Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
Патент на изобретение №2460540

(19)

RU

(11)

2460540

(13)

C2

(51) МПК A61K39/395 (2006.01)

A61P35/00 (2006.01)

C12N15/12 (2006.01)

C07K16/28 (2006.01)

C12N15/63 (2006.01)

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ Статус: по данным на 07.09.2012 - нет данных Пошлина:

(21), (22) Заявка: 2008146922/10, 27.04.2007

(24) Дата начала отсчета срока действия патента:

27.04.2007

Приоритет(ы):

(30) Конвенционный приоритет:

28.04.2006 US 60/795,831

(43) Дата публикации заявки: 10.06.2010

(45) Опубликовано: 10.09.2012

(56) Список документов, цитированных в отчете о

поиске: STOICA GE et al. "Identification of anaplastic lymphoma kinase as a receptor for the growth factor pleiotrophin". J Biol Chem. 2001 May 18; 276(20), с.16772-16779. STOICA GE et al. "Midkine binds to anaplastic lymphoma kinase (ALK) and acts as a growth factor for different cell types". J Biol Chem. 2002 Sep 27; 277(39), с.35990-35998. AUF DER MAURA, et al. "Antigen-independent selection of intracellular stable antibody frameworks". Methods. 2004 Oct; 34(2), с.215-224. US2001021505 A1, 13.09.2001. РОЙТ А. и др. Иммунология. - М.: Мир, 2000, с.97-112.

(85) Дата начала рассмотрения заявки PCT на национальной фазе: 28.11.2008

(86) Заявка PCT:

CH 2007/000202 20070427

(87) Публикация заявки PCT:

WO 2007/124610 20071108

Адрес для переписки:

103735, Москва, ул. Ильинка, 5/2, ООО "Союзпатент", пат.пов. А.П.Агурееву, рег. 590

(72) Автор(ы):

АУФ ДЕР МАУР Адриан (CH),

ЛИХТЛЕН Петер (CH),

БАРБЕРИ Олсайд (CH)

(73) Патентообладатель(и):

ДЕЛЕНЕКС ТЕРАПЬЮТИКС АГ (CH)

(54) АНТИТЕЛА, СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С ВНЕКЛЕТОЧНЫМ ДОМЕНОМ ТИРОЗИНКИНАЗНОГО РЕЦЕПТОРА (ALK)

(57) Реферат:

Изобретение относится к биохимии и представляет собой варианты антител, связывающих белок киназы анапластической лимфомы (ALK) человека. Также представлены: варианты антител с радиоактивной меткой или токсином; последовательность ДНК, кодирующая антитело; экспрессионный вектор, содержащий ДНК-последовательность; клетка-хозяин, трансформированная вектором; способ получения антитела посредством культивирования клетки, а также применение антитела для производства лекарственного средства для лечения рака или опухолей. Изобретение можно эффективно использовать для лечения опухоли или рака. 6 н. и 26 з.п. ф-лы, 5 ил., 2 табл., 5 пр.

Перекрестные ссылки на родственные заявки

Заявка заявляет приоритет предварительной заявки US 60/795831, зарегистрированной 28 апреля 2006 г., все содержание которой включено сюда посредством ссылки.

Содержание всех патентов, патентных заявок и ссылок, процитированных по ходу настоящей заявки, включено сюда полностью посредством ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к антителу, специфичному к ALK человека (киназе анапластической лимфомы), в частности к scFv, к кодирующей его последовательности нуклеиновой кислоты, его получению и применению в качестве медикамента или с диагностическими целями. Упомянутое антитело применимо для местного лечения опухолей или рака, в частности глиобластомы.

Уровень техники

ALK (киназа анапластической лимфомы, CD246) является членом семейства рецепторов тирозинкиназы (RTK). Как типичный представитель этого семейства она является трансмембранным белком типа I, в основном состоящим из трех доменов: внеклеточного домена, связывающего лиганд (аминокислотные остатки 19-1038), который содержит домен LDL-рецептора класса А и два домена МАМ (МАМ: меприн, А5 антиген протеиновая тирозинфосфатаза µ), трансмембранного домена (аминокислотные остатки 1039-1059) и цитоплазматического домена (аминокислотные остатки 1060-1620), содержащего домен тирозинкиназы. На N-конце образующегося белка присутствует сигнальный пептид (аминокислотные остатки 1-18), который отщепляется при секреции.

Полноцепочечные ALK мыши и человека были клонированы в 1997 г. двумя независимыми группами (Iwahara 1997; Morris 1997). ALK обладает высоким сходством с RTK, называемым лейкоцитарной тирозинкиназой (LTK) и принадлежит сверхсемейству рецепторов инсулина. ALK проявляет 57% идентичности аминокислотной последовательности и 71% сходства аминокислотной последовательности с LTK в районах их перекрывания (Morris 2001). ALK обладает высокой степенью N-гликозилирования и содержит 21 предполагаемый участок N-гликозилирования. Аминокислотные остатки от 687 до 1034 обладают значительным сходством (50% идентичности) с LTK. Однако проксимальная N-концу последовательность из 686 аминокислот не демонстрирует никакой гомологии ни с одним известным белком за исключением очень короткой последовательности, обнаруженной также в рецепторе LDL (Duyster 2001/SWISSPROT). Дополнительно, она содержит два домена МАМ в виде аминокислотных последовательностей 264-427 и 478-636 (меприн, А5 антиген протеиновая тирозинфосфатаза µ). Считается, что эти домены обладают функцией адгезии, поскольку они широко распространены среди различных белков адгезии, задействованных в межклеточном взаимодействии (De Juan 2002). Дополнительно, имеется участок связывания предполагаемых лигандов ALK, соответствующий аминокислотной последовательности 396-406 (Stoica 2001; см. ниже). Аминокислотная последовательность киназного домена мышиной ALK демонстрирует 98% идентичность аминокислотной последовательности человеческой ALK, 78% идентичность аминокислотной последовательности мышиной LTK, 52% идентичность аминокислотной последовательности мышиной ros, 47% идентичность аминокислотной последовательности рецептору инсулиноподобного ростового фактора человека и 46% идентичность аминокислотной последовательности инсулинового рецептора человека (Iwahara 1997; Ladanyi 2000). Никакие сплайсинг-варианты ALK не были описаны до сих пор. Однако ALK часто связывают с хромосомными транслокациями (см. ниже).

Ген ALK занимает около 315 кб и включает 16 экзонов. Большая часть гена состоит из двух больших интронов, охватывающих около 170 кб. Транскрипт ALK составляет 6,5 кб в длину (Kutok 2002). Согласно Morris кДНК составляет 6226 пар оснований (Morris 2001).

Экспрессия ALK у мышей начинается во время эмбриогенеза примерно на стадии развития Е11, сохраняется в неонатальном периоде развития, где он экспрессируется в нервной системе. У взрослых его физиологическая экспрессия ограничена определенными нейрональными районами ЦНС (нервными и глиальными клетками и, вероятно, эндотелиальными клетками) на низком уровне (Morris 1997; Duyster 2001; Stoica 2001). Действительно, распространенность ALK в постнатальном периоде падает (Morris 2001). На основе образца (распределения) его экспрессии сделано предположение о роли рецептора в развитии головного мозга (Duyster 2001). Ограниченная нервной системой экспрессия ALK предполагает, что он служит рецептором нейротрофных факторов (см. далее). В согласии с этим образец его экспрессии перекрывается с генами, кодирующими семейство нейротрофиновых рецепторов TRK (Morris 2001). Однако мыши, несущие нокаут ALK, не проявляют какого-либо определенного фенотипа (неопубликованные данные), что может быть обусловлено некоторой функциональной избыточностью членов семейства TRK или других нейротрофиновых рецепторов. Следует отметить, что гематопоэтические ткани не показывают никакого различимого уровня экспрессии ALK (см. ниже) (Morris 2001).

Недавно описаны два потенциальных лиганда ALK «плейотрофин» (PTN) и «мидкин» (МК) (Stoica 2001; Duyster 2001; Stoica 2002). Взаимодействие между PTN и ALK идентифицировано с помощью очищенного белка плейотрофина человека для скрининга пептидной библиотеки фагового дисплея. С помощью такого способа была идентифицирована последовательность, присутствующая во внеклеточном домене ALK (аминокислотные остатки 396-406). Важно, что эта последовательность не является общей с LTK, являющейся RTK наиболее близкородственной ALK. Этот район связывания лиганда также является консервативным у потенциального гомолога ALK у Drosophila (Loren 2001). ALK быстро фосфорилируется при связывании PTN (Bowden 2002). Дополнительно, показано, что ALK стимулируется плейотрофином в культуре клеток. Это делает взаимодействие плейотрофина с ALK особенно интересным в свете участия плейотрофина в патологических процессах (Stoica 2001). Клеточные линии, лишенные экспрессии ALK, неспособны проявлять ростовой ответ на плейотрофин и vice versa (Stoica 2001). In vivo повышенные уровни плейотрофина показаны в сыворотке крови больных, страдающих различными солидными опухолями, и исследования на животных указывают на вклад плейотрофина в рост опухолей (Stoica 2002). Роль PTN в качестве лимитирующего скорость ангиогенного фактора при росте опухолей хорошо установлена на животных моделях (Choudhuri 1997). В 1996 г. Czubayko et al. (Czubayko 1996) показали важность PTN в ангиогенезе опухолей при предотвращении апоптоза и при метастазах путем модуляции уровней PTN с помощью направленного применения рибозимов. Уровни PTN в сыворотке крови мышей показали четкую корреляцию с размером опухолей. PTN играет значительную роль в ряде наиболее агрессивных типов рака человека, таких как меланома и рак поджелудочной железы, предоставляя таким образом интересные перспективы для возможных дальнейших применений ингибитора ALK (Weber 2000; Stoica 2001). Среди больных людей повышенные уровни плейотрофина в сыворотке крови обнаружены у больных раком поджелудочной железы (n=41; Р<0,0001) и раком кишечника (n=65; Р=0,0079). У здоровых индивидуумов PTN экспрессируется строго регулируемым образом во время перинатального развития органов и в выборочных популяциях нейронов и глии у взрослых.

Наличие совместной экспрессии PTN и ALK, как обнаружено у некоторых раковых клеточных линий, указывает на то, что они могут образовывать аутокринную петлю ростовой стимуляции (Stoica 2001). Несмотря на все эти данные из литературы следует, что неясно, является ли действие PTN опосредованным одним ALK и/или другими неидентифицированными рецепторами PTN (Duyster 2001). Предложены, по меньшей мере, два других потенциальных рецептора PTN: рецептор тирозинфосфатазы RPTP и гепаринсульфат протеогликан N-синдекан. Однако RPTP может действовать как модулятор сигнала в PTN/ALK пути передачи сигнала и N-синдекан может действовать в качестве шаперона лиганда (Bowden 2002).

Недавно в качестве второго лиганда ALK был идентифицирован другой секретируемый ростовой фактор, родственный плейотрофину, называемый мидкином (МК). Сходным с PTN способом связывающую и активирующую функции МК (например, индукцию колониеобразования на мягком агаре в культуре клеток) можно блокировать тем же антителом, выработанным против ALK-ECD (Stoica 2001). Подобно плейотрофину, мидкин регулируется на повышение во многих опухолях, хотя его физиологическая экспрессия в нормальных тканях взрослых очень ограничена (Stoica 2002). Анализ 47 образцов опухоли мочевого пузыря выявил, что экспрессия МК значительно повышена (примерно в четыре раза) по сравнению с нормальной тканью мочевого пузыря. Дополнительно, заметная сверхэкспрессия коррелирует с плохой выживаемостью больных (O'Brien 1996).

Однако сродство МК к ALK примерно в пять раз ниже, чем сродство плейотрофина (Stoica 2002). Интересно, что, как и в случае плейотрофина, ингибирование ALK рибозимами также ингибирует воздействия МК на клеточную культуру (Stoica 2002). Авторы этих исследований также пришли к заключению, что ингибирование пути PTK/MK/ALK открывает очень привлекательные возможности для лечения различных заболеваний, у некоторых из которых пока что возможности лечения очень ограничены, например глиобластомы и рака поджелудочной железы (Stoica 2002).

У здоровых индивидуумов экспрессия мРНК ALK достигает пика во время неонатального периода и сохраняется у взрослых в нескольких избранных разделах нервной системы. Недавно экспрессию белка ALK обнаружили также в эндотелиальных клетках, связанных с нейрональными и глиальными клетками. Доказательство того, что, по крайней мере, часть злокачественных активностей, описанных для плейотрофина, опосредована ALK, получено в опытах, в которых экспрессию ALK сводят на нет с помощью направленного применения рибозима.

Такое истощение ALK предотвращало стимулированное плейотрофином фосфорилирование противоапоптозного белка Akt и приводило к продлению жизни мышей, получивших ксенотрансплантаты. Действительно, количество апоптозных клеток в трансплантатах опухоли значительно повышено при подавлении экспрессии ALK (Powers 2002).

Доказательство того, что злокачественные активности, описанные для МК, опосредованы ALK, получено в экспериментах с моноклональными антителами против ALK ECD. Добавление супернатанта клеток гибридомы с двумя антителами против ALK ECD при разведении 1:25 приводит к значительному уменьшению колониеобразования клетками SW-13 в мягком агаре (Stoica 2002). Анализ десяти различных клеточных линий выявил, что способность к ростовому ответу на PTN отлично коррелирует с экспрессией мРНК ALK (обнаружено, что следующие клеточные линии, отвечавшие на PTN, экспрессируют мРНК ALK: HUVEC, NTH3T3, SW-13, Colo357, МЕ-180, U87, MD-MB 231; Stoica 2001). Интересно, что у некоторых раковых клеточных линий (Colo357 рак поджелудочной железы, Hs578T рак груди и U87 глиобластома) PTN и ALK экспрессируются совместно, указывая на то, что PTN и ALK образуют аутокринную петлю стимуляции роста (Stoica 2001).

Интересно то, что показано, что оба PTN и МК вызывают транскрипционную регуляцию на повышение противоапоптозного белка bcl-2 (Stoica 2002). Дополнительно, активированный Akt (который является важной нижерасположенной мишенью аберрантной передачи сигнала ALK) фосфорилирует проапоптозный фактор, называемый bad, приводя, таким образом, к диссоциации bcl-xl, который, будучи свободным от bad, может подавлять апоптоз путем блокирования высвобождения цитохрома с (см. ссылки в Bowden 2002).

Аберрантная экспрессия ALK может быть вовлечена в развитие нескольких типов рака. Однако первоначально ее связывали с подгруппой высокозлокачественных неходжкинских лимфом (NHL), так называемых анапластических крупноклеточных лимфом (ALCL). Неходжкинские лимфомы представляют клональные неоплазии, развивающиеся из различных клеток лимфатического происхождения.

У большинства больных с первичным системным клиническим подтипом ALCL имеется транслокация t2,5, приводящая к экспрессии составного белка, соединяющего N-конец нуклеофосмина (NPM) с С-концом ALK. Составной белок состоит из аминокислотных остатков 1-117 NPM, присоединенных к аминокислотным остаткам 1058-1620 ALK, и хромосомный разрыв находится в интроне, расположенном между экзонами, кодирующими ТМ и околомембранный домен ALK (Duyster 2001). NPM-ALK является продуктом транскрипции, содержащим открытую рамку считывания из 2040 пар оснований, кодирующих белок из 680 аминокислотных остатков (Morris 2001). Это соответствует разрыву в интроне 4 NPM, который охватывает 911 пар оснований, и в интроне 16 ALK, который охватывает 2094 пар оснований (Kutok 2002). Скорее всего, последовательность ALK в этом составном белке является минимальной последовательностью, необходимой, чтобы белок приводил к ALCL (Duyster 2001). Инверсированный составной белок (ALK-NPM) не экспрессируется, по крайней мере, в лимфоидных клетках (Kutok 2002). Белок NPM дикого типа характеризуется повсеместной экспрессией и функционирует в качестве переносчика белков из цитоплазмы в ядро. Фактически NPM является ядерным белком размером 38 кДа, кодируемым хромосомой 5, который содержит NLS, связывает ядерные белки и участвует в передвижении цитоплазма/ядро (Duyster 2001). NPM является одним из наиболее распространенных ядерных белков и обычно присутствует в виде гексамера (Morris 2001). Наиболее важно то, что NPM обычно претерпевает самоолигогмеризацию (гексамеры), а также гетерогенную олигомеризацию с NPM-ALK (Duyster 2001). Транслокация 2;5 помещает часть гена ALK, кодирующую тирозинкиназу на хромосоме 2 под контроль сильного промотора NPM на хромосоме 5, что приводит к постоянной экспрессии химерного белка NPM-ALK (p80) (Duyster 2001). Поэтому ALK киназа является нерегулируемой и эктопической как в плане клеточного цикла (лимфоидного), так и клеточного компартмента (ядро/ядрышко и цитоплазма) (Ladanyi 2000). Локализация NPM (питоплазматическая или ядерная), по всей видимости, не влияет на его действие на генез лимфом (Duyster 2001). Возникающая аберрантная тирозинкиназная активность запускает злокачественное перерождение через конститутивное фосфорилирование внутриклеточных мишеней. Разные другие менее распространенные составные белки с ALK также связаны с ALCL. Все варианты показывают связь тирозинкиназного домена ALK с альтернативным промотором, регулирующим его экспрессию.

Показано, что полноцепочечная ALK также экспрессируется примерно в 92% клеток первичной нейробластомы и в некоторых рабдомиосаркомах (Lamant 2000). Однако до сих пор не было показано какой-либо корреляции между экспрессией ALK и биологией опухоли. Этот факт, взятый вместе с отсутствием доказательства в отношении значительных уровней эндогенно фосфорилированной ALK в этих опухолях, предполагает, что экспрессия ALK в нейробластоме отражает ее обычную экспрессию в незрелых нейрональных клетках, а не первичную онкогенную роль, и ALK в этих опухолях не является фосфорилированным конститутивно, таким образом ставя под вопрос важность роли ALK в этих опухолях (Duyster 2001; PuIford 2001). Тем не менее, передача сигнала ALK может быть важной, по меньшей мере, в некоторых нейробластомах, как предполагают Miyake et al., которые обнаружили сверхэкспрессию и конститутивное фосфорилирование ALK благодаря генной амплификации в клеточных линиях, выведенных из нейробластомы (Miyake 2002). Однако другие клеточные линии, выведенные из нейробластомы, не показывают конститутивной активации ALK, выступая, таким образом, против основного участия ALK в патологии (Dirks 2002; PuIford 2004).

Интереснее всего, что ALK кажется важным для роста глиобластомы многоформной, очень злокачественной опухоли мозга, предоставляющей очень ограниченные возможности для терапии (Powers 2002). Показано, что в этих разрушительных опухолях происходят множественные генетические изменения, включая утрату или мутации PTEN, р53 и INK4a-ARF. Дополнительно, передача сигнала RTK играет особенно важную роль в росте и развитии этих опухолей, которые сверхэкспрессируют различные ростовые факторы, например PDGF, HGF, NGF и VBGF, что указывает на наличие аутокринных петель сигнала RTK. Powers и соавторы показали экспрессию мРНК и белков ALK в образцах опухоли больных глиобластомой, тогда как такие сигналы не детектировались в нормальных смежных тканях головного мозга (Powers 2002). Дополнительно, клетки глиобластомы человека U87MG (полученные от больного и представляющие хорошо охарактеризованную модельную систему для исследования генезиса опухолей и передачи сигнала в глиобластоме) демонстрируют ALK-зависимое противоалоптозное поведение в исследовании с применением ксенотрансплантата. Когда ALK подавлен в этих раковых клетках с помощью рибозимов, мыши, которым инъецировали такие опухолевые клетки, выживают, по меньшей мере, в два раза дольше, чем мыши, которым инъецировали опухолевые клетки дикого типа, и такие опухолевые клетки демонстрируют значительно повышенный апоптоз. Таким образом, ALK и его лиганды предоставляют важный сигнал выживания, который является лимитирующим скорость роста опухолевых клеток U87MG in vivo (Powers 2002). Эти данные указывают, что ингибирование передачи сигнала ALK может быть многообещающим подходом для улучшения прогноза продолжительности жизни больных глиобластомой.

Глиобластома многоформная с большим отрывом является наиболее распространенной и злокачественной первичной глиальной опухолью с количеством случаев примерно 2/100000 в год (примерно 15000 случаев в US и Западной Европе в год). Она преимущественно поражает полушария головного мозга, но может также поразить ствол мозга (в основном у детей) или спинной мозг. Опухоли могут появляться de novo (первичная глиобластома) или могут развиваться из астроцитом более низкой степени (вторичная глиобластома). Первичные и вторичные глиобластомы демонстрируют небольшое молекулярное перекрывание и на молекулярном уровне представляют собой различные заболевания. Они обе содержат много генетических отклонений, включая изменения р53, EGFR, MDM2, PDGF, PTEN, p16, RB.

Никаких значительных достижений терапии не достигнуто за последние 25 лет. Терапии являются только паллиативными и могут продлевать прогноз жизни от 3 месяцев до одного года. Больные обычно проявляют медленно прогрессирующий неврологический дефицит, например слабость моторики, симптомы внутричерепного давления, например головная боль, головокружение, дурнота, рвота, когнитивные нарушения или припадки. Изменения личности также могут быть ранними симптомами. Этиология глиобластомы неизвестна, семейные случаи представляют менее 1%. Единственным реальным идентифицированным фактором риска является контакт с бензиновыми соединениями. Диагноз обычно ставят с помощью исследования изображений мозга (СТ, ЯМР) и биопсии. Полное определение стадии большинства глиобластом не является ни практическим, ни возможным, поскольку у этих опухолей нет ясно определенных границ. Скорее они проявляют хорошо известные тенденции к местной инвазии и распространению по путям плотного белого вещества. Первичной причиной того, почему невозможно лечение до исцеления больного, является то, что опухоль находится за пределами местного контроля при диагностике. Первичными химиотерапевтическими агентами являются кармустин (алкилирующий агент) и цисплатина, но только 40% больных до некоторой степени реагируют на лечение.

Хотя имеются известные неопределенности относительно роли ALK в глиобластомах, это заболевание предлагает различные подходы для направленных на ALK лекарств. Фактически для этой разрушительной болезни даже небольшое улучшение возможностей имеющейся на настоящее время терапии сослужит огромную службу потребностям медицины. Важно заметить, что, поскольку клетки глиобластомы экспрессируют полноцепочечный ALK, для лечения этого рака можно считать ALK мишенью не только для небольших молекул ингибиторов киназы, но также для антител и/или фрагментов антител, например scFv, т.е. для индукции апоптоза в клетках опухоли. Строго ограниченная локализация глиобластомы в ЦНС способствует применению scFv, поскольку их можно эффективно доставлять в ЦНС (быстрый клиренс отсутствует из-за компартментализации, но имеется лучшее проникновение в опухоль по сравнению с IgG из-за их меньшего размера). Антитела и/или фрагменты антител можно направлять против связывающей лиганд последовательности ALK (аминокислотные остатки 396-406) или против других областей внеклеточной части рецептора.

Очень ограниченная экспрессия ALK в здоровых тканях при физиологических условиях указывает, что опухоли, экспрессирующие ALK, могут быть превосходными мишенями при лечении болезни с применением радиоактивных или связанных с токсином антител и/или фрагментов антител независимо от того, является ли ALK вовлеченным в патогенез этих опухолей или нет. В дополнение к клеткам глиобластомы экспрессия ALK с высокой значимостью обнаружена в клеточных линиях меланомы и клеточных линиях карциномы груди (где она не является конститутивно фосфорилированной) (Dirks 2002). Тот факт, что большая часть внеклеточного домена ALK представляется довольно уникальной в протеоме человека, должно сделать этот подход высокоспецифичным.

WO 9515331/US 5529925 раскрывает клонирование и секвенирование последовательностей нуклеиновых кислот человека, которые подвергаются перегруппировке при хромосомной перестановке t(2;5) (p23;q35), происходящей в лимфоме человека. Обнаружено, что перестановка перемещает последовательность гена ядерного фосфопротеина (гена NPM) на хромосоме 5q35 к последовательности ранее не идентифицированного гена тирозинкиназы (здесь и далее гена ALK) на хромосоме 2р23. Последовательность составного гена и составного белка (составного гена и белка NPM/ALK соответственно) также раскрыты.

Полная последовательность ALK запатентована в US 5770421, названном "Human ALK Protein Tyrosine Kinase." Дополнительно, патент US 6174674 В1 "Method of detecting a chromosomal rearrangement involving a breakpoint in the ALK or WPM gene" раскрывает праймеры для детектирования слитой (составной) последовательности NPM-ALK в образцах, полученных от больных. В другой патентной заявке US 6696548 "ALK protein tyrosine kinase/receptor and ligands thereof" раскрыто применение ALK для детектирования лигандов ALK и связывание антител со специфическими последовательностями ALK. Раскрыт также способ идентификации агента, способного связываться с выделенным полипептидом ALK.

WO 0196394/US 20020034768 раскрывают роль ALK в качестве рецептора плейотрофина. US 20040234519 раскрывает антитела против плейотрофина, и WO 2006020684 описывает определение плейотрофина.

Раскрытие изобретения

Основным объектом изобретения является предоставление стабильного и растворимого антитела или производного антитела, которое связывается с человеческим белком ALK in vitro и in vivo. Наиболее предпочтительно антитело является специфически направленным против связывающего лиганд домена ALK (аминокислотные остатки 396-406) и в этой связи блокирует как биологическое действие МК, имеющие K D для ALK приблизительно 170 пМ, так и биологическое действие PTN, имеющего K D для ALK примерно 20-30 пМ (Stoica 2002; Stoica 2001). В предпочтительном осуществлении упомянутое антитело или фрагмент антитела является scFv антителом или Fab фрагментом. Далее термин антитело включает полноцепочечные антитела, а также производные антитела.

Теперь, для того чтобы выполнить эти и дополнительные объекты изобретения, которые прояснятся при прочтении описания, упомянутое антитело характеризуется тем, что оно включает CDR3 вариабельного района тяжелой цепи с последовательностью, имеющей, по меньшей мере, 50% идентичности последовательности SEQ. ID. NO:2. Предпочтительно идентичность последовательности составляет, по меньшей мере, 60%, 65%, 75%, 85% или более, предпочтительно, по меньшей мере, 92%. Наиболее предпочтительно упомянутое антитело имеет CDR3 V H с последовательностью SEQ. ID. NO:2.

В одном осуществлении антитело или его связывающая антиген часть согласно изобретению специфически связывается с конкретным эпитопом белка ALK. Такие аминокислотные остатки эпитопа находятся, например, среди аминокислотных последовательностей 1-50, 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750-800, 800-900, 900-1000, 1000-1100, 1100-1200, 1200-1300, 1300-1400, 1400-1500 или 1500-1620 белка ALK или их любых интервалов, частей или отрезков. В одном осуществлении антитело или его связывающая антиген часть специфически связывается с эпитопом, включающим, в основном состоящим, или фрагментом района, охватывающего аминокислотные остатки 391±3 и 406±3 (SEQ. ID No:91 показывает аминокислотные остатки от 388 до 409 человеческого белка ALK), предпочтительно аминокислотные остатки 391-406 (SEQ. ID. No:1) белка ALK (SEQ ID NO:1). Понятно, что указанные отрезки не следует рассматривать как отрезки, имеющие резкие границы, но что антитело или его связывающая антиген часть может связываться или частично связываться с районом, расположенным близко или находящимся внутри связывающего лиганд домена ALK. Предпочтительно антитела или производные антител связываются с эпитопом белка ALK из 10-20 аминокислотных остатков в длину.

В другом осуществлении антитело или его связывающая антиген часть может характеризоваться как специфически связывающаяся с белком ALK с K D менее примерно 10×10 -6 М. В конкретном осуществлении антитело или его связывающая антиген часть специфически связываются с белком ALK (иди его фрагментом) с K D , по меньшей мере, примерно 10×10 -7 М, по меньшей мере, примерно 10×10 -8 М, по меньшей мере, примерно 10×10 -9 М, по меньшей мере, примерно 10×10 -10 М, по меньшей мере, примерно 10×10 -11 М, по меньшей мере, примерно 10×10 -12 М или с еще более благоприятной K D .

В других различных осуществлениях антитело или его связывающая антиген часть включает вариабельный район тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности аминокислотной последовательности вариабельного района тяжелой цепи согласно SEQ ID NO:4.

В других осуществлениях антитело или его связывающая антиген часть включает вариабельный район легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности аминокислотной последовательности вариабельного района легкой цепи согласно SEQ ID NO:5.

В других дополнительных осуществлениях антитело или его связывающая антиген часть включает как вариабельный район тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности аминокислотной последовательности вариабельного района тяжелой цепи согласно SEQ ID NO:4, так и вариабельный район легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности аминокислотной последовательности вариабельного района легкой цепи согласно SEQ ID NO:5.

В других конкретных осуществлениях антитело или его связывающая антиген часть специфически связывается с эпитопом, перекрывающимся с эпитопом, связывающимся с антителом или производным антитела ESBA521 (SEQ. ID. NO:19) и/или конкурирует за связывание белка ALK или его части с антителом или производным антитела ESBA521. В родственном осуществлении антитело или его связывающая антиген часть специфически связывается с эпитопом, включающим остатки 391-406 (SEQ ID NO:1) белка ALK или его частью.

Вариабельные районы тяжелой и легкой цепей антител или их связывающие антиген части обычно включает один или более район, определяющий комплементарность (CDR). Такие районы включают CDR1, CDR2 и CDR3. В конкретных осуществлениях CDR вариабельных районов тяжелой цепи имеют, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 95% или более предпочтительно 100% идентичности CDR антитела ESBA521. В других конкретных осуществлениях CDR вариабельных районов легкой цепи имеют, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 95% или более предпочтительно 100% идентичности CDR вариабельного района легкой цепи антитела ESBA521.

Соответственно, конкретное антитело или фрагмент согласно изобретению включает вариабельный район тяжелой цепи, включающий один или более район, определяющий комплементарность (CDR), представляющий, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 95% или более предпочтительно 100% идентичности CDR вариабельного района тяжелой цепи ESBA521 и вариабельный район легкой цепи, включающий один или более район, определяющий комплементарность (CDR), представляющий, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 95% или более предпочтительно 100% идентичности CDR вариабельного района легкой цепи антитела ESBA521.

Вариабельный район тяжелой цепи антитела или его связывающая антиген часть может также включать все три CDR, представляющие, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 95% или более предпочтительно 100% идентичности CDR вариабельного района тяжелой цепи ESBA521 и/или все три CDR, представляющие, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 95% или более предпочтительно 100% идентичности CDR вариабельного района легкой цепи антитела ESBA521.

В другом осуществлении изобретения антитела или их связывающие антиген части (а) включают вариабельный район тяжелой цепи, кодируемый или полученный из (т.е. являющийся продуктом) человеческого гена V H (например, Н3 типа), и/или (б) включает вариабельный район легкой цепи, кодируемый или полученный из человеческого гена V или (например, 1 типа).

Антитела согласно настоящему изобретению включают полноцепочечные антитела, например моноклональные антитела, включающие эффекторный домен (например, Fc домен), а также части или фрагменты антител, например одноцепочечные антитела и Fab фрагменты. Антитела также могут быть связаны с различными терапевтическими агентами (например, противораковыми агентами, химиотерапевтическими агентами или токсинами) и/или с меткой (например, радиоактивной меткой).

В другом аспекте изобретение представляет выделенные нуклеиновые кислоты, включающие последовательность, кодирующую вариабельный район тяжелой цепи антитела, имеющую, по меньшей мере, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности SEQ ID NO:22. Изобретение также представляет выделенные нуклеиновые кислоты, включающие последовательность, кодирующую вариабельный район легкой цепи антитела, имеющую, по меньшей мере, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности SEQ ID NO:21.

Изобретение также представляет экспрессирующие векторы, включающие любую из вышеупомянутых нуклеиновых кислот саму по себе или в комбинации (например, экспрессируемую с помощью одного или более векторов), а также клетки хозяина, включающие такие экспрессирующие векторы.

Подходящие клетки хозяина для экспрессии антител согласно изобретению включают разнообразные эукариотические клетки, например клетки дрожжей, клетки млекопитающих, например клетки яичника китайского хомяка (СНО), NSO клетки, клетки миеломы или растительные клетки. Молекулы согласно изобретению могут также экспрессироваться в клетках прокариотов, например Е.coli.

Изобретение также представляет способы получения антител или их связывающих антиген частей путем экспрессии нуклеиновых кислот, кодирующих антитела, в клетках хозяина (например, нуклеиновые кислоты, кодирующие связывающий антиген район антитела). В дополнительном аспекте изобретение представляет гибридому или трансфектому, включающую вышеупомянутые нуклеиновые кислоты.

В другом осуществлении изобретение предоставляет антиген, включающий эпитоп белка ALK, предпочтительно домен связывания лиганда PTN, более предпочтительно фрагмент, включающий, в основном состоящий, или фрагмент района, охватывающий аминокислотные остатки 391±3 и 406±3 (see SEQ. ID No:91, которая показывает аминокислотные остатки от 388 до 409 человеческого белка ALK), наиболее предпочтительно аминокислотные остатки 391-406 (SEQ. ID. No:1). Антиген можно применять для выработки, скрининга или детектирования присутствия антитела против ALK или можно применять в качестве агента для активной иммунотерапии, например вакцины.

В качестве вакцины антиген может применяться сам по себе или в комбинации с подходящим вспомогательным средством или гаптеном, например в смеси или в химическом или генетическом конъюгате. Антиген, применяемый для активной иммунотерапии, можно также применять в комбинации с пассивной иммунотерапией, например с любым из антител против ALK, раскрытых здесь, или в комбинации с моноклональным или поликлональным препаратом антител против ALK, например гаммаглобулином серопозитивного донора.

В другом осуществлении молекулы антитела (или связывающие районы V L и V H ) являются целиком человеческими. Лечение человека человеческими антителами дает ряд преимуществ. Например, антитела с большой вероятностью являются менее иммуногенными для людей, чем антитела, не относящиеся к человеку. Терапия также является быстрой, потому что инактивация ALK может произойти, как только антитело достигает области рака (где экспрессируется ALK). Поэтому в родственном осуществлении антитело является scFv, например ESBA521 или антителом, включающим V L и/или V H районы (или их CDR, например CDR3 V L (SEQ ID NO:3) и/или CDR3 V H (SEQ ID NO:2)) ESBA521.

Человеческие антитела также локализуются на нужных участках организма человека более эффективно, чем антитела нечеловеческого происхождения. Дополнительно, лечение является специфическим для ALK, антитело является рекомбинантным и высокоочищенным, и в отличие от традиционных терапий данный подход свободен от возможного загрязнения случайными агентами. Альтернативно, антитела и производные антител согласно настоящему изобретению можно получать путем химического синтеза.

В другом осуществлении изобретение представляет композиции для лечения рака (или получения соответствующих медикаментов), которые могут предотвращать неоплазию у субъекта путем конкурирования с лигандами ALK, например мидкином (МК) и/или плейотрофином (PTN), и таким образом блокирования передачи сигнала ALK, опосредованного такими лигандами. Такую композиции можно вводить саму по себе или в комбинации с известными в данной области техники противораковыми агентами, например метотриксатом и т.п.

Антитело согласно изобретению и/или вакцину ALK можно применять сами по себе или в сочетании с известными терапевтическими, например, противораковыми агентами, например метотриксатом и т.п.

Другие свойства и преимущества изобретения будут ясны из нижеследующего детального описания, а также из формулы изобретения.

Краткое описание фигур

Изобретение станет более понятным и дополнительные его объекты, отличные от вышеописанных, будут очевидны при рассмотрении нижеследующего детального описания. Это описание обращается к приложенным фигурам, где:

Фигура 1 показывает схему применяемого белка ALK человека. Пептид из 16 аминокислотных остатков участка связывания PTN (пунктирная линия) применяют в качестве эпитопа в двухгибридном скрининге связывателей scFv.

Фигура 2 показывает ступенчатую рандомизацию частей CDR3 V H , CDR3 V L и CDR2 V H для получения ESBA521 в качестве вторичного связывателя и набора scFv в качестве третичных связывателей (см. табл.1). Х означает любой аминокислотный остаток.

Фигура 3 показывает эксперимент с применением ELISA, где характеристики связывания улучшенных scFv сравнивают с таковыми окружения (каркаса), из которого они происходят.

Фигура 4 показывает иммуноокрашивание клеток HeLa, подвергнутых переходной трансфекции ESBA521 (левая панель) и поликлональными антителами, специфичными к ALK (правая панель). Средняя панель: те же клетки в световом микроскопе.

Фигура 5 показывает эксперимент с применением ELISA для проведения сравнения ESBA521 с улучшенными третичными связывателями.

Осуществление изобретения

Для облегчения понимания изобретения следует вначале пояснить конкретные термины.

Определения

Термин «ALK» и «AIk-I»включает белок ALK человека, кодируемый геном ALK (киназа анапластической лимфомы), который является мембранным белком тирозинкиназы/рецептора.

Термин «антитело» относится к целым антителам и любому фрагменту, связывающему антиген (например, «связывающей антиген части», «связывающему антиген полипептиду» или «иммуносвязывателю»), или его одиночной цепи. «Антитело» относится к гликопротеину, включающему, по меньшей мере, две тяжелые цепи (Н) и две легкие цепи (L), взаимосвязанные дисульфидными мостиками, или их связывающую антиген часть. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельного района тяжелой цепи (сокращенно V H ) и константного района тяжелой цепи. Константный район тяжелой цепи состоит из трех доменов, СН1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельного района легкой цепи (сокращенно V L ) и константного района легкой цепи. Константный район легкой цепи состоит из одного домена CL. Районы V H и V L можно дополнительно подразделять на районы гипервариабельности, называемые районами, определяющими комплементарность (CDR), перемежающиеся более консервативными районами, называемыми каркасными районами (FR). Каждый V H и V L состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных в направлении от N-конца к С-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные районы тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который реагирует с антигеном. Константные районы антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (CIq) классической системы комплемента.

Термин «связывающая антиген часть» антитела (или просто «часть антитела») относится к одному или более фрагменту антитела, который сохраняет способность специфически связываться с антигеном (например, ALK). Показано, что функция связывания антигена антителом может осуществляться фрагментами полноцепочечного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охваченные термином «связывающая антиген часть» антитела, включают: 1) Fab фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из V L , V H , CL и СН1 доменов; 2) F(ab') 2 фрагмент, двухвалентный фрагмент, включающий два Fab фрагмента, соединенных дисульфидным мостиком в районе связки (шарнира); 3) Fd фрагмент, состоящий из V H и СН1 доменов; 4) Fv фрагмент, состоящий из V H и V L доменов одной ветви антитела; 5) одиночный домен или dAb фрагмент (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), состоящий из V H домена, и 6) изолированный район, определяющий комплементарность (CDR), или 7) комбинация двух или более изолированных CDR, которые при необходимости могут быть соединены синтетическим линкером. Дополнительно, хотя два домена Fv фрагмента, V H и V L , кодируются отдельными генами, они могут быть соединены с помощью рекомбинантных способов, с помощью синтетического линкера, что позволяет получать их в виде единой белковой цепи, в которой V H и V L районы объединены с образованием одновалентных молекул (известных как одноцепочечный Fv (scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также включены в термин «связывающая антиген часть» антитела. Эти фрагменты антител получают с помощью общепринятых способов, известных специалисту в данной области техники, и фрагменты подвергают скринингу на применимость по тому же способу, как интактные антитела. Связывающие антиген части можно получать с помощью рекомбинантных техник или путем ферментативного или химического расщепления интактных иммуноглобулинов. Антитела могут принадлежать разным изотипам, например IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 подтип), IgA1, IgA2, IgD, IgE или IgM.

Термин «каркасный» относится к известным в данной области техники частям вариабельных районов антитела, которые находятся между более разнообразными CDR районами. Такие каркасные районы обычно называются каркасными районами от 1 до 4 (FR1, FR2, FR3 и FR4), и они предоставляют конструкцию (каркас) для поддержки в трехмерном пространстве трех CDR районов, находящихся в тяжелой или легкой цепи антитела, так что CDR могут образовывать связывающую антиген поверхность. Такой каркас может также называться несущей конструкцией, поскольку он обеспечивает поддержку для презентации более разнообразных CDR. Другие CDR и каркасные районы семейства иммуноглобулинов, например повторы анкирина и фибронектин, могут применяться в качестве связывающих антиген молекул (см. также патенты US 6300064, 6815540 и US 20040132028).

Термин «эпитоп» или «антигенная детерминанта» относится к участку антигена, с которым специфически связывается иммуноглробулин или антитело (например, в ALK аминокислотные остатки 391-406 человеческого AIk-I (см., например, SEQ ID NO:1). Эпитоп обычно включает, по меньшей мере, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислотных остатков в уникальной пространственной конформации. См., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol.66, G. E. Morris, Ed. (1996).

Термин «специфическое связывание», «избирательное связывание», «избирательно связывает» относится к связыванию антитела с эпитопом определенного антигена. Обычно антитело связывается со сродством (K D ) меньше примерно 10 -7 М, например меньше примерно 10 -8 М, 10 -9 М или 10 -10 М или еще меньше.

Термин «K D » относится к константе равновесия реакции диссоциации конкретного взаимодействия антигена с антителом. Обычно антитела согласно изобретению связываются с ALK с константами диссоциации (K D ), составляющими меньше примерно 10 -7 М, например меньше примерно 10 -8 М, 10 -9 М или 10 -10 М или еще меньше, измеренными, например, с помощью техники поверхностного плазмонового резонанса (SPR) с установкой BIACORE.

Термины «нейтрализует ALK», «ингибирует ALK» и «блокирует ALK» применяются взаимозаменяемо по отношению к способности антител согласно изобретению предотвращать взаимодействие ALK с одним или более лигандом мишенью и, например, запускать передачу сигнала.

Термин «молекула нуклеиновой кислоты» относится к молекулам ДНК и молекулам РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно является двухцепочечной ДНК. Нуклеиновая кислота является «оперативно связанной», когда она находится в функциональном взаимодействии с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор или усилитель являются оперативно связанными с кодирующей последовательностью, если они воздействуют на транскрипцию этой последовательности.

Для нуклеиновых кислот термин «значительная гомология» указывает, что две нуклеиновые кислоты или их определенные последовательности при оптимальном наложении и сравнении проявляют идентичность с учетом необходимых вставок или делеций нуклеотидов, по меньшей мере, примерно 80% нуклеотидов, обычно, по меньшей мере, примерно от 90% до 95% нуклеотидов и более предпочтительно, по меньшей мере, примерно от 98% до 99,5% нуклеотидов. Альтернативно, значительная гомология существует, когда сегменты гибридизуются в условиях избирательной гибридизации с комплементарной цепочкой. Такие условия гибридизации известны в данной области техники и описаны, например, в Sambrook et al. infra.

Процент идентичности двух последовательностей является функцией числа идентичных положений в последовательностях, принимая в расчет число промежутков (разрывов) и длину каждого промежутка, которые надо внести для оптимального наложения двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности двух последовательностей можно проводить с помощью математического алгоритма, как описано в неограничивающих примерах ниже.

Процент идентичности двух нуклеотидных последовательностей можно определять с помощью программы GAP в составе программного пакета GCG с применением NWSgapdna, CMP матрицы при вкладе промежутков 40, 50, 60, 70 или 80 и длине промежутка 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Процент идентичности двух нуклеотидных или аминокислотных последовательностей можно также определять с помощью алгоритма Е. Meyers and W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)), включенного в программу ALIGN (version 2.0), с применением РАМ120 таблицы весов остатков, штрафа за длину промежутка 12 и штрафа за промежуток 4. Дополнительно, процент идентичности двух аминокислотных последовательностей можно определять с помощью алгоритма Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)), включенного в программу GAP программного пакета GCG, с применением матрицы Blossum 62 или матрицы РАМ250, веса промежутка 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и веса длины промежутка 1, 2, 3, 4, 5 или 6.

Последовательности нуклеиновой кислоты и белка согласно настоящему изобретению можно далее применять как «последовательности запроса» при проведении поиска в общественных базах данных, например, чтобы идентифицировать родственные последовательности. Такой поиск можно проводить с помощью программ NBLAST и XBLAST (version 2.0) Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Поиск нуклеотидных последовательностей согласно BLAST можно проводить с помощью программы NBLAST при счете очков = 100, длине слова = 12 для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных нуклеотидной последовательности изобретения. Поиск белков согласно BLAST можно проводить с помощью программы XBLAST при счете очков = 50, длине слова = 3 для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных белковой молекуле по изобретению. Для получения наложения с разрывами с целью сравнения можно применять Gapped BLAST, как описано в Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402. При применении программ BLAST и Gapped BLAST можно пользоваться параметрами по умолчанию для соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST).

Настоящее изобретение также охватывает «консервативные модификации последовательностей» для последовательностей с SEQ ID NO согласно настоящему изобретению, т.е. такие модификации нуклеотидной и аминокислотной последовательностей, которые не отражаются на связывании антигена антителом, кодируемым нуклеотидной последовательностью или содержащим аминокислотную последовательность. Такие консервативные модификации последовательностей включают замены, вставки и делеции нуклеотидов и аминокислотных остатков. Например, модификации можно вносить с помощью стандартных техник, известных в данной области техники, например сайт-направленного мутагенеза и мутагенеза, опосредованного ПЦР. Консервативные замещения аминокислот включают такие, при которых аминокислотный остаток замещают аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков со сходными боковыми цепями определены в данной области техники. Такие семейства включают аминокислотные остатки с основными свойствами боковых цепей (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными свойствами боковых цепей (например, аспарагиновая и глутаминовая кислоты), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), -разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Так, предсказанные несущественные аминокислотные остатки в человеческих антителах против ALK предпочтительно заменяют другими аминокислотными остатками из того же семейства по свойствам боковых цепей. Способы идентификации консервативных замещений нуклеотидов и аминокислот, не приводящих к нарушению связывания антигена, хорошо известны в данной области техники (см., например, Brummell et al. Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12 (10): 879-884 (1999); and Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997)).

Альтернативно в другом осуществлении мутации вводят случайным образом по всей или в части последовательности, кодирующей антитело против ALK, например, с помощью насыщающего мутагенеза (saturation mutagenesis) и получившиеся модифицированные антитела против ALK подвергают скринингу по активности связывания. «Консенсусной последовательностью» является последовательность, образованная из наиболее часто встречающихся аминокислот (или нуклеотидов) в семействе родственных последовательностей (см., например, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987)). В семействе белков каждое положение в консенсусной последовательности занято аминокислотным остатком, чаще всего встречающимся в этом положении в данном семействе. Если два аминокислотных остатка встречаются с равной частотой, каждый из них можно включить в консенсусную последовательность.

Со ссылкой на таблицы и фигуры, предоставленные здесь, консенсусную последовательность CDR вариабельных районов тяжелой/легкой цепи антитела можно получить путем оптимального наложения аминокислотных последовательностей CDR вариабельных районов антител, обладающих реактивностью по отношению к эпитопу 390-406 человеческого белка ALK-1.

Термин «вектор» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной переносить другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Одним типом вектора является «плазмида», что относится к кольцевой двухцепочечной петле ДНК, в которую можно лигировать дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, где дополнительные сегменты ДНК можно лигировать в вирусный геном. Определенные векторы способны к автономной репликации в клетке хозяина, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие начало репликации бактериального типа, и эписомальные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомальные векторы млекопитающих) могут интегрироваться в геном клетки хозяина при поступлении в клетку хозяина и поэтому реплицироваться вместе с геномом хозяина.

Термин «клетка хозяина» относится к клетке, в которую введен экспрессирующий вектор. Клетки хозяина могут включать бактериальные, микробные, растительные или животные клетки. Бактерии, способные к трансформации, включают членов семейства энтеробактерий, например штаммы Escherichia coli или Salmonella; Bacillaceae, например Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus и Haemophilus influenzae. Подходящие микроорганизмы включают Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris. Подходящие животные клетки хозяина включают линии СНО (линия клеток яичников китайского хомяка) и NSO клетки.

Термин «лечение» относится к терапевтическим или превентивным мерам, описанным здесь. Способы «лечения» включают введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, антитела согласно настоящему изобретению, например субъекту, имеющему опосредованное ALK нарушение, или субъекту, который в конечном счете может получить такое нарушение, для предотвращения, лечения, замедления, уменьшения тяжести нарушения, или для облегчения одного или более симптома нарушения или повторного нарушения, или для продления жизни субъекта за пределы ожидаемого в отсутствие такого лечения.

Термин «опосредованное ALK нарушение» относится к состоянию болезни и/или симптомам, связанным с опосредованным ALK раком или опухолями. В основном, термин «опосредованное ALK нарушение» относится к любому нарушению, наступление, развитие или течение симптомов которого требует участия ALK. Примеры опосредованного ALK нарушения включают, не ограничиваясь этим, в частности, глиобластому.

Термин «эффективная доза» относится к количеству, достаточному для достижения или, по меньшей мере, для частичного достижения необходимого действия. Термин «терапевтически эффективная доза» определяется как количество, необходимое для излечения или, по меньшей мере, частичного замедления заболевания и его осложнений у больного, уже страдающего от заболевания. Количества, эффективные для такого применения, зависят от тяжести заболевания, которое лечат, и общего состояния иммунной системы больного.

Термин «субъект» относится к любому человеческому существу или животному. Например, способы и композиции согласно настоящему изобретению можно применять для лечения субъекта, больного раком, например глиобластомой.

Если не указано обратное, все технические и научные термины, применяемые здесь, имеют общепринятое значение, понятное любому работающему в данной области техники, к которой относится изобретение. Хотя способы и материалы, сходные или эквивалентные описанным здесь, можно применять на практике или при тестировании настоящего изобретения, подходящие способы и материалы описаны ниже. В случае конфликта настоящее описание, включая определения, будет направляющим. Дополнительно, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не ограничивают область притязаний изобретения.

Различные аспекты изобретения описаны более детально в последующих разделах. Следует понимать, что различные осуществления, предпочтения и интервалы можно комбинировать по необходимости. Дополнительно, в зависимости от конкретного осуществления избранные определения, осуществления или интервалы не могут применяться.

Настоящее изобретение представляет в первом аспекте антитело, связывающее человеческий белок ALK, где упомянутое антитело включает CDR3 вариабельного района тяжелой цепи с последовательностью, имеющей, по меньшей мере, 50% идентичности последовательности SEQ. ID NO:2. Предпочтительно идентичность последовательности составляет, по меньшей мере, 60%, 70%, 75%, 80% или более предпочтительно, по меньшей мере, 90%. Наиболее предпочтительно CDR3 имеет точно такую последовательность, как SEQ ID NO:2.

В предпочтительном осуществлении настоящего изобретения антитело специфически связывается с человеческим белком ALK, т.е. оно не связывается с мышиным белком ALK, у которого участок связывания PTN отличается всего на два аминокислотных остатка от участка связывания PTN (SEQ ID NO:1) человеческого белка ALK. Изолейцин в положении 3 белка человека заменен валином и аспартат заменен аланином в соответствующей последовательности мышиного белка.

Антитело согласно настоящему изобретению может быть полноцепочечным антителом, а также фрагментом антитела, например scFv или Fab фрагментом. Связывающие антиген фрагменты хорошо известны в данной области техники. Предпочтительно применяют scFv антитело.

Тяжелая цепь и легкая цепь включают каркасные последовательности, каждая включает три CDR района, CDR1, CDR2 и CDR3, которые преимущественно вовлечены в связывание антигена. Антитело согласно настоящему изобретению включает V H домен типа Н3 и V L домен типа X.

Каркасы V H и V L антитела согласно настоящему изобретению являются стабильными и растворимыми, так что они функциональны в восстановительной среде внутри клетки. Предпочтительно это каркас 4,4, который был выделен ранее с помощью дрожжевой системы скрининга, называемой системой с контролем качества "Quality control system" (Auf der Maur et al. 2001; Auf der Maur et al. 2004). Последовательность каркаса можно узнать, например, из SEQ ID NO:20 (см. ниже), где каркасные части представлены неподчеркнутыми и прямыми литерами, тогда как последовательности CDR подчеркнуты, а последовательность линкера показана курсивом.

Антитело согласно настоящему изобретению способно связываться с пептидом из 16 аминокислотных остатков, представляющим эпитоп ALK, имеющим последовательность, которая, по меньшей мере, на 75%, предпочтительно на 80%, 85%, 90%, 95% или наиболее предпочтительно на 100% идентична последовательности SEQ ID NO:1. Эта последовательность также называется участком связывания PTN и является уникальной последовательностью во всем геноме человека. Соответствующая последовательность у мыши отличается по двум из 16 аминокислотных остатков, т.е. имеет V в положении 3 и А в положении 7 вместо I и D соответственно. Предпочтительно антитело согласно настоящему изобретению связывается с человеческим, но не с мышиным ALK, т.е. является специфичным для белка человека. Эпитоп ALK, включающий примерно остатки 391-406 или состоящий из этих остатков, уникальным образом подходит для отбора антител или связывающего антиген фрагмента, которые могут специфически связывать ALK и блокировать или ингибировать опосредованную ALK активность. Этот эпитоп также необходим для скрининга или выработки антител, специфически блокирующих активность ALK. Так, этот эпитоп, особенно эпитоп, включающий примерно остатки 391-406 или состоящий примерно из этих остатков, уникальным образом подходит для применения в качестве активного иммунотерапевтического агента или вакцины, как описано ниже.

Антитело согласно настоящему изобретению обладает сродством к пептиду эпитопа ALK с K D 30 нМ или менее, предпочтительно 10 нМ или менее, наиболее предпочтительно ниже 3 нМ.

В другом осуществлении настоящего изобретения антитело включает CDR3 вариабельного района легкой цепи с последовательностью, составляющей, по меньшей мере, 50% идентичности последовательности SEQ ID NO:3. Предпочтительно идентичность последовательности составляет, по меньшей мере, 60%, 70%, 80%, 85%, более предпочтительно, по меньшей мере, 90%. Наиболее предпочтительно последовательность CDR3 идентична SEQ ID NO:3. Снова это антитело связывает пептид эпитопа ALK, имеющий последовательность, которая, по меньшей мере, на 75%, предпочтительно на 80%, 85%, 90%, 95% или наиболее предпочтительно на 100% идентична последовательности SEQ ID NO:1. Также антитело обладает сродством к пептиду эпитопа ALK с K D менее 10 нМ, предпочтительно менее 7 нМ.

В предпочтительном осуществлении настоящего изобретения антитело включает последовательность V H SEQ. ID. NO:4 и последовательность V L SEQ ID NO:5. Дополнительно, оно может включать, по меньшей мере, одну мутацию, по меньшей мере, в одном из CDR, приводящую к повышенному сродству, характеризуемому значением K D менее примерно 3 нМ. Упомянутая, по меньшей мере, одна мутация предпочтительно находится в CDR1 или CDR2 V H и/или V L , наиболее предпочтительно в CDR2 V H .

В другом предпочтительном осуществлении настоящего изобретения антитело включает CDR2 вариабельного района тяжелой цепи, включающий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO.7, SEQ. ID. NO:8, SEQ. ID. NO:9, SEQ. ID. NO:10, SEQ. ID. NO:11, SEQ. ID. NO:12 или SEQ. ID. NO:13. Предпочтительно перед этими определенными последовательностями расположены аминокислотные остатки AI и за ними следует последовательность SEQ. ID. NO:17, так что определяется весь CDR2 целиком.

Предпочтительное антитело согласно настоящему изобретению включает последовательность V H SEQ. ID. NO:4 и V L SEQ. ID. NO:5. В антителах scFv структура домена может быть следующей NH 2 -V L -линкер-V H -COOH или NH 2 -V H -линкер-V L -COOH, предпочтительно линкер имеет последовательность SEQ. ID. NO:16. Альтернативно, вариабельные районы, представленные последовательностями SEQ. ID. NO:4 и 5, могут быть сконструированы в полноцепочечное антитело, например IgG или IgM. Константные районы, необходимые для комбинирования с вариабельными районами согласно изобретению, известны в данной области техники.

В область притязаний настоящего изобретения входит применение антитела или производного антитела в качестве лекарства или в качестве диагностического подхода. Предпочтительно рассматривается получение лекарства для лечения рака или опухолей. Для этой цели антитело можно пометить радиоактивной меткой с помощью радиоактивного изотопа или радиоактивного металла. Это особенно ценно для направленного воздействия на опухоль, для получения изображения и в исследованиях биологического распределения. Также техника рекомбинантных ДНК делает возможным генетическое соединение кодирующих районов вариабельных V генов с модифицированными доменами токсина. Например, составной белок scFv-токсин, где scFv является специфичным для белка маркера опухоли, может направить токсин на опухоль, где токсин проявляет свои цитотоксические свойства. Такая направленная терапия приводит к избирательной концентрации цитотоксических агентов или радиоактивных изотопов в опухолях и должна уменьшать их токсичность для нормальных тканей.

В предпочтительном осуществлении настоящего изобретения антитело применяют для лечения рака или опухолей, предпочтительно нейробластомы, глиобластомы, рабдомиосаркомы, карциномы груди, меланомы, рака поджелудочной железы, неходжкинской лимфомы В-клеток, карциномы щитовидной железы, мелкоклеточной карциномы легких, ретинобластомы, саркомы Эвига, рака простаты, рака кишечника или рака поджелудочной железы, предпочтительно глиобластомы, нейробластомы и рабдомиосаркомы. Экспрессия ALK и белка детектируется во многих опухолях мягких тканей (Li et al., 2004). Полноцепочечный ALK обнаружен в этих опухолях человека. Дополнительно, антитело предпочтительно применяют для местной терапии. Наиболее предпочтительной является местная терапия глиобластомы.

Другим аспектом настоящего изобретения является предоставление последовательности ДНК, кодирующей антитело согласно настоящему изобретению. Подходящим прокариотическим экспрессирующим вектором для ESBA512 (SEQ. ID.No:19) является pTFT74 (последовательность SEQ. ID. No:90, включающая последовательность, кодирующую ESBA512). Здесь последовательность, кодирующая ESBA512, находится под контролем промотора Т7, и продукт рекомбинантного гена обычно очищают над тельцами включения. Другим предпочтительным прокариотическим экспрессирующим вектором является рАК-400, где к последовательности ESBA512 присоединен гистидиновый таг для упрощения очистки (см. последовательность SEQ. ID. NO:89, включающую последовательность, кодирующую ESBA512). Продукт гена секретируется клетками хозяина в периплазму.

Дополнительно, предоставлены экспрессирующий вектор, включающий упомянутую последовательность ДНК, и подходящие клетки хозяина, трансформированные упомянутым экспрессирующим вектором. Предпочтительно упомянутыми клетками хозяина являются клетки E.coli.

Еще одним аспектом настоящего изобретения является получение антител согласно настоящему изобретению, включающее выращивание клеток хозяина, трансформированных экспрессирующим вектором для получения упомянутого антитела, в условиях, которые позволяют синтез упомянутого антитела и выделение его из упомянутой культуры.

Другим аспектом настоящего изобретения является предоставление эпитопа ALK, включающего или состоящего, в основном, из остатков 391-406 последовательности SEQ. ID. NO:1. Упомянутый эпитоп необходим для идентификации, скрининга или выработки антител против ALK или их фрагментов. Предпочтительно антитело или его связывающий антиген фрагмент способны специфически связываться с остатками 391-406 (SEQ. ID. NO:1) выделенного белка ALK или его фрагмента. Более предпочтительно антитело является одноцепочечным антителом (scFv), Fab фрагментом, IgG или IgM.

В дополнительном аспекте предоставлена ALK вакцина, включающая выделенный белок ALK или его фрагмент или нуклеиновую кислоту, кодирующую эпитоп ALK. Предпочтительно вакцина включает остатки 391-406 выделенного белка ALK. Упомянутую вакцину объединяют в композиции вместе с носителем, вспомогательным веществом и/или гаптеном для усиления иммунного ответа.

Последовательности согласно настоящему изобретению следующие:

Нуклеотидная последовательность ESBA512, районы CDR подчеркнуты, последовательность линкера показана курсивом.

Изобретение ниже описано с помощью примеров.

ПРИМЕРЫ

Материалы и способы

В основном, при практическом выполнении настоящего изобретения применяются, если не указано обратное, общепринятые технические подходы химии, молекулярной биологии, технологии рекомбинантных ДНК, иммунологии (особенно, например, техники работы с антителами) и стандартные техники получения полипептидов. См., например, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., IrI Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., C. S. H. L. Press, Pub. (1999) и Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992).

Пример 1. Скрининг для идентификации scFv, связывающих ALK

В результате многочисленных структурных исследований взаимодействия антигена с антителом обнаружено, что остатки в определяющем комплементарность районе 3 тяжелой цепи (CDR-H3) обычно вносят вклад в наиболее значимые контакты с антигеном (Chothia and Lesk, 1987; Chothia et al., 1985; Padlan, 1994). Авторы применили свою недавно описанную технику скрининга взаимодействия антигена с антителом с помощью дрожжевого двойного гибрида для прямого выделения связывающих антиген scFv путем скрининга четырех библиотек scFv с рандомизованными синтетическими последовательностями CDR-H3 (Auf der Maur et al., 2002). Четыре библиотеки основаны на четырех стабильных каркасах scFv человека, в которых 7 аминокислот в третьей петле CDR вариабельного района тяжелой цепи (V H -CDR3) подвергнуты рандомизации. Рандомизованные части получают с помощью стандартной техники ПЦР. Библиотеки scFv подвергают скринингу с применением пептида из 16 аминокислотных остатков, полученного из внеклеточного домена киназы анапластической лимфомы рецептора тирозинкиназы человека (ALK) с помощью дрожжевой системы скрининга, называемой «контроль качества» "Quality Control" (Auf der Maur et al., 2001; Auf der Maur et al., 2004). Вкратце, технология "Quality Control" является независимой от антигена системой отбора в пределах организма для идентификации в природном наборе вариабельных районов человеческих легких цепей (V L ) и вариабельных районов тяжелых цепей (V H ) таких, которые могут дать комбинации V L и V H с нужными биофизическими свойствами, такими как стабильность, растворимость и выход экспрессии. Из одной из четырех библиотек scFv изолирован один многообещающий специфический связыватель после первого круга скрининга. Этот конкретный scFv получен из библиотеки каркаса FW4.4. FW4.4 (SEQ. ID. NO:20) состоит из V L домена ( 1), связанного с помощью классического гибкого глицинсеринового линкера (GGGGS) 4 с доменом V H3 . Последовательность CDR3 V H FW4.4 включает 13 аминокислотных остатков (DAGIAVAGTGFDY; SEQ. ID. NO:18). Для конструирования библиотеки центральную часть CDR3 V H (DAXXXXXXXGFDY) рандомизуют с помощью стандартных способов ПЦР-клонирования с применением вырожденных олигонуклеотидов. Последние два остатка (Асп и Тир) сохраняют постоянными, поскольку их важность для структуры показана во многих случаях (Chothia and Lesk, 1987). Остальные аминокислотные остатки не модифицируют, чтобы удерживать многообразие библиотеки в пределах контролируемых размеров. Библиотеку scFv клонируют в дрожжевой экспрессирующий вектор (pLib1) в виде добавления с С-конца к домену транскрипционной активации Gal4 (Auf der Maur et al., 2002).

Связывающий лиганд домен (LBD) человеческого ALK выбран в качестве антигена для скрининга взаимодействия (Stoica et al., 2001). Этот пептид из 16 аминокислотных остатков клонируют в другой дрожжевой экспрессирующий вектор (pBait1) в виде добавления на С-конце к связывающему ДНК белку LexA.

Дрожжевой репортерный штамм YDE173 (Auf der Maur et al., 2002), содержащий стабильно встроенные репортерные гены HIS3 и lacZ под контролем шести участков связывания LexA трансформируют вектором с приманкой, экспрессирующим LBD ALK, присоединенный к LexA, вместе с библиотекой рандомизованных CDR-H3 scFv, присоединенных к домену активации Gal4. Трансформированные клетки отбирают на чашках, не содержащих гистидин и содержащих 2,5 мМ 3-аминотриазола (3-АТ), являющегося конкурентным ингибитором продукта гена HIS3. Растущие колонии отбирают за период времени 6 дней и выделяют плазмиды библиотеки. Тот же репортерный штамм трансформируют спасательными плазмидами (rescue plasmid) для подтверждения зависимой от антигена активации гена. Количественный жидкостной анализ -галакттозидазы проводят для измерения силы связывания между LBD ALK, т.е. пептидом из 16 аминокислотных остатков, и отобранными scFv. Молекулы scFv с наиболее высокой активацией репортерного гена проявляют также наилучшее сродство (около 31 нМ) к пептиду LBD ALK в экспериментах с применением ELISA (данные не приведены).

Последовательности других CDR3 V H , идентифицированные как вносящие вклад в связывание ALK, приведены в таблице 1а ниже.

Пример 2. Созревание сродства

Для получения scFv с повышенным сродством этот первичный связыватель подвергают дальнейшему созреванию сродства путем мутагенеза и второго цикла скрининга в дрожжевой системе. Для проведения созревания сродства уровень экспрессии составного белка LexA с LBD ALK уменьшают, чтобы понизить активацию репортерного гена, запускаемую взаимодействием первичного связывателя с пептидом LBD ALK. Сильный промотор вектора pBait1 заменяют укороченным и таким образом менее активным вариантом промотора ADH (алкогольдегадрогеназы), получая вектор pBait3. Такого понижения уровня экспрессии приманки в присутствии первичного связывателя достаточно для ингибирования роста на чашках без гистидина, содержащих 5 мМ 3-АТ. Мутагенез первичного связывателя с целью созревания сродства проводят путем рандомизации частей CDR3 в вариабельном районе легкой цепи. Ее проводят прямо в дрожжах путем гомологичной рекомбинации (Schaerer-Brodbeck and Barberis, 2004). Последовательность CDR3 V L FW4.4 включает 11 аминокислотных остатков (SEQ. ID. NO:14: GTWDSSLSGW). Первые два положения частично рандомизуют, так что первая позиция кодирует GIy, Ala или Gln и вторая позиция кодирует Thr, Ser или Ala. В положениях от 5 до 8 внутри CDR3 V L допускается любой аминокислотный остаток. Оставшиеся положения поддерживают постоянными. Рандомизацию проводят в помощью ПЦР. Получившийся продукт ПЦР имеет размер 356 пар оснований и включает рандомизованную кассету CDR, обрамленную каркасными последовательностями из 267 пар оснований выше нее и 27 пар оснований ниже. Этот продукт является так называемым донорным фрагментом ПЦР, несущим гомологии вектору мишени. Вектор мишени является дрожжевой плазмидой (pLib1), кодирующей первичный связыватель, присоединенный к домену активации Gal4. Для улучшения эффективности гомологичной рекомбинации и исключения ложных положительных сигналов при последующем скрининге CDR-L3 вектора мишени слегка модифицируют. Вводят уникальный участок рестрикции Sac в середину CDR3 V L , что ведет к сдвигу рамки считывания в части, кодирующей scFv составного белка, и приводит к образованию укороченного белка, неспособного связываться с LBD ALK. Дополнительно, участок Sac позволяет линеаризовать вектор мишени, что повышает эффективность рекомбинации у дрожжей.

Скрининг запускают предварительно трансформированным репортерным дрожжевым штаммом YDE173 с плазмидой (pBait3), экспрессирующей составной белок LexA-LBD ALK под контролем укороченного промотора ADH. Эти предварительно трансформированные дрожжевые клетки снова делают компетентными и трансформируют одновременно линеаризованным вектором мишени и донорным фрагментом ПЦР, несущим гомологии выше и ниже CDR3 V L . При гомологичной рекомбинации между продуктом ПЦР и вектором мишени новая последовательность CDR3 V L интегрируется в соответствующий участок вектора мишени. В результате этого события изначальный CDR3 V L заменяется на рандомизованный CDR3 V L . Это позволяет провести реконструкцию кольцевой плазмиды, экспрессирующей полностью функциональный составной белок с новой последовательностью CDR3 V L , который активирует экспрессию репортерного гена и позволяет рост на чашках с селективной средой при взаимодействии с пептидом LBD ALK.

В общей сложности 119 клонов вырастает на чашках с селективной средой за период времени наблюдения из 6 дней. Эти клоны отбирают, выделяют плазмидные библиотеки и повторно трансформируют тот же дрожжевой репортерный штамм. Проводят количественный жидкостной анализ -галактозидазы для измерения силы связывания между LBD ALK (антиген) и scFv с созревшим сродством. 20 клонов с наивысшей активацией lacZ тестируют также с помощью ELISA с применением пептида LBD ALK. Наилучший кандидат характеризуется K D приблизительно 7 нМ (фигура 3) и называется ESBA521.

Последовательности других CDR3 V L , идентифицированные как вносящие вклад в связывание ALK, представлены в таблице 1с.

Пример 3. scFv ESBA521 специфически связывается с трансмембранной формой человеческого ALK

Для тестирования того, является ли вновь идентифицированный scFv способным узнавать также трансмембранный белок ALK человека на поверхности живых клеток, проводят эксперименты по иммуноокрашиванию клеток HELA, трансфицированных переходным образом. ESBA521 реагирует с белком ALK по способу сходному с реакцией поликлональных антител (Фиг.4). В контрольном эксперименте показано, что каркас 4.4 scFv не взаимодействует с человеческим ALK. Неожиданно оказалось, что ESBA521 связывается только с человеческим белком ALK, но не связывается с соответствующим белком мыши, хотя последовательность антигенного пептида мыши отличается от последовательности человеческого пептида только по двум положениям. В противоположность этому поликлональное антитело против ALK узнает оба белка, человеческий и мышиный. Поэтому связывание ESBA521 является специфическим для человеческого белка ALK на клеточной поверхности.

Пример 4. Выделение улучшенных связывателей с помощью ПЦР-мутагенеза CDR2 V H

Для дальнейшего улучшения связывания антигена применяют ESBA521 в качестве исходного scFv в дополнительном цикле созревания сродства с применением того же подхода с двухгибридной системой, как описано для первого круга созревания сродства, за исключением того, что в этом случае мутагенезу с помощью ПЦР подвергают CDR2 V H и трансформируют дрожжи реципиент, где гомологичную рекомбинацию CDR2 проводят по аналогичному способу. Снова в CDR2 вводят участок рестрикции для возможности линеаризации плазмиды мишени. Мутации, внесенные в CDR2, приведены в таблице 2.

Среди изолированных scFv, полученных после этой процедуры, у семи оказалось значительно улучшенное сродство с K D в интервале 2-3 нМ (фиг.5), где наилучшим является мутант 28.11.

Пример 5. Предотвращение роста опухоли при введении антител против ALK

Предшественники антитела ESBA521 отобраны на связывание аминокислотных остатков 391-406 ALK, включающих аминокислоты (396-406), которые известны как связывающие плейотрофин (Stoica 2001). ESBA521 получен путем рандомизации дополнительных аминокислотных остатков в CDR его предшественника и отбора связывателей, связывающихся с аминокислотной последовательностью 391-406, находящейся в своем природном окружении внеклеточного домена (BCD) ALK. Эти процедуры приводят к получению антитела, связывающего ECD ALK с высоким сродством по тому же участку, где связывается PTN. По нашим данным, это первое моноклональное антитело, специфически направленное на PTN-связывающий участок ALK. Соответственно, предсказано, что ESBA521 обладает высоким сродством к ECD ALK и эффективно конкурирует с плейотрофином (PTN) и мидкином (МК) за связывание с рецептором ALK и таким образом антитело ESBA521 подходит для ингибирования связывания обоих лигандов, МК и PTN, с белком ALK.

Поскольку ALK и его лиганды вовлечены в неоплазию, инвазию опухолей и ангиогенез, ингибирование взаимодействия между ALK и его природными лигандами нарушает опосредованный ALK генез опухолей.

Действие ESBA521 на специфическую опухоль можно определить с помощью двух следующих анализов, описанных ниже.

В первом анализе проводят эксперименты с ксенотрансплантатом, поставленные для определения роли ALK как фактора, лимитирующего скорость роста опухоли (Powers 2002). Вкратце, получают суспензию клеток U87MG с концентрацией 20 миллионов клеток на мл среды, дополненной 10% сывороткой плода коровы. Их вводят путем инъекции мышам NU/NU и измеряют возникающие опухоли. Вводят тестируемые антитела, предпочтительно полноцепочечные антитела, более предпочтительно пегилированные антитела, и измеряют рост опухолей.

Хотя показаны и описаны присутствующие предпочтительные осуществления изобретения, следует понимать, что изобретение не ограничивается ими, но может осуществляться и применяться разными способами в рамках области притязаний приложенной формулы изобретения.

Формула изобретения

1. Антитело, связывающее белок киназы анапластической лимфомы (ALK) человека, включающее легкую цепь вариабельного района и тяжелую цепь вариабельного района, причем каждый вариабельный район содержит три CDR и 4 каркасных участка в порядке FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4, где

(i) последовательность CDR3 вариабельного района тяжелой цепи имеет, по меньшей мере, 60% идентичность с SEQ ID NO:2; и

(ii) последовательность CDR3 вариабельного района легкой цепи имеет, по меньшей мере, 50% идентичность с SEQ ID NO:3,

которое связывается с эпитопом пептида, являющимся фрагментом, по существу, состоящим из SEQ ID NO:91, который охватывает аминокислотные остатки 388-409 человеческого ALK белка.

2. Антитело по п.1, у которого его сродство к пептиду эпитопа ALK характеризуется K D 30 нМ или ниже, предпочтительно 10 нМ или ниже, наиболее предпочтительно ниже 3 нМ.

3. Антитело по п.1, где связывание белка ALK человека является специфическим.

4. Антитело по п.1, являющееся фрагментом антитела, scFv антителом или Fab фрагментом.

5. Антитело по п.1, в котором каркасные районы V H и V L являются стабильными и растворимыми, так чтобы сохранять функциональность в восстановительном окружении внутри клетки.

6. Антитело по п.1, включающее CDR3 вариабельного района тяжелой цепи с последовательностью, проявляющей, по меньшей мере, 70%, 75%, 85% или более предпочтительно, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности SEQ ID NO:2.

7. Антитело по п.1, включающее CDR3 вариабельного района тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO:2.

8. Антитело по п.1, включающее CDR3 вариабельного района легкой цепи с последовательностью, проявляющей, предпочтительно, по меньшей мере, 60%, 70%, 75%, 85%, более предпочтительно, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности SEQ ID NO:3.

9. Антитело по п.1, включающее CDR3 вариабельного района легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO:3.

10. Антитело по любому из предшествующих пунктов, включающее

последовательность вариабельного района тяжелой цепи, имеющую, по меньшей мере, 80% идентичность с SEQ ID NO:4, где последовательность вариабельного района тяжелой цепи CDR3 имеет, по меньшей мере, 60% идентичность с SEQ ID NO:2; и

последовательность вариабельного района легкой цепи, имеющую, по меньшей мере, 80% идентичность с SEQ ID NO:5, где последовательностью вариабельного района легкой цепи CDR3, имеет, по меньшей мере, 70% идентичность с SEQ ID NO:3.

11. Антитело по п.10, где вариабельная цепь района тяжелой цепи CDR имеет, по меньшей мере, 80% идентичность с CDR SEQ ID NO:19, и где

этот вариабельный район легкой цепи CDRs, является, по меньшей мере, на 80% идентичным с CDR SEQ ID NO:19.

12. Антитело по п.1, включающее каркасный район SEQ ID NO:20.

13. Антитело по п.1, содержащее V H последовательности SEQ ID NO:4 и V L последовательности SEQ ID NO:5.

14. Антитело по п.13, включающее, по меньшей мере, одну мутацию, по меньшей мере, в одном из CDR, приводящую к более высокому сродству, характеризуемому K D менее приблизительно 3 нМ.

15. Антитело по п.14, отличающееся тем, что упомянутая мутация или упомянутые мутации находятся в CDR1 или CDR2 V H и/или V L .

16. Антитело по п.14, отличающееся тем, что упомянутая мутация находится в CDR2 V H .

17. Антитело по п.1, включающее CDR2 вариабельного района тяжелой цепи, включающий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 или SEQ ID NO:13.

18. Антитело по п.17, где упомянутым определенным последовательностям CDR2 предшествуют аминокислотные остатки AI и за которыми следуют последовательности SEQ ID NO:17.

19. Антитело по п.5, содержащее структуру NH 2 -V L -линкер-V H -СООН или NH 2 -V H -линкер-V L -COOH, где линкер имеет последовательность SEQ ID NO:16.

20. Антитело, охарактеризованное в п.1, которое помечено с помощью радиоактивной метки или с помощью токсина.

21. Антитело по п.1, применяемое в качестве лекарственного средства для лечения рака или опухоли.

22. Антитело по п.1, применяемое в качестве диагностического инструмента для диагностики рака или опухоли.

23. Применение антитела по любому из предшествующих пунктов для производства лекарственного средства для лечения рака или опухолей.

24. Применение по п.23, при котором лекарственное средство необходимо для ингибирования связывания МК и/или PTN с ALK или опосредованной ALK передачи сигнала.

25. Применение по п.23 или 24, при котором лекарственное средство является комбинированным, пригодным для введения упомянутого антитела в комбинации с противораковым агентом, например метотрексатом.

26. Применение по п.25, при котором лечение является лечением нейробластомы, глиобластомы, рабдомиосаркомы, карциномы груди, меланомы, рака поджелудочной железы, неходжкинской лимфомы В-клеток, карциномы щитовидной железы, мелкоклеточной карциномы легких, ретинобластомы, саркомы Эвига, рака простаты, рака кишечника, рака поджелудочной железы, липомы, липосаркомы, фибросаркомы, в частности глиобластомы, нейробластомы и рабдомиосаркомы.

27. Последовательность ДНК, кодирующая антитело по любому из пп.1-19.

28. Экспрессионный вектор, включающий последовательность ДНК по п.27.

29. Клетка-хозяин, трансформированная экспрессионным вектором по п.28.

30. Клетка-хозяин по п.29, представляющая собой клетку E.COLI.

31. Способ получения антитела по пп.1-19, включающий культивирование клеток-хозяин по п.29 в условиях, позволяющих синтез упомянутого антитела и извлечение его из упомянутой культуры.

32. Антитело по любому из пп.1-10, которое связывается с эпитопом, являющимся фрагментом, включающим или в основном состоящим из SEQ ID NO:1.

РИСУНКИ