Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
Патент на изобретение №2461831

(19)

RU

(11)

2461831

(13)

C1

(51) МПК G01N33/50 (2006.01)

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ Статус: по данным на 17.09.2012 - нет данных Пошлина:

(21), (22) Заявка: 2011124305/15, 16.06.2011

(24) Дата начала отсчета срока действия патента:

16.06.2011

Приоритет(ы):

(22) Дата подачи заявки: 16.06.2011

(45) Опубликовано: 20.09.2012

(56) Список документов, цитированных в отчете о

поиске: RU 2407007 С1, 20.12.2010. RU 2152617 С1, 10.07.2000. US 6673566 В1, 06. 01.2004. MOSHAGE H. et al. Nitrite and nitrate determinations in plasma: a critical evaluation. Clin Chem. 1995, Jun, 41 (6 Pt 1):892-6. реферат. ISHIBASHI T. et al. Methods to evaluate endothelial function: A search for a marker of nitric oxide (NO) in vivo: re-evaluation ofNOx in plasma and red blood cells and a trial to detect nitrosothiols. J Pharmacol Sci. 2003 Dec; 93(4):409-16. реферат.

Адрес для переписки:

117997, Москва, ул. Островитянова, 1, ГОУ ВПО "РГМУ ФА по ЗДиСР", отдел охраны интеллектуальной собственности

(72) Автор(ы):

Титов Владимир Юрьевич (RU),

Осипов Анатолий Николаевич (RU),

Горский Виктор Александрович (RU),

Агапов Михаил Андреевич (RU),

Балякин Юрий Викторович (RU),

Иванова Анна Владимировна (RU),

Камчатнов Павел Рудольфович (RU),

Жданова Софья Геннадьевна (RU)

(73) Патентообладатель(и):

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" (ГОУ ВПО РГМУ Росздрава) (RU)

(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОСТРОГО НЕСПЕЦИФИЧЕСКОГО ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ПРОЦЕССА

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для диагностики острых неспецифических воспалительных процессов. Определяют в плазме крови пациента концентрацию нитритов и N-нитрозосоединений. При ее суммарной величине свыше 0,15 мкМ диагностируют наличие острого неспецифического воспалительного процесса. Изобретение обеспечивает возможность ранней диагностики острого неспецифического воспалительного процесса до проявления его клинических признаков вне зависимости от особенностей конкретного больного и области локализации воспаления. 2 табл., 3 пр.

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для диагностики острых неспецифических воспалительных процессов.

Ранняя диагностика воспалительного процесса необходима для его успешной профилактики и лечения.

Применяемые в настоящее время методы - исследование формулы крови, СОЭ являются методами, показания которых проявляются только на стадии выраженных клинических признаков воспалительного процесса и не пригодны для его ранней диагностики. Кроме того, показатели здоровых людей, имеют значительный разброс. Например, высокий показатель СОЭ характерен для беременных [Сметнев А.С., Кукес В.Г. // Внутренние болезни. / М.: Медицина, 1981, 496 с.].

Более точным подходом является определение специфических белков-маркеров воспаления [патент РФ 2407007]. Данный способ может быть выбран в качестве прототипа. Но он требует специальной аппаратуры и едва ли применим для массового мониторинга.

Заметим также, что нормальные показатели всех этих методов имеют значительный разброс.

Известно, что при воспалении активированные клетки белой крови, обеспечивающие неспецифический иммунитет, продуцируют окись азота (NO), благодаря активации индуцибельной NO-синтазы [Gómez-Jiménez J, Salgado A, Mourelle М, Martin MC, Segura RM, Peracaula R, and Moncada S. Crit. Car. Med. 1995, v.23(2):253-258.; Belmont H., Levartovsky D., Goel A., Amin A., Giorno R., Rediske J., Skovron М., and Abramson S. Arthritis Rheum. 1997, v.40(10):1810-1816].

В связи с этим NO рассматривается как важнейший медиатор воспаления [Moncada S. Schweiz. Rundsch. Med. Prax., 1993, v.82(42): 1154-1160; Moncada, S., Palmer, R., and Higgs, E. Pharm. Rev., 1991, v.43: 109-142]. Предпринимались попытки определить содержание метаболитов NO в крови и других физиологических жидкостях в норме и при воспалении. В подавляющем большинстве работ об их содержании судят по суммарной концентрации нитрата и нитрита (NOx) - конечных и наиболее стойких метаболитов окиси азота [Benjamin, N., and Vallance, P. Lancet, 1994, 344, 960.; Blum, J., Dosogne, H., Hoeben, D., Vangroenweghe, F., Hammon, H., Bruckmaier, R., and Burvenich, C., Domest. Anim. Endocrinol., 2000, 19, 223-235; Jang, D., and Murrell, Free Radic. Biol. & Med., 1998, 24, 1511-1519].

Предложен, в частности, способ ранней диагностики воспаления при ревматоидном артрите, основанный на определении нитрата в плазме крови больного (патент РФ 2245556). В соответствии с полученными авторами данными, при дебюте ревматоидного артрита содержание нитрата, в среднем, выше, чем в контроле более чем в 2 раза. Заметим, что содержание нитрата определялось потенциометрически. Этот метод очень чувствителен к наличию примесных ионов [Емченко С.В., Цыганенко О.И. Методы определения нитратов и нитритов в пищевых продуктах. // В "Методы анализа токсикантов в пищевых продуктах". Аналитические обзоры. Серия Экология. РАН Сибирское отделение. Новосибирск 1993, вып.27, с.95-115]. Авторами получены очень высокие величины содержания нитрата в плазме здоровых людей (порядка миллимоль), не соответствующие данным литературы.

Также предложен способ оценки активности и характера воспаления дыхательных путей, основанный на регистрации содержания NOx в бронхоальвеолярном лаваже (патент РФ 2152617). По данным авторов, в период обострения воспалительных процессов дыхательных путей данный показатель увеличивается более чем в 2 раза, по сравнению с контролем, а показатели ниже контрольных значений в 2 и более раза в период ремиссии указывают на необратимый характер воспаления дыхательных путей.

Однако эти способы предложены только для диагностики или конкретных заболеваний (ревматоидный артрит) или воспалительного процесса определенной локализации (дыхательные пути). Кроме того, контрольные показатели имеют большой разброс. Известно также, что нитрат в норме поступает в организм в большом количестве экзогенно вместе с водой и пищей. На его содержание, по-видимому, будет влиять и эффективность выделительной системы. Поэтому очевидно, что диагностический подход, основанный на его регистрации, нельзя считать корректным.

Таким образом, нами в литературе не найдено высокочувствительного и надежного экспресс-метода с однозначной трактовкой полученных результатов, пригодного для массового мониторинга острого неспецифического воспалительного процесса на доклинической стадии.

Задачей изобретения являлась разработка способа массовой диагностики неспецифических воспалительных процессов до проявления клинических признаков воспаления.

Технический результат заключается:

- в обеспечении возможности ранней достоверной диагностики острого неспецифического воспалительного процесса до проявления его клинических признаков вне зависимости от особенностей конкретного больного и области локализации воспаления путем избирательной оценки повышенного содержания продукта метаболизма NO, присущего воспалению при исключении из анализа других продуктов метаболизма окиси азота, присущих как воспалительным, так и физиологическим процессам в организме;

- а также в простоте, быстроте и отсутствии больших материальных затрат при проведении исследования за счет исключения этапа предварительной подготовки образца и использования дорогостоящей аппаратуры.

Нами установлено, что анализ содержания конкретных метаболитов окиси азота дает точную информацию о состоянии пациента, если определять не просто общий пул метаболитов NO, а содержание их основных физиологически значимых групп.

Как показали наши исследования, в плазме здоровых людей присутствуют следующие метаболиты NO: динитрозильные комплексы железа (ДНКЖ) (в конц. 3-20 мкМ), и нитрат - от нескольких десятков до нескольких сотен мкМ. В то время как нитрит (далее NO 2 - ) и N-нитрозосоединения (далее RNNO) содержатся в следовых количествах, но появляются при воспалительных процессах и исчезают при выздоровлении. Причем их появление регистрируется до появления каких-либо клинических признаков. Содержание прочих метаболитов NO не претерпевает каких-либо существенных изменений при развитии воспаления.

Нами выявлен достоверный маркер острого неспецифического воспаления - повышенная до определенной степени суммарная концентрация нитритов и RNNO.

Мы предполагаем, что при взаимодействии NO с активными формами кислорода, продуцируемыми активированными лейкоцитами, происходит образование активных короткоживущих форм азота - пероксинитрит, двуокись азота, которые трансформируются до нитрита и RNNO.

Сущность изобретения состоит в следующем.

Для диагностики острого неспецифического воспалительного процесса определяют в плазме крови пациента суммарную концентрацию нитритов и RNNO. При ее величине свыше 0,150 мкМ диагностируют наличие острого неспецифического воспалительного процесса.

Таким образом, появление нитритов и RNNO в плазме в концентрации свыше 150 нМ является признаком начала воспалительного процесса.

Способ осуществляется следующим образом.

Осуществляют забор крови у пациента. Для предотвращения ее свертывания использовали гепарин - 0,1 мл 1% раствора на 10 мл крови.

Плазму получали путем центрифугирования образцов. В плазме крови определяют концентрацию нитритов и RNNO. Определение производят следующим образом:

НЕОБХОДИМЫЕ РЕАКТИВЫ

40 мМ р-р KН 2 РО 4 (или NaH 2 PO 4 );

1,5 М маточный раствор NaCl;

25 мкМ маточный водный раствор нитрита (натрия либо калия) - для калибровки.

Гемолизированные эритроциты человека, полученные путем разбавления крови дистиллированной водой в 10 раз. Каталаза, содержащаяся в гемолизате - фермент-детектор, специфически ингибирующийся всеми нитрозосоединениями в присутствии галоид-ионов [Титов В.Ю., Петренко Ю.М., Ванин А.Ф. Биохимия, 2008, 73, 113-118]. Гемоглобин, содержащийся в гемолизате - ловушка NO [Moncada, S., Palmer, R., and Higgs, E. Pharm. Rev., 1991, 43, 109-142], позволяющая исключить физиологические доноры NO (ДНКЖ, S-нитрозотиолы), которые тоже оказывают на каталазу ингибирующий эффект.

Перекись водорода (3% раствор) - для определения активности каталазы.

ПОРЯДОК ПРОВЕДЕНИЯ АНАЛИЗА

1. Определяется активность каталазы в реакционной среде (общий объем 20 мл), содержащей 40 мМ фосфатный буфер, рН 6,0, гемолизированные эритроциты - 100 мкМ по гемгруппе, содержащие эндогенную каталазу, 150 мМ NaCl, 200 мкМ глутатиона, 50 мкМ FeSO 4 , 300 мкМ о-фенантролина (либо ЭДТА), Реагенты добавляются в вышеуказанном порядке. Это - контрольный образец.

2. Проводится калибровка. Определяется активность каталазы в вышеуказанной среде в присутствии 60, 120, 180 и 240 нМ нитрита. Строится калибровочная кривая.

3. Исследуемый образец (100-1000 мкл) добавляется в основную среду после добавления NaCl (см п.1). Далее в нее с 1-минутными интервалами добавляется глютатион, закисное железо и о-фенантролин (либо ЭДТА). Определяется активность каталазы и суммарное содержание NO 2 - и RNNO, согласно калибровке.

ДНКЖ, также способные ингибировать каталазу, разрушаются под действием хелатора железа (о-фенантролин либо ЭДТА), а высвобождающаяся NO перехватывается оксигемоглобином. S-нитрозотиолы, под воздействием закисного железа и глютатиона, трансформируются в ДНКЖ, разрушаемые хелатором железа. Нитрит и RNNO не разрушаются под воздействием указанных факторов и сохраняют ингибирующую способность [Титов В.Ю., Петренко Ю.М., Ванин А.Ф. Биохимия, 2008, 73, 113-118]. Суммарное содержание нитритов и RNNO определяют согласно калибровке (см. п.2).

4. Также проводится дополнительный контроль: измерение активности каталазы в присутствии образца и в отсутствии NaCl. В отсутствии прочих ингибиторов каталазы (не содержащих нитрозогруппу) она должна быть аналогична контролю (1).

Активность каталазы определяется любым известным методом, не требующим использования перекиси водорода в концентрации более 9 мМ. Предпочтительнее видится разработанный нами ранее калориметрический метод, основанный на контроле кинетики теплопродукции, сопровождающей разложение перекиси [Titov, V.; Petrenko, Yu., Biochemistry (Moscow), 2003, 68, 627-633]. Этот метод не связан с фотометрией, а потому не чувствителен к исходной окрашенности и мутности образца.

Для доказательств возможности реализации заявленного назначения и достижения указанного технического результата приводим следующие данные.

В таблице 1 представлены данные о суммарном содержании нитрита и RNNO в плазме крови здоровых доноров и хирургических больных, полученные на кафедре экспериментальной и клинической хирургии медико-биологического факультета РГМУ. В качестве здоровых доноров приглашались добровольцы из студентов и сотрудников медико-биологического факультета РГМУ. В плазме здоровых доноров нитрит и RNNO достоверно не обнаруживались.

В плазме людей, страдающих различными заболеваниями, сопровождающимися развитием острого неспецифического воспалительного процесса, появляется субстанция с каталазоингибирующими свойствами, характерными для нитрита и RNNO. Ее суммарная концентрация - свыше 0,15 мкМ.

Эти данные говорят о том, что воспаление действительно сопряжено с появлением в плазме нитрита и RNNO не зависимо от характера воспалительного заболевания.

При выздоровлении содержание NO 2 - +RNNO снижалось до следового (таблица 2).

Для подтверждения высокой чувствительности предлагаемого диагностического параметра приводим следующие данные.

Пример конкретного выполнения

Пример 1. Пациент В., 44 года, пришедший как доброволец для контрольной группы. Температура 36,6°С, никаких субъективных болезненных ощущений не испытывал, наоборот, чувствовал себя очень бодро. АД 120/70. Было отмечено лишь некоторое увеличение частоты сердцебиения (до 80 ударов в минуту). Но он объяснил это тем, что волнуется. Однако в плазме крови у него обнаружено 0,4 мкМ NO 2 - +RNNO. На следующий день появились чихание, насморк, легкая головная боль, а еще через день - покраснение миндалин и увеличение температуры до 37,2°С. В. не стал обращаться к врачу, ограничился полосканием горла настоем эвкалипта. Через 6 дней симптомы болезни исчезли, температура нормализовалась, содержание NO 2 - +RNNO стало следовым.

Пример 2. Пациент А., 11 лет. Чувствовал себя здоровым, температура -36,6°С. Отмечалась повышенная возбудимость, некоторая рассеянность. Но в плазме крови было зафиксировано 0,9 мкМ NO 2 - +RNNO. На следующий день отмечалась тошнота, головная боль, боль в горле и повышение температуры до 39°С. В поликлинике был поставлен диагноз - ангина катаральная, назначено лечение. Через неделю температура нормализовалась, болезненные ощущения отсутствовали, но сохранялось некоторое покраснение миндалин. Содержание NO 2 - +RNNO в плазме снизилось до 0,35 мкМ. Еще через неделю при повторном обследовании в поликлинике пациент был признан здоровым. Содержание NO 2 - +RNNO в плазме стало следовым.

Особую ценность предлагаемый метод может представлять как способ контроля состояния людей, которые не могут сообщить врачу о своем состоянии. Таковыми, в частности, являются неврологические больные. Вот примеры, полученные при нашем исследовании, проведенном на кафедре неврологии РГМУ с целью определения возможности использования предлагаемого метода для текущего мониторинга состояния больных с инсультом.

Пример 3. Больная И., 68 лет. Поступила в стационар с острым нарушением мозгового кровообращения по ишемическому типу. При поступлении: лимфоузлы не увеличены, дыхание везикулярное, хрипов нет. Общий анализ крови не свидетельствовал о наличии воспалительных заболеваний: лейкоциты - 6,1·10 3 /мкл, СОЭ - 12 мм/час. Но в плазме зафиксировано 2,5 мкМ NO 2 - +RNNO. Рентгенологическое исследование, проведенное через 4 дня, выявило инфильтрацию легочной ткани в нижней доле правого легкого. Был поставлен диагноз - нижнедолевая пневмония. Было проведено лечение антибиотиками. При выписке инфильтраты в легких отсутствовали, содержание NO 2 - +RNNO в плазме - следовое.

Пример 4. Больной Д. Поступил в стационар с острым нарушением мозгового кровообращения по ишемическому типу. При поступлении температура 36,2°С, хронические заболевания отрицает. Анализ крови на день поступления: гемоглобин - 16,4 г/дл (норма - 12~17), эритроциты - 5,36·10 6 /мкл (3.7~5.5), гематокрит - 46,3% (37~55), цветовой показатель - 0,92 ед (0,82~1,05), тромбоциты - 147·10 3 /мкл (150~450), лейкоциты - 6,7 10 3 /мкл (4~9), лимфоциты - 22% (19~37), нейтрофилы палочкоядерные - 2% (1~6), нейтрофилы сегментоядерные - 70% (47~72), моноциты - 6% (2~11), СОЭ - 8 мм/час (2~15). Но в плазме зафиксировано 0,4 мкМ NO 2 - +RNNO. В дальнейшем у больного был диагностирован хронический бронхит и мочевая инфекция в стадии обострения.

Таблица 1

Содержание нитро- и нитрозосоединений в плазме здоровых доноров и больных, страдающих различными воспалительными заболеваниями.

Доноры

NO 2 - +RNNO, мкМ

Здоровые (n=20)

следы

Острый гайморит (n=6)

1-2,5

Острый панкреатит (n=15)

0,8-3

Холецистит (n=8)

0,9-2,0

Абсцесс печени (n=2)

0,6-1,5

Острый аппендицит (n=18)

2,5-10

ОРЗ (n=18)

0,3-1,2

Таблица 2

Изменение содержания (NO 2 - +RNNO) в плазме больных по мере выздоровления.

Больной,

Диагноз

Содержание (NO 2 - +RNNO), мкМ

При поступлении

При выписке

1

Острый гаймрит

1,5±0,15

следы

2

То же

1,1±0,09

следы

3

То же

0,9±0,05

следы

4

Острый холецистит

0,9±0,05

следы

5

Абсцесс печени

0,6±0,05

следы

6

Острый аппендицит

10,0±0,9

следы

7

То же

2,5±0,2

следы

8

Панкреонекроз

0,85±0,07

следы

9

ОРЗ

0,3±0,08

следы

10

То же

1,2±0,08

следы

11

То же

1,7±0,1

следы

Формула изобретения

Способ диагностики острого неспецифического воспалительного процесса, отличающийся тем, что определяют в плазме крови пациента концентрацию нитритов и N-нитрозосоединений и при ее суммарной величине свыше 0,15 мкМ диагностируют наличие острого неспецифического воспалительного процесса.