[2-(диэтиламино)этил]-N-(2-{[2-(4-гидрокси-2-оксо-2,3-дигидро-1,3-бензотиазол-7-ил)этил]амино}этил)-3-[2-(3-хлорфенил)этокси]пропанамида и

7-[(1R)-2-({2-[(3-{[2-(2-хлорфенил)этил]амино}пропил)тио]этил}амино)-1-гидроксиэтил]-4-гидрокси-1,3-бензотиазол-2(3H)-она,

или их фармацевтически приемлемой соли. 2 -Адренорецепторные агонисты согласно этому воплощению могут быть получены, как описано в разделе настоящей заявки Экспериментальное получение. Названия 2 -адренорецепторных агонистов согласно этому воплощению представляют собой названия ИЮПАК, сгенерированные с использованием пакета программ по присвоению названий IUPAK NAME, ACD Labs, версия 8.

В еще одном воплощении изобретения агонист 2 -адренорецептора выбран из:

N-[2-(диэтиламино)этил]-N-(2-{[2-(4-гидрокси-2-оксо-2,3-дигидро-1,3-бензотиазол-7-ил)этил]амино}этил)-3-[2-(1-нафтил)этокси]-пропанамида дигидробромида,

N-[2-(диэтиламино)этил]-N-(2-{[2-(4-гидрокси-2-оксо-2,3-дигидро-1,3-бензотиазол-7-ил)этил]амино}этил)-3-[2-(3-хлорфенил)этокси]-пропанамида дигидробромида и

7-[(1R)-2-({2-[(3-{[2-(2-хлорфенил)этил]амино}пропил)-тио]этил}амино)-1-гидроксиэтил]-4-гидрокси-1,3-бензотиазол-2(3H)-она дигидробромида.

В одном воплощении изобретения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(3-фенокси-пропил)-аммониевая соль, а 2 -адренорецепторным агонистом является формотерол (например, в виде фумарата). В одном аспекте этого воплощения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(3-фенокси-пропил)-аммония бромид. В другом аспекте этого воплощения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(3-фенокси-пропил)-аммония нападизилат (например, геми-нафталин-1,5-дисульфонат).

В одном воплощении изобретения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(2-фенетилокси-этил)-аммониевая соль, а 2 -адренорецепторным агонистом является формотерол (например, в виде фумарата). В одном аспекте этого воплощения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(2-фенетилокси-этил)-аммония бромид. В другом аспекте этого воплощения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(2-фенетилокси-этил)-аммония нападизилат (например, геми-нафталин-1,5-дисульфонат).

В одном воплощении изобретения антагонистом мускариновых рецепторов является [[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-[3-(3,4-дихлор-фенокси)-пропил]диметил-аммониевая соль, а 2 -адренорецепторным агонистом является формотерол (например, в виде фумарата). В одном аспекте этого воплощения антагонистом мускариновых рецепторов является [[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-[3-(3,4-дихлор-фенокси)-пропил]диметил-аммония бромид. В другом аспекте этого воплощения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-[3-(3,4-дихлор-фенокси)-пропил]диметил-аммония нападизилат (например, геми-нафталин-1,5-дисульфонат).

В одном воплощении изобретения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-[2-(3,4-дихлор-бензилокси)-этил]-диметил-аммониевая соль, a 2 -адренорецепторным агонистом является формотерол (например, в виде фумарата). В одном аспекте этого воплощения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-[2-(3,4-дихлор-бензилокси)-этил]-диметил-аммония бромид. В другом аспекте этого воплощения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-[2-(3,4-дихлор-бензилокси)-этил]-диметил-аммония нападизилат (например, геми-нафталин-1,5-дисульфонат).

В одном воплощении изобретения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-(4-хлор-бензилокси)-этил]-[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-аммониевая соль, а 2 -адренорецепторным агонистом является формотерол (например, в виде фумарата). В одном аспекте этого воплощения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-(4-хлор-бензилокси)-этил]-[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-аммония бромид. В другом аспекте этого воплощения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-(4-хлор-бензилокси)-этил]-[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-аммония нападизилат (например, геми-нафталин-1,5-дисульфонат).

В одном воплощении изобретения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(3-фенокси-пропил)-аммониевая соль, а 2 -адренорецепторным агонистом является N-[2-(диэтиламино)этил]-N-(2-{[2-(4-гидрокси-2-оксо-2,3-дигидро-1,3-бензотиазол-7-ил)этил]амино}этил)-3-[2-(1-нафтил)этокси]-пропанамид или его фармацевтически приемлемая соль (например, дигидробромид). В одном аспекте этого воплощения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(3-фенокси-пропил)-аммония бромид. В другом аспекте этого воплощения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(3-фенокси-пропил)-аммония нападизилат (например, геми-нафталин-1,5-дисульфонат).

В одном воплощении изобретения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(2-фенетилокси-этил)-аммониевая соль, а 2 -адренорецепторным агонистом является N-[2-(диэтиламино)этил]-N-(2-{[2-(4-гидрокси-2-оксо-2,3-дигидро-1,3-бензотиазол-7-ил)этил]амино}этил)-3-[2-(1-нафтил)этокси]пропанамид или его фармацевтически приемлемая соль (например, дигидробромид). В одном аспекте этого воплощения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(2-фенетилокси-этил)-аммония бромид. В другом аспекте этого воплощения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(2-фенетилокси-этил)-аммония нападизилат (например, геми-нафталин-1,5-дисульфонат).

В одном воплощении изобретения антагонистом мускариновых рецепторов является [[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-[3-(3,4-дихлор-фенокси)-пропил]диметил-аммониевая соль, а 2 -адренорецепторным агонистом является N-[2-(диэтиламино)этил]-N-(2-{[2-(4-гидрокси-2-оксо-2,3-дигидро-1,3-бензотиазол-7-ил)этил]амино}этил)-3-[2-(1-нафтил)этокси]пропанамид или его фармацевтически приемлемая соль (например, дигидробромид). В одном аспекте этого воплощения антагонистом мускариновых рецепторов является [[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-[3-(3,4-дихлор-фенокси)-пропил]диметил-аммония бромид. В другом аспекте этого воплощения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-[3-(3,4-дихлор-фенокси)-пропил]диметил-аммония нападизилат (например, геми-нафталин-1,5-дисульфонат).

В одном воплощении изобретения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-[2-(3,4-дихлор-бензилокси)-этил]-диметил-аммониевая соль, a 2 -адренорецепторным агонистом является N-[2-(диэтиламино)этил]-N-(2-{[2-(4-гидрокси-2-оксо-2,3-дигидро-1,3-бензотиазол-7-ил)этил]амино}этил)-3-[2-(1-нафтил)этокси]пропанамид или его фармацевтически приемлемая соль (например, дигидробромид). В одном аспекте этого воплощения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-[2-(3,4-дихлор-бензилокси)-этил]-диметил-аммония бромид. В другом аспекте этого воплощения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-[2-(3,4-дихлор-бензилокси)-этил]-диметил-аммония нападизилат (например, геми-нафталин-1,5-дисульфонат).

В одном воплощении изобретения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-(4-хлор-бензилокси)-этил]-[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-аммониевая соль, а 2 -адренорецепторным агонистом является N-[2-(диэтиламино)этил]-N-(2-{[2-(4-гидрокси-2-оксо-2,3-дигидро-1,3-бензотиазол-7-ил)этил]амино}этил)-3-[2-(1-нафтил)этокси]пропанамид или его фармацевтически приемлемая соль (например, дигидробромид). В одном аспекте этого воплощения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-(4-хлор-бензилокси)-этил]-[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-аммония бромид. В другом аспекте этого воплощения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-(4-хлор-бензилокси)-этил]-[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-аммония нападизилат (например, геми-нафталин-1,5-дисульфонат).

В одном воплощении изобретения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(3-фенокси-пропил)-аммониевая соль, а 2 -адренорецепторным агонистом является N-[2-(диэтиламино)этил]-N-(2-{[2-(4-гидрокси-2-оксо-2,3-дигидро-1,3-бензотиазол-7-ил)этил]амино}этил)-3-[2-(3-хлорфенил)этокси]-пропанамид или его фармацевтически приемлемая соль (например, дигидробромид). В одном аспекте этого воплощения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(3-фенокси-пропил)-аммония бромид. В другом аспекте этого воплощения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(3-фенокси-пропил)-аммония нападизилат (например, геми-нафталин-1,5-дисульфонат).

В одном воплощении изобретения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(2-фенетилокси-этил)-аммониевая соль, а 2 -адренорецепторным агонистом является N-[2-(диэтиламино)этил]-N-(2-{[2-(4-гидрокси-2-оксо-2,3-дигидро-1,3-бензотиазол-7-ил)этил]амино}этил)-3-[2-(3-хлорфенил)этокси]пропанамид или его фармацевтически приемлемая соль (например, дигидробромид). В одном аспекте этого воплощения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(2-фенетилокси-этил)-аммония бромид. В другом аспекте этого воплощения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(2-фенетилокси-этил)-аммония нападизилат (например, геми-нафталин-1,5-дисульфонат).

В одном воплощении изобретения антагонистом мускариновых рецепторов является [[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-[3-(3,4-дихлор-фенокси)-пропил]диметил-аммониевая соль, а 2 -адренорецепторным агонистом является N-[2-(иэтиламино)этил]-N-(2-{[2-(4-гидрокси-2-оксо-2,3-дигидро-1,3-бензотиазол-7-ил)этил]амино}этил)-3-[2-(3-хлорфенил)этокси]-пропанамид или его фармацевтически приемлемая соль (например, дигидробромид). В одном аспекте этого воплощения антагонистом мускариновых рецепторов является [[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-[3-(3,4-дихлор-фенокси)-пропил]диметил-аммония бромид. В другом аспекте этого воплощения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-[3-(3,4-дихлор-фенокси)-пропил]диметил-аммония нападизилат (например, геми-нафталин-1,5-дисульфонат).

В одном воплощении изобретения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-[2-(3,4-дихлор-бензилокси)-этил]-диметил-аммониевая соль, а 2 -адренорецепторным агонистом является N-[2-(диэтиламино)этил]-N-(2-{[2-(4-гидрокси-2-оксо-2,3-дигидро-1,3-бензотиазол-7-ил)этил]амино}этил)-3-[2-(3-хлорфенил)этокси]-пропанамид или его фармацевтически приемлемая соль (например дигидробромид). В одном аспекте этого воплощения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-[2-(3,4-дихлор-бензилокси)-этил]-диметил-аммония бромид. В другом аспекте этого воплощения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-[2-(3,4-дихлор-бензилокси)-этил]-диметил-аммония нападизилат (например, геми-нафталин-1,5-дисульфонат).

В одном воплощении изобретения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-(4-хлор-бензилокси)-этил]-[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-аммониевая соль, a 2 -адренорецепторным агонистом является N-[2-(диэтиламино)этил]-N-(2-{[2-(4-гидрокси-2-оксо-2,3-дигидро-1,3-бензотиазол-7-ил)этил]амино}этил)-3-[2-(3-хлорфенил)этокси]-пропанамид или его фармацевтически приемлемая соль (например, дигидробромид). В одном аспекте этого воплощения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-(4-хлор-бензилокси)-этил]-[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-аммония бромид. В другом аспекте этого воплощения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-(4-хлор-бензилокси)-этил]-[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-аммония нападизилат (например, геми-нафталин-1,5-дисульфонат).

В одном воплощении изобретения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(3-фенокси-пропил)-аммониевая соль, а 2 -адренорецепторным агонистом является 7-[(1R)-2-({2-[(3-{[2-(2-хлорфенил)этил]амино}пропил)тио]-этил}амино)-1-гидроксиэтил]-4-гидрокси-1,3-бензотиазол-2(3Н)-он или его фармацевтически приемлемая соль (например, дигидробромид). В одном аспекте этого воплощения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(3-фенокси-пропил)-аммония бромид. В другом аспекте этого воплощения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(3-фенокси-пропил)-аммония нападизилат (например, геми-нафталин-1,5-дисульфонат).

В одном воплощении изобретения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(2-фенетилокси-этил)-аммониевая соль, a 2 -адренорецепторным агонистом является 7-[(1R)-2-({2-[(3-{[2-(2-хлорфенил)этил]амино}пропил)тио]этил}амино)-1-гидроксиэтил]-4-гидрокси-1,3-бензотиазол-2(3Н)-он или его фармацевтически приемлемая соль (например, дигидробромид). В одном аспекте этого воплощения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(2-фенетилокси-этил)-аммония бромид. В другом аспекте этого воплощения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(2-фенетилокси-этил)-аммония нападизилат (например, геми-нафталин-1,5-дисульфонат).

В одном воплощении изобретения антагонистом мускариновых рецепторов является [[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-[3-(3,4-дихлор-фенокси)-пропил]диметил-аммониевая соль, а 2 -адренорецепторным агонистом является 7-[(1R)-2-({2-[(3-{[2-(2-хлорфенил)этил]амино}пропил)-тио]этил}амино)-1-гидроксиэтил]-4-гидрокси-1,3-бензотиазол-2(3Н)-он или его фармацевтически приемлемая соль (например, дигидробромид). В одном аспекте этого воплощения антагонистом мускариновых рецепторов является [[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-[3-(3,4-дихлор-фенокси)-пропил]диметил-аммония бромид. В другом аспекте этого воплощения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-[3-(3,4-дихлор-фенокси)-пропил]диметил-аммония нападизилат (например, геми-нафталин-1,5-дисульфонат).

В одном воплощении изобретения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-[2-(3,4-дихлор-бензилокси)-этил]-диметил-аммониевая соль, а 2 -адренорецепторным агонистом является 7-[(1R)-2-({2-[(3-{[2-(2-хлорфенил)этил]-амино}пропил)тио]этил}амино)-1-гидроксиэтил]-4-гидрокси-1,3-бензотиазол-2(3Н)-он или его фармацевтически приемлемая соль (например, дигидробромид). В одном аспекте этого воплощения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-[2-(3,4-дихлор-бензилокси)-этил]-диметил-аммония бромид. В другом аспекте этого воплощения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-[2-(3,4-дихлор-бензилокси)-этил]-диметил-аммония нападизилат (например, геми-нафталин-1,5-дисульфонат).

В одном воплощении изобретения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-(4-хлор-бензилокси)-этил]-[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-аммониевая соль, а 2 -адренорецепторным агонистом является 7-[(1R)-2-({2-[(3-{[2-(2-хлорфенил)этил]-амино}пропил)тио]этил}амино)-1-гидроксиэтил]-4-гидрокси-1,3-бензотиазол-2(3Н)-он или его фармацевтически приемлемая соль (например, дигидробромид). В одном аспекте этого воплощения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-(4-хлор-бензилокси)-этил]-[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-аммония бромид. В другом аспекте этого воплощения антагонистом мускариновых рецепторов является [2-(4-хлор-бензилокси)-этил]-[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-аммония нападизилат (например, геми-нафталин-1,5-дисульфонат).

Комбинация по настоящему изобретению может обеспечивать полезный терапевтический эффект в лечении респираторных заболеваний. Примеры таких возможных эффектов включают улучшения одного или более следующих параметров: уменьшение притока воспалительных клеток в легкое, умеренные и тяжелые обострения, FEV 1 (объем форсированного выдоха за одну секунду), жизненная емкость (VC), максимальная скорость выдоха (PEF), счет симптомов и качество жизни.

Для лечения респираторных заболеваний мускариновый антагонист (первый активный ингредиент) и агонист 2 -адренорецептора (второй активный ингредиент) по настоящему изобретению могут быть введены одновременно, последовательно или раздельно. Под последовательным понимают то, что активные ингредиенты вводят в любом порядке один непосредственно сразу за другим. Они все же могут оказывать желаемый эффект, если их вводят по отдельности, но в этом способе введения они обычно будут введены с интервалов менее 4 часов, более удобно с интервалом менее двух часов, более удобно с интервалом менее 30 минут и наиболее удобно с интервалом менее 10 минут.

Активные ингредиенты по настоящему изобретению могут быть введены посредством перорального или парентерального (например, внутривенного, подкожного, внутримышечного или внутрисуставного) введения с использованием традиционных лекарственных форм для системного введения, таких как таблетки, капсулы, пилюли, порошки, водные или масляные растворы или суспензии, эмульсии и стерильные инъекционные водные или масляные растворы или суспензии. Активные ингредиенты также могут быть введены местно (в легкое и/или дыхательные пути) в форме растворов, суспензий, аэрозолей и сухих порошковых композиций. Эти лекарственные формы обычно будут включать один или более чем один фармацевтически приемлемый ингредиент, который может быть выбран, например, из адъювантов, носителей, связывающих веществ, смазывающих веществ, разбавителей, стабилизаторов, буферных агентов, эмульгаторов, регулирующих вязкость агентов, поверхностно-активных веществ, консервантов, корригентов и красителей. Как известно специалисту в данной области техники, наиболее приемлемый способ введения активных ингредиентов зависит от множества факторов.

В одном воплощении настоящего изобретения активные ингредиенты вводят посредством отдельных фармацевтических препаратов. Следовательно, в одном аспекте настоящего изобретения предложен набор, содержащий препарат первого активного ингредиента, представляющего собой мускариновый антагонист по настоящему изобретению, и препарат второго активного ингредиента, представляющего собой агонист 2 -адренорецептора, и возможно инструкции для одновременного, последовательного или раздельного введения данных препаратов пациенту, нуждающемуся в этом.

В другом воплощении активные ингредиенты могут быть введены посредством единой фармацевтической композиции. Следовательно, согласно настоящему изобретению также предложена фармацевтическая композиция, содержащая, в смеси, первый активный ингредиент, представляющий собой мускариновый антагонист по настоящему изобретению, и второй активный ингредиент, представляющий собой агонист 2 -адренорецептора.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть изготовлены путем смешивания мускаринового антагониста (первый активный ингредиент) с агонистом 2 -адренорецептора (второй активный ингредиент) и фармацевтически приемлемым адъювантом, разбавителем или носителем. Следовательно, в еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ изготовления фармацевтической композиции, включающий смешивание мускаринового антагониста по настоящему изобретению с агонистом 2 -адренорецептора и фармацевтически приемлемым адъювантом, разбавителем или носителем.

Очевидно, что терапевтическая доза каждого активного ингредиента, вводимая в соответствии с настоящим изобретением, будет варьироваться в зависимости от конкретного используемого активного ингредиента, способа, которым следует вводить активный ингредиент, и подлежащего лечению состояния или расстройства.

В одном воплощении настоящего изобретения мускариновый антагонист по настоящему изобретению вводят посредством ингаляции. При введении посредством ингаляции доза мускаринового антагониста по настоящему изобретению обычно будет находиться в диапазоне от 0,1 микрограмма (мкг) до 5000 мкг, от 0,1 до 1000 мкг, от 0,1 до 500 мкг, от 0,1 до 100 мкг, от 0,1 до 50 мкг, от 0,1 до 5 мкг, от 5 до 5000 мкг, от 5 до 1000 мкг, от 5 до 500 мкг, от 5 до 100 мкг, от 5 до 50 мкг, от 5 до 10 мкг, от 10 до 5000 мкг, от 10 до 1000 мкг, от 10 до 500 мкг, от 10 до 100 мкг, от 10 до 50 мкг, от 20 до 5000 мкг, от 20 до 1000 мкг, от 20 до 500 мкг, от 20 до 100 мкг, от 20 до 50 мкг, от 50 до 5000 мкг, от 50 до 1000 мкг, от 50 до 500 мкг, от 50 до 100 мкг, от 100 до 5000 мкг, от 100 до 1000 мкг или от 100 до 500 мкг. Обычно дозу будут вводить 1-4 раза в сутки, удобно - один или два раза в сутки, и наиболее удобно - один раз в сутки.

В одном воплощении настоящего изобретения агонист 2 -адренорецептора может быть удобно введен посредством ингаляции. При введении посредством ингаляции доза 2 -агониста обычно будет находиться в диапазоне от 0,1 до 50 мкг, от 0,1 до 40 мкг, от 0,1 до 30 мкг, от 0,1 до 20 мкг, от 0,1 до 10 мкг, от 5 до 10 мкг, от 5 до 50 мкг, от 5 до 40 мкг, от 5 до 30 мкг, от 5 до 20 мкг, от 5 до 10 мкг, от 10 до 50 мкг, от 10 до 40 мкг, от 10 до 30 мкг или от 10 до 20 мкг. Обычно дозу будут вводить 1-4 раза в сутки, удобно - один или два раза в сутки, и наиболее удобно - один раз в сутки.

В одном воплощении в настоящем изобретении предложен фармацевтический продукт, содержащий, в комбинации, первый активный ингредиент, представляющий собой мускариновый антагонист по настоящему изобретению, и второй активный ингредиент, представляющий собой агонист 2 -адренорецептора, при этом каждый активный ингредиент приготовлен в виде препарата для ингаляционного введения.

Активные ингредиенты по настоящему изобретению удобно вводить посредством ингаляции (например, местно в легкое и/или в дыхательные пути) в форме растворов, суспензий, аэрозолей и сухих порошковых композиций. Например, дозирующие ингаляторные устройства можно использовать для введения активных ингредиентов, диспергированных в подходящем пропелленте и с дополнительными эксципиентами, такими так этанол, поверхностно-активные вещества, смазывающие вещества или стабилизаторы, или без них. Подходящие пропелленты включают углеводородные, хлорфторуглеродные и гидрофторалкановые (например, гептафторалкановые (HFA)) пропелленты или смеси любых подобных пропеллентов. Предпочтительными пропеллентами являются Р134а и Р227, каждый из которых можно использовать по отдельности или в комбинации с другими пропеллентами и/или поверхностно-активным веществом и/или другими эксципиентами. Также можно использовать распыляемые водные суспензии или, предпочтительно, растворы, после корректировки до подходящей величины pH и/или тоничности или без нее, либо в виде однодозовых, либо в виде многодозовых композиций.

Сухие порошковые композиции и находящиеся под давлением HFA аэрозоли активных ингредиентов можно вводить посредством пероральной или назальной ингаляции. Для ингаляции желательно, чтобы соединение было тонкоизмельченным. Тонкоизмельченное соединение предпочтительно имеет средний массовый диаметр менее 10 мкм и может быть суспендировано в пропеллентной смеси с помощью диспергирующего вещества, например жирной С 8 -С 20 -кислоты или ее соли (например, олеиновой кислоты), соль желчных кислот, фосфолипида, алкилсахарида, перфторированного или полиэтоксилированного поверхностно-активного вещества, либо другого фармацевтически приемлемого диспергирующего вещества.

Одна из возможностей заключается в смешивании тонкоизмельченного соединения по изобретению с веществом-носителем, например моно-, ди- или полисахаридом, сахарным спиртом или другим полиолом. Подходящими носителями являются сахара, например лактоза, глюкоза, раффиноза, мелезитоза, лактитол, мальтитол, трегалоза, сахароза, маннитол; и крахмал. Альтернативно, тонкоизмельченное соединение может иметь покрытие из другого вещества. Кроме того, порошковую смесь можно распределить в твердые желатиновые капсулы, каждая из которых содержит желаемую дозу активного соединения.

Другая возможность заключается в переработке тонкоизмельченного порошка в сферы, которые разрушаются в процессе ингаляции. Таким сферонизированным порошком можно заполнить резервуар для лекарственного средства многодозового ингалятора, например известного как Turbuhaler ® , в котором дозатор отмеряют нужную дозу, которая затем вдыхается пациентом. С помощью этой системы активный ингредиент, с веществом-носителем или без него, доставляется пациенту.

Комбинация по настоящему изобретению полезна в лечении или предупреждении таких расстройств дыхательных путей, как хроническая обструктивная болезнь легких (COPD), хронический бронхит всех типов (включая ассоциированную с ним одышку), астма (аллергическая и неаллергическая; "синдром стерторозного дыхания у младенцев"), острый респираторный дистресс-синдром взрослых (ARDS), хроническая обструкция дыхательных путей, бронхиальная гиперактивность, фиброз легких, эмфизема легких и аллергический ринит, обострение гиперреактивности дыхательных путей после другой лекарственной терапии, в частности другой ингаляционной лекарственной терапии, или пневмокониоз (например, алюминоз, антракоз, асбестоз, халикоз, птилоз, сидероз, силикоз, табакоз и биссиноз).

Сухие порошковые ингаляторы можно использовать для введения активных ингредиентов, самих по себе или в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, в последнем случае либо в виде тонкоизмельченного порошка, либо в виде упорядоченной смеси. Сухой порошковый ингалятор может быть однодозовым или многодозовым и в нем может использоваться сухой порошок или содержащая порошок капсула.

Дозирующий ингалятор, небулайзер и сухие порошковые ингаляторные устройства общеизвестны, и многие из таких устройств доступны.

В настоящем изобретении также предложен фармацевтический продукт, набор или фармацевтическая композиция по изобретению для одновременного, последовательного или раздельного применения в терапии.

В настоящем изобретении также предложено применение фармацевтического продукта, набора или фармацевтической композиции по изобретению в лечении респираторного заболевания, в частности хронической обструктивной болезни легких или астмы.

В настоящем изобретении также предложено применение фармацевтического продукта, набора или фармацевтической композиции по изобретению в изготовлении лекарственного средства для лечения респираторного заболевания, в частности хронической обструктивной болезни легких или астмы.

В настоящем изобретению также предложен способ лечения респираторного заболевания, включающий одновременное, последовательное или раздельное введение:

(а) (терапевтически эффективной) дозы первого активного ингредиента, представляющего собой мускариновый антагонист по настоящему изобретению; и

(б) (терапевтически эффективной) дозы второго активного ингредиента, представляющего собой агонист 2 -адренорецептора;

пациенту, нуждающемуся в этом.

В контексте настоящего описания термин "терапия" также включает "профилактику", если нет конкретных указаний на обратное. Термины "терапевтический" и "терапевтически" следует истолковывать соответственно. Ожидается, что профилактика особенно важна в отношении лечения субъектов, которые пострадали от предшествующего эпизода рассматриваемого заболевания или расстройства, либо которые иным образом считаются имеющими увеличенный риск рассматриваемого заболевания или расстройства. Как правило, субъекты с риском развития конкретного заболевания или состояния включают субъектов, имеющих семейную историю данного заболевания или состояния, или субъектов, которые были идентифицированы путем генетического тестирования или скрининга как особенно чувствительные к развитию этого заболевания или расстройства.

Фармацевтический продукт, набор или композиция по настоящему изобретению возможно могут содержать третий активный ингредиент, представляющий собой вещество, подходящее для применения в лечении респираторных заболеваний. Примеры третьего активного ингредиента, который может быть включен в настоящее изобретение, включают

- ингибитор фосфодиэстераз,

- модулятор функции хемокиновых рецепторов,

- ингибитор функции киназ,

- ингибитор протеаз,

- стероидный агонист глюкокортикоидных рецепторов и

- нестероидный агонист глюкокортикоидных рецепторов.

Примеры ингибитора фосфодиэстераз, которые могут быть использованы в качестве третьего активного ингредиента согласно этому воплощению включают ингибитор PDE4, такой как ингибитор изоформы PDE4D, ингибитор PDE3 и ингибитор PDE5. Примеры включают соединения:

(Z)-3-(3,5-дихлор-4-пиридил)-2-[4-(2-инданилокси-5-метокси-2-пиридил]-пропеннитрил,

N-[9-амино-4-оксо-1-фенил-3,4,6,7-тетрагидропирроло[3,2,1-jk][1,4]бензодиазепин-3(R)-ил]пиридин-3-карбоксамид (CI-1044);

3-(бензилокси)-1-(4-фторбензил)-N-[3-(метилсульфонил)фенил]-1Н-индол-2-карбоксамид,

(1S-экзо)-5-[3-(бицикло[2.2.1]гепт-2-илокси)-4-метоксифенил]тетрагидро-2(1Н)-пиримидинон (атизорам),

N-(3,5-дихлор-4-пиридинил)-2-[1-(4-фторбензил)-5-гидрокси-1Н-индол-3-ил]-2-оксоацетамид (AWD-12-281),

-[3-(циклопентилокси)-4-метоксифенил]-1,3-дигидро-1,3-диоксо-2Н-изоиндол-2-пропанамид (CDC-801),

N-[9-метил-4-оксо-1-фенил-3,4,6,7-тетрагидропирроло[3,2,1-jk][1,4]бензодиазепин-3(R)-ил]пиридин-4-карбоксамид (СI-1018),

цис-[4-циано-4-(3-циклопентилокси-4-метоксифенил)циклогексан-1-карбоновую кислоту (циломиласт),

8-амино-1,3-бис(циклопропилметил)ксантин (Ципамфиллин),

N-(2,5-дихлор-3-пиридинил)-8-метокси-5-хинолинкарбоксамид (D-4418),

5-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксибензилиден)-2-иминотиазолидин-4-он (Дарбуфелон),

2-метил-1-[2-(1-метилэтил)пиразоло[1,5-а]пиридин-3-ил]-1-пропанон (Ибудиласт),

2-(2,4-дихлорфенилкарбонил)-3-уреидобензофуран-6-ил-метансульфонат (Лиримиласт),

(-)-(R)-5-(4-метокси-3-пропоксифенил)-5-метилоксазолидин-2-он (Мезопрам),

(-)-цис-9-этокси-8-метокси-2-метил-1,2,3,4,4а,10b-гексагидро-6-(4-диизопропиламинокарбонилфенил)-бензо[с][1,6]нафтиридин (Пумафентрин),

3-(циклопропилметокси)-N-(3,5-дихлор-4-пиридил)-4-(дифторметокси)-бензамид (Рофлумиласт),

N-оксид Рофлумиласта,

5,6-диэтоксибензо[b]тиофен-2-карбоновую кислоту (Тибенеласт),

2,3,6,7-тетрагидро-2-(мезитилимино)-9,10-диметокси-3-метил-4Н-пиримидо[6,1-а]изохинолин-4-он (треквинзин) и

3-[[3-(циклопентилокси)-4-метоксифенил]-метил]-N-этил-8-(1-метилэтил)-3Н-пурин-6-амин (V-11294A).

Примеры модулятора функции хемокиновых рецепторов, которые можно использовать в качестве третьего активного ингредиента согласно этому воплощению, включают антагонист рецептора CCR3, антагонист рецептора CCR4, антагонист рецептора CCR5 и антагонист рецептора CCR8.

Примеры ингибитора функции киназ, которые можно использовать в качестве третьего активного ингредиента согласно этому воплощению включают ингибитор киназы р38 и ингибитор 1КК (ингибитор NF(нуклеарный фактор)-кВ-киназы).

Примеры ингибитора протеаз, которые можно использовать в качестве третьего активного ингредиента согласно этому воплощению, включают ингибитор эластазы нейтрофилов или ингибитор ММР12 (матриксной металлопротеиназы-12).

Примеры стероидного агониста глюкокортикоидных рецепторов, которые можно использовать в качестве третьего активного ингредиента согласно этому воплощению включают будесонид, флутиказон (например, в виде пропионатного сложного эфира), мометазон (например, в виде фуроатного сложного эфира), беклометазон (например, в виде 17-пропионатного или 17,21-дипропионатного сложных эфиров), циклесонид, лотепреднол (как, например, этабонат), этипреднол (как, например, диклоацетат), триамцинолон (например, в виде ацетонида), флунизолид, зотиказон, флумоксонид, рофлепонид, бутиксокорт (например, в виде пропионатного сложного эфира), преднизолон, преднизон, типредан, сложные эфиры стероидов, например S-фторметиловый эфир 6 ,9 -дифтор-17 -[(2-фуранилкарбонил)окси]-11 -гидрокси-16 -метил-3-оксо-андроста-1,4-диен-17 -карботиокислоты, S-(2-оксо-тетрагидро-фуран-3S-ил)овый эфир 6 ,9 -дифтор-11 -гидрокси-16 -метил-3-оксо-17 -пропионилокси-андроста-1,4-диен-17 -карботиокислоты и S-фторметиловый эфир 6 ,9 -дифтор-11 -гидрокси-16 -метил-17 -[(4-метил-1,3-тиазол-5-карбонил)окси]-3-оксо-андроста-1,4-диен-17 -карботиокислоты, сложные эфиры стероидов согласно DE 4129535, стероиды согласно WO 2002/00679, WO 2005/041980 или стероиды GSK 870086, GSK 685698 и GSK 799943.

Примеры модулятора нестероидного агониста глюкокортикоидных рецепторов, которые можно использовать в качестве третьего активного ингредиента согласно этому воплощению включают описанные в WO 2006/046916.

Изобретение проиллюстрировано следующими неограничивающими Примерами. В Примерах представлены следующие фигуры.

Фиг.1. Порошковая рентгеновская дифрактограмма мускаринового антагониста 2 (МА2) [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(3-фенокси-пропил)-аммония бромида: кристаллическая форма А.

Фиг.2. Порошковая рентгеновская дифрактограмма мускаринового антагониста 7 (МА7) [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(3-фенокси-пропил)-аммония геми-нафталин-1,5-дисульфоната: кристаллическая форма 1.

Фиг.3. Порошковая рентгеновская дифрактограмма мускаринового антагониста 7 (МА7): кристаллическая форма 2.

Фиг.4. Порошковая рентгеновская дифрактограмма мускаринового антагониста 7 (МА7): кристаллическая форма 3.

Фиг.5. Порошковая рентгеновская дифрактограмма мускаринового антагониста 11 (МА11) [2-(4-хлор-бензилокси)-этил]-[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-аммония геми-нафталин-1,5-дисульфоната: кристаллическая форма А.

Фиг.6. % ингибирования 1 мкМ метахолин-индуцированного тонуса формотеролом (1 нМ), Соединением А (МА2) (10 нМ) и Соединением А (10 нМ) в присутствии формотерола (1 нМ) в трахее морских свинок in vitro.

Фиг.7. % ингибирования 1 мкМ метахолин-индуцированного тонуса формотеролом (1 нМ), Соединением В (МА11) (10 нМ) и Соединением В (10 нМ) в присутствии формотерола (1 нМ) в трахее морских свинок in vitro.

Фиг.8. Метахолин-индуцированный бронхостеноз у морской свинки: 3 мкг/кг и 27 мкг/кг Соединения А (ВА1), 0,2 мкг/кг Соединения Z (МА2) или комбинация 3 мкг/кг Соединения А и 0,2 мкг/кг Соединения Z.

Фиг.9. Метахолин-индуцированный бронхостеноз у морской свинки: 1 мкг/кг и 27 мкг/кг Соединения А (ВА1), 0,01 мкг/кг Соединения Y (МА11) или комбинация 1 мкг/кг Соединения А и 0,01 мкг/кг Соединения Y.

Получение мускариновых антагонистов

Мускариновые антагонисты по настоящему изобретению могут быть получены следующим образом. Соли, альтернативные описанным в данном изобретении, можно получить посредством традиционной химии, используя способы, аналогичные описанным.

Общие экспериментальные подробности получения мускариновых антагонистов

Если не указано иное, то при получении мускариновых антагонистов использовали следующие общие условия.

Все взаимодействия выполняли в атмосфере азота, если не указано иное.

Спектры NMR получали на спектрометре Varian Unity Inova 400 с 5 мм датчиком для инверсного детектирования тройного резонанса, работающим при 400 МГц или на спектрометре Bruker Avance DRX 400 с 5 мм датчиком для инверсного детектирования тройного резонанса типа ТХ1, работающим при 400 МГц или на спектрометре Bruker Avance DPX 300 со стандартным 5 мм датчиком двухчастотным датчиком, работающим при 300 МГц. Сдвиги приведены в м.д. (миллионных долях) относительно тетраметилсилана.

Когда продукты очищали колоночной хроматографией, «флэш-силикагель» относится к силикагелю для хроматографии, 0,035-0,070 мм (220-440 меш) (например, силикагель 60 Fluka), и приложенное давление азота вплоть до 10 фунт на кв. дюйм (6,895×10 4 Па) ускоряло элюирование колонки. Когда использовали тонкослойную хроматографию (TLC), этот термин относится к TLC на силикагеле с использованием пластинок, обычно 3×6 см силикагеля на пластинах из алюминиевой фольги с флюоресцентным индикатором (254 нм), (например, Fluka 60778). Все растворители и имеющиеся в продаже реагенты использовали такими, как они были получены.

Все соединения, содержащие основный(е) центр(ы), который очищали с помощью HPLC (высокоэффективной жидкостной хроматографии), получали в виде соли TFA (трифторуксусной кислоты), если не указано иное.

Условия проведения препаративной HPLC

Колонка с обращенной фазой С18 (колонка с внутренним диаметром (вн. д.) 100×22,5 мм Genesis, с размером частиц 7 мкм). УФ-детектирование при 230 нм.

Системы LC/MS

Используемые системы жидкостной хроматографии/масс-спектроскопии (LC/MS):

LC-MS способ 1

Масс-спектрометр Waters Platfom с колонкой с обращенной фазой С18 (100×3,0 мм Higgins Clipeus с размером частиц 5 мкм), элюирование А: вода + 0,1% муравьиной кислоты; Б: ацетонитрил + 0,1% муравьиной кислоты. Градиент:

Градиент - Время

поток, мл/мин





0,00

1,0

95

5

1,00

1,0

95

5

15,00

1,0

5

95

20,00

1,0

5

95

22,00

1,0

95

5

25,00

1,0

95

5

Определение - MS, ELS (испарительное светорассеяние), УФ (100 мкл расщепление в MS с последовательно встроенным УФ-детектором при 254 нм).

Способ ионизации при MS - электрораспыление (положительный ион).

LC-MS Способ 2

Waters Micromass ZQ с колонкой с обращенной фазой С18 основе (30×4,6 мм Phenomenex Luna, размер частиц 3 мкм), элюирование А: вода + 0,1% муравьиной кислоты; Б: ацетонитрил + 0,1% муравьиной кислоты. Градиент:

Градиент - Время

поток, мл/мин





0,00

2,0

95

5

0,50

2,0

95

5

4,50

2,0

5

95

5,50

2,0

5

95

6,00

2,0

95

5

Определение - MS, ELS, УФ (100 мкл расщепление в MS с последовательно встроенным УФ-детектором).

Способ ионизации MS - электрораспыление (положительный и отрицательный ион).

LC-MS Способ 3

Waters Micromass ZQ с колонкой с обращенной фазой С18 основе (30×4,6 мм Phenomenex Luna, размер частиц 3 мкм), элюирование А: вода + 0,1% муравьиной кислоты; Б: ацетонитрил + 0,1% муравьиной кислоты. Градиент:

Градиент - Время

поток, мл/мин





0,00

2,0

95

5

0,50

2,0

95

5

4,50

2,0

5

95

5,50

2,0

5

95

6,00

2,0

95

5

Определение - MS, ELS, УФ (100 мкл расщепление в MS с последовательно встроенным УФ-детектором).

Способ ионизации MS - электрораспыление (положительный и отрицательный ион).

LC-MS Способ 4

Waters Micromass ZQ с колонкой с обращенной фазой С18 (100×3,0 мм Higgins Clipeus с размером частиц 5 мкм), элюирование А: вода + 0,1% муравьиной кислоты; Б: ацетонитрил + 0,1% муравьиной кислоты. Градиент:

Градиент - Время

поток, мл/мин





0,00

1,0

95

5

1,00

1,0

95

5

15,00

1,0

5

95

20,00

1,0

5

95

22,00

1,0

95

5

25,00

1,0

95

5

Определение - MS, ELS, УФ (100 мкл расщепление в MS с последовательно встроенным УФ-детектором при 254 нм).

Способ ионизации при MS - электрораспыление (положительный ион).

Порошковые рентгеновские дифрактограммы (XRPD) собирали на приборе Philips X-Pert MPD с высоким разрешением в режиме отражения и в конфигурации - с диапазоном сканирования 2 от 2° до 40° и 100-секундной выдержкой на один шаг 0,03°. Рентгеновские лучи генерировали с помощью медной острофокусной трубки, работающей на 45 кВ и 40 мА. Длины волн прямого пучка рентгеновского излучения составляли 1,5406 Å (K 1 ), так как использовали монохроматор. Данные собирали на держателях с нулевым фоном, куда помещали ~2 мг соединения. Держатель (предоставленный PANalytical) был изготовлен из монокристалла кремния, который был разрезан вдоль нерассеивающей плоскости в диапазоне от 2° до 40° 2 и затем отполирован на оптически плоской финишной поверхности. Рентгеновские лучи, присущие такой поверхности, гасились экстинкцией Брэгга. Необработанные данные сохраняли в электронном виде и оценку выполняли на необработанных или сглаженных дифрактограммах. XRPD снимали при температуре и относительной влажности окружающей среды.

- Термограммы дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC) измеряли, используя дифференциальный сканирующий калориметр ТА Q1000 с алюминиевыми поддонами и перфорированными крышками. Массы образцов варьировались от 1 до 5 мг. Процедуру выполняли в токе газообразного азота (50 мл/мин) и исследования проводили для температуры в диапазоне от 25 до 300°С при постоянной скорости увеличения температуры 10°С в минуту.

- Термограммы термогравиметрического анализа (TGA) измеряли, используя термогравиметрический анализатор ТА Q500 с платиновыми поддонами. Массы образцов варьировались в диапазоне от 2 до 15 мг. Процедуру выполняли в токе газообразного азота (60 мл/мин) и исследования проводили для температуры в диапазоне от 25 до 300°С при постоянной скорости увеличения температуры 10°С в минуту.

Профили GVS (гравиметрической сорбции пара) измеряли, используя прибор для динамической сорбции пара DVS-1. Твердый образец массой приблизительно 1-5 мг помещали в стеклянный сосуд, и регистрировали массу образца, на протяжении двуцикличного пошагового метода (относительная влажность (RH) от 40 до 90 до 0 до 90 до 0%, с шагом 10% RH). GVS-профили регистрировали при температуре окружающей среды.

Сокращения, использованные в Экспериментальном разделе:

водн. = водный

DCM = дихлорметан

DMF = диметилформамид

EtOAc = этилацетат

EtOH = этанол

GVS = гравиметрическая сорбция пара

МеОН = метанол

КТ = комнатная температура

Rt = время удерживания

THF = тетрагидрофуран

насыщ. = насыщенный.

Мускариновым антагонистам и промежуточным соединениям, используемым для их получения, описанным в данном изобретении, присвоены названия в соответствии с номенклатурой ИЮПАК, сгенерированные с использованием плагина Autonom 2000 для программы IsisDraw, версия 2.5, которая поставляется MDL Information Systems Inc.

Промежуточные соединения, используемые в получении мускариновых антагонистов

Следующие промежуточные соединения 1-16, используемые в получении мускариновых антагонистов, были получены следующим образом.

Промежуточное соединение 1: 2-Оксо-2-фенил-N-проп-2-инил-ацетамид

Оксалилхлорид (6,1 г; 48 ммоль) добавляли к раствору фенилглиоксиловой кислоты (6,0 г; 40 ммоль) и 3 капель DMF в безводном DCM (50 мл). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 3 ч, затем растворитель удаляли. Остаток переносили в безводный DCM (50 мл), и раствор охлаждали до 0°С. Осторожно в течение 10 мин добавляли смесь пропаргиламина (2,2 г; 40 ммоль) и триэтиламина (4,05 г; 40 ммоль), затем смесь оставляли нагреваться до КТ. Перемешивание продолжали в течение 2,5 ч, затем добавляли воду (10 мл). Смесь промывали 1 М HCl, насыщенным гидрокарбонатом натрия (водн.), затем рассолом. Органическую фазу затем сушили (Na 2 SO 4 ), и растворитель удаляли. Остаток кристаллизовали из циклогексана с получением продукта в виде светло-коричневого твердого вещества.

Выход: 5,75 г; 76%. LC-MS (Метод 3): Rt (время удерживания) 2,47 мин; m/z 188 [MH + ].

Промежуточное соединение 2: (5-метил-оксазол-2-ил)-фенил-метанон

Метансульфоновую кислоту (10 г; 104 ммоль) по каплям добавляли к раствору 2-оксо-2-фенил-N-проп-2-инил-ацетамида (Промежуточное соединение 1) (2,4 г; 12,83 ммоль) в 1,4-диоксане (20 мл). Полученный раствор нагревали при 90°C в течение 66 ч. Реакционную смесь охлаждали, и растворитель удаляли. Темный остаток разделяли между DCM и водой. DCM-фракцию промывали 1 М HCl (2×), насыщенным раствором гидрокарбоната натрия (водн., 2×), затем рассолом. Раствор сушили (Na 2 SO 4 ), и растворитель удаляли, получая неочищенный продукт. Очистку осуществляли колоночной хроматографией, элюируя смесью циклогексан/EtOAc (4:1). Это позволило получить продукт в виде беловатого твердого вещества.

Выход: 1,0 г; 41%. LC-MS (Метод 3): Rt 2,94 мин; m/z 188 [МН + ].

Промежуточное соединение 3: (5-бромметил-оксазол-2-ил)-фенил-метанон

Смесь (5-метил-оксазол-2-ил)-фенил-метанона (Промежуточное соединение 2) (0,8 г; 4,28 ммоль), N-бромсукцинимида (0,9 г; 5,06 ммоль) и 2,2'-азобис(2-метилпропионитрила) (56 мг; 0,34 ммоль) в четыреххлористом углероде (8 мл) нагревали при температуре дефлегмации в течение 1,5 ч. Реакционную смесь охлаждали до КТ и фильтровали. Фильтрат разбавляли DCM и промывали водой, насыщенным раствором гидрокарбоната натрия (водн.) и рассолом. Ее сушили (Na 2 SO 4 ), и растворитель удаляли. Очистку осуществляли колоночной хроматографией, элюируя смесью циклогексан/EtOAc (4:1). Это позволило получить продукт в виде желтого твердого вещества.

Выход: 0,9 г; 79%. LC-MS (Метод 3): Rt 3,26 мин; m/z 266, 268 [MH + ].

Промежуточное соединение 4: (5-диметиламинометил-оксазол-2-ил)-фенил-метанон

(5-Бромметил-оксазол-2-ил)-фенил-метанон (Промежуточное соединение 3) (0,18 г; 0,68 ммоль) растворяли в 2 М растворе диметиламина в THF (3 мл; 6 ммоль). Смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч, при этом почти незамедлительно образовывался осадок. Растворитель удаляли, и остаток разделяли между DCM и насыщенным раствором гидрокарбоната натрия (водн.). Водную фазу экстрагировали DCM, объединенную органическую фазу сушили (Na 2 SO 4 ), и растворитель удаляли, получая продукт в виде оранжевого масла, которое кристаллизовалось при стоянии.

Выход: 0,16 г; 99%. LC-MS (Метод 2): Rt 1,22 мин; m/z 231 [МН + ].

Промежуточное соединение 5: циклогексил-(5-метил-оксазол-2-ил)-фенил-метанол

Раствор (5-метил-оксазол-2-ил)-фенил-метанона (Промежуточное соединение 2) (3,0 г; 16 ммоль) в 32 мл обезвоженного THF при 0°С в атмосфере азота обрабатывали в течение 10 мин, добавляя по каплям 2 М раствор хлорида циклогексилмагния в диэтиловом эфире (10 мл, 20 ммоль). Полученный темно-желтый раствор перемешивали при 0°C в течение примерно 30 мин, в течение которых происходило образование осадка, и затем при КТ в течение 1,5 ч. Реакционную смесь опять охлаждали до 0°C и осторожно обрабатывали насыщенным раствором хлорида аммония (водн.). Смесь перемешивали при КТ в течение 10 мин, затем разбавляли водой (10 мл). Фазы разделяли, и органическую фазу промывали рассолом. Объединенную водную фазу экстрагировали DCM, а объединенную органическую фазу сушили (MgSO 4 ) и концентрировали в вакууме, получая неочищенный продукт, который растирали с эфиром, отфильтровывали и сушили.

Выход: 3,65 г; 84%. LCMS (Метод 3): Rt 3,78 мин; m/z 272 [MH + ].

Промежуточное соединение 6: (5-бромметил-оксазол-2-ил)-циклогексил-фенил-метанол

Раствор циклогексил-(5-метил-оксазол-2-ил)-фенил-метанола (Промежуточное соединение 5) (3,0 г; 11,1 ммоль) в 1,2-дихлорэтане (22 мл) обрабатывали N-бромсукцинимидом (2,16 г; 12,2 ммоль), затем 2,2'-азобис(2-метилпропионитрилом) (0,18 г; 2,1 ммоль). Смесь нагревали до 80°C в течение 2,5 ч и затем оставляли охлаждаться до КТ. Добавляли насыщенным раствор гидрокарбоната натрия (водн.), и фазы разделяли. Органический слой промывали рассолом и объединенные водные слои экстрагировали DCM. Объединенную органическую фазу сушили (MgSO 4 ) и концентрировали в вакууме, получая неочищенный продукт в виде коричневого масла. Очистку осуществляли колоночной хроматографией, элюируя смесью 33-100% DCM/циклогексан, затем 25% EtOAc/DCM.

Выход: 1,85 г; 48%. LCMS (Метод 3): Rt 4,27 мин; m/z 350, 352 [МН + ].

Промежуточное соединение 7: 2-фенетилокси-этанол

Получение 2-фенетилокси-этанола описано в J. Med. Chem. 1983, 26, 1570-1576.

Промежуточное соединение 8: [2-(2-бром-этокси)-этил]-бензол

Трифенилфосфин (1,65 г; 6,3 ммоль) добавляли к раствору 2-фенетилокси-этанола (Промежуточное соединение 7) (950 мг; 5,7 ммоль) и четырехбромистого углерода (2,09 г; 6,3 ммоль) в DCM (25 мл) и перемешивали при КТ в течение 6 ч. Затем добавляли дополнительный эквивалент трифенилфосфина и четырехбромистого углерода и перемешивали в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали, и остаток очищали колоночной хроматографией на диоксиде кремния, используя циклогексан в качестве элюента. Концентрирование чистых фракций позволило получить продукт в виде прозрачного масла.

Выход: 1,25 г; 96%.

1 H ЯМР (CDCl 3 ): 2.91 (t, 2H), 3.44 (t, 2H), 3.71 (t, 2H), 3.76 (t, 2H), 7.19-7.24 (m, 3H), 7.27-7.31 (m, 2H) м.д.

Промежуточное соединение 9: 2-(4-метил-бензилокси)-этанол

Смесь гидроксида калия (1,19 г; 21,3 ммоль) в этиленгликоле (12 мл; 213 ммоль) нагревали при 130°C в течение 3 ч, затем охлаждали до 35°С и добавляли 4-метилбензилбромид (3,94 г; 21,3 ммоль). Реакционную смесь нагревали при 35°C в течение 20 ч, охлаждали до КТ и разделяли между водой и диэтиловым эфиром. Водный слой экстрагировали диэтиловым эфиром. Объединенные органические слои промывали рассолом, сушили (MgSO 4 ) и концентрировали досуха с получением коричневого масла. Его очищали колоночной хроматографией на диоксиде кремния, используя градиент 0-100% диэтиловый эфир/циклогексан. Чистые фракции объединяли и концентрировали с получением желтой жидкости.

Выход: 2,97 г; 84%.

1 H ЯМР (CDCl 3 ): 2.04 (t, 1H), 2.35 (s, 3H), 3.58 (t, 2H), 3.75 (m, 2H), 4.52 (s, 2H), 7.16 (d, 2H), 7.23 (d, 2H) м.д.

Промежуточное соединение 10: 1-(2-бром-этоксиметил)-4-метил-бензол

Получали аналогично способу, использованному для Промежуточного соединения 8, но используя 1-(2-бром-этоксиметил)-4-метил-бензол (Промежуточное соединение 9) вместо 2-фенетилокси-этанола (Промежуточное соединение 9)

Выход: 85%.

1 H ЯМР (CDCl 3 ): 2.35 (s, 3Н), 3.47 (t, 2H), 3.76 (t, 2H), 4.55 (s, 2H), 7.16 (d, 2H), 7.24 (d, 2H) м.д.

Промежуточное соединение 11: 4-(3-бром-пропокси)-1,2-дихлор-бензол

Смесь 3,4-дихлорфенола (1,98 г; 12,14 ммоль), 1,3-дибромпропана (6,0 мл; 59 ммоль) и карбоната калия (2,5 г; 18 ммоль) в ацетонитриле нагревали при 80°С в течение ночи. Реакционную смесь охлаждали до КТ, фильтровали и фильтрат разделяли между водой и диэтиловым эфиром. Органический слой сушили (MgSO 4 ), концентрировали и очищали колоночной хроматографией на диоксиде кремния, используя 0-10% диэтилового эфира/циклогексан в качестве элюента, что позволило получить продукт.

Выход: 2,96 г; 86%.

1 H ЯМР (CDCl 3 ): 2.32 (m, 2H), 3.59 (t, 2H), 4.08 (t, 2H), 6.77 (dd, 1H), 7.00 (d, 1H),7.32(d, 1Н) м.д.

Промежуточное соединение 12: 2-(3.4-дихлор-бензилокси)-этанол

Получали аналогично способу, использованному для Промежуточного соединения 9, но используя 3,4-дихлорбензилхлорид вместо 4-метилбензилбромида

Выход: 72%.

1 H ЯМР (CDCl 3 ): 1.83 (br.s, 1H), 3.61 (t, 2H), 3.79 (t, 2H), 4.52 (s, 2H), 7.17 (dd, 1H), 7.42 (d, 1H), 7.45 (d, 1H) м.д.

Промежуточное соединение 13: 4-(2-бром-этоксиметил)-1,2-дихлор-бензол

Получали аналогично способу, использованному для Промежуточного соединения 8, но используя 2-(3,4-дихлор-бензилокси)-этанол (Промежуточное соединение 12) вместо 2-фенетилокси-этанола (Промежуточное соединение 7)

Выход: количественный.

1 H ЯМР (CDCl 3 ): 3.50 (t, 2Н), 3.80 (t, 2Н), 4.53 (s, 2H), 7.19 (dd, 1H), 7.42 (d,1H), 7.46 (d, 1Н) м.д.

Промежуточное соединение 14: 2-(4-хлор-бензилокси)-этиловый эфир метансульфоновой кислоты

Раствор метансульфонилхлорида (980 мкл; 12,6 ммоль) в безводном DCM (10 мл) медленно добавляли к охлажденному (0°C) раствору 2-(4-хлор-бензилокси)-этанола (2,14 г; 11,46 ммоль) и диизопропилэтиламина (2,0 мл; 23 ммоль) в безводном DCM (10 мл). Реакционную смесь оставляли нагреваться до КТ в течение ночи. Добавляли воду, и органический слой сушили (MgSO 4 ) и концентрировали. Остаток очищали колоночной хроматографией на диоксиде кремния, используя градиент 0-20% смеси диэтиловый эфир/циклогексан, с получением чистого продукта.

Выход: 1,87 г; 67%.

1 H ЯМР (CDCl 3 ): 3.03 (s, 3Н), 3.74 (m, 2Н), 4.39 (m, 2Н), 4.54 (s, 2Н), 7.27 (d, 2Н), 7.33 (d, 2Н) м.д.

Промежуточное соединение 15: 1-(2-бром-этоксиметил)-4-хлор-бензол

Смесь 2-(4-хлор-бензилокси)-этилового эфира метансульфоновой кислоты (Промежуточное соединение 14) (1,37 г; 5,18 ммоль) и бромида лития (1,80 г; 20,7 ммоль) в ацетоне (15 мл) нагревали при дефлегмации в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали досуха, и остаток разделяли между DCM и водой. Органический слой сушили (MgSO 4 ), концентрировали и очищали колоночной хроматографией на диоксиде кремния, используя DCM/циклогексан (1:3) в качестве элюента, с получением продукта в виде бесцветного масла.

Выход: 0,67 г; 78%.

1 H ЯМР (CDCl 3 ): 3.49 (t, 2H), 3.79 (t, 2H), 4.55 (s, 2H), 7.30 (d, 2H), 7.32 (d, 2H) м.д.

Промежуточное соединение 16: циклогексил-(5-диметиламинометил-оксазол-2-ил)-фенил-метанол

Раствор (5-бромметил-оксазол-2-ил)-циклогексил-фенил-метанола (Промежуточное соединение 6) (3,2 г; 9,2 ммоль) в THF (40 мл) обрабатывали 2 М раствором диметиламина в THF (40 мл; 80 ммоль). Суспензия образовывалась после перемешивания в течение нескольких минут. Реакционную смесь оставляли при КТ в течение ночи, затем твердое вещество отфильтровывали и отбрасывали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении, и остаток разделяли между DCM и насыщенным раствором гидрокарбоната натрия (водн.). Органический слой сушили (Na 2 SO 4 ) и упаривали с получением указанного в заголовке соединения в виде твердого вещества.

Выход: 2,74 г; 95%.

LC-MS (Метод 1): Rt 6,57 мин; m/z 315 [МН + ].

1 H ЯМР (DMSO-d 6 ): 0.92-1.29 (m, 6H), 1.42-1.74 (m, 4H), 2.10 (s, 6H), 2.22 (m, 1H), 3.45 (s, 2H), 5.90 (s, 1H), 6.98 (s, 1H), 7.18-7.22 (m, 1H), 7.27-7.34 (m, 2H), 7.40-7.46 (m, 2H) м.д.

Два энантиомера циклогексил-(5-диметиламинометил-оксазол-2-ил)-фенил-метанола (Промежуточное соединение 16) (2,74 г) разделяли препаративной хиральной HPLC, используя колонку Chiralpak ® IA (250×20 мм), заполненную силикагелем (5 мкм) с иммобилизованным на нем трис(3,5-диметилфенил-карбаматом) амилозы. Колонку элюировали 5%-ным EtOH в гептане, забуференном 0,1%-ным диэтиламином, при 15 мл/мин. Первый элюируемый энантиомер (Rt 8,5 мин) позволил получить (S)-циклогексил-(5-диметиламинометил-оксазол-2-ил)-фенил-метанол (Промежуточное соединение 16а) в виде белого твердого вещества.

Промежуточное соединение 16а: (S)-циклогексил-(5-диметиламинометил-оксазол-2-ил)-фенил-метанол

Выход: 0,73 г; 27%.

LC-MS (Метод 1): Rt 6,50 мин; m/z 315 [MH + ].

1 H ЯМР (CDCl 3 ): 1.12-1.39 (m, 7Н), 1.62-1.76 (m, 3H), 2.25 (s, 6H), 2.29-2.32 (m, 1H), 3.54 (dd AB , 2Н), 3.70 (br.s, 1Н), 6.84 (s, 1H), 7.24 (t, 1H), 7.33 (t, 2H), 7.64 (d, 2H) м.д.

Второй элюируемый энантиомер (Rt 10,3 мин) позволил получить (R)-циклогексил-(5-диметиламинометил-оксазол-2-ил)-фенил-метанол (Промежуточное соединение 16b) в виде белого твердого вещества.

Промежуточное соединение 16b: (R)-циклогексил-(5-диметиламинометил-оксазол-2-ил)-фенил-метанол

Выход: 1,04 г; 38%.

LC-MS (Метод 1): Rt 6,48 мин; m/z 315 [MH + ].

1 H ЯМР (CDCl 3 ): 1.10-1.39 (m, 7Н), 1.62-1.76 (m, 3H), 2.25 (s, 6H), 2.29-2.35 (m, 1H), 3.54 (dd AB , 2H), 3.70 (br.s, 1H), 6.84 (s, 1H), 7.24 (t, 1H), 7.33 (t, 2H), 7.64 (d, 2H) м.д.

Мускариновый антагонист 1 (MA1): [2-((S)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(3-фенокси-пропил)-аммония бромид

Раствор (S)-циклогексил-(5-диметиламинометилоксазол-2-ил)-фенил-метанола (Промежуточное соединение 16а) (0,060 г; 0,19 ммоль) и 3-феноксипропилбромида (0,215 г; 1 ммоль) в ацетонитриле (1,33 мл) и хлороформе (2 мл) оставляли стоять при КТ в течение 5 суток. Растворитель удаляли с получением неочищенного продукта. Очистку осуществляли колоночной хроматографией, элюируя последовательно DCM 2,5%; 5%; 10%; затем 20%-ным МеОН в DCM.

Выход: 50 мг, 43%.

LC-MS (Метод 1): Rt 8,32 мин; m/z 449 [М + ].

1 H ЯМР (CDCl 3 ): 1.06-1.17 (m, 3H), 1.23-1.36 (m, 4H), 1.52-1.85 (m, 3H), 2.28-2.35 (m, 3H), 3.32 (s, 3H), 3.33 (s, 3H), 3.63 (dd, 2H), 4.04 (t, 2H), 5.23 (dd AB , 2H), 6.85 (d, 2H), 6.98 (t, 1 H), 7.20 (t, 1H), 7.26-7.30 (m, 4H), 7.55-7.58 (m, 3H) м.д.

Мускариновый антагонист 2 (МА2): [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(3-фенокси-пропил)-аммония бромид

Раствор (R)-циклогексил-(5-диметиламинометилоксазол-2-ил)-фенил-метанола (Промежуточное соединение 16b) (98 мг; 0,31 ммоль) и 3-феноксипропилбромида (740 мг; 3,44 ммоль) в хлороформе (1,5 мл) и ацетонитриле (1,5 мл) нагревали при 50°C в течение 22 ч. Реакционную смесь концентрировали досуха с получением бесцветного вязкого масла, которое растирали с диэтиловым эфиром с получением белого смолообразного вещества. Его очищали колоночной хроматографией, элюируя 2,5-25% MeOH/DCM с получением продукта в виде мутного вязкого масла. Сушка под вакуумом при 45°C в течение 1-2 суток позволила получить белое твердое вещество.

Выход: 142 мг, 86%.

LC-MS (Метод 1): Rt 8,41 мин; m/z 449 [М + ].

1 H ЯМР (CDCl 3 ): 1.06-1.16 (m, 3Н), 1.21-1.37 (m, 4H), 1.59-1.74 (m, 3H), 2.32 (m, 3Н), 3.32 (s, 3Н), 3.33 (s, 3Н), 3.61 (dd, 2H), 4.03 (t, 2H), 4.14 (br s, 1H), 5.20 (dd AB , 2H), 6.85 (d, 2H), 6.98 (t, 1H), 7.19 (t, 1H), 7.26-7.30 (m, 4H), 7.55-7.58 (m, 3Н) м.д.

Мускариновый антагонист 2 (МА2): [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(3-фенокси-пропил)-аммония бромид - кристаллическая Форма А

Общие экспериментальные условия для получения кристаллической формы А МА2 аналогичны описанным ниже в Получении [2] МА11.

(R)-Цикпогексил-(5-диметиламинометил-оксазол-2-ил)-фенил-метанол 1

(5-Диметиламинометил-оксазо-2-ил)-фенил-метанон 2 растворяли в THF (8,4 л/кг) и охлаждали до температуры 0±5°C, к нему в течение по меньшей мере 1 ч добавляли циклогексилмагния хлорид (1,3 экв., в виде 20 масс./масс.%-ного раствора в смеси толуол/THF). Реакционную смесь нагревали до 20°С в течение 40 мин и перемешивали при 20°С в течение по меньшей мере 1 ч, в этот момент времени степень превращения в продукт составляла >96% по данным HPLC. Реакционную смесь добавляли к смеси 23,1%-ного масс./масс. NH 4 Cl (3,97 л/кг) и воды (3,97 л/кг). Фазы разделяли, и водный слой экстрагировали этилацетатом (7 л/кг). Объединенные органические слои промывали водой (5,25 л/кг) и 70% объема удаляли дистилляцией (p 130 мбар (13 кПа), 50°C). К остатку после дистилляции добавляли ацетонитрил (7,82 л/кг), и суспензию нагревали до достижения полного растворения (70°C). Затем реакционную смесь охлаждали до 0°C в течение 7 ч и перемешивали при 0°C в течение по меньшей мере 1 ч. Продукт реакции (±)-циклогексил-(5-диметиламинометил-оксазол-2-ил)-фенил-метанол затем собирали фильтрацией и промывали три раза холодным ацетонитрилом (1,65 л/кг). Выходы, получаемые согласно этой методике, лежали в диапазоне 60-70%, а достигаемая чистота составляла >97% площади пика (HPLC) и >97% масс./масс. (ЯМР). (R)-Циклогексил-(5-диметиламинометил-оксазол-2-ил)-фенил-метанол выделяли из этой рацемической смеси посредством хиральной SMB (на псевдоподвижном слое) хроматографии на колонке Chiralpak AD, используя ацетонитрил: изопропанол: диэтилметиламин (90:10:0,1) в качестве элюента.

1 Альтернативное получение (R)-циклогексил-(5-диметиламинометил-оксазол-2-ил)-фенил-метанола описано в WO 2007/017669 (Пример 6).

2 Получение (5-диметиламинометил-оксазо-2-ил)-фенил-метанона описано в WO 2007/017669 (Промежуточное соединение 4).

Методика получения затравочных кристаллов кристаллической формы А (МА2) - методика 1

(R)-Циклогексил-(5-диметиламинометил-оксазол-2-ил)-фенил-метанол (1 экв.) и 3-феноксипропилбромид (1,1 экв.) суспендировали в изопропаноле (4,3 л/кг). Полученную суспензию нагревали при дефлегмации в течение по меньшей мере 20 ч или пока степень превращения в продукт не составляла >98% по данным HPLC. Полученный раствор разбавляли изопропанолом (2 л/кг) и охлаждали до 50°С. При 50°С добавляли трет-бутилметиловый эфир (ТВМЕ) (9,5 л/кг), и раствор перемешивали при 50°С в течение еще 2 ч, во время которых происходила спонтанная кристаллизация. Смесь постепенно охлаждали до 0°C в течение 3 ч и перемешивали при 0°С в течение по меньшей мере 1 ч. Кристаллический продукт собирали фильтрацией и четыре раза промывали холодным ТВМЕ (0,16 л/кг). Выходы продукта при этой методике составляли >80%, а чистота составляла >98% площади пика (HPLC) и >97% масс./масс. (ЯМР).

Методика получения затравочных кристаллов кристаллической формы А (МА2) - методика 2

(R)-Циклогексил-(5-диметиламинометил-оксазол-2-ил)-фенил-метанол (1 экв.) и 3-феноксипропилбромид (1,1 экв.) суспендировали в изопропаноле (3,14 л/кг). Полученную суспензию нагревали до температуры дефлегмации (100°C), при которой достигалось полное растворение. После нагревания при дефлегмации в течение 8 1 / 2 ч реакционную смесь охлаждали до температуры окружающей среды в течение ночи. Анализ с использованием HPLC показал полное превращение в продукт. Отбирали образец реакционной смеси (0,043 л/кг), и по каплям добавляли ТВМЕ (0,14 л/кг), в результате чего происходило выпадение осадка. Эту суспензию добавляли к реакционной смеси при температуре окружающей среды, в результате чего происходила кристаллизация. Полученную суспензию охлаждали до 0°C и перемешивали в течение 3 ч при этой температуре. Продукт собирали фильтрацией, используя изопропанол (2,14 л/кг) для облегчения переноса из сосуда на фильтр. Осадок на фильтре промывали изопропанолом (1 л/кг) и сушили на роторном испарителе в течение ночи. Неочищенный продукт получали в виде белого твердого вещества с выходом 86%.

Неочищенный продукт помещали в ТВМЕ (10,4 л/кг в расчете на неочищенный продукт) и перемешивали при температуре окружающей среды в течение 2 ч. Продукт собирали фильтрацией, и осадок на фильтре промывали ТВМЕ (20 мл) и сушили на роторном испарителе в течение ночи. Выход составлял 94% от неочищенного продукта, а чистота 98,3% площади пика по данным HPLC.

Получение кристаллической формы А (МА2)

К (R)-циклогексил-(5-диметиламинометил-оксазол-2-ил)-фенил-метанолу (1 экв.) в изопропаноле (4,44 л/кг) при температуре окружающей среды добавляли 3-феноксипропилбромид (1,1 экв.). Смесь нагревали до температуры дефлегмации (83°С) в течение 90 мин и перемешивали при дефлегмации в течение 20 ч. После этого смесь охлаждали до 57°С в течение 13 мин. Отбирали образец, и затем реакционную смесь еще раз нагревали до температуры дефлегмации. Определяли, что степень превращения в продукт в реакции составляет 98,4% по данным HPLC.

Реакционную смесь разбавляли изопропанолом (5,55 л/кг) и охлаждали до 57°С. Раствор фильтровали через нагретый, встроенный в линию фильтр, в сосуд с перемешиванием. Реактор и фильтрационные линии промывали теплым (55°С) изопропанолом (1,11 л/кг). Содержимое перемешиваемого сосуда переносили обратно в реактор и промывали изопропанолом (1,11 л/кг). Изопропанол (5,55 л/кг) отгоняли при температуре 47°С-50°С и давлении 200 мбар (20 кПа). Остаток охлаждали до 52°С. При этой температуре в течение 35 мин добавляли ТВМЕ (10 л/кг). Полученный раствор перемешивали в течение 2 ч при 50°С. Добавляли затравочные кристаллы (1,18% масс./масс.(относительно вводимого (R)-циклогексил-(5-диметиламино-метил-оксазол-2-ил)-фенил-метанола)), и смесь перемешивали в течение еще 2 ч при 50°С. Образовавшуюся суспензию охлаждали до 0°С в течение 3 ч и перемешивали при этой температуре в течение 13 ч. После фильтрации осадок на фильтре четыре раза промывали холодным (1°С-8°С) ТВМЕ (1,48 л/кг, 1,67 л/кг, 2,04 л/кг и 2,04 л/кг). Осадок на фильтре предварительно сушили в течение 4,5 ч в потоке азота и после этого его дополнительно сушили на роторном испарителе при 45°С и 12 мбар (1,2 кПа), получая продукт в виде белого кристаллического вещества. Выход, полученный этим способом, в масштабе 2,7 кг составлял 90,5%, а чистота составляла 98,3% площади пика (HPLC) и 98,9% масс./масс. (ЯМР). Потери при высушивании составляли 0,23% масс./масс. (гравиметрически).

Анализ кристаллической формы А мускаринового антагониста 2 (МА2)

Образец кристаллической формы А, полученной согласно "Методике получения затравочных кристаллов кристаллической формы А - методика 2", анализировали с использованием XRPD, DSC и TGA.

Температура плавления формы А, как было установлено посредством DSC, составляла 150°С (начало) (±2°С). Потеря массы, наблюдаемая до плавления при TGA, была незначительной, около 0,0%. GVS определение показало увеличение массы на 0,8% (масс./масс, %) при RH 80% (±0,2%).

XRPD-спектр кристаллической формы А мускаринового антагониста 2 (МА2) представлен на Фиг.1.

Мускариновый антагонист 3 (МА3): [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(2-фенетилокси-этил)-аммония бромид

Получали согласно способу, использованному для получения МА2, но используя [2-(2-бром-этокси)-этил]-бензол (Промежуточное соединение 10) вместо 3-феноксипропилбромида.

Выход: 94%.

LC-MS (Метод 1): Rt 8,50 мин; m/z 463 [М + ].

1 H ЯМР (CD 3 OD): 1.06-1.39 (m, 6H), 1.55 (m, 1H), 1.65-1.79 (m, 3H), 2.40 (m, 1H), 2.90 (t, 2H), 2.94 (s, 6H), 3.47 (m, 2H), 3.78 (t, 2H), 3.86 (m, 2H), 4.56 (s, 2H), 7.12 (m, 1H), 7.19-7.28 (m, 5H), 7.32-7.37 (m, 3H), 7.55 (m, 2H).

Мускариновый антагонист 4 (MA4): [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-[3-(3,4-дихлор-фенокси)-пропил]-диметил-аммония бромид

Получали согласно способу, использованному для МА2, но используя 4-(3-бром-пропокси)-1,2-дихлор-бензол (Промежуточное соединение 11) вместо 3-феноксипропилбромида.

Выход: 59%.

LC-MS (Метод 4): Rt 8,85 мин; m/z 517 [М + ].

1 H ЯМР (CDCl 3 ): 1.08-1.40 (m, 7H), 1.60-1.76 (m, 3H), 2.34 (m, 3H), 3.34 (s, 6H), 3.65 (m, 2H), 3.99 (m, 3H), 5.25 (dd AB , 2H), 6.73 (dd, 1H), 6.96 (а, 1H), 7.22 (t, 1H), 7.26-7.34 (m, 3H), 7.56 (m, 3H) м.д.

Мускариновый антагонист 5 (МА5): [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-[2-(3,4-дихлор-бензилокси)-этил]-диметил-аммония бромид

Получали согласно способу, использованному для получения МА2, но используя 4-(2-бром-этоксиметил)-1,2-дихлор-бензол (Промежуточное соединение 13) вместо 3-феноксипропилбромида.

Выход: 86%.

LC-MS (Метод 1): Rt 9,07 мин; m/z 517 [М + ].

1 H ЯМР (CDCl 3 ): 1.09-1.37 (m, 7H), 1.60-1.77 (m, 3H), 2.31 (m, 1H), 3.33 (s, 6H), 3.91 (m, 2H), 3.98 (m, 3H), 4.55 (s, 2H), 5.20 (dd AB , 2Н), 7.17 (dd, 1H), 7.24 (m, 1H), 7.31 (t, 2H), 7.40 (d, 1H), 7.44, (d, 1H), 7.48, (s, 1H), 7.56 (d, 2H) м.д.

Мускариновый антагонист 6 (MA6): [2-(4-хлор-бензилокси)-этил]-[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-аммония бромид

Получали согласно способу, использованному для получения МА2, но используя 1-(2-бром-этоксиметил)-4-хлор-бензол (Промежуточное соединение 15) вместо 3-феноксипропилбромида.

Раствор (R)-циклогексил-(5-диметиламинометилоксазол-2-ил)-фенил-метанола (0,40 г; 1,27 ммоль) и 1-(2-бром-этоксиметил)-4-хлор-бензола (Промежуточное соединение 15) (0,67 г; 2,68 ммоль) в хлороформе (4 мл) и ацетонитриле (4 мл) нагревали при 50°С в течение 3 суток. Реакционную смесь концентрировали досуха, что позволило получить желтое масло, которое очищали колоночной хроматографией, элюируя 2,5-25% MeOH/DCM, с получением продукта в виде белой пены. Выход: 0,68 г; 92%.

Выход: 92%.

LC-MS (Метод 1): Rt 8,72 мин; m/z 483 [М + ].

1 H ЯМР (CDCl 3 ): 1.08-1.40 (m, 7H), 1.61-1.76 (m, 3H), 2.31 (m, 1H), 3.32 (s, 6H), 3.88 (m, 2H), 3.94 (m, 2H), 4.03 (br. s, 1H), 4.54 (s, 2H), 5.17 (dd AB , 2H), 7.21-7.26 (m, 3H), 7.28-7.34 (m, 4H), 7.46 (s, 1H), 7.56 (d, 2H) м.д.

Мускариновый антагонист 7 (МА7): [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(3-фенокси-пропил)-аммония геми-нафталин-1,5-дисульфонат

Смесь [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(3-фенокси-пропил)-аммония бромида (МА2) (201 мг; 0,372 ммоль), динатриевой соли нафталин-1,5-дисульфоната (68 мг; 0,21 ммоль), DCM (2,8 мл) и воды (2,8 мл) энергично перемешивали при КТ в течение ночи. Твердые вещества собирали фильтрацией, промывали смесью DCM/вода и сушили под вакуумом при 40°С. Полученный образец МА7 ниже упоминается как аморфная форма МА7.

1 H ЯМР продемонстрировала спектр, соответствующий геми-соли (отношение катион/анион 2:1).

Выход: 208 мг; 94%.

LC-MS (Метод 1): Rt 8,35 мин; m/z 449 [М + ].

1 H ЯМР (CD 3 OD): 1.04-1.37 (m, 12H), 1.55-1.75 (m, 8H), 2.22 (m, 4H), 2.40 (m, 2H), 3.01 (s, 6H), 3.02 (s, 6H), 3.37 (m, 2H), 3.97 (m, 4H), 4.67 (s, 4H), 6.89 (d, 4H), 6.95 (t, 2H), 7.21 (t, 2H), 7.28 (m, 8H), 7.51 (m, 8H), 8.19 (d, 2H), 9.02 (d, 2H) м.д.

Солевая форма 1

МА7 (аморфную форму) (как она получена здесь выше) нагревали в толуоле с перемешиванием при 60° в течение 48 часов и оставляли охлаждаться до КТ при перемешивании с получением продукта в виде небольших пластинок. Продукт собирали фильтрацией и сушили под вакуумом при 50°С в течение 3 ч. Температуру плавления формы 1 определяли посредством DSC; во время которой тестируемая форма 1 претерпевала дегидратацию, после чего дегидратированная форма 1 полностью или частично превращалась в безводную форму, плавилась при 225°С ± 2°С (начало). Содержание воды по данным TGA составляло 0,7% (±0,2%). GVS определение показало увеличение массы (масс./масс.%) на 3,1% при RH 80% (±0,5%).

XRPD-спектр формы 1 представлен на Фиг.2.

Дополнительные количества формы 1 получали следующим образом: МА7 (аморфную форму) кристаллизовали из дефлегмирующего ацетонитрила, применяя горячую фильтрацию раствора, и оставляли охлаждаться до КГ при перемешивании, с получением продукта в виде небольших пластинок. Продукт собирали фильтрацией и перемешивали в толуоле при 60°С в течение 19 ч. Твердые вещества собирали декантированием растворителя и сушили под вакуумом при 50°С в течение 3 ч. Результаты XRPD- и DSC-анализов соответствовали Форме 1.

Солевая форма 2

Аморфную форму МА7 нагревали в анизоле при 154°С в течение 3 ч, затем оставляли стоять при КТ в течение 48 ч. Твердые вещества собирали декантированием растворителя и сушили под вакуумом при 45°С. Обнаружено, что температура плавления формы 2 по данным DSC составляла 227°С ± 2°С (начало). Содержание воды по данным TGA составляло 0,0%. GVS определение показало 0,7%-ное увеличение массы (%масс./масс.) при RH 80% (±0,2%).

XRPD-спектр формы 2 представлен на Фиг.3.

Дополнительные количества формы 2 получали следующим образом: аморфную форму МА7 кристаллизовали из дефлегмирующего хлорбензола и оставляли медленно охлаждаться до КТ с получением продукта в виде тонких иголок. Продукт собирали фильтрацией и сушили под вакуумом при КГ в течение ночи. Результаты XRPD- и DSC-анализов соответствовали форме 2.

Дополнительные количества формы 2 получали следующим образом: аморфную форму МА7 перемешивали в толуоле при 80°С в течение по меньшей мере 60 часов. Твердые вещества собирали, декантируя растворитель, и сушили под вакуумом при 45°С. Результаты XRPD- и DSC-анализов соответствовали форме 2.

Солевая форма 3

Аморфную форму МА7 кристаллизовали из дефлегмирующей смеси ацетон/вода, используя горячую фильтрацию раствора, и оставляли охлаждаться до КТ при перемешивании, с получением продукта в виде белого порошка. Продукт собирали фильтрацией и сушили под вакуумом при КТ в течение ночи.

Температуру плавления формы 3 определяли посредством DSC, во время которой тестируемая форма 3 претерпевала дегидратацию и после этого дегидратированная форма 3 полностью или частично превращалась в безводную форму, плавилась при 224°С ± 2°С (начало). Содержание воды по данным TGA составляло 2,1% (±0,2%). GVS определение показало 3,0%-ное увеличение массы (% масс./масс.) при RH 80% (±0,2%).

XRPD-спектр формы 3 представлен на Фиг.4.

Мускариновый антагонист 8 (МА8): [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(2-фенетилокси-этил)-аммония геми-нафталин-1,5-дисульфонат

Получали согласно способу, использованному для получения МА7, но используя [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(2-фенетилокси-этил)-аммония бромид (МА3) вместо [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(3-фенокси-пропил)-аммония бромида.

Выход: 98%.

LC-MS (Метод 1): Rt 8,64 мин; m/z 463 [М + ].

1 H ЯМР (CD 3 OD): 1.05-1.39 (m, 12H), 1.53 (m, 2H), 1.68 (m, 4H), 1.77 (m, 2H), 2.39 (m, 2H), 2.85 (s, 12H), 2.87 (t, 4H), 3.36 (m, 4H), 3.72 (t, 4H), 3.76 (m, 4H), 4.46 (s, 4H), 7.11 (m, 2H), 7.20 (m, 8H), 7.22-7.27 (m, 2H), 7.33 (t, 6H), 7.54 (m, 6H), 8.20 (dd, 2H), 9.02 (d, 2H) м.д.

Кристаллизовали дефлегмирующего из ацетонитрила и оставляли медленно охлаждаться до КТ с получением продукта в виде тонких иголок. Точка кипения: 215-216 (10°С/мин).

Мускариновый антагонист 9 (МА9): [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-[3-(3,4-дихлор-фенокси)-пропил]-диметил-аммония геми-нафталин-1,5-дисульфонат

Получали согласно способу, использованному для получения МА7, но используя [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-[3-(3,4-дихлор-фенокси)-пропил]-диметил-аммония бромид (МА4) вместо [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(3-фенокси-пропил)-аммония бромида.

Выход: 56%.

LC-MS (Метод 1): Rt 9,13 мин; m/z 517 [М + ].

1 H ЯМР (CD 3 OD): 1.05-1.37 (m, 12H), 1.56-1.75 (m, 8H), 2.23 (m, 4H), 2.40 (m, 2H), 3.03 (s, 6H), 3.04 (s, 6H), 3.34 (m, 4H), 3.96 (m, 4H), 4.68 (s, 4H), 6.85 (dd, 2H), 7.09 (d, 2H), 7.21 (m, 2H), 7.30 (t, 4H), 7.42 (d, 2H), 7.52 (m, 8H), 8.20 (dd, 2H), 9.02 (dd, 2H) м.д.

Кристаллизовали из горячего МеОН. Точка кипения: 225-227°С (1°С/мин).

Мускариновый антагонист 10 (МА10): [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-[2-(3,4-дихлор-бензилокси)-этил]-диметил-аммония геми-нафталин-1,5-дисульфонат

Получали согласно способу, использованному для получения МА7, но используя [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-[2-(3,4-дихлор-бензилокси)-этил]-диметил-аммония бромид (МА5) вместо [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(3-фенокси-пропил)-аммония бромида.

Выход: 76%. LC-MS (Метод 1): Rt 9,06 мин; m/z 517 [M + ].

1 H ЯМР (CD 3 OD): 1.05-1.37 (m, 12H), 1.54 (m, 2H), 1.63-1.76 (m, 6H), 2.38 (m, 2H), 3.03 (s, 12H), 3.47 (m, 4H), 3.86 (m, 4H), 4.51 (s, 4H), 4.71 (s, 4H), 7.22-7.33 (m, 8H), 7.46 (s, 2H), 7.52 (m, 10H), 8.20 (dd, 2H), 9.02 (d, 2H) м.д.

Мускариновый антагонист 11 (МА11): [2-(4-хлор-бензилокси)-этил]-[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-аммония геми-нафталин-1,5-дисульфонат

Получение [1]

МА11 может быть получен согласно способу, использованному для получения МА7, но используя [2-(4-хлор-бензилокси)-этил]-[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-аммоний-бромида (МА6) вместо [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(3-фенокси-пропил)-аммония бромида. Пример получения описан ниже.

Смесь [2-(4-хлор-бензилокси)-этил]-[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-аммония бромида (0,20 г; 0,36 ммоль), динатриевой соли нафталин-1,5-дисульфоната (0,059 г; 0,18 ммоль), DCM (2,8 мл) и воды (2,8 мл) энергично перемешивали при КТ в течение ночи. Добавляли н-гептан (1,0 мл) и смесь энергично перемешивали. При отстаивании получали два прозрачных слоя и желтое масло. Добавляли DCM (1,0 мл) (вызывает растворение масла), и смесь перемешивали при КТ в течение ночи, что приводило к выпадению в осадок белого твердого вещества. Твердое вещество собирали фильтрацией, промывали смесью DCM/вода и сушили под вакуумом при 50°С.

Спектр 1 H ЯМР соответствует геми-соли (отношение катион/анион 2:1).

Выход: 0,17 г; 77%.

LC-MS (Метод 1): Rt 8,62 мин; m/z 483 [M + ].

1 H ЯМР (CD 3 OD): 1.04-1.37 (m, 12H), 1.53 (m, 2H), 1.64-1.76 (m, 6H), 2.38 (m, 2H), 3.03 (s, 12H), 3.46 (m, 4H), 3.85 (m, 4H), 4.52 (s, 4H), 4.70 (s, 4H), 7.24 (m, 2H), 7.34 (m, 12H), 7.43 (s, 2H), 7.52 (m, 6H), 8.20 (d, 2H), 9.02 (d, 2H) м.д.

"Солевая Форма А" [2-(4-хлор-бензилокси)-этил]-[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-аммония геми-нафталин-1,5-дисульфоната

[2-(4-Хлор-бензилокси)-этил]-[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-аммония геми-нафталин-1,5-дисульфонат (как он был получен здесь выше) (107 мг; 0,17 ммоль) растворяли в минимальном количестве MeCN при КТ. Раствор нагревали и затем оставляли охлаждаться опять до КТ. Полученное кристаллическое твердое вещество отфильтровывали и сушили под вакуумом. Выход: 83 мг, 78%. XRPD-анализ полученного этим способом продукта идентифицировал продукт как "солевую форму А".

Получение [2]

Общие экспериментальные условия для получения [2]

Все реакции проводили в атмосфере инертного газа, если не указано иное.

ЯМР-спектры получали на спектрометре Bruker AVANCE400: частота: 400 МГц; 2-канальный; z-градиент. Диапазон температур: 0-120°С.

Условия HPLC:

колонка Phenomenex Luna C18(2) (50×4,6 мм), размер частиц 3 мкм. UV-детекция при 210 нМ. Элюирование: А: вода + 0,05% трифторуксусной кислоты; Б: ацетонитрил + 0,05% трифторуксусной кислоты. Градиент:

Градиент - Время

поток, мл/мин





0,00

1,0

90

10

8,00

1,0

10

90

9,00

1,0

10

90

9,50

1,0

90

10

12,00

1,0

90

10

LC-MS-метод: LC-метод, как приведено выше. MS: HP-1100 MSD. Детекция - API-ES (ионизация при атмосферном давлении с электрораспылением), режим положительно заряженных ионов.

Получение [2]

Смесь (R)-циклогексил-(5-диметиламинометилоксазол-2-ил)-фенил-метанола (1 экв.) и 1-(2-бром-этоксиметил)-4-хлор-бензола (2 экв.) в 2-пропаноле (5 об.) нагревали при 52°С в течение 164 ч. HPLC показала превращение 98%. Реакционную смесь упаривали досуха, получая [2-(4-хлор-бензилокси)-этил]-[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-аммония бромид. Неочищенный образец [2-(4-хлор-бензилокси)-этил]-[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-аммония бромида растворяли в дихлорметане (4,98 об.), и при комнатной температуре в течение 10 мин добавляли раствор динатриевой соли 1,5-нафталин-дисульфоновой кислоты (1 экв.) в воде (10 об.). Смесь разбавляли дихлорметаном (4,98 об.) и перемешивали в течение 1 часа при комнатной температуре. Мешалку отключали, и эмульсия оседала, после чего ее разделяли. К органическому слою при комнатной температуре в течение 72 мин добавляли смесь трет-бутилметилового эфира (tBME) (10 об.) и 2-пропанола (1,6 об.). Полученную суспензию фильтровали, и осадок на фильтре промывали tBME (2,15 об.). После сушки (роторный испаритель при температуре бани 40-50°С при давлении 5-10 мбар (0,5-1 кПа)) получали [2-(4-хлор-бензилокси)-этил]-[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-аммония геми-нафталин-1,5-дисульфонат. Выход, полученный в этом получении с использованием 130 г (R)-циклогексил-(5-диметиламинометилоксазол-2-ил)-фенил-метанола составлял 216 г (83%). 1 H ЯМР продемонстрировала спектр, соответствующий геми-соли (отношение катион/анион 2:1).

Превращение в "солевую форму А" осуществляли путем суспендирования неочищенной партии [2-(4-хлор-бензилокси)-этил]-[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-аммония геми-нафталин-1,5-дисульфоната, полученного как описано выше, в ацетонитриле (13,8 об.). Суспензию нагревали до температуры дефлегмации и перемешивали при температуре дефлегмации в течение 1 часа. Затем суспензию охлаждали до 70°С и перемешивали при этой температуре в течение ночи. Суспензию охлаждали до комнатной температуры, твердое вещество отфильтровывали, промывали ацетонитрилом (1,4 об.) и сушили (роторный испаритель при температуре бани 40-50°С при 5-10 мбар (0,5-1 кПа)), получая "солевую форму А". Выход, полученный в результате этого превращения с использованием 216 г неочищенного [2-(4-хлор-бензилокси)-этил]-[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-аммония геми-нафталин-1,5-дисульфоната в качестве исходного материала, составлял 203,5 г (94%).

Получение [3]

Общие экспериментальные условия для способа получения [3] такие же, как для способа получения [2].

Смесь (R)-циклогексил-(5-диметиламинометилоксазол-2-ил)-фенил-метанола (1 экв.) и 1-(2-бром-этоксиметил)-4-хлор-бензола (2 экв.) в 2-пропаноле (5 об.) подвергали воздействию следующего температурного режима: нагревание до 70°С (внутренняя температура) в течение 1 часа, перемешивание при 70°С в течение 26 часов и затем охлаждение до 20°С в течение 30 минут. Степень превращения в продукт проверяли посредством HPLC.

Реакционную смесь упаривали досуха (роторный испаритель при температуре бани 40-50°С при 10-15 мбар (1-1,5 кПа)), и остаток растворяли в дихлорметане (8,9 об.). К этому раствору в течение по меньшей мере 10 минут добавляли раствор динатриевой соли 1,5-нафталин-дисульфоновой кислоты (1 экв.) в воде (17,7 об.). Полученную смесь разбавляли дихлорметаном (8,9 об.), и перемешивание продолжали при комнатной температуре в течение 1 часа. Мешалку отключали, и эмульсия оседала, после чего ее разделяли. К органическому слою при комнатной температуре в течение по меньшей мере 60 мин добавляли смесь tBME (17,7 об.) и 2-пропанола (2,86 об.). Полученную суспензию перемешивали при комнатной температуре в течение 10-60 минут и затем фильтровали. Осадок на фильтре промывали tBME (2×3,46 об.) и сушили (роторный испаритель при температуре бани 40-50°С при 5-10 мбар (0,5-1 кПа)) до тех пор, пока не получали потери при высушивании (LOD) 2% масс./масс. Вещество суспендировали в ацетонитриле (22,9 об.), и суспензию подвергали воздействию следующего температурного режима:

нагревание до дефлегмации в течение по меньшей мере 30 минут. Перемешивание при дефлегмации в течение 60-70 минут, затем охлаждение до 70°С (внутренняя температура), перемешивание при 70°С в течение 16-24 часов и окончательное охлаждение до 20°С в течение 1 часа. Суспензию фильтровали, и осадок на фильтре промывали ацетонитрилом (4,61 об.). Вещество сушили (роторный испаритель при температуре бани 40-50°С при давлении 5-10 мбар (0,5-1 кПа)), пока не получали LOD 1% масс./масс..

Выход, полученный в этом способе получения с использованием 25,0 г (R)-циклогексил-(5-диметиламинометилоксазол-2-ил)-фенил-метанола, составлял 38,7 г (78%).

Выход, полученный в этом получении с использованием 129,9 г (R)-циклогексил-(5-диметиламинометилоксазол-2-ил)-фенил-метанола, составлял 203,6 г (79%).

HPLC и ЯМР продемонстрировали спектр, соответствующий геми-соли (отношение катион/анион 2:1).

Анализ твердого состояния солевой формы А МА11-[2-(4-хлор-бензилокси)-этил]-[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-аммония геми-нафталин-1,5-дисульфоната

Температура плавления формы А при определении посредством DSC была найдена равной 233°С (начало) (±3°С). Потеря массы, наблюдаемая до плавления при TGA, была очень низкой (0,0%-0,5%). GVS определение продемонстрировала увеличение массы менее чем на 0,5% (масс./масс.%) при RH 80% (±0,3%).

XRPD-спектр "солевой формы А МА11" представлен на Фиг.5.

"Солевую форму А" микронизировали в струйной мельнице 50 мм, с давлением в эжекторе 5 бар (5×10 5 Па) и измельчающем давлением 1,5-2 бар (1,5-2×10 5 Па), что давало 90%-ный выход. Размер частиц микронизированного вещества, при определении посредством лазерной дифракции Malvern с подачей сухого порошка, составлял d(0,1) 0,77 мкм: d(0,5), 1,45 мкм: d(0,9): 2,65 мкм. Исследовательская оценка дезагрегационных свойств микронизированной «солевой Формы А» показала прекрасную фракцию мелкодисперсных частиц (FPF (мелкодисперсная фракция) >60%) во всем диапазоне относительной влажности (0-75% RH).

Биологическая активность мускариновых антагонистов

Ингибирующие действия соединений - мускариновых антагонистов - определяли с помощью анализа связывания радиоактивного лиганда с мускариновым рецептором.

Для оценки аффинности мускариновых антагонистов к рецепторам М2 и М3 изучали связывание радиоактивного лиганда, используя [ 3 H]-N-метил-скополамин ([ 3 H]-HMS) и имеющиеся в продаже клеточные мембраны, экспрессирующие человеческие мускариновые рецепторы (М2 или М3). Мембраны в TRIS-буфере инкубировали в 96-луночных планшетах с [ 3 H]-HMS и антагонистом М3 в различных концентрациях в течение 3 часов. Мембраны и связанный радиолиганд затем собирали фильтрацией и оставляли сушиться в течение ночи. Затем добавляли сцинтилляционную жидкость, и связанный радиоактивный лиганд подсчитывали, используя сцинтилляционный счетчик Canberra Packard Topcount.

Полупериод жизни антагонистов на каждом мускариновом рецепторе измеряли, используя альтернативный радиолиганд [ 3 H]-QNB ([ 3 H]-хинуклидинилбензилат) и адаптацию вышеупомянутого анализа аффинности. Антагонисты инкубировали в течение 3 часов в концентрации, в 10 раз превышающей величину их Ki, определенную с использованием лиганда [ 3 H]-QNB, с мембранами, экспрессирующими мускариновые рецепторы человека. В конце этого периода времени добавляли [ 3 H]-QNB до концентрации, в 25 раз превышающей величину его Kd для изучаемого рецептора, и инкубацию продолжали в течение разных периодов времени от 15 минут до 180 минут включительно. Затем мембраны и связанный радиоактивный лиганд собирали фильтрацией и оставляли сушиться в течение ночи. Затем добавляли сцинтилляционную жидкость и связанный радиоактивный лиганд подсчитывали, используя сцинтилляционный счетчик Canberra Packard Topcount.

Степень, в которой [ 3 H]-QNB детектируется в связанном с мускариновыми рецепторами состоянии, соответствует степени, в которой антагонист диссоциирует из рецептора, т.е. полупериоду существования антагонистов на рецепторах.

В анализе связывания с рецептором тестировали следующие соединения:

Мускариновый антагонист

Ki связывания с М 3 , нМ

МА 1

9,4

МА 2

0,2

МА 3

0,6

МА 4

0,9

МА 5

2,1

МА 6

0,6

Получение 2 -адренорецепторных агонистов

Следующие агонисты 2 -адренорецепторов, которые можно использовать в комбинации по настоящему изобретению, могут быть получены следующим образом.

Общие экспериментальные подробности получения 2 -адренорецепторных агонистов

1 H ЯМР-спектры регистрировали на приборе Varian Inova 400 МГц или Varian Atercury-VX 300 МГц. Центральные пики хлороформа-d ( H 7,27 м.д.), диметилсульфоксида-d 6 ( H 2,50 м.д.), ацетонитрила-d 3 ( H 1,95 м.д.) или метанола-d 4 ( H 3.31 м.д.) использовали в качестве внутренних стандартов. Колоночную хроматографию выполняли, используя силикагель (0,040-0,063 мм, Merck). Если не указано иное, то исходные вещества имелись в продаже. Все растворители и имеющиеся в продаже реагенты имели лабораторную чистоту и были использованы такими, как они были получены.

Для LC/MS-анализа (жидкостная хроматография и масс-спектроскопия) использовали следующий способ:

прибор Agilent 1100; колонка Waters Symmetry 2,1×30 мм; масс-APCI (химическая ионизация при атмосферном давлении); скорость потока 0,7 мл/мин; длина волны 254 нм; растворитель А: вода + 0,1% TFA (трифторуксусная кислота); растворитель Б: ацетонитрил + 0,1% TFA; градиент 15-95%/Б 8 мин, 95% Б 1 мин.

Аналитическую хроматографию выполняли на Symmetry С 18 -колонке, 2,1×30 мм с размером частиц 3,5 мкм, используя смесь ацетонитрил/вода/0,1% трифторуксусной кислоты в качестве подвижной фазы с градиентом 5%-95% ацетонитрила в течение 8 минут при потоке 0,7 мл/мин.

Сокращения или термины, использованные в примерах, имеют следующие значения:

SCX: твердофазная экстракция с сульфоновокислотным сорбентом

HPLC: высокоэффективная жидкостная хроматография

DMF: N,N-диметилформамид

Агонисты 2 -адренорецепторов и промежуточные соединения, используемые для их получения, названы в данном описании на основании изображенных структур с использованием пакета программ по присвоению названий ИЮПАК NAME, ACD Labs, версия 8.

Агонист 1 2 -адренорецептора (BA1: Получение 1

N-[2-(Диэтиламино)этил]-N-(2-{[2-(4-гидрокси-2-оксо-2,3-дигидро-1,3-бензотиазол-7-ил)этил]амино}этил)-3-[2-(1-нафтил)этокси]-пропанамида дигидробромид

а) трет-Бутил-3-[2-(1-нафтил)этокси]пропаноат

1-Нафталин-этанол (10 г) обрабатывали гидроксидом бензилтриметил-аммония (Triton В ® ; 0,9 мл 40%-ного раствора в метаноле), и полученную смесь перемешивали в вакууме в течение 30 минут. Затем смесь охлаждали до 0°С и обрабатывали трет-бутилакрилатом (8,19 г). Полученную смесь медленно нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи. После этого неочищенную смесь абсорбировали на оксид алюминия (30 г) и элюировали диэтиловым эфиром (200 мл). Органические фракции концентрировали, получая неочищенное вещество (16,6 г), которое очищали флэш-хроматографией на диоксиде кремния, элюируя смесью 1:8 диэтиловый эфиртексан, с получением указанного в подзаголовке соединения (12,83 г).

1 H ЯМР (CDCl 3 ) 8.05 (dd, 1H), 7.84 (dd, 1H), 7.72 (dd, 1H), 7.54-7.34 (m, 4H), 3.81-3.69 (m, 4H), 3.35 (t, 2H), 2.52-2.47 (m, 2H), 1.45 (s, 9H).

б) 3-[2-(1-Нафтил)этокси]пропановая кислота

трет-Бутил-3-[2-(1-нафтил)этокси]пропаноат (6,19 г) переносили в дихлорметан (30 мл) и обрабатывали трифторуксусной кислотой (5 мл). Полученный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов, добавляли дополнительно 1 мл трифторуксусной кислоты, и раствор перемешивали в течение ночи. Смесь концентрировали, переносили в 2 М раствор гидроксида натрия (30 мл) и промывали эфиром (2×20 мл). Водный слой затем подкисляли (используя 1 М соляную кислоту) и экстрагировали эфиром (2×30 мл). Объединенные органические слои промывали рассолом (20 мл), сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали и концентрировали в вакууме, получая указанное в подзаголовке соединение (5,66 г) в виде прозрачного масла.

1 H ЯМР (CDCl 3 ) 8.05 (bs, 1H), 7.85 (bs, 1H), 7.74 (bs, 1H), 7.50-7.38 (m, 4H), 3.84-3.75 (bm, 4H), 3.39 (bs, 2H), 2.65 (bs, 2H).

в) N-(2-Диэтиламиноэтил)-N-(2-гидроксиэтил)-3-[2-(1-нафтил)-этокси]-пропанамид

Оксалилхлорид (0,33 г) добавляли по каплям к раствору 3-[2-(1-нафтил)этокси]пропановой кислоты (0,53 г) в дихлорметане (10 мл), добавляли диметилформамид (1 каплю), и перемешивание продолжали при комнатной температуре в течение 1 часа. После этого смесь концентрировали, повторно растворяли в дихлорметане (10 мл) и добавляли по каплям к раствору 2-(2-диэтиламиноэтиламино)этанола (0,35 г) и диизопропилэтиламина (0,56 г) в дихлорметане (10 мл). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа, разбавляли (дихлорметан, 50 мл), промывали водой (2×20 мл), рассолом (20 мл), сушили над сульфатом магния и концентрировали, получая неочищенный продукт (0,91 г), который очищали колоночной флэш-хроматографией (элюируя 5-7%-ным метанолом в дихлорметане) с получением 0,63 г указанного в подзаголовке соединения.

1 H ЯМР (CDCl 3 ) 8.05 (d, 1Н), 7.85 (d, 1H), 7.73 (d, 1H), 7.52-7.47 (m, 2H), 7.42-7.35 (m, 2H), 3.84-3.78 (m, 6H), 3.72-3.70 (m, 1/2H), 3.45-3.35 (m, 6H), 2.79-2.77 (m, 1+1/2H), 2.62-2.58 (m, 2H), 2.54-2.49 (m, 4H), 1.04-1.01 (m, 6H).

г) N-[2-(Диэтиламино)этил]-N-(2-{[2-(4-гидрокси-2-оксо-2,3-дигидро-1,3-бензотиазол-7-ил)этил]амино}этил)-3-[2-(1-нафтил)этокси]-пропанамид

Раствор диметилсульфоксида (0,097 г) в дихлорметане (1 мл) добавляли к раствору оксалилхлорида (0,079 г) в дихлорметане (10 мл) при -78°С. Реакционную смесь перемешивали в течение 15 минут и затем добавляли раствор N-(2-диэтиламиноэтил)-N-(2-гидроксиэтил)-3-[2-(1-нафтил)этокси]-пропанамида (0,22 г) в дихлорметане (1 мл + 1 мл промывки), и реакционную смесь перемешивали в течение еще 15 минут. Добавляли триэтиламин (0,29 г), и реакционную смесь оставляли нагреваться до комнатной температуры в течение 1 часа, после чего смесь разбавляли (дихлорметан, 30 мл), органические фракции промывали бикарбонатом натрия (20 мл), рассолом (20 мл), сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали и концентрировали в вакууме с получением указанного в подзаголовке соединения (0,21 г).

Неочищенный продукт растворяли в метаноле (10 мл) и добавляли гидрохлорид 7-(2-аминоэтил)-4-гидрокси-1,3-бензотиазол-2(3Н)-она (полученный согласно методике, изложенной в Organic Process Research & Development, 2004, 8(4), 628-642; 0,131 г) вместе с уксусной кислотой (0,1 мл) и водой (0,1 мл). После перемешивания при комнатной температуре в течение 30 минут добавляли цианоборгидрид натрия (0,020 г), и реакционную смесь перемешивали в течение ночи. Добавляли аммиак (7 н. в метаноле, 1 мл), и смесь концентрировали. Неочищенный остаток очищали колоночной флэш-хроматографией, элюируя 1%-ным аммиаком в 5%-7%-ном метаноле в дихлорметане. Неочищенный продукт использовали непосредственно на следующей стадии.

д) N-[2-(Диэтиламино)этил]-N-(2-{[2-(4-гидрокси-2-оксо-2,3-дигидро-1,3-бензотиазол-7-ил)этил]амино}этил)-3-[2-(1-нафтил)этокси]пропанамида дигидробромид

N-[2-(Диэтиламино)этил]-N-(2-{[2-(4-гидрокси-2-оксо-2,3-дигидро-1,3-бензотиазол-7-ил)этил]амино}этил)-3-[2-(1-нафтил)этокси]пропанамид (0,052 г) растворяли в этаноле (1,5 мл) и обрабатывали 48%-ной бромистоводородной кислотой (21 мкл). Белую твердую дигидробромидную соль (0,058 г) собирали фильтрацией.

MS: APCI(+ve) 579 (M+1).

1 H ЯМР (DMSO) 11.78-11.71 (m, 1H), 10.11-10.06 (m, 1H), 9.51-9.43 (m, 0.33Н), 9.21-9.13 (m, 0.66H), 8.75-8.66 (m, 1H), 8.59-8.51 (m, 1H), 8.06 (d, 1H), 7.95-7.90 (m, 1H), 7.79 (d, 1H), 7.60-7.48 (m, 2H), 7.47-7.39 (m, 2H), 6.87 (t, 1H), 6.76 (dd, 1H), 3.78-3.53 (m, 10Н), 3.25-3.09 (m, 10Н), 2.91-2.80 (m, 2H), 2.73-2.61 (m, 2H), 1.26-1.15 (m, 6H). ЯМР указывает на смесь ротамеров приблизительно 2:1 при 298 К.

Агонист 1 2 -адренорецептора (BA1): Получение 2

N-[2-(Диэтиламино)этил]-N-(2-{[2-(4-гидрокси-2-оксо-2,3-дигидро-1,3-6ензотиазол-7-ил)этил]амино}этил)-3-[2-(1-нафтил)этокси]-пропанамида дигидробромид

а) N'-(2,2-Диметоксиэтил)-N,N-диэтил-этан-1,2-диамин

Раствор N,N-диэтил-этилендиамина (150 г) в метаноле (500 мл) быстро обрабатывали диметилацеталем глиоксаля (60%-ный масс. раствор в воде, 225 г), добавляя его по каплям при 10-15°С. После завершения добавления раствор нагревали до 15°С, затем до 22°С и оставляли при этой температуре на 16 часов. Реакционную смесь обрабатывали 5%-ным палладием на угле (паста, тип 38Н от Johnson-Matthey, 15 г) и гидрировали при 6 бар (600 кПа) до завершения реакции согласно GC/MS (газовая хроматография/масс-спектроскопия). Катализатор удаляли фильтрацией и фильтрат упаривали досуха (азеотроп с толуолом, 2,5 л) с получением 196,2 г указанного в подзаголовке соединения.

1 H ЯМР (CDCl 3 ): 4.48 (t, 1Н), 3.39 (s, 6H), 2.75 (d, 2H), 2.69 (t, 2H), 2.57-2.48 (m, 6H), 1.01 (ts, 6H).

б) N-[2-(Диэтиламино)этил]-N-(2,2-диметоксиэтил)-3-[2-(1-нафтил)-этокси]пропанамид

Оксалилхлорид (151 мл) добавляли по каплям в течение 45 минут к раствору 3-[2-(1-нафтил)этокси]пропановой кислоты (389 г) (Пример 7 стадия б)) в дихлорметане (2,1 л) и DMF (0,5 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение еще 16 часов. После этого смесь концентрировали, снова растворяли в DCM (дихлорметан) (1,7 л) и добавляли по каплям в течение 1,75 часа при 0°С к раствору N'-(2,2-диметоксиэтил)-N,N-диэтилэтан-1,2-диамина (325 г) и изопропилдиэтиламина (551 мл) в DCM (1,7 л). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов, промывали водным насыщенным раствором бикарбоната натрия (5×1 л), водой (1,5 л), сушили над сульфатом натрия и концентрировали с получением 650 г указанного в подзаголовке соединения.

m/e 431 (M+H + , 100%).

в) N-[2-(Диэтиламино)этил]-3-[2-(1-нафтил)этокси]-N-(2-оксоэтил)-пропанамид

Раствор N-[2-(диэтиламино)этил]-N-(2,2-диметоксиэтил)-3-[2-(1-нафтил)этокси]пропанамида (93 г) в DCM (270 мл) обрабатывали по каплям при 0°С трифторуксусной кислотой (270 мл) в течение 1,5 часа. После добавления реакционную смесь оставляли нагреваться до комнатной температуры и перемешивали в течение еще 1 часа. Реакционную смесь концентрировали, и остаток вливали в водный насыщенный раствор бикарбоната натрия (1800 мл, осторожно). Водную смесь экстрагировали DCM (4×400 мл), и объединенные экстракты сушили над сульфатом магния и концентрировали. Остаток использовали непосредственно в следующей реакции.

г) N-[2-(Диэтиламино)этил]-N-(2-{[2-(4-гидрокси-2-оксо-2,3-дигидро-1,3-бензотиазол-7-ил)этил]амино}этил)-3-[2-(1-нафтил)этокси]пропанамида дигидробромид

Суспензию 7-(2-амино-этил)-4-гидрокси-3Н-бензотиазол-2-она гидрохлорида (53 г) в безводном NMP (N-метилпирролидинон) (216 мл) нагревали до 60°С и обрабатывали одной порцией раствора NaOH (8,2 г) в метаноле (102 мл). Ярко-оранжевую суспензию охлаждали до комнатной температуры и обрабатывали по каплям раствором N-[2-(диэтиламино)этил]-3-[2-(1-нафтил)этокси]-N-(2-оксоэтил)-пропанамида в дихлорметане (475 мл) в течение 20 минут. Реакционную смесь оставляли перемешиваться в течение 25 минут. Затем порциями в течение 20 минут добавляли триацетоксиборгидрид натрия (91,5 г), и смесь перемешивали в течение еще 50 минут. Реакционную смесь вливали в воду (1,8 л), и кислый раствор (pH 5) промывали трет-бутил-метиловым эфиром (ТВМЕ) (3×500 мл). Водную фазу подщелачивали до pH 8 путем добавления твердого карбоната калия и экстрагировали дихлорметаном (3×750 мл); объединенные органические экстракты сушили над сульфатом магния и концентрировали с получением темного масла. Его растворяли в этаноле (200 мл) и добавляли 48%-ную водную бромистоводородную кислоту (73 мл). Раствор выдерживали в течение 30 минут, затем упаривали досуха. Остаток растирали с этанолом (560 мл); полученное твердое вещество собирали фильтрацией и сушили в вакууме при 50°С. Клейкое твердое вещество суспендировали в кипящем этаноле (100 мл) и фильтровали в горячем состоянии. Собранное твердое вещество сушили в вакууме при 50°С. Это вещество перекристаллизовывали из смеси этанол/вода (3:1, 500 мл). После выстаивания в течение ночи полученное твердое вещество собирали фильтрацией и промывали ледяным этанолом (75 мл). Сушка в вакууме при 50°С в течение 24 ч позволила получить 57 г указанного в заголовке соединения.

Агонист 2 2 -адренорецептора (ВА2)

N-[2-(Диэтиламино)этил]-N-(2-{[2-(4-гидрокси-2-оксо-2,3-дигидро-1,3-бензотиазол-7-ил)этил]амино)этил)-3-[2-(3-хлорфенил)этокси]пропанамида дигидробромид

а) трет-Бутил-3-[2-(3-хлорфенил)этокси]пропаноат

2-(3-Хлорфенил)этанол (20 г) обрабатывали гидроксидом бензилтриметиламмония (Triton В ® ) (2,67 мл), и полученную смесь перемешивали в вакууме в течение 30 минут. Затем смесь охлаждали до 0°С и обрабатывали трет-бутилакрилатом (17,40 г). Реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 16 часов. Смесь фильтровали через оксид алюминия (15 г), элюируя эфиром (75 мл). Собранный фильтрат концентрировали, получая указанное в подзаголовке соединение (34,40 г) в виде масла.

1 H ЯМР (CDCl 3 ) 7.26-7.07 (m, 4H), 3.69-3.59 (m, 4H), 2.86-2.81 (t, 2H), 2.50-2.45 (t, 2H), 1.43 (s, 9H).

б) 3-[2-(3-Хлорфенил)этокси]пропановая кислота

трет-Бутил-3-[2-(3-хлорфенил)этокси]пропаноат (Пример 1а), 34,40 г) растворяли в дихлорметане (150 мл) и обрабатывали трифторуксусной кислотой (50 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов, затем концентрировали в вакууме и азеотропно отгоняли с дихлорметаном (2×10 мл). Остаток переносили в дихлорметан (300 мл) и экстрагировали насыщенным гидрокарбонатом натрия (200 мл). Основный слой промывали дихлорметаном (20 мл), затем подкисляли 2 М соляной кислотой. Кислотный слой экстрагировали дихлорметаном (2×200 мл). Органические слои объединяли, промывали рассолом, сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали и концентрировали, получая указанное в подзаголовке соединение (24,50 г) в виде масла.

m/е 227 [М-Н].

в) N-[2-(Диэтиламино)этил]-N-(2,2-диметоксиэтил)-3-[2-(3-хлорфенил)этокси]пропанамид

Оксалилхлорид (9,50 мл) добавляли по каплям в течение 45 минут к раствору 3-[2-(3-хлорфенил)этокси]пропановой кислоты (22,50 г) (Пример 1б) в дихлорметане (120 мл) и DMF (0,5 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение еще 16 часов. Затем смесь концентрировали, снова растворяли в DCM (1,7 л) и добавляли по каплям в течение 1,75 часа при 0°С к раствору N'-(2,2-диметоксиэтил)-N,N-диэтилэтан-1,2-диамина (20,20 г) (Пример 16а) и изопропилдиэтиламина (34,43 мл) в DCM (200 мл). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов, промывали водным насыщенным раствором бикарбоната натрия (3×1 л), водой (1,5 л), сушили над сульфатом натрия и концентрировали, получая 39,50 г указанного в подзаголовке соединения.

m/e 415 (M+H + , 83%).

г) N-[2-(Диэтиламино)этил]-3-[2-(3-хлорфенил)этокси]-N-(2-оксоэтил)-пропанамид

Раствор N-[2-(диэтиламино)этил]-N-(2,2-диметоксиэтил)-3-[2-(3-хлорфенил)этокси]пропанамида (Пример 1в) (20 г) в DCM (500 мл) обрабатывали по каплям при 0°С трифторуксусной кислотой (50 мл) в течение 30 минут. После добавления реакционную смесь оставляли нагреваться до комнатной температуры и перемешивали в течение еще 1 часа. Реакционную смесь концентрировали, и остаток выливали в насыщенный водный раствор бикарбоната натрия (1800 мл; осторожно). Водную смесь экстрагировали DCM (3×400 мл), и объединенные экстракты сушили над сульфатом магния и концентрировали. Остаток использовали непосредственно в следующей реакции.

д) N-[2-(Диэтиламино)этил]-N-(2-[[2-(4-гидрокси-2-оксо-2,3-дигидро-1,3-бензотиазол-7-ил)этил]амино}этил)-3-[2-(3-хлорфенил)этокси]-пропанамида дигидробромид

Суспензию гидрохлорида 7-(2-амино-этил)-4-гидрокси-3Н-бензотиазол-2-она (11,77 г) в безводном NMP (50 мл) нагревали до 65°С и обрабатывали одной порцией раствора NaOH (1,83 г) в метаноле (23 мл). Ярко-оранжевую суспензию охлаждали до комнатной температуры и обрабатывали по каплям раствором N-[2-(диэтиламино)этил]-3-[2-(3-хлорфенил)этокси]-N-(2-оксоэтил)пропанамида (Пример 1г) в дихлорметане (50 мл) в течение 30 минут. Реакционную смесь оставляли перемешиваться в течение 30 минут. Затем порциями в течение 20 минут добавляли триацетоксиборгидрид натрия (20,33 г), и смесь перемешивали в течение еще 16 часов. Реакционную смесь выливали в воду (1,8 л), подщелачивали до pH 8 путем добавления твердого карбоната калия и экстрагировали дихлорметаном (2×500 мл); объединенные органические экстракты сушили над сульфатом магния и концентрировали, получая темное масло. Остаток очищали хроматографией на диоксиде кремния, используя смесь 10% (0,1% водн. NH 3 /MeOH)/DCM в качестве элюента, с получением указанного в подзаголовке соединения в виде коричневого масла. Выход 6,58 г. Масло растворяли в этаноле (150 мл), и добавляли 48%-ую водную бромистоводородную кислоту (10 мл). Раствор выдерживали в течение 30 минут, затем упаривали досуха. Остаток растирали с этанолом (100 мл); полученное твердое вещество собирали фильтрацией и сушили в вакууме при 50. Это вещество перекристаллизовывали из смеси этанол/вода (6:1, 500 мл); после выстаивания в течение ночи полученное твердое вещество собирали фильтрацией и промывали ледяным этанолом (75 мл). Сушка в вакууме при 50°С в течение 24 ч позволила получить 4,96 г указанного в заголовке соединения.

MS: APCI (+ve): 563 (М+1); чистота 99,3% (Т9505М).

1 H ЯМР (DMSO, 90°С) 11.75-11.73 (m, 1Н), 10.08-10.06 (d, 1H), 8.65 (bs, 1H), 7.33-7.19 (m, 4H), 6.89-6.84 (t, 1H), 6.77-6.74 (m, 1H), 3.68-3.58 (m, 8H), 3.17-3.16 (m, 10Н), 2.86-2.80 (m, 4H), 2.67-2.62 (m, 2H), 1.23-1.19 (t, 6H).

Элементный анализ

CHNS: С: 46,54% (46,39); Н: 5,75% (5,70); N: 7,94% (7,73); S: 4,46% (4,42).

Агонист 3 2 -адренорецептора (ВА3)

7-[(1R)-2-({2-[(3-{[2-(2-Хлорфенил)этил]амино}-пропил)тио]-этил}амино)-1-гидроксиэтил]-4-гидрокси-1,3-бензотиазол-2(3Н)-она дигидробромид

а) 1-Хлор-2-[(Е)-2-нитровинил]бензол

2-Хлорбензальдегид (от Aldrich) (10,0 г) смешивали с нитрометаном (26,05 г) и ацетатом аммония (21,92 г) в уксусной кислоте (200 мл), и смесь нагревали при дефлегмации в течение 40 минут. Смесь оставляли охлаждаться до комнатной температуры, и большую часть уксусной кислоты удаляли в вакууме. Остаток растворяли в дихлорметане и промывали водой, затем раствором карбоната калия (×2), затем опять водой. Органические фракции сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали и упаривали, получая желаемое вещество в виде оранжевого масла (12,83 г).

1 H ЯМР 5 (CDCl 3 ) 8.41 (d, 1H), 7.62-7.57 (m, 2H), 7.52-7.48 (m, 1H), 7.43 (dt, 1H), 7.34 (ddd, 1H).

б) 2-(2-Хлорфенил)этанамин

Гидрид алюминия получали путем добавления по каплям раствора серной кислоты (8,40 мл) в безводном THF (60 мл) к перемешиваемому раствору 1,0 М алюмогидрида лития в THF (314 мл) при 0-10°С в атмосфере азота. После перемешивания при 5°С в течение 30 минут по каплям добавляли раствор 1-хлор-2-[(Е)-2-нитровинил]бензола (12,83 г) в безводном THF (160 мл), поддерживая внутреннюю температуру от 0°С до 10°С. После завершения добавления реакционную смесь нагревали при дефлегмации в течение 5 минут. Смесь оставляли охлаждаться до комнатной температуры, затем охлаждали до 0°С, и осторожно по каплям добавляли изопропанол (22 мл), поддерживая температуру ниже 20°С. Осторожно по каплям добавляли 2 М гидроксид натрия (35 мл), поддерживая температуру ниже 20°С. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут, затем фильтровали через слой целита, который затем промывали THF (×3). Фильтрат упаривали досуха. Остаток очищали колоночной хроматографией на диоксиде кремния, используя этилацетат для загрузки вещества, затем 10%-ный триэтиламин в этилацетате, затем смесь 10% триэтиламина, 45% этанола и 45% этилацетата в качестве элюентов и получая желаемое вещество (4,66 г).

1 H ЯМР (CDCl 3 ) 7.36 (dd, 1H), 7.25-7.13 (m, 3H), 2.98 (dt, 2H), 2.91-2.87 (m, 2H).

в) трет-Бутил-[2-(2-хлорфенил)этил]карбамат

К перемешиваемому раствору 2-(2-хлорфенил)этанамина (25,57 г) и триэтиламина (22,87 мл) в безводном THF (300 мл) добавляли раствор ди-трет-бутилдикарбоната (35,85 г) в безводном THF (50 мл) в течение 10 минут при температуре окружающей среды в атмосфере азота. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. Растворители удаляли в вакууме, получая желаемое вещество в виде желтого масла (42,0 г).

1 H ЯМР (CDCl 3 ) 7.35 (d, 1H), 7.25-7.14 (m, 3H), 4.57 (s, 1H), 3.43-3.35 (m, 2H), 2.95 (t, 2H), 1.43 (d, 9H).

г) трет-Бутил-аллил[2-(2-хлорфенил)этил]карбамат

К суспензии гидрида натрия (60%-ная в минеральном масле) (7,23 г), промытой (×3) в безводном DMF (200 мл), добавляли раствор трет-бутил-[2-(2-хлорфенил)этил]карбамата (42,0 г) в безводном DMF (50 мл) в течение 15 минут при 35°С в атмосфере азота. После завершения добавления смесь перемешивали при 50°С в течение 90 минут. Смесь оставляли охлаждаться до комнатной температуры, затем медленно добавляли аллилбромид (15,63 мл), поддерживая температуру 25°С с использованием внешнего охлаждения. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов, затем разбавляли водой и экстрагировали этилацетатом (×3). Органические фракции объединяли, промывали водой, сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали и упаривали. Остаток очищали, используя колоночную хроматографию на диоксиде кремния, загружая с помощью 1%-ного этилацетата в изогексане, затем используя изогексан с этилацетатом (0%, 1%, 2%, 5%) в качестве элюентов с получением желаемого вещества (27,0 г). Было получено несколько смешанных фракций, поэтому их объединяли и повторно очищали, используя колоночную хроматографию на диоксиде кремния, как и ранее, получая еще 4 г желаемого соединения. Обе партии продукта объединяли, получая в сумме 31,0 г.

1 H ЯМР (CDCl 3 ) 7.36-7.31 (m, 1H), 7.21-7.12 (m, 3H), 5.83-5.68 (m, 1H), 5.17-5.05 (m, 2H), 3.86-3.66 (m, 2H), 3.41 (t, 2H), 3.03-2.90 (m, 2H), 1.43 (s, 9H).

HPLC: 95,90% при 220 нМ; [М+Н-Вос] + =196,1 (рассчит. = 295,1339) (мультимодовый +).

д) трет-Бутил-[2-(2-хлорфенил)этил]{3-[(2-гидроксиэтил)тио]-пропил}-карбамат

трет-Бутил-аллил[2-(2-хлорфенил)этил]карбамат (31,0 г) смешивали с 2-меркаптоэтанолом (7,37 мл) и AIBN (2,2'-азо-бис-изобутиронитрил) (1,15 г) и перемешивали при 65°С в течение 45 минут. Смесь охлаждали и добавляли дополнительные количества меркаптоэтанола (1 мл) и AIBN (200 мг). Затем смесь нагревали при 65°С в течение еще 30 минут. Вещество очищали колоночной хроматографией на диоксиде кремния, нанося вещество в 20%-ном этилацетате в изогексане, затем элюируя 20%-ным этилацетатом в изогексане, меняя до 50% с получением желаемого вещества (31,94 г).

1 H ЯМР (CDCl 3 ) 7.38-7.32 (m, 1H), 7.22-7.13 (m, 3H), 3.75-3.68 (m, 2H), 3.41 (t, 2H), 3.32-3.14 (m, 2H), 3.03-2.91 (m, 2H), 2.72 (t, 2H), 2.54-2.36 (m, 2H). 1.85-1.71 (m, 2H), 1.42 (s, 9H).

HPLC: 92,31% при 220 нМ; [М+Н-Вос] + =274,1 (рассчит. = 373,1478) (мультимодовый +).

е) трет-Бутил-[2-(2-хлорфенил)этил]{3-[(2-оксоэтил)тио]пропил}-карбамат

Комплекс триоксида серы: пиридин (30,52 г) растворяли в DMSO (200 мл) и перемешивали при комнатной температуре в атмосфере азота в течение 15 минут. Добавляли DCM (100 мл), затем раствор трет-бутил-[2-(2-хлорфенил)этил]{3-[(2-гидроксиэтил)тио]пропил}карбамата (23,9 г) и основание Хюнига (63,5 мл) в DCM (160 мл), которое добавляли одной порцией (экзотермическая реакция). Полученную смесь перемешивали при температуре окружающей среды в течение 15 минут. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом, промывали водой, затем 1 н. HCl, затем насыщенным раствором бикарбоната натрия, сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали, и растворители удаляли в вакууме. Вещество очищали колоночной хроматографией на диоксиде кремния, элюируя 20%-ным этилацетатом в изогексане, с получением желаемого вещества (12,43 г).

1 H ЯМР (CDCl 3 ) 9.46 (t, 1H), 7.36-7.32 (m, 1H), 7.21-7.13 (m, 3H), 3.40 (t, 2H), 3.29-3.13 (m, 4H), 3.02-2.90 (m, 2H), 2.45-2.34 (m, 2H), 1.82-1.69 (m, 2H), 1.49-1.36 (m, 9H).

ж) трет-Бутил-[2-(2-хлорфенил)этил]{3-[(2-{[(2R)-2-гидрокси-2-(4-гидрокси-2-оксо-2,3-дигидро-1,3-бензотиазол-7-ил)этил]амино}этил)тио]-пропил}карбамат

трет-Бутил-[2-(2-хлорфенил)этил]{3-[(2-оксоэтил)тио]пропил}карбамат (11,32 г) растворяли в смеси метанола (200 мл) и уксусной кислоты (1,74 мл). К раствору добавляли смесь гидрохлорида 7-[(1R)-2-амино-1-гидроксиэтил]-4-гидрокси-1,3-бензотиазол-2(3H)-она (8,0 г), и смесь перемешивали при комнатной температуре в атмосфере азота в течение 1 часа. Добавляли цианоборгидрид натрия (1,92 г), и смесь перемешивали в течение еще 2 часов. Растворители удаляли в вакууме, и остаток разбавляли водой, подщелачивали 0,880 водным аммиаком и экстрагировали этилацетатом (×3) (во время экстракции фильтровали через целит). Органические фракции объединяли, промывали рассолом, сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и упаривали, получая коричневый остаток (15,5 г). Вещество очищали колоночной хроматографией на диоксиде кремния, используя DCM с МеОН (2%, 5%, 10%, 20% и 30%, все с 1% 0,880 водн. NH 3 ) в качестве элюента, получая желаемое вещество (6,67 г; 38%).

1 H ЯМР (DMSO) 7.43-7.38 (m, 1H), 7.30-7.21 (m, 3H), 6.86 (d, 1H), 6.69 (d, 1H), 4.56 (dd, 1H), 3.23-3.10 (m, 2H), 2.88 (t, 2H), 2.71-2.48 (m, 8H), 2.46-2.39 (m, 2H), 1.72-1.62 (m, 2H), 1.40-1.22 (m, 9H).

HPLC: 97,46% при 220 нМ; [М+Н] + =582,1 (рассчит. = 582,1863) (мультимодовый +).

з) 7-[(1R)-2-({2-[(3-{[2-(2-Хлорфенил)этил]амино}-пропил)тио]этил}-амино)-1-гидроксиэтил]-4-гидрокси-1,3-бензотиазол-2(3H)-она дигидробромид

К перемешиваемой суспензии Вос-защищенного соединения со стадии ж) (5,93 г) в DCM (20 мл) добавляли трифторуксусную кислоту (20 мл) при 0°С, и полученную смесь перемешивали в атмосфере азота в течение 30 минут. Смесь разбавляли толуолом, и растворители удаляли, затем производили азеотропную отгонку с толуолом (×2). Остаток растворяли в ацетонитриле, подкисляли 48%-ной водн. HBr и концентрировали в вакууме (не досуха). Смесь дополнительно разбавляли ацетонитрилом, и выпавшее в осадок твердое вещество собирали фильтрацией, промывали ацетонитрилом и сушили под вакуумом, получая 6,35 г. Присутствовали примеси (3,8%) (изомер со стадии д)), поэтому вещество снова растворяли в смеси ацетонитрил: вода (1:1) и очищали, используя препаративную HPLC (колонка С8 (30×80 мм), Sunfire; буфер на основе NH 4 OAc; ацетонитрил 5-50% в течение 10 минут). Полученное вещество сушили в течение ночи в эксикаторе при 10 мбар (1 кПа) над КОН и H 2 SO 4 . Полученную диацетатную соль растворяли в воде и подщелачивали 0,880 водн. аммиаком. Образовывалось белое смолообразное вещество, поэтому воду декантировали, и смолообразное вещество сушили в вакууме, получая свободное основание (4,11 г). Его растворяли в горячем этаноле, раствор фильтровали, затем оставляли охлаждаться до комнатной температуры. Раствор подкисляли 48%-ной водн. HBr и оставляли кристаллизоваться. Белое твердое вещество собирали фильтрацией, промывали этанолом и сушили в вакууме, получая 3,81 г (партия 1).

1 H ЯМР (DMSO) 11.67 (s, 1Н), 10.15 (s, 1H), 8.70 (s, 4H), 7.50-7.30 (m, 4H), 6.94 (d, 1H), 6.78 (d, 1H), 6.45 (s, 1H), 4.96-4.90 (m, 1H), 3.22-3.02 (m, 10Н), 2.86-2.76 (m, 2H), 2.66 (t, 2H), 1.91 (квинтет, 2Н).

HPLC: 99,63% при 220 нМ; [M+H] + =482 (рассчит. = 482,1339) (мультимодовый +).

Элементный анализ:

С

Н

N

S

Рассчитано:

41,04

4,70

6,53

9,96

Обнаружено:

1:

41,07

4,69

6,67

9,72

2:

41,08

4,68

6,74

9,67

3:

40,96

4,68

6,75

9,67

Маточные растворы упаривали досуха, затем растирали с ацетонитрилом. Твердое вещество собирали фильтрацией, получая 719 мг партии 2 (суммарно 4,53 г).

1 H ЯМР (DMSO) 11.67 (s, 1H), 10.15 (s, 1H), 8.80-8.60 (m, 4H), 7.50-7.29 (m, 4H), 6.94 (d, 1H), 6.78 (d, 1H), 6.45 (s, 1H), 4.96-4.89 (m, 1H), 3.22-3.00 (m, 10Н), 2.85-2.76 (m, 2H), 2.66 (t, 2H), 1.90 (квинтет, 2Н).

HPLC: 99,20% при 220 нМ; [М+H] + =482 (рассчит. = 482,1339) (мультимодовый +).

Элементный анализ:

С

Н

N

S

Рассчитано:

41,04

4,70

6,53

9,96

Обнаружено:

1:

40,90

4,69

6,78

9,60

2:

41,01

4,70

6,83

9,60

3:

40,97

4,69

6,76

9,63

Биологическая активность агонистов 2 -адренорецепторов

Продуцирование цАМФ, опосредованное адренергическими 2 -рецепторами

Подготовка клеток

Клетки Н292 выращивали в колбах 225 см 2 в инкубаторе при 37°С, 5% CO 2 , в среде RPMI, содержащей 10% (об./об.) FBS (фетальной телячьей сыворотки) и 2 мМ L-глутамина.

Экспериментальный метод

Прикрепленные Н292-клетки удаляли из колб с культурой ткани посредством обработки раствором Accutase для отделения клеток в течение 15 минут. Колбы инкубировали в течение 15 минут в инкубаторе с увлажнением при 37°С, 5% CO 2 . Отделенные клетки ресуспендировали в среде RPMI (содержащей 10% (об./об.) FBS и 2 мМ L-глутамин) в концентрации 0,05×10 6 клеток на мл. 5000 клеток в 100 мкл добавляли в каждую лунку подготовленного для тканевых культур 96-луночного планшета, и клетки инкубировали в течение ночи в инкубаторе с увлажнением при 37°С, 5% СО 2 . Культуральные среды удаляли, и клетки дважды промывали 100 мкп аналитического буфера и заменяли 50 мкл аналитического буфера (раствор HBSS (сбалансированный солевой раствор Хенкса), содержащий 10 мМ HEPES (N-2-гидроксиэтил-пиперазин-N-2-этансульфоновая кислота) pH 7,4 и 5 мМ глюкозы). Клетки оставляли при комнатной температуре на 20 минут, после чего добавляли 25 мкл ролипрама (1,2 мМ, приготовленного в аналитическом буфере, содержащем 2,4% (об./об.) диметилсульфоксида). Клетки инкубировали с ролипрамом в течение 10 минут, после чего добавляли тестируемые соединения, и клетки инкубировали в течение 60 минут при комнатной температуре. Конечная концентрация ролипрама в анализе составляла 300 мкМ, и конечная концентрация носителя диметилсульфоксида составляла 1,6% (об./об.). Реакцию останавливали путем удаления супернатантов, промывая один раз 100 мкл аналитического буфера и заменяя их 50 мкл лизирующего буфера. Клеточный монослой замораживали при -80°С в течение 30 минут (или в течение ночи).

AlphaScreen - детекция цАМФ

Концентрацию цАМФ (циклоаденозинмонофосфата) в клеточном лизате определяли, используя методологию AlphaScreen . Планшет с замороженными клетками оттаивали в течение 20 минут на планшетном шейкере, затем 10 мкл клеточного лизата переносили в 96-луночный белый планшет. В каждую лунку добавляли по 40 мкл смешанных шариков для AlphaScreen -детекции, предварительно инкубированных с биотинилированным цАМФ, и планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 10 часов в темноте. Сигнал AlphaScreen измеряли, используя спектрофотометр EnVision (Perkin-Elmer Inc.) с рекомендованными установочными параметрами производителя. Концентрации цАМФ определяли относительно калибровочной кривой, определенной в том же эксперименте с использованием стандартных концентраций цАМФ. Строили кривые зависимости ответа от концентрации для Соединения А, и данные аппроксимировали к четырехпараметрическому логистическому уравнению с целью определения как рЕС 50 , так и внутренней активности (1А). Внутреннюю активность выражали в виде доли от максимальной активности, определенной для формотерола в каждом эксперименте. Результаты приведены в Таблице 1.

Анализы селективности

Адренергический 1D-рецептор

Подготовка мембран

Мембраны получали из клеток почки эмбриона человека 293 (НЕК293), экспрессирующих рекомбинантный 1D-рецептор человека. Их разбавляли в аналитическом буфере (50 мМ HEPES, 1 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота); 0,1% желатина; pH 7,4) с получением конечной концентрации мембран, которая обеспечивала четкое окно между максимальным и минимальным специфическим связыванием.

Экспериментальный метод

Анализы проводили в 96-луночных полипропиленовых планшетах с U-образным дном. В каждую тестируемую лунку добавляли 10 мкл [ 3 Н]-празозина (конечная концентрация 0,3 нМ) и 10 мкл тестируемого соединения (10× конечная концентрация). Для каждого анализируемого планшета готовили 8 повторов для связывания [ 3 H]-празозина в присутствии 10 мкл растворителя (10% (об./об.) DMSO в аналитическом буфере; для определения максимального связывания) или 10 мкл BMY7378 (конечная концентрация 10 мкМ; для определения неспецифического связывания (NSB)). Затем добавляли мембраны для достижения конечного объема 100 мкл. Планшеты инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре и затем фильтровали на покрытых PEI (полиэтиленимином) GF/B фильтровальных планшетах, предварительно вымоченных в течение 1 часа в аналитическом буфере, используя 96-луночный планшетный клеточный харвестер Tomtec. Выполняли пять промывок, используя 250 мкл буфера для промывки (50 мМ HEPES, 1 мМ EDTA; pH 7,4) при 4°С для удаления несвязанной радиоактивности. Планшеты сушили, затем заклеивали снизу, используя приспособления Packard для заклеивания планшетов, и в каждую лунку добавляли MicroScint-O (50 мкл). Планшеты заклеивали (TopSeal А) и связанную с фильтром радиоактивность измеряли на сцинтилляционном счетчике (TopCount, Packard BioScience), используя 3-минутный протокол подсчета.

Общее специфическое связывание (В 0 ) определяли путем вычитания среднего значения NSB из среднего значения максимального связывания. Значения NSB также вычитали из значений всех других лунок. Эти данные выражали в виде процента В 0 . Кривые зависимости эффекта от концентрации соединения (ингибирование связывания [ 3 H]-празозина) определяли, используя серийные разведения обычно в диапазоне от 0,1 нМ до 10 мкМ. Данные аппроксимировали к четырехпараметрическому логистическому уравнению с целью определения активности соединений, которую выражали в виде pIC 50 (отрицательный логарифм молярной концентрации, вызывающей 50%-ное ингибирование связывания [ 3 H]-празозина). Результаты показаны ниже в Таблице 1.

Адренергический 1 -рецептор

Подготовка мембран

Мембраны, содержащие рекомбинантные адренергические бета-1-рецепторы человека, получали от Euroscreen. Их разбавляли аналитическим буфером (50 мМ HEPES, 1 мМ EDTA, 120 мМ NaCl; 0,1% желатина; pH 7,4) с получением конечной концентрации мембран, которая обеспечивала четкое окно между максимальным и минимальным специфическим связыванием.

Экспериментальный метод

Анализы проводили в 96-луночных полипропиленовых планшетах с U-образным дном. В каждую тестируемую лунку добавляли 10 мкл [ 125 I]-иодцианопиндолола (конечная концентрация 0,036 нМ) и 10 мкл тестируемого соединения (10× конечная концентрация). Для каждого анализируемого планшета готовили 8 повторов для связывания [ 125 I]-иодцианопиндолола в присутствии 10 мкл растворителя (10% (об./об.) DMSO в аналитическом буфере; для определения максимального связывания) или 10 мкл пропранолола (конечная концентрация 10 мкМ; для определения неспецифического связывания (NSB)). Затем добавляли мембраны для достижения конечного объема 100 мкл. Планшеты инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре и затем фильтровали на покрытых PEI GF/B фильтровальных планшетах, предварительно вымоченных в течение 1 часа в аналитическом буфере, используя 96-луночный планшетный клеточный харвестер Tomtec. Выполняли пять промывок с использованием 250 мкп буфера для промывки (50 мМ HEPES, 1 мМ EDTA, 120 мМ NaCl; pH 7,4) при 4°С для удаления несвязанной радиоактивности. Планшеты сушили, затем заклеивали снизу, используя приспособления Packard для заклеивания планшетов, и в каждую лунку добавляли MicroScint-O (50 мкл). Планшеты заклеивали (TopSeal А) и связавшуюся с фильтром радиоактивность измеряли на сцинтилляционном счетчике (TopCount, Packard BioScience), используя 3-минутный протокол подсчета.

Общее специфическое связывание (В 0 ) определяли путем вычитания среднего значения NSB из среднего значения максимального связывания. Кроме того, значения NSB вычитали из значений для всех других лунок. Эти данные выражали в виде процента В 0 . Кривые зависимости эффекта от концентрации соединения (ингибирование связывания [ 125 I]-иодцианопиндолола) определяли, используя серийные разведения, обычно в диапазоне от 0,1 нМ до 10 мкМ. Данные аппроксимировали к четырехпараметрическому логистическому уравнению с целью определения активности соединений, которую выражали в виде pIC 50 (отрицательный логарифм молярной концентрации, вызывающей 50%-ное ингибирование связывания [ 125 I]-иодцианопиндолола). Результаты показаны ниже в Таблице 1.

D2-Рецептор дофамина

Подготовка мембран

Мембраны, содержащие человеческие рекомбинантные дофаминовые рецепторы подтипа D2, получали от Perkin Elmer. Их разбавляли в аналитическом буфере (50 мМ HEPES, 1 мМ EDTA, 120 мМ NaCl; 0,1% желатина; pH 7,4) с получением конечной концентрации мембран, которая обеспечивала четкое окно между максимальным и минимальным специфическим связыванием.

Экспериментальный метод

Анализы проводили в 96-луночных полипропиленовых планшетах с U-образным дном. В каждую тест-лунку добавляли по 30 мкл [ 3 H]-спиперона (конечная концентрация 0,16 нМ) и по 30 мкл тестируемого соединения (10× конечная концентрация). Для каждого анализируемого планшета готовили 8 повторов для связывания [ 3 H]-спиперона в присутствии 30 мкл носителя (10% (об./об.) DMSO в аналитическом буфере; для определения максимального связывания) или 30 мкл галоперидола (конечная концентрация 10 мкМ; для определения неспецифического связывания (NSB)). Затем добавляли мембраны для достижения конечного объема 300 мкл. Планшеты инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре и затем фильтровали на PEI-покрытых GF/B фильтровальных планшетах, предварительно вымоченных в течение 1 часа в аналитическом буфере, используя 96-луночный планшетный клеточный харвестер Tomtec. Выполняли пять промывок с использованием 250 мкл буфера для промывки (50 мМ HEPES, 1 мМ EDTA, 120 мМ NaCl; pH 7,4) при 4°С для удаления несвязанной радиоактивности. Планшеты сушили, затем заклеивали снизу, используя приспособления Packard для заклеивания планшетов, и в каждую лунку добавляли MicroScint-O (50 мкл). Планшеты заклеивали (TopSeal А) и связавшуюся с фильтром радиоактивность измеряли на сцинтилляционном счетчике (TopCount, Packard BioScience), используя 3-минутный протокол счета.

Общее специфическое связывание (В 0 ) определяли путем вычитания среднего значения NSB из среднего значения максимального связывания. Кроме того, значения NSB вычитали из значений для всех других лунок. Эти данные выражали в виде процента В 0 . Кривые зависимости эффекта от концентрации соединения (ингибирование связывания [ 3 Н]-спиперона) определяли, используя серийные разведения обычно в диапазоне от 0,1 нМ до 10 мкМ. Данные аппроксимировали к четырехпараметрическому логистическому уравнению с целью определения активности соединений, которую выражали в виде pIC 50 (отрицательный логарифм молярной концентрации, вызывающей 50%-ное ингибирование связывания [ 3 Н]-спиперона). Результаты показаны в Таблице 1.

Таблица 1

Соединение

рЕС 50 в отношении 2

Внутренняя активность в отношении 2

pIC 50 в отношении 1-связывания

pIC 50 в отношении 1-связывания

pIC 50 в отношении D2-связывания

ВА1

8,2

0,8

6,6

<5

6,1

ВА2

8,3

0,7

<6,1

<5

5,6

ВА3

9,2

0,8

7,6

6,9

5,8

Данные in vitro для комбинаций

Оценка активности соединений на изолированных трахеальных кольцах от морской свинки, предварительно сократившихся под действием метахолина

Добавление 2 -адренорецепторных агонистов и/или антагонистов мускариновых рецепторов М3 вызывает релаксацию изолированных трахеальных колец морских свинок, предварительно сократившихся под действием мускаринового агониста метахолина. Самцов морских свинок-альбиносов Dunkin-Hartley (300-350 г) умерщвляли посредством смещения шейных позвонков и извлекали трахею. Прикрепленную соединительную ткань удаляли, и каждую трахею разрезали на кольцевые сегменты (шириной 2-3 мм). Их суспендировали в ванночках для органов емкостью 10 мл, содержащих модифицированный раствор Кребса следующего состава (мМ): NaCl 117,56; KCl 5,36; NaH 2 PO 4 1,15; MgSO 4 1,18; глюкоза 11,10; NaHCO 3 25,00 и CaCl 2 2,55. Их поддерживали при 37°С и непрерывно газировали 5%-ным CO 2 в O 2 . В раствор Кребса добавляли индометацин (2,8 мкМ), кортикостерон (10 мкМ), аскорбат (1 мМ), CGP20712A (1 мкМ) и фентоламин (3 мкМ): индометацин для предотвращения развития тонуса гладких мышц вследствие синтеза циклооксигеназных продуктов, кортикостерон для ингибирования процесса захвата 2, аскорбат для предотвращения окисления катехоламина, а CGP20712A и фентоламин для того, чтобы избежать любых осложняющих эффектов, связанных с 1- и -адренорецепторной активацией, соответственно. Трахеальные кольца подвешивали между двумя крючками из нержавеющей стали, один из которых был присоединен к изометрическому датчику силы, а другой присоединен к неподвижной опоре в ванночке для органов. Регистрировали изменения изометрической силы. Хлорид ацетил- -метилхолина (метахолин), индометацин, кортикостерон-21-ацетат, гидрохлорид фентоламина, аскорбиновую кислоту, метансульфат CGP20712A приобретали у Sigma Chemical Company. Индометацин растворяли в 10%-ном масс./об. Na 2 CO 3 , кортикостерон-21-ацетат в этаноле, а остальные соединения в DMSO. Мускариновые антагонисты (МА2), (МА11) и формотерол перед добавлением к тканям разбавляли в растворе Кребса, и уровень DMSO в ванночке составлял <0,1%.

Мускариновый антагонист 2 (МА2): [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(3-фенокси-пропил)-аммония бромид и формотерол

В начале каждого эксперимента к тканям прикладывали силу 1 гс (9,8×10 -3 Н), и прежнее состояние восстанавливали в течение периода уравновешивания 30 мин, пока не устанавливалось неподвижное положение. Затем на ткани воздействовали 1 мкМ мускаринового агониста метахолина для оценки жизнеспособности ткани. Ткани промывали, три раза меняя раствор Кребса в ванночках. Через 30 минут ткани снова, подвергали сокращению с использованием 1 мкМ метахолина. Когда сокращение достигало плато, в среды в ванночках добавляли 1 нМ формотерола, 10 нМ мускаринового антагониста (МА2) (кристаллическая форма А) или комбинацию обоих и оставляли на 60 минут.

Данные собирали, используя программное обеспечение для Windows ADInstruments Chart5, созданное натяжение измеряли перед добавлением метахолина и после того, как ответ на него достигал плато. Ответ на соединение МА2 и/или формотерол измеряли с 10-минутными интервалами после их добавления. Все ответы выражали в виде процента ингибирования метахолин-индуцированного сокращения. Результаты изображены на Фиг.6 и приведены в Таблице 2, где Соединение А представляет собой (МА2).

Таблица 2

Соединение

% ингибирования 1 мкМ метахолин-индуцированного тонуса

10 мин

20 мин

30 мин

40 мин

50 мин

Формотерол (1 нМ)

21

37

41

42

44

Соединение А (10 нМ)

23

62

94

104

106

Соединение А (10 нМ) в присутствии формотерола (1 нМ)

55

97

104

105

106

Таблица 2. % ингибирования 1 мкМ метахолин-индуцированного тонуса под действием формотерола (1 нМ), Соединения А (10 нМ) и Соединения А (10 нМ) в присутствии формотерола (1 нМ) в трахее морских свинок in vitro.

Мускариновый антагонист 11 (МА11): [2-(4-хлор-бензилокси)-этил]-[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-аммония геми-нафталин-1,5-дисульфонат и формотерол

В начале каждого эксперимента к тканям прикладывали силу 1 гс (9,8 мкН), и прежнее состояние восстанавливали в течение периода уравновешивания 30 мин, пока не устанавливалось неподвижное положение. Затем на ткани воздействовали 1 мкМ мускаринового агониста метахолина для оценки жизнеспособности ткани. Ткани промывали, три раза меняя раствор Кребса в ваннах. Через 30 минут ткани снова подвергали сокращению с использованием 1 мкМ метахолина. Когда сокращение достигало плато, в среды в ваннах добавляли 1 нМ формотерол, 10 нМ мускариновый антагонист МА11 или комбинацию обоих и оставляли на 60 минут.

Данные собирали, используя программное обеспечение для Windows ADInstruments Chart5, созданное натяжение измеряли перед добавлением метахолина и после того, как ответ на него достигал плато. Ответ на соединение (МА11) и/или формотерол измеряли с 10-минутными интервалами после их добавления. Все ответы выражали в виде процента ингибирования метахолин-индуцированного сокращения. Результаты изображены на Фиг.7 и приведены в Таблице 3, где Соединение В представляет собой (МА11).

Таблица 3

Соединение

% ингибирования 1 мкМ метахолин-индуцированного тонуса

10 мин

20 мин

30 мин

40 мин

50 мин

Формотерол (1 нМ)

21

37

41

42

44

Соединение В (10 нМ)

11

29

49

67

84

Соединение В (10 нМ) в присутствии формотерола (1 нМ)

38

80

98

103

107

Таблица 3. % ингибирования 1 мкМ метахолин-индуцированного тонуса под действием формотерола (1 нМ), Соединения В (10 нМ) и Соединения В (10 нМ) в присутствии формотерола (1 нМ) в трахее морских свинок in vitro.

Данные in vivo для комбинаций

Оценка функции легких у анестезированных морских свинок

Самцов морских свинок Dunkin-Hartley (300-600 г) взвешивали, и им вводили растворитель (0,05 М фосфат; 0,1% Твина 80; 0,6%-ный солевой раствор; pH 6), или соединение через внутритрахеальный путь с использованием обратимой газовой анестезии (5%-ный галотан в кислороде). Животным вводили соединение или растворитель за два часа до введения метахолина. Морских свинок анестезировали пентобарбитоном (1 мл/кг, раствор в концентрации 60 мг/мл, внутрибрюшинно) приблизительно за 30 минут до первого введения бронхосуживающего средства. В трахею вводили канюлю, и животное вентилировали, используя респираторный насос постоянного объема (Harvard Rodent Ventilator model 683) со скоростью 60 вдохов/мин и дыхательным объемом 5 мл/кг. В яремную вену вводили канюлю для введения метахолина или поддержания анестезии (0,1 мл раствора пентобарбитона; 60 мг/мл; как было необходимо).

Животных переносили в систему Flexivent (SCIREQ, Montreal, Canada) для измерения сопротивления дыхательных путей. Животных вентилировали (квазисинусоидальный режим вентилирования) со скоростью 60 вдохов/мин и дыхательным объемом 5 мл/кг. Создавали положительное давление в конце выдоха, равное 2-3 см Н 2 О. Сопротивление дыхательных путей измеряли, используя устройство "моментального снимка" Flexivent (продолжительность 1 секунда, частота 1 Гц). Как только получали стабильную величину базового сопротивления, животным давали метахолин в возрастающих дозах (0,5; 1; 2; 3 и 5 мкг/кг, в/в (внутривенно)) приблизительно с 4-минутными интервалами с помощью катетера яремной вены. После каждого введения бронхосуживающего средства регистрировали величину пикового сопротивления. Морских свинок подвергали эвтаназии, используя приблизительно 1,0 мл пентобарбитона натрия (Euthatal) внутривенно после завершения измерений функции легких.

Процент бронхопротекции, производимой соединением, рассчитывали для каждой дозы бронхосуживающего средства следующим образом:

,

где % изменения R veh представляет собой среднее от максимального изменения в процентах сопротивления дыхательных путей в группе, которую лечили растворителем. Представленные результаты получали после применения метахолина в дозе 5 мкг/кг и выражали в процентах бронхопротекции (средняя величина ± стандартная ошибка средней величины).

агонист 1 2 -Адренорецептора (BA1: N-[2-(диэтиламино)этил]-N-(2-{[2-(4-гидрокси-2-оксо-2,3-дигидро-1,3-бензотиазол-7-ил)этил]амино}этил)-3-[2-(1-нафтил)этокси]пропанамида дигидробромид и мускариновый антагонист 2 (МА2): [2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(3-фенокси-пропил)-аммония бромид

Морским свинкам вводили растворитель; 3 и 27 мкг/кг Соединения (ВА1), 0,2 мкг/кг Соединения (МА2) (кристаллическая форма А) или комбинацию 3 мкг/кг Соединения (ВА1) и 0,2 мкг/кг Соединения (МА2) внутритрахеальным путем. Введение возрастающих внутривенных доз метахолина (0,5; 1; 2; 3 и 5 мкг/кг) вызывало дозозависимый бронхостеноз у животных, которых лечили растворителем, в диапазоне от 13±2,6% при 0,5 мкг/кг до 2530±280% при 5 мкг/кг через два часа после введения растворителя (n=9). Внутритрахеальное введение Соединения (МА2) в дозе 0,2 мкг/кг вызывало 13%-ное ингибирование метахолин-индуцированного бронхостеноза (2210±268% увеличения сопротивления; n=8). Внутритрахеальное введение Соединения (ВА1) (3 и 27 мкг/кг) за 2 часа до метахолина вызывало 17 и 81%-ное ингибирование метахолин-индуцированного бронхостеноза (2090±239 и 470±221% увеличения сопротивления, соответственно; n=8 и 6 соответственно). Комбинация Соединения (МА2) (0,2 мкг/кг) и Соединения (ВА1) (3 мкг/кг) вызывала 55% ингибирование метахолин-индуцированного бронхостеноза (1140±151% увеличения сопротивления; n=8) (см. Фиг.8, где Соединение А представляет собой (ВА1), а Соединение Z представляет собой (МА2).

Агонист 1 2 -адренорецептора (BA1: N-[2-(диэтиламино)этил]-N-(2-{[2-(4-гидрокси-2-оксо-2.3-дигидро-1,3-бензотиазол-7-ил)этил]амино}этил)-3-[2-(1-нафтил)этокси]пропанамида дигидробромид и мускариновый антагонист 11 (МА11): [2-(4-хлор-бензилокси)-этил]-[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметилъ-диметил-аммония геми-нафталин-1,5-дисульфонат

Морским свинкам вводили растворитель; 1 и 27 мкг/кг Соединения (ВА1); 0,01 мкг/кг Соединения (МА11) или комбинацию 1 мкг/кг Соединения (ВА1) и 0,01 мкг/кг Соединения (МА11) внутритрахеальным путем. Введение возрастающих внутривенных доз метахолина (0,5; 1; 2; 3 и 5 мкг/кг) вызывало дозозависимый бронхостеноз у животных, которых лечили растворителем, в диапазоне от 14±2,6% при 0,5 мкг/кг до 2240±269% при 5 мкг/кг через два часа после введения растворителя (n=10). Внутритрахеальное введение Соединения (МА11) в дозе 0,2 мкг/кг вызывало 16%-ное ингибирование метахолин-индуцированного бронхостеноза (1880±272% увеличения сопротивления, n=6). Внутритрахеальное введение Соединения (ВА1) (1 и 27 мкг/кг) за 2 часа до метахолина вызывало 38 и 89%-ное ингибирование метахолин-индуцированного бронхостеноза (1380±333 и 242±69% увеличения сопротивления, соответственно; n=8 и 6, соответственно). Комбинация Соединения (МА11) (0,2 мкг/кг) и Соединения (ВА1) (3 мкг/кг) вызывала 43%-ное ингибирование метахолин-индуцированного бронхостеноза (1273±260% увеличения сопротивления; n=7) (см. Фиг.9, где Соединение А представляет собой (ВА1), а Соединение Y представляет собой (МА11)).

Формула изобретения

1. Фармацевтический продукт для лечения респираторного заболевания, содержащий комбинацию первого активного ингредиента, представляющего собой мускариновый антагонист, выбранный из:

[2-((S)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(3-фенокси-пропил)-аммониевой соли,

[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(3-фенокси-пропил)-аммониевой соли,

[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-(2-фенетилокси-этил)-аммониевой соли,

[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-[3-(3,4-дихлор-фенокси)-пропил]диметил-аммониевой соли,

[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-[2-(3,4-дихлор-бензилокси)-этил]-диметил-аммониевой соли,

[2-(4-хлор-бензилокси)-этил]-[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-аммониевой соли;

и второго активного ингредиента, представляющего собой агонист 2 -адренорецептора, где каждый активный ингредиент приготовлен в виде препарата для ингаляционного введения.

2. Продукт по п.1, где первый активный ингредиент представляет собой мускариновый антагонист, являющийся бромидной или нападизилатной солью.

3. Продукт по п.1, где первый активный ингредиент представляет собой мускариновый антагонист, являющийся бромидной солью.

4. Продукт по п.1, где первый активный ингредиент представляет собой мускариновый антагонист, являющийся нападизилатной солью.

5. Продукт по п.1, где первый активный ингредиент представляет собой [2-(4-хлор-бензилокси)-этил]-[2-((R)-циклогексил-гидрокси-фенил-метил)-оксазол-5-илметил]-диметил-аммониевую соль.

6. Продукт по любому из пп.1-5, где агонист 2 -адренорецептора представляет собой формотерол.

7. Продукт по любому из пп.1-5, где агонист 2 -адренорецептора выбран из:

N-[2-(диэтиламино)этил]-N-(2-{[2-(4-гидрокси-2-оксо-2,3-дигидро-1,3-бензотиазол-7-ил)этил]амино}этил)-3-[2-(1-нафтил)этокси]пропанамида,

N-[2-(диэтиламино)этил]-N-(2-{[2-(4-гидрокси-2-оксо-2,3-дигидро-1,3-бензотиазол-7-ил)этил]амино}этил)-3-[2-(3-хлорфенил)этокси]пропанамида и

7-[(1R)-2-({2-[(3-{[2-(2-хлорфенил)этил]амино}пропил)тио]этил}амино)-1-гидроксиэтил]-4-гидрокси-1,3-бензотиазол-2(3H)-она,

или их фармацевтически приемлемой соли.

8. Применение продукта по любому из пп.1-7 в изготовлении лекарственного средства для лечения респираторного заболевания.

9. Применение по п.8, где респираторное заболевание представляет собой хроническую обструктивную болезнь легких.

10. Способ лечения респираторного заболевания, включающий одновременное, последовательное или раздельное введение:

(а) терапевтически эффективной дозы первого активного ингредиента, представляющего собой антагонист мускариновых рецепторов, как он определен в любом из пп.1-5; и

(б) терапевтически эффективной дозы второго активного ингредиента, представляющего собой агонист 2 -адренорецептора; пациенту, нуждающемуся в этом.

11. Набор для лечения респираторного заболевания, содержащий препарат первого активного ингредиента, представляющего собой антагонист мускариновых рецепторов, как он определен в любом из пп.1-5, и препарат второго активного ингредиента, представляющего собой агонист 2 -адренорецептора, и возможно инструкции по одновременному, последовательному или раздельному введению данных препаратов пациенту, нуждающемуся в этом.

12. Фармацевтическая композиция для лечения респираторного заболевания, содержащая, в смеси, первый активный ингредиент, представляющий собой антагонист мускариновых рецепторов, как он определен в любом из пп.1-5, и второй активный ингредиент, представляющий собой агонист 2 -адренорецептора.

РИСУНКИ