Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
Патент на изобретение №2461565

(19)

RU

(11)

2461565

(13)

C1

(51) МПК C07K7/06 (2006.01)

C12P21/00 (2006.01)

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ Статус: по данным на 17.09.2012 - нет данных Пошлина:

(21), (22) Заявка: 2011114850/10, 15.04.2011

(24) Дата начала отсчета срока действия патента:

15.04.2011

Приоритет(ы):

(22) Дата подачи заявки: 15.04.2011

(45) Опубликовано: 20.09.2012

(56) Список документов, цитированных в отчете о

поиске: DORGHAM К. еt al., An engineered CX3CR1 antagonist endowed with anti-inflammatory activity, J Leukoc BioL, 2009, v.86, no.4, pp.903-911. INOUE A. еt al. Antagonist of fractalkine (CX3CL1) delays the initiation and ameliorates the progression of lupus nephritis in MRL/lpr mice, Arthritis Rheum, 2005, v.52, no.5, pp.1522-1533. MARUYAMA K. еt al.Oligo-capping: a simple method to replace the cap structure of eukaryotic mRNAs with oligoribonucleotides, Gene, 1994, v.138, no.1-2, pp.171-174.

Адрес для переписки:

121552, Москва, ул. 3-я Черепковская, 15а, ФГУ "РКНПК", пат.пов. О.И.Куприяновой

(72) Автор(ы):

Азьмуко Андрей Андреевич (RU),

Арефьева Татьяна Игоревна (RU),

Беспалова Жанна Дмитриевна (RU),

Красникова Татьяна Леонидовна (RU),

Кухтина Надежда Борисовна (RU),

Молокоедов Александр Сергеевич (RU),

Палькеева Марина Евгеньевна (RU),

Рулева Наталья Юрьевна (RU),

Сидорова Мария Владимировна (RU),

Соколов Владимир Олегович (RU)

(73) Патентообладатель(и):

Федеральное государственное учреждение "Российский кардиологический научно-производственный комплекс" Министерства здравоохранения и социального развития (ФГУ "РКНПК" Минздравсоцразвития России) (RU)

(54) ПЕПТИД ДЛЯ ИНГИБИРОВАНИЯ ФРАКТАЛКИН-СТИМУЛИРОВАННОЙ МИГРАЦИИ МОНОЦИТАРНЫХ КЛЕТОК

(57) Реферат:

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к пептиду для ингибирования фракталкин-стимулированной миграции моноцитарных клеток. Пептид выбрают из H-PKEQWVKD-NH 2 или

H-DAMQHLDRQAAA-NH 2 . Предложенное изобретение позволяет синтезировать пептид, лишенный побочных реакций, ингибирующий фракталкин-стимулированную миграцию моноцитарных клеток. 1 ил., 1 табл., 3 пр.

Предлагаемое изобретение относится к биологически активным пептидам и белкам, способным ингибировать подвижность клеток, стимулированную хемокином фракталкином, а также к лекарственным средствам на их основе.

Известно, что хемокины являются основными регуляторными белками, по градиенту которых осуществляется рекрутирование и миграция лейкоцитов при воспалении. Кроме того, известно, что воспаление является неотъемлемым компонентом многих патологических состояний, таких как онкогенез, атеросклероз, аутоиммунные заболевания, болезнь Альцгеймера и др.

К семейству хемокинов принадлежат, в частности, относительно короткие белки - моноцитарный хемотаксический белок-1 (МСР-1) и фракталкин. Функция хемокинов осуществляется через специальные рецепторы, экспрессируемые клетками иммунной системы и клетками-мишенями действия хемокинов. Известно, что фракталкин в отличие от других хемокинов является мембраносвязанным хемокином, который включает в себя хемокиновый, трансмембранный и внутриклеточный домены. Хемокиновый домен заякорен в мембране через трансмембранный муцин-подобный стержень, соединенный с внутриклеточным доменом [1]. Заякоренный хемокиновый домен фракталкина высвобождается из клеточной мембраны протеолизом и переходит в растворимую форму, обозначаемую как растворимый фракталкин. В мембранной форме фракталкин действует как адгезионная молекула, в растворимой форме - как хемоаттрактант. Фракталкин экспрессируется дендритными клетками, эндотелиальными и гладкомышечными клетками и нейронами и связывается с рецептором, экспрессируемым клетками иммунной системы и глиальными клетками центральной нервной системы. В экспериментах на животных показано, что взаимодействие фракталкина с рецептором играет заметную роль в атерогенезе [2], ревматоидном артрите [3] и нефропатии [4]. Выявлена связь экспрессии фракталкина, фракталкинового рецептора и боли у пациентов, страдающих устойчивыми болями при панкреатите [5]. Действие фракталкина проявляется как в растворимой, так и в связанной форме в гомеостатических условиях и при воспалении. В настоящее время ингибирование связывания фракталкина с рецептором можно рассматривать в качестве одной из возможностей противовоспалительной терапии сердечно-сосудистых, ревматологических, панкреатических и неврологических заболеваний. Поэтому поиск и синтез ингибиторов такого рода представляется актуальным.

Установлено, что в патогенезе атеросклероза ведущая роль принадлежит хемокину МСР-1 (monocyte chemoattractant protein-1), который экспрессируется макрофагами, гладкомышечными и эндотелиальными клетками стенки сосуда. Известен С - концевой фрагмент 65-76 моноцитарного хемотаксического белка - 1 (МСР-1), ингибирующий МСР-1-зависимую миграцию моноцитов in vitro и in vivo [9]. Поскольку в экспериментах на животных установлена независимая роль МСР-1 и фракталкина в миграции моноцитов/макрофагов и их участия в формировании атеросклеротических бляшек [8], несомненный интерес в дополнение к антагонисту, описанному в [9], представляет разработка пептидных фрагментов структуры хемокинового домена фракталкина - антагонистов, способных ингибировать фракталкин-зависимую миграцию моноцитов.

В настоящее время в литературе представлены единичные примеры антагонистов фракталкина [6, 7]. Наиболее близким к заявляемому антагонисту является ингибитор миграции Т - лимфоцитов и естественных киллеров крови человека in vitro и моноцитов/макрофагов мыши in vivo [7]. Этот ингибитор (F1) представляет собой последовательность хемокинового домена фракталкина (1-77 аминокислотных остатков), модифицированную в N-концевой части добавлением остатка изолейцина в «нулевом» положении и заменой аминокислотных остатков QHHGVT на LDNGVS, либо эта последовательность, ковалентно связанная с Fc - фрагментом иммуноглобулина (F1-Ig). Ингибитор F1 получали с помощью химического синтеза или генной инженерии с использованием химерных фагмидных векторов. Из F1 затем получали конъюгат с Fc-фрагментом иммуноглобулина - F1-Ig. F1 (10 нг/мл) и F1-Ig (35 нг/мл) ингибировали миграцию CD8 (CD - cluster determination, кластеры дифференцировки - антигены клеточной поверхности) Т-лимфоцитов in vitro на 18% и 24% соответственно, а естественных киллеров - на 26% и 34%. Более значительные эффекты ингибирования (для естественных киллеров при F1 73% и при F1-Ig 69% и для Т-лимфоцитов при F1 49% и при F1-Ig 73%) зарегистрированы при 10-кратном увеличении концентрации антагонистов. Поскольку в настоящее время это единственные антагонисты фракталкина, ингибирующие миграцию Т-лимфоцитов и естественных киллеров крови человека in vitro, стимулируемую хекмокиновым доменом, они выбраны в качестве прототипа заявляемого изобретения.

Недостатками прототипа являются дороговизна и сложность синтеза, обусловленные длиной аминокислотной последовательности и методом синтеза (метод генной инженерии с использованием химерных фагмидных векторов), что предполагает многостадийную дорогостоящую очистку и трудности в стандартизации препарата. Кроме того, в случае предполагаемого применения подобных антагонистов в противовоспалительной терапии, белковые соединения могут вызывать аллергические осложнения.

Задачей настоящего изобретения явился поиск и синтез относительно коротких пептидов, лишенных побочных реакций, ингибирующих фракталкин-стимулированную миграцию моноцитарных клеток, причем синтез, очистка и идентификация таких пептидов должны быть значительно проще и дешевле по сравнению с синтезом, выделением и идентификацией белка-прототипа.

Поставленная задача решается путем синтеза пептидов формулы: H-PKEQWVKD-NH 2 и H-DAMQHLDRQAAA-NH 2 .

Заявляемые пептиды содержат 8 и 12 аминокислотных остатков соответственно (для сравнения прототип - белок длиной в 78 аминокислотных остатков и его конъюгат с Fc-фрагментом иммуноглобулина). Синтез заявляемых пептидов осуществляется твердофазным способом с помощью Fmoc-технологии, что в настоящее время с учетом длины пептида является рутинной задачей. Очистка пептидов осуществляется путем обычной одностадийной ВЭЖХ. Все это делает получение заявляемых антагонистов значительно проще и дешевле, чем синтез белка-прототипа.

Неочевидность изобретения обусловлена тем, что поставленная задача решается путем синтеза пептидов последовательности 53-60 и 60-71 фракталкина, хотя из литературы неизвестно ни одного фрагмента этого белка, способного ингибировать фракталкин-стимулированную миграцию моноцитарных клеток. Таким образом, из литературных данных не следовало, что поиск пептидных ингибиторов фракталкин-стимулированной подвижности моноцитарных клеток среди фрагментов молекулы фракталкина может привести к желаемым результатам. Заявляемые пептиды нетоксичны, поскольку являются фрагментами эндогенного фракталкина.

Синтез заявляемых пептидов осуществляется по стандартной технологии пептидного синтеза на твердой фазе с применением наиболее современной Fmoc-(9-флуоренилметоксикарбонил)-технологии. В качестве нерастворимого носителя использовали сополимер стирола с 1% дивинилбензола с кислотолабильными якорными группами. Для блокирования функциональных групп боковых цепей аминокислот применяли следующие защиты: тpeт-бутильную для карбоксильных групп аспарагиновой и глутаминовой кислот; трет-бутилоксикарбонильную (Воc) - защиту для -аминогруппы лизина; 2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6-сульфонильную (Pmc) - защиту для гуанидиновой функции аргинина; тритильную (Trt) - группу для карбоксамидной функции глутамина и имидазольного кольца гистидина. Пептидную цепь наращивали по одной аминокислоте, начиная синтез с С-конца. Для создания амидных связей использовали N,N'-диизопропилкарбодиимид в присутствии 1-гидроксибензотриазола (DIC/HOBt-метод). Для заключительного деблокирования и отщепления пептидов от носителя применяли трифторуксусную кислоту со скэвенджерами. Сырой продукт твердофазного синтеза очищали с использованием препаративной ВЭЖХ.

Пример 1. Синтез амида октапептида H-Pro-Lys-Glu-Gln-Trp-Val-Lys-Asp-NH 2 (1), соответствующего последовательности 53-60

Список сокращений:

АА - аминокислота;

Вое - трет-бутилоксикарбонил;

Bu t - трет-бутил;

DIC - N,N'-диизопропилкарбодиимид;

DCM - дихлорметан;

DMSO-d 6 - дейтерированный диметилсульфоксид;

DTT - дитиотреитол;

Fmoc - 9-флуоренилметоксикарбонил;

НОВТ - 1-гидроксибензотриазол;

NMP - N-метилпирролидон;

4-MePip - 4 метилпиперидин;

Pmc - 2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6-сульфонил;

TIBS - триизобутилсилан;

TFA - трифторуксусная кислота;

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография.

В работе использованы производные L-аминокислот (Bachem, Швейцария), DIC, HOBt, TIBS, (Fluka, Швейцария). Для синтеза применяли N-метилпирролидон, дихлорметан, пиперидин, метанол и TFA (Applied Biosystems GmbH, Германия). Аналитическую ВЭЖХ проводили на хроматографе (Gilson, Франция), использовали колонку Kromasil C18, 4.6×250 мм, 5 мкм; буфер А: 0.1% водная трифторуксусная кислота, буфер Б: 80% ацетонитрил + 20% буфера А; градиент Б от 10 до 70% за 30 мин. Скорость потока 1 мл/мин, детекция при 220 нм. Структура полученных пептидов доказана спектрами 1 Н-ЯМР и данными масс-спектрометрии. 1 H-ЯМР-спектры снимали на спектрометре WM-500 (Bruker) 500 МГц (ФРГ) в DMSO-d 6 при 300К, концентрация пептидов составляла 2-3 мг/мл. Химические сдвиги измерялись относительно тетраметилсилана. Масс-спектры регистрировали на приборе PC-Kompact MALDI (Kratos, Англия).

Для твердофазного синтеза использовали сополимер стирола с 1% дивинилбензола с 4-(2,4-диметоксифенил)-Fmoc-аминометилфенокси - якорной группой (Rink-amide-полимер) фирмы Nova BioChem, Германия, предназначенный для получения амидов пептидов, содержащий 0.56 ммоль/г аминогрупп. Синтез амида октапептида проводили с С-конца, ступенчато (присоединяя по одной аминокислоте), исходя из 0.45 г (0.25 ммоль) Rink-amide-полимера. Синтез проводили в автоматическом режиме на пептидном синтезаторе Applied Biosystems 431 А по стандартной программе для однократной конденсации Fmoc-аминокислот. (См. протокол твердофазного синтеза).

Протокол твердофазного синтеза

Операция

Реагент

Время обработки

Циклы 1-8

1

Промывка

5×NMP

3 мин

2

Деблокирование -аминогрупп

25% 4-MePip/NMP

10 мин

3

Промывка

5×NMP

3 мин

4

Активация

1 ммоль Fmoc-AA+1 ммоль НОВТ+1 ммоль DIC в NMP

20 мин

5

Конденсация

1 ммоль активированного производного Fmoc-AA в NMP

90 мин

6

Промывка

5×NMP

3 мин

Заключительное деблокирование и отщепление октапептида от полимера проводили в одну стадию путем обработки соответствующего нонапептидилполимера смесью 10 мл TFA, 0.25 мл деионизованной воды и 0.25 мл TIBS, 0.25 г DTT в течение 2 ч. Затем полимер отфильтровывали, промывали 2×2 мл деблокирующей смеси, фильтрат упаривали и к остатку прибавляли сухой эфир. Осадок отфильтровывали, промывали DCM (3×3 мл) эфиром (3×5 мл), сушили в вакуум-эксикаторе. Сырой продукт твердофазного синтеза с содержанием основного вещества 75% очищали с помощью препаративной ВЭЖХ на приборе Beckman (США), используя колонку Диасорб С 16 13 ОТ (25×250 мм), размер частиц сорбента 10 мкм. В качестве элюентов использовали буфер А - 0.01 М раствор ацетата аммония и буфер Б - 80% ацетонитрила в воде. Элюцию проводили градиентом 0.5% в минуту буфера Б в буфере А от 100% буфера А со скоростью 10 мл/мин. Пептиды детектировали при длине волны 220 нм. Фракции, содержащие целевой продукт, объединяли, ацетонитрил упаривали и лиофилизовали. Выход пептида (1) составил 100 мг 58.2% (в расчете на стартовую аминокислоту, присоединенную к полимерному носителю, т.е. это суммарный выход на все стадии синтеза), чистота пептида - 98% (колонка Kromasil С 18, 4.6×250 мм, 5 мкм; буфер А: 0.1% водная трифторуксусная кислота, буфер Б: 80% ацетонитрил+20% буфера А; градиент Б от 10 до 70% за 30 мин; R t - 12.43 мин); m/z: 1028.6 [М+Н] + , вычислено М=1027.17.

Пример 2. Синтез амида додекапептида H-Asp-Ala-Met-Gln-His-Leu-Asp-Arg-Gln-Ala-Ala-Ala-NH 2 (2), соответствующего последовательности 60-71 хемокинового домена фракталкина

Твердофазный синтеза пептида (2) проведен на том же полимерном носителе и по тому же протоколу с соответствующим увеличением количества синтетических циклов, что и синтез пептида (1).

Заключительное отщепление защитных групп проводили одновременно с отщеплением целевого пептида от полимерного носителя действием трифторуксусной кислоты со скэвенджерами: TFA 10 мл, TIBS 0.25 мл, DTT 0.25 г, тиоанизол 0.5 мл, фенол 0.75 г, вода 0.25 мл в течение 2 ч. Полученный пептид очищали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на обращенной фазе, как описано в примере 1.

Выход пептида (2) составил 146 мг 62.9% (в расчете на стартовую аминокислоту, присоединенную к полимерному носителю, т.е. это суммарный выход на все стадии синтеза), чистота пептида - 97% (колонка Kromasil С 18, 4.6×250 мм, 5 мкм; буфер А: 0.1% водная трифторуксусная кислота, буфер Б: 80% ацетонитрил + 20% буфера А; градиент Б от 10 до 70% за 30 мин; R t - 11.12 мин); m/z: 1325.46 [M+H] + , 1347.46

[M+Na] + , 1363.45 [М+К] + ; вычислено М=1324.48.

Пример 3. Анализ влияния синтезированных пептидов на миграцию моноцитарных клеток in vitro

Исследования проводили в 48-луночной камере Бойдена с использованием фракции CD14+CD16+моноцитов периферической крови здоровых добровольцев. Мононуклеарные клетки выделяли из периферической крови путем центрифугирования в градиенте плотности Histopaque ( =1.077, Sigma). Для удаления из полученной популяции клеток нейтрофильных и эозинофильных гранулоцитов и NK-клеток в клеточную суспензию вносили конъюгированные с магнитными бусами FcR Blocking Reagent и Non-Monocyte Depletion Cocktail, состоящий из конъюгированных с магнитными бусами антител к CD15 и CD56 антигенам, в концентрациях, рекомендованных производителем (Miltenyi Biotec Inc., Germany). Затем клетки отмывали от несвязавшихся антител, после чего наносили на колонку, помещенную в магнитное поле, и собирали фракцию клеток, прошедшую через колонку. Для выделения CD16+ моноцитов клетки инкубировали с моноклональными антителами к CD16, конъюгированными с магнитными бусами, после чего клеточную суспензию наносили на колонку, помещенную в магнитное поле. В конечном итоге, освобождались от всех клеток, за исключением CD16+ моноцитов, которые задерживались на колонке. CD16+, моноциты снимали с колонки, отмывали в фосфатном буфере без Са 2+ и Mg 2+ и ресуспендировали в растворе Хэнкса с 0,5% бычьего сывороточного альбумина. Полученная суспензия клеток содержала не менее 65% CD16+ моноцитов, которые, по данным цитофлуориметрического анализа, коэкспрессировали CD14 и рецепторы фракталкина CX3CR1, т.е. имели CD14+CD16+CX3CR1+ фенотип. Количество жизнеспособных клеток, окрашенных трипановым синим, составляло не менее 98%. В лунки камеры Бойдена наносили по 10 5 клеток и камеру инкубировали 45 мин в CO 2 - инкубаторе.

Полученные результаты представлены на фиг.1. Фракталкин (100 нг/мл) стимулировал миграцию моноцитов на 75% в сравнении со спонтанной миграцией клеток. Октапептид (53-60) (100 мкг/мл) достоверно ингибировал (на 70%) стимулированную фракталкином миграцию CD14+CD16+ моноцитов (Фиг.1) Додекапептид (60-71) (100 мкг/мл) также проявлял ингибирующие свойства - достоверно ингибировал (на 60%) стимулированную фракталкином миграцию CD14+CD16+ моноцитов (Фиг.1). Ингибирование миграции моноцитов указанными пептидами происходило также и при концентрации 1 мкг/мл. Следует отметить, что при использовании пептидного фрагмента хемокина МСР-1, ингибирующего миграцию моноцитов т vitro в аналогичной (100 мкг/мл) концентрации, противовоспалительный эффект in vivo достигается в значительно меньшей дозе - 35 мкг/кг [9].

Таким образом, впервые показано, что пептидные фрагменты 53-60 и 60-71 аминокислотной последовательности хемокинового домена фракталкина ингибируют фракталкин - зависимую миграцию CD14+CD16+ моноцитов человека на 70% и 60% в концентрации 100 мкг/мл. В прототипе подобные эффекты ингибирования для естественных киллеров при F1 (73%), при F1-Ig (69%) и для Т-лимфоцитов при F1 (49%) и при F1-Ig (73%) достигаются при 0,35 мкг/мл. Однако получение синтетических пептидных ингибиторов хемокинового домена фракталкина намного проще и менее затратно по сравнению с прототипом. Заявляемые пептиды нетоксичны, поскольку являются короткими фрагментами эндогенного белка человека.

Формула изобретения

Пептид для ингибирования фракталкин-стимулированной миграции моноцитарных клеток, выбранный из H-PKEQWVKD-NH 2 или Н-DAMQHLDRQAAA-NH 2 .

РИСУНКИ