Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
Патент на изобретение №2462256

(19)

RU

(11)

2462256

(13)

C2

(51) МПК A61K35/32 (2006.01)

A61K35/48 (2006.01)

A61P1/02 (2006.01)

C12N5/071 (2010.01)

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ Статус: по данным на 17.09.2012 - нет данных Пошлина:

(21), (22) Заявка: 2009135689/15, 28.02.2008

(24) Дата начала отсчета срока действия патента:

28.02.2008

Приоритет(ы):

(30) Конвенционный приоритет:

28.02.2007 JP 2007-049128

(43) Дата публикации заявки: 10.04.2011

(45) Опубликовано: 27.09.2012

(56) Список документов, цитированных в отчете о

поиске: ЕР 1259593 В1, 13.04.2005. ЕР 1731177 A1, 13.12.2006. ЕР 1690929 A1, 16.08.2006. OHAZAMA A. Stem-cell-based tissue engineering of murine teeth. J Dent Res. 2004, v.83(7), p.518-22, PubMed, PMID: 15218039. RU 2265445 C1, 10.12.2005. RU 2281776 C1, 20.08.2006.

(85) Дата начала рассмотрения заявки PCT на национальной фазе: 28.09.2009

(86) Заявка PCT:

JP 2008/053529 20080228

(87) Публикация заявки PCT:

WO 2008/105499 20080904

Адрес для переписки:

191002, Санкт-Петербург, а/я 5, ООО "Ляпунов и партнеры", пат.пов. Е.Г.Ильмеру, рег. 1144

(72) Автор(ы):

ЦУДЗИ Такаси (JP),

САКУРАГАВА Нобуо (JP)

(73) Патентообладатель(и):

ОГАН ТЕКНОЛОДЖИС ИНК. (JP),

ДЗЕ КИТАСАТО ГАКУЭН ФАУНДЭЙШН (JP),

НИДЭК КО., ЛТД. (JP)

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЗУБА И ЗУБ, ПОЛУЧЕННЫЙ УКАЗАННЫМ СПОСОБОМ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины, стоматологии. Сущность способа получения зуба заключается в том, что размещают в поддерживающем носителе первую клеточную массу, по существу состоящую из клеток только одного из следующих видов: мезенхимных клеток, имеющих происхождение из амниона, который должен быть выброшен как экскременты при родоразрешении, или эпителиальных клеток, и вторую клеточную массу, по существу состоящую из клеток другого вида из указанных мезенхимальных клеток, имеющих происхождение из амниона, который должен быть выброшен как экскременты при родоразрешении, и эпителиальных клеток, где указанные первая и вторая клеточные массы не смешаны друг с другом, но приведены в тесный контакт друг с другом. Указанные эпителиальные клетки имеют происхождение, из следующих источников: зубного зачатка третьего моляра, кожи, слизистой оболочки или десны. Культивируют указанные первую и вторую клеточные массы в поддерживающем носителе. Способ лечения или ухода при различных симптомах, с которыми связаны утрата или повреждение зубов, осуществляют путем трансплантации зуба и/или ткани периодонта, полученных способом в место, где утрачен и/или поврежден зуб. Он дополнительно включает стадию выравнивания зуба таким образом, чтобы он имел ту же направленность, что и другие зубы в месте трансплантации. Использование изобретения позволяет получить зуб, клетки которого расположены в определенном порядке таким образом, чтобы регенерированный зуб функционировал в качестве ткани, повысив эффективность лечения. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 1 пр., 3 ил.

Область техники

Настоящее изобретение относится к способу получения зуба и к зубу, полученному этим способом.

Предшествующий уровень техники

Зуб представляет собой орган, имеющий эмаль в самом верхнем слое и дентин - во внутреннем слое, где обе ткани представляют собой твердые ткани; одонтобласт, который продуцирует дентин, внутри дентина и зубную пульпу в центральной части. Зуб может быть утрачен в результате зубного кариеса, заболеваний периодонта и тому подобного, и с учетом значительного влияния наличия или отсутствия зубов на внешность и на вкус пищи, а также с целью поддержания здоровья и высокого качества жизни разработаны различные методики восстановления зубов.

Например, в J. Dent. Res., 2002, Vol.81(10), pp.695-700 раскрыто, что ткань, подобную зубной, регенерируют путем трансплантации клеток, таких как эпителиальные клетки, выделенные из зубного зачатка, и мезенхимных клеток зубного фолликула с биоразлагаемым носителем в брюшную полость крысы.

В качестве способа регенерации зубного зачатка описано, например, в выложенной патентной заявке Японии (JP-A) 2004-331557, что клетки зубного зачатка, выделенные из живого организма, культивируют в присутствии биологически активных веществ, таких как факторы роста фибробластов и тому подобных. В JP-A 2004-357567 высказано предположение, что по меньшей мере один тип клеток, выбранных из клеток зубного зачатка и клеток, которые могут быть дифференцированы в эти клетки зубного зачатка, где оба типа клеток выделены из живого организма, культивируют параллельно с носителем, содержащим фибрин, при этом "зуб", имеющий специфичную форму, образуется в результате использования содержащего фибрин носителя, имеющего желаемую для зубного зачатка форму.

С другой стороны, в регенеративной медицине интерес в последнее время сфокусирован на повторном использовании биологических тканей, которые были удалены ранее. В частности, в отличие от тканей, вырезанных при заболеваниях, интерес в последнее время сфокусирован на тканях, которые удалены при родоразрешении, таких как пуповина и амнион, в качестве органов, имеющих стволовые клетки и способных быть вовлеченными в клеточную дифференцировку.

К методикам, в которых внимание сосредоточено на амнионе, относится методика, описанная в JP-A 2006-6249, согласно которой эпителиальные клетки и интерстициальные клетки, выделенные из амниона, выращивают в большом количестве в недифференцированном состоянии. Раскрыто, что клетки, выращенные таким способом, полезны в регенеративной медицине и тому подобном, поскольку они обладают мультипотентностью, подобной мультипотентности недифференцированных эмбриональных стволовых клеток.

В JP-A 2004-254682 описано, что клетки "боковой популяции" были выделены из амниотического мезенхимного клеточного слоя человека и амниотического эпителиального клеточного слоя человека в качестве стволовых клеток. Описано, что клетки "боковой популяции" по меньшей мере способны дифференцироваться в нервные клетки и полезны в качестве источника веществ, продуцируемых нервными клетками.

Раскрытие изобретения

Однако, чтобы регенерированный зуб или зубной зачаток функционировал в качестве ткани, необходимо, чтобы множество типов клеток, составляющих ткань, было распределено (расположено в определенной компоновке) соответствующим образом относительно друг друга. Сложно получить зуб, эффективный в качестве ткани, просто используя амнион.

Соответственно, целью настоящего изобретения была разработка нового применения амниона, а также разработка способа получения зуба, клетки которого расположены в определенном порядке.

Настоящее изобретение было создано при вышеописанных обстоятельствах, и согласно изобретению предложен способ получения зуба и зуб, полученный этим способом.

Согласно первому аспекту настоящего изобретения предложен способ получения зуба, при котором размещают в поддерживающем носителе первую клеточную массу, по существу состоящую из клеток только одного из следующих видов клеток: мезенхимных клеток амниотического происхождения или эпителиальных клеток, и вторую клеточную массу, по существу состоящую только из клеток другого вида из указанных мезенхимных клеток амниотического происхождения и эпителиальных клеток, где указанные первая и вторая клеточные массы не смешаны друг с другом, но приведены в тесный контакт друг с другом; и культивируют первую и вторую клеточные массы в поддерживающем носителе.

Согласно второму аспекту настоящего изобретения предложен зуб, полученный вышеописанным способом.

Согласно настоящему изобретению может быть предложено новое применение амниона и может быть предложен зуб, имеющий определенное расположение клеток.

Описание графических материалов

На Фиг.1А представлены схематические концептуальные рисунки, на которых показана процедура, описанная в Примерах настоящего изобретения по выполнению реконструкции зубного зачатка с использованием мезенхимных клеток и эпителиальных клеток, выделенных из зубного зачатка, и показано состояние капли геля до того, как в нем размещены клетки в определенном порядке.

На Фиг.1Б схематически концептуально показана процедура, описанная в Примерах настоящего изобретения по выполнению реконструкции зубного зачатка с использованием мезенхимных клеток и эпителиальных клеток, выделенных из зубного зачатка, и показано размещение первой клеточной массы в капле геля.

На Фиг.1В схематически концептуально показана процедура Примеров настоящего изобретения по выполнению реконструкции зубного зачатка с использованием мезенхимных клеток и эпителиальных клеток, выделенных из зубного зачатка, и показано размещение второй клеточной массы в капле геля.

На Фиг.1Г схематически концептуально показана процедура, описанная в Примерах настоящего изобретения, по реконструкции зубного зачатка с использованием мезенхимных клеток и эпителиальных клеток, выделенных из зубного зачатка, и показано отвердевшее состояние капли геля, в которой размещены первая клеточная масса и вторая клеточная масса.

На Фиг.2 представлено изображение окрашенного гематоксилином-эозином (ГЭ) воссозданного зубного зачатка из примера осуществления настоящего изобретения после культивирования в органной культуре. Полоска на Фигуре имеет длину 25 мкм.

На Фиг.3 представлена диаграмма, на которой наложены друг на друга флуоресцентная микрофотография реконструированного зубного зачатка из примера воплощения настоящего изобретения и его микрофотография, полученная на дифференциальном интерференционном микроскопе, после культивирования в органной культуре. Полоска на фигуре имеет длину 100 мкм.

Лучший способ осуществления изобретения

Способ получения зуба по настоящему изобретению включает следующие стадии:

размещают в поддерживающем носителе первую клеточную массу, по существу состоящую только либо из мезенхимных клеток амниотического происхождения, либо из эпителиальных клеток, и вторую клеточную массу, по существу состоящую только из клеток второго вида из указанных мезенхимных и эпителиальных клеток, где указанные первая и вторая клеточные массы не смешаны друг с другом, но приведены в тесный контакт друг с другом (далее - "стадия размещения"); и

культивируют первую и вторую клеточные массы в поддерживающем носителе (далее - "стадия культивирования"),

В вышеописанном способе амнион предпочтительно выделен из амниотического плотного слоя.

В вышеописанном способе эпителиальные клетки предпочтительно выделены по меньшей мере из одного зубного зачатка, кожи, слизистой оболочки или десны, более предпочтительно из зубного зачатка.

В вышеописанном способе получения зуба первая клеточная масса или вторая клеточная масса, по существу представляющая собой мезенхимные клетки амниотического происхождения, предпочтительно является клеточной массой, состоящей из отдельных клеток, а также, более предпочтительно, если обе - и первая клеточная масса, и вторая клеточная масса состоят из отдельных клеток.

Поскольку в настоящем способе клеточные массы, образованные каждым из типов мезенхимных клеток амниотического происхождения и эпителиальных клеток, размещают в поддерживающем носителе таким образом, чтобы они находились в контакте друг с другом без смешивания друг с другом, и культивируют, может быть эффективно воспроизведено определенное расположение клеток, специфичное для зуба, то есть дентин внутри и эмаль снаружи, что означает формирование зуба как ткани.

Кроме того, в результате применения амниона, в частности мезенхимных клеток амниотического происхождения, которые до этого часто выбрасывали, в качестве материала для получения зуба, может быть создан новый кандидат на материал для зуба и может быть предложен новый способ применения амниона.

В контексте настоящего изобретения термин "зуб" означает ткань, постоянно имеющую слой дентина внутри и слой эмали снаружи, предпочтительно, о направленности которого можно судить по коронке и корню. Направленность зуба можно идентифицировать по расположению его коронки и корня. Коронку и корень можно визуально определить по их форме, гистологическому окрашиванию и тому подобному. Коронка - это часть, имеющая слоистую структуру эмали и дентина, тогда как у корня слой эмали отсутствует.

Дентин и эмаль специалисты могут без труда идентифицировать морфологически на основании гистологического окрашивания и тому подобного. Эмаль может быть также идентифицирована по присутствию амелобласта, которое может быть подтверждено наличием/отсутствием амелогенина. С другой стороны, дентин может быть идентифицирован по присутствию одонтобласта, которое может быть подтверждено наличием/отсутствием дентинового сиалопротеина. Подтверждение присутствия амелогенина и дентинового сиалопротеина можно легко осуществить методами, хорошо известными в данной области, к которым относятся гибридизация in situ, окрашивание антителом и т.п.

Направленность зуба можно идентифицировать по расположению его коронки и корня. Коронку и корень можно визуально определить по их форме, гистологическому окрашиванию и т.п.

В контексте настоящего изобретения термины "зубной зачаток" и "зубная почка" используют как специфично относящиеся к зачатку и почке, которые различают на основании стадий развития, описанных ниже. В данном случае "зубной зачаток" означает ранний зародыш зуба, для которого предопределено в будущем стать зубом и который находится на стадии, включающей стадию почки и стадию колокола в соответствии с типичным определением стадий развития зуба, и, в частности, означает такую ткань, в которой не наблюдается аккумуляция дентина и эмали, характерных для твердой ткани зуба. С другой стороны, термин "зубная почка" означает ткань на переходной стадии от стадии "зубного зачатка", используемого в настоящем изобретении, когда начинается аккумуляция дентина и эмали, характерных для твердой ткани зуба, и стадией, предшествующей прорастанию зуба из десны для проявления типичных функций зуба.

Развитие зуба от зубного зачатка включает каждую из следующих стадий: стадию почки, стадию мешочка, раннюю стадию колокола и позднюю стадию колокола. Так, на стадии почки эпителиальные клетки инвагинируют таким образом, что они заворачиваются вокруг мезенхимных клеток, и при достижении ранней стадии колокола и поздней стадии колокола часть, состоящая из эпителиальных клеток, становится наружной эмалью, а часть, состоящая из мезенхимных клеток, начинается формировать дентин внутри. Таким образом, зуб формируется из зубного зачатка путем межклеточного взаимодействия между эпителиальными клетками и мезенхимными клетками.

В контексте настоящего изобретения "мезенхимная клетка" означает клетку, имеющую происхождение из мезенхимной ткани, а "эпителиальная клетка" означает клетку, имеющую происхождение из эпителиальной ткани.

Кроме того, в контексте настоящего изобретения термин "ткань периодонта" означает альвеолярную кость и корневую оболочку, сформированную, в основном, в наружном слое зуба. Альвеолярная кость и корневая оболочка могут быть морфологически легко идентифицированы специалистами в данной области с помощью гистологического окрашивания и т.п.

Далее описан способ получения зуба по настоящему изобретению.

На стадии размещения в способе получения зуба по настоящему изобретению первую клеточную массу и вторую клеточную массу приводят в контакт друг с другом и размещают в поддерживающем носителе.

На данном этапе каждая из первой клеточной массы и второй клеточной массы по существу состоит только из мезенхимных клеток или только из эпителиальных клеток. Клеточная масса, по существу состоящая только из мезенхимных клеток, содержит вышеупомянутые мезенхимные клетки для формирования зуба. Клеточная масса, содержащая мезенхимные клетки для формирования зуба, может быть получена на стадии приготовления, как описано для вышеупомянутого способа получения, а с другой стороны, клеточная масса, по существу состоящая только из эпителиальных клеток, может быть получена независимо от клеточной массы, по существу состоящей только из мезенхимных клеток (первая стадия приготовления клеток и вторая стадия приготовления клеток).

Термин "клеточная масса" означает состояние, когда клетки плотно упакованы, при этом клетки могут находиться либо в состоянии ткани, либо в состоянии отдельных клеток. Термин "по существу состоит из" означает, что количество субстанций, входящих в состав, отличающихся от представляющих интерес клеток, мало насколько это возможно. В настоящем изобретении клеточная масса, по существу состоящая из амниотических мезенхимных клеток, состоит из отдельных клеток, тогда как клеточная масса, по существу состоящая из эпителиальных клеток, может представлять собой либо часть ткани, либо массу из отдельных клеток. Предпочтительно, чтобы как эпителиальные клетки, так и мезенхимные клетки представляли собой клеточные массы, состоящие из отдельных клеток, поскольку после культивирования одновременно может быть сформировано множество зубов.

Одна какая-то из первой клеточной массы или второй клеточной массы может представлять собой эпителиальные клетки или мезенхимные клетки. Число клеток, составляющих эти клеточные массы, варьирует в зависимости от вида животного и от типа, твердости и размера поддерживающего носителя и может составлять, как правило, от 10 1 до 10 8 клеток и предпочтительно от 10 3 до 10 8 клеток в клеточной массе.

Мезенхимные клетки, используемые в настоящем изобретении, представляют собой мезенхимные клетки амниотического происхождения. Амнион представляет собой орган, который составляет часть плаценты, в который обернут плод в матке и который обычно выбрасывают как экскременты при родоразрешении. В настоящем изобретении средства получения амниона не ограничены, лишь бы амнион был получен, но предпочтительно используют амнион, полученный как отходы при родоразрешении.

Амнион состоит из трех слоев, то есть слоя амниотических эпителиальных клеток и слоя амниотической базальной мембраны, а также амниотического плотного слоя, который толще, чем остальные слои. Мезенхимные клетки амниотического происхождения в настоящем изобретении могут представлять собой мезенхимные клетки, выделенные из амниотического плотного слоя.

Мезенхимные клетки амниотического происхождения могут быть индивидуально выбраны из цельной ткани амниона с помощью паттерна поверхностных антигенов или тому подобного, но предпочтительно их получают из амниотического компактного слоя после его отделения от слоя амниотических эпителиальных клеток, поскольку это может уменьшить примесь других клеток.

Отделение амниотического компактного слоя от других клеточных слоев можно осуществлять либо путем физического отделения, используя ножницы или тому подобное, от других клеточных слоев, ориентируясь на толщину и морфологию мембраны, либо путем химического отделения, используя обработку ферментами, от слоя эпителиальных клеток или слоя базальной мембраны. Фермент, используемый для получения плотного слоя, может представлять собой фермент, способный к отделению слоя эпителиальных клеток, его предпочтительными примерами являются трипсин - для отделения эпителиального слоя и диспаза - для расщепления слоя базальной мембраны. Эти ферменты можно использовать либо по отдельности, либо в комбинации. Клеточный слой, полученный после удаления слоя эпителиальных клеток и слоя базальной мембраны этими методами ферментативной обработки, может быть использован в качестве амниотического плотного слоя.

Могут быть выбраны подходящие температура обработки и время обработки для ферментативной обработки, а также условия центрифугирования и перемешивания, которые, возможно, используют в зависимости от ферментативной активности используемых ферментов, и специалисты в данной области техники могут без труда осуществить желаемую обработку ферментами. Эти процедуры ферментативной обработки можно повторять или осуществлять с использованием комбинации множества типов ферментов в зависимости от состояния ткани. Обработку ферментом(ами) можно осуществлять, как описано в известных литературных источниках, например в J. Neurosci. Res. 78, 208-214, 2004.

В случаях, когда амниотические мезенхимные клетки получены в виде амниотического плотного слоя, этот амниотический плотный слой можно дополнительно довести до состояния отдельных клеток путем ферментативной обработки, встряхивания или тому подобного. Примеры фермента(ов), которые можно использовать для перевода амниотического плотного слоя в отдельные клетки, включают коллагеназу, диспазу и папаин. Эти ферменты можно использовать либо по отдельности, либо в комбинации. Специалисты в данной области могут соответствующим образом и без труда выбрать концентрации и условия обработки для этих ферментов.

Клеточная масса, по существу состоящая из мезенхимных клеток, может содержать и другие мезенхимные клетки, если мезенхимные клетки амниотического происхождения в нее включены.

Примерами иных мезенхимных клеток, чем вышеуказанные мезенхимные клетки, являются мезенхимные клетки, выделенные из зубного зачатка и из иных тканей, чем зубной зачаток. Примеры мезенхимных клеток, выделенных из тканей, иных, чем зубной зачаток, включают клетки, выделенные из других мезенхимных тканей в живом организме, такие как, предпочтительно, клетки костного мозга, не содержащие кровяных клеток, и мезенхимные стволовые клетки, более предпочтительно мезенхимные клетки полости рта, клетки костного мозга внутри челюстной кости, мезенхимные клетки, имеющие происхождение от клеток черепного нервного гребня, мезенхимные клетки-предшественники, которые могут генерировать мезенхимные клетки, и их стволовые клетки.

В случаях когда в качестве мезенхимных клеток используют мезенхимные клетки, иные, чем клетки амниотического происхождения, количество мезенхимных клеток амниотического происхождения предпочтительно составляет не менее чем 50 мас.%, более предпочтительно - не менее 75 мас.%, еще более предпочтительно - не менее примерно 90 мас.%, чтобы гарантированно получить зуб, имеющий желаемое расположение клеток, хотя это количество варьирует в зависимости от происхождения и зубообразующего потенциала других мезенхимных клеток. Количество не менее чем 50 мас.% предпочтительно, поскольку желаемый зуб может быть гарантированно получен независимо от уровня зубообразующего потенциала мезенхимных клеток, полученных из другой ткани.

Эпителиальные клетки, используемые в настоящем изобретении, предпочтительно получены из зубного зачатка, так что они могут воспроизводить расположение клеток в живом организме и эффективно формировать зуб, имеющий специфичную структуру и направленность, и предпочтительно на стадии между стадией почки и стадией мешочка, с точки зрения незрелости и гомогенности стадии дифференциации этих клеток.

Эпителиальные клетки могут также представлять собой клетки, выделенные из тканей, иных, чем зубной зачаток, и их примеры включают клетки, выделенные из других эпителиальных тканей в живом организме. Предпочтительные примеры эпителиальных клеток включают эпителиальные клетки кожи, слизистой оболочки и десны в полости рта, и более предпочтительные примеры эпителиальных клеток включают незрелые эпителиальные клетки-предшественники, которые могут продуцировать дифференцированные, например кератинизированные или паракератинизированные эпителиальные клетки, такие как клетки кожи, слизистой оболочки и тому подобные. Примеры таких незрелых эпителиальных клеток-предшественников включают некератинизированные эпителиальные клетки и их стволовые клетки.

В случаях, когда клетки выделены из тканей для приготовления клеточной массы, зубной зачаток и другие ткани могут быть собраны из челюстной кости или т.п. различных животных, например приматов, например людей и обезьян, и копытных животных, таких как, например, свиньи, коровы и лошади, которые являются млекопитающими; а также грызунов, таких как мыши, крысы и кролики, которые являются мелкими млекопитающими. Для сбора зубного зачатка и ткани можно применять без модификации условия, обычно используемые для сбора ткани, зубной зачаток и ткань можно собирать в стерильных условиях и хранить в подходящем консервирующем растворе. Примеры человеческого зубного зачатка включают зубной зачаток третьего моляра, который представляет собой так называемый зуб мудрости, а также эмбриональный зубной зачаток, с точки зрения утилизации аутогенных тканей, предпочтительно использование зубного зачатка зуба мудрости.

В случаях когда вышеуказанные клетки готовят из ткани, например зубного зачатка, зубной зачаток, выделенный из его окружающей ткани, сначала разделяют на мезенхимную ткань зубного зачатка и эпителиальную ткань зубного зачатка по их форме. Поскольку ткань зубного зачатка можно структурно идентифицировать под микроскопом, ее можно легко выделить путем разрыва или разрезания, используя анатомические ножницы, пинцет и т.п. Отделение мезенхимной ткани зубного зачатка и эпителиальной ткани зубного зачатка из зубного зачатка можно легко осуществить по их форме путем разрыва или разрезания, используя инъекционные иглы, вольфрамовые иглы, пинцет и т.п.

Предпочтительно для более легкого выделения клеток зубного зачатка из их окружающей ткани и/или для выделения эпителиальной ткани и мезенхимной ткани из ткани зубного зачатка можно использовать фермент. Примеры ферментов, используемых для такой цели, включают диспазу, коллагеназу и трипсин.

Клетки, составляющие клеточные массы, можно переводить из состояния собранной ткани в состояние отдельных клеток. На стадии приготовления можно использовать фермент, чтобы облегчить диспергирование клеток в виде отдельных клеток. Примеры таких ферментов включают диспазу, коллагеназу и трипсин. В данном случае для выделения эпителиальных клеток из эпителиальной ткани предпочтительно проводить обработку трипсином и обработку ДНКазой после обработки коллагеназой. С другой стороны, для выделения мезенхимных клеток из мезенхимной ткани предпочтительно проводить обработку коллагеназой и обработку трипсином одновременно, а в конце проводить обработку ДНКазой. В данном случае обработку ДНКазой проводят для предотвращения снижения количества выделенных клеток, происходящего по причине агрегации клеток, вызванной ДНК, высвобожденной из раствора после повреждения части клеток ферментативной обработкой и лизиса клеточной мембраны.

Клетки, составляющие клеточные массы, могут представлять собой клетки, подвергнутые предварительному культивированию перед стадией размещения с целью получения достаточного числа каждого вида клеток. Для клеточной культуры можно применять условия, обычно используемые для культивации животных клеток, например температуру, без модификации.

В качестве среды для культивирования можно использовать среду, обычно применяемую для культивирования животных клеток, такую как модифицированная по Дульбекко среда Игла (DMEM), и можно добавлять сыворотку для стимуляции клеточной пролиферации или, в качестве альтернативы сыворотке, можно добавлять клеточный ростовой фактор, такой как FGF, EGF или PDGF, или известный компонент сыворотки, такой как трансферрин. Когда добавляют сыворотку, ее концентрацию можно подходящим образом менять в зависимости от условий культуры, и обычно она может составлять 10 об.%. Для культивирования клеток можно применять нормальные условия культивирования, например, можно применять условия культивирования в инкубаторе 37°С в атмосфере 5% СО 2 . Можно добавлять антибиотик, такой как стрептомицин, если это удобно.

Относительно размещения клеточных масс на стадии размещения: первую и вторую клеточные массы размещают в поддерживающем носителе, который может поддерживать клетки в состоянии контакта. В этом случае клеточные массы не смешиваются друг с другом. Таким образом, поскольку клеточные массы размещают без смешивания их друг с другом, образуется пограничная поверхность между клеточными массами. Такой способ размещения клеток называют "компартментализацией", что соответствует данному описанию изобретения.

Поддерживающий носитель, используемый по изобретению, может представлять собой носитель, в котором можно культивировать клетки, и, предпочтительно, представляет собой смесь с вышеописанной средой. Примеры такого поддерживающего носителя включают коллаген, фибрин, ламинин, смесь внеклеточного матрикса, полигликолевую кислоту (ПГК), полимер молочной кислоты (ПМК), сополимер молочной кислоты/гликолевой кислоты (ПМГК), Cellmatrix (торговое название), Mebiol Gel (торговое название) и Matrigel (торговое название). Эти поддерживающие носители могут иметь твердость, за счет которой клетки могут действительно оставаться в тех положениях, как они были размещены в поддерживающем носителе, и примеры таких поддерживающих носителей включают носители в форме геля, волокна и твердого вещества. В данном случае твердость, при которой клетки могут практически оставаться в своих положениях, может быть приемлемой для объемной культуры, то есть представлять собой твердость, при которой положение клеток может сохраняться, но не ингибирована гипертрофия клеток вследствие их пролиферации, и определить такую твердость легко. Например, в случае коллагена применение его в конечной концентрации от 2 до 3 мг/мл обеспечивает подходящую твердость.

Кроме того, в данном случае поддерживающий носитель может иметь толщину, достаточную, чтобы обеспечить возможность роста первой и второй клеточных масс внутри носителя, и эта толщина может быть подходящим образом задана в зависимости от размера интересующей ткани и т.п.

Кроме того, поддерживающий носитель может обладать удерживающей способностью, благодаря которой клетки могут сохранять свое состояние контакта без диспергирования. В контексте настоящего изобретения термин "состояние контакта" предпочтительно относится к состоянию плотной упакованности (высокой плотности), которое обеспечивает межклеточное взаимодействие внутри каждой клеточной массы и между клеточными массами.

Состояние высокой плотности подразумавает плотность, почти эквивалентную плотности, при которой конструируется ткань, например, в случае клеточных масс - от 5×10 7 до 1×10 9 клеток/мл в момент размещения клеток, предпочтительно от 1×10 8 до 1×10 9 клеток/мл, для обеспечения межклеточного взаимодействия без ослабления клеточной активности, и наиболее предпочтительно - от 2×10 8 до 8×10 8 клеток/мл. В целях препарирования клеточной массы, обладающей такой плотностью клеток, предпочтительно собирать в массе и осаждать клетки путем центрифугирования, поскольку это удобным образом обеспечивает достижение высокой плотности без ослабления клеточной активности. Такое центрифугирование можно проводить при частоте вращения, эквивалентной центробежной силе от 300 до 1200 × g, которая не окажет вредного влияния на выживаемость клеток, и предпочтительно от 500 до 1000 × g, в течение 3-10 минут. Центрифугирование менее чем при 300 × g может привести к недостаточному осаждению клеток, и плотность клеток может стать низкой, тогда как центрифугирование при центробежной силе выше 1200 × g может вызвать повреждение клеток, и, следовательно, оба случая не являются предпочтительными.

В случаях, когда высокая плотность клеток достигнута путем центрифугирования, центрифугирование обычно проводят после приготовления суспензии отдельных клеток в контейнере, таком как пробирка, используемая для центрифугирования клеток, и надосадочную жидкость удаляют до максимально возможной степени, оставляя клетки в виде осадка. Предпочтительно, с точки зрения полного удаления надосадочной жидкости, чтобы контейнер, например пробирка, был силиконизированным.

В случаях когда осадок получен путем центрифугирования, его можно непосредственно размещать внутри поддерживающего носителя. Здесь объем компонентов, иных, чем интересующие клетки (например, культуральной среды, буферного раствора, поддерживающего носителя или тому подобного), предпочтительно не превышает объем клеток, и, наиболее предпочтительно, компоненты, иные, чем интересующие клетки, отсутствуют. При такой высокой плотности клеточной массы клетки находятся в близком контакте друг с другом, и межклеточное взаимодействие может эффективно проявляться.

В случаях, когда клетки используют в состоянии ткани, предпочтительно удалить компоненты, иные, чем интересующие клетки, такие как соединительные ткани, путем проведения ферментативной обработки или тому подобного. В случаях когда имеется много компонентов, иных, чем интересующие клетки, например в случаях, когда объем других компонентов составляет не менее, чем объем клеток, межклеточное взаимодействие не может осуществляться успешно, что не является предпочтительным.

Чем теснее контакт между первой клеточной массой и второй клеточной массой, тем лучше, и особенно предпочтительно, чтобы вторая клеточная масса была размещена таким образом, чтобы оказывать давление на первую клеточную массу. Кроме того, оборачивание твердого вещества вокруг первой клеточной массы и второй клеточной массы, которое не ингибирует проникновение культуральной среды или кислорода, также эффективно для того, чтобы сделать контакт между клеточными массами более тесным. Также предпочтительно добавлять суспензию клеток высокой плотности к раствору, имеющему другую вязкость, для размещения в нем клеточной суспензии с последующим отвердеванием самого этого раствора, поскольку при этом может быть удобно достигнуто сохранение контакта клеток. При этом в случае когда первая клеточная масса представляет собой массу из отдельных мезенхимных клеток зубного зачатка, а вторая клеточная масса представляет собой эпителиальную ткань зубного зачатка, предпочтительно приводить эмалевый узелок эпителиальной ткани зубного зачатка в контакт с первой клеточной массой, но настоящее изобретение не ограничено этим.

В случаях когда поддерживающий носитель находится в форме геля, раствора или тому подобного, стадию размещения можно осуществлять проведением стадии отверждения, в результате которой поддерживающий носитель отвердевает. В результате стадии отверждения клетки, размещенные внутри поддерживающего носителя, могут быть зафиксированы внутри поддерживающего носителя. Для отверждения поддерживающего носителя можно применять условия, обычно используемые для отвердения поддерживающего носителя, без модификации. Например, в случаях, когда в качестве поддерживающего носителя используют отвердевающее соединение, такое как коллаген, отверждения можно достичь в обычно применяемых для подобных операций условиях, например, оставляя гель стоять при температуре культивирования в течение промежутка времени от нескольких минут до нескольких десятков минут. Этим способом связи между клетками внутри поддерживающего носителя могут быть зафиксированы и сделаны прочными.

На стадии культивирования способа получения зуба по настоящему изобретению первую клеточную массу и вторую клеточную массу культивируют внутри поддерживающего носителя. На этой стадии культивирования межклеточное взаимодействие первой клеточной массы и второй клеточной массы, которые находятся в близком контакте друг с другом, проявляется эффективно для реконструкции ткани, а именно зуба.

Стадию культивирования можно осуществлять таким образом, чтобы состояние контакта первой клеточной массы и второй клеточной массы сохранялось за счет поддерживающего носителя, а культивирование можно осуществлять с поддерживающим носителем, который просто содержит первую и вторую клеточные массы, либо же культивирование происходит в присутствии других животных клеток.

Время культивирования варьирует в зависимости от числа клеток, размещенных в поддерживающем носителе, и состояния клеточных масс, а также в зависимости от условий проведения стадии культивирования и может составлять, как правило, от 1 до 300 суток, предпочтительно от 1 до 120 суток, чтобы сформировался зуб, имеющий эмаль снаружи и дентин внутри, и предпочтительно от 1 до 60 суток - с точки зрения быстроты получения зуба. Кроме того, для формирования зуба, имеющего ткань периодонта, временной период может составлять, как правило, от 1 до 300 суток, предпочтительно от 1 до 60 суток.

В случаях, когда культивирование проводят только с поддерживающим носителем, его можно проводить в нормальных условиях, используемых для культивирования животных клеток. Здесь, как правило, условия для культивирования животных клеток можно применять без модификации и вышеупомянутые условия можно использовать без модификации. Кроме того, в культуру можно добавлять сыворотку животного происхождения и различные клеточные факторы, известные как эффективные для роста и дифференциации клеток. Примерами таких клеточных факторов являются FGF (фактор роста фибробластов) и BMP (костный морфогенетический белок).

Кроме того, с точки зрения газообмена и обеспечения питательными веществами тканей и клеточных масс, предпочтительно использовать органную культуру. В органной культуре, как правило, культивирование проводят с помощью плавающей пористой мембраны на культуральной среде, пригодной для роста животных клеток, и путем помещения клеточной массы, заключенной в поддерживающий носитель, на эту мембрану. Пористая мембрана, используемая при этом, предпочтительно представляет собой мембрану, имеющую множество пор диаметром от 0,3 до 5 мкм, и ее конкретными примерами являются Cell Culture Insert (торговое название) и Isopore Filter (торговое название).

Культивирование в присутствии других животных клеток предпочтительно, поскольку зуб, имеющий специфичное расположение клеток, может формироваться на ранней стадии в ответ на действия различных цитокинов и тому подобного, происходящего из животных клеток. Такое культивирование в присутствии других животных клеток можно осуществлять ex vivo с использованием изолированных клеток или культивированных клеток.

Кроме того, поддерживающий носитель, содержащий первую и вторую клеточные массы, можно трансплантировать в живой организм для осуществления культивирования in vivo. Такое культивирование in vivo особенно предпочтительно, поскольку зуб и/или ткань периодонта может формироваться на ранней стадии. В данном случае первую и вторую клеточные массы вместе с поддерживающим носителем трансплантируют в живой организм.

Предпочтительные примеры животных, которых можно использовать для данного применения, включают млекопитающих, таких как, например, люди, свиньи и мыши, и более предпочтительно, если животное имеет происхождение от того же вида, что и ткань зубного зачатка. В случаях, когда трансплантируют ткань зубного зачатка человека, предпочтительно использовать человека или млекопитающее, отличное от человека, которое изменено таким образом, чтобы стать иммунодефицитным. Примеры локализаций в живом организме для максимально нормального развития органа или ткани из животных клеток in vivo предпочтительно включают субренальную капсулу, брыжейку тонкой кишки (сальник), подкожную область и ротовую полость.

Период времени роста при трансплантации варьирует в зависимости от размера эксплантата в момент трансплантации и от размера развивающегося зуба и может составлять типично от 3 до 400 суток. Например, время трансплантации в субренальную капсулу предпочтительно составляет от 7 до 60 суток - с точки зрения регенерации зуба и размера развивающегося зуба в месте трансплантации, хотя оно варьирует в зависимости от размера эксплантата, подлежащего трансплантации, и от того, какого размера зуб предстоит регенерировать.

Культуру ех vivo (прекультуру) можно готовить перед трансплантацией в живой организм. Прекультура является предпочтительной, поскольку связи между клетками и связь между первой и второй клеточными массами могут быть усилены, чтобы усилилось межклеточное взаимодействие. В результате общее время роста может быть уменьшено.

Период прекультуры может быть малым или большим. Предпочтителен более длительный период времени, например 3 суток или более, предпочтительно 7 суток или более, поскольку в течение этого времени зубная почка может развиться из зубного зачатка, и за счет этого время до того момента, как зуб сформируется, после трансплантации может быть уменьшено. Например, в случае органной культуры для трансплантации под субренальную капсулу период прекультуры предпочтительно составляет от 1 до 7 суток в целях эффективной регенерации зуба.

Зуб, изготовленный способом по настоящему изобретению, имеет специфичное для зуба расположение клеток (структуру), где дентин находится внутри, а эмаль - снаружи, и, предпочтительно, имеет направленность, то есть имеет верхнюю часть (коронку) и корень зуба. Благодаря такому специфичному расположению клеток и, предпочтительно, помимо расположения клеток, также направленности могут осуществлять функции зуба. Следовательно, изготовленный зуб можно широко применять в качестве альтернативы зуба. В частности, когда используют мезенхимные клетки и эпителиальные клетки, имеющие происхождение от аутогенного зубного зачатка, можно избежать проблем, вызванных отторжением. Как правило, проблем, вызванных отторжением, можно также избежать, когда клетки имеют происхождение от зубного зачатка другого человека, имеющего совпадающий трансплантационный антиген.

Зубы, изготовленные способом по настоящему изобретению, могут быть получены в форме набора зубов, имеющих специфичное для зуба расположение клеток.

Поскольку такой набор зубов состоит из множества зубов, имеющих специфичное для зуба расположение клеток, каждый зуб можно выделить из набора и использовать в качестве эксплантата отдельного зуба, как описано ниже. Таким образом можно эффективно получать зубы в качестве эксплантатов.

Для получения набора зубов, состоящего из множества зубов, предпочтительно, чтобы обе клеточные массы, первая и вторая, состояли из отдельных клеток. Таким образом можно получить множество частей, содержащих факторы, такие как эмалевый центр, которые контролируют число зубов, посредством чего можно сформировать множество зубов.

Стадию культивирования можно выполнять с использованием органной культуры либо субренальной капсулы, как описано выше, и когда используют полученный зуб в качестве эксплантата, предпочтительно использовать органную культуру, в которой отсутствует контакт с другими клетками животных и всю процедуру можно проводить in vitro.

Кроме того, в способе по настоящему изобретению период культивирования может быть продлен до формирования ткани периодонта. В результате этого, если это возможно, в дополнение к самому зубу формируется ткань периодонта, такая как альвеолярная кость и периодонтальная мембрана, которая поддерживает и фиксирует зуб на челюстной кости. В результате после трансплантации может быть получен функционирующий зуб.

Для получения ткани периодонта стадию выделения ткани периодонта после культивирования можно осуществлять после вышеописанной стадии культивирования для получения отдельно ткани периодонта. Выделение ткани периодонта можно проводить любым способом, позволяющим отделить ткань периодонта, сформировавшуюся во время стадии культивирования, от зуба, и примеры способов включают отделение пинцетом и т.п. и частичное расщепление ферментами.

Зуб и ткань периодонта, полученные в соответствии с настоящим изобретением, можно применять в качестве эксплантата и можно также, предпочтительно, применять для исследований процесса развития зуба, так что в будущем их можно применять в качестве эффективного исследовательского инструмента для разработки тканей, относящихся к зубу.

В случаях когда полученные зуб или ткань периодонта применяют в качестве эксплантата, стадию культивирования в соответствии со способом по изобретению предпочтительно проводят в органной культуре, в которой отсутствует контакт с другими животными клетками, и всю методику можно проводить in vitro.

Способ трансплантации зуба также является частью настоящего изобретения. В способ трансплантации получают вышеописанный набор зубов; отделяют каждый зуб от набора зубов и осуществляют трансплантацию отделенного зуба с выравниванием зуба таким образом, чтобы он имел ту же направленность, что и другие зубы в месте трансплантации.

Таким образом можно одновременно получить множество зубов, имеющих специфичное расположение клеток и направленность, и можно эффективно провести трансплантацию зуба.

Зуб согласно настоящему изобретению можно также применять для лечения или ухода при различных симптомах, с которыми связаны утрата или повреждение зубов, и примерами этих симптомов являются зубной кариес, краевой периодонтит (пародонтоз), утрата зубов в результате заболеваний периодонта, разрушение или авульсия зубов, вызванные несчастными случаями, и т.п.

Иными словами, способ лечения согласно настоящему изобретению включает трансплантацию зуба и/или ткани периодонта, полученных способом получения зуба по настоящему изобретению, в место, где утрачен и/или поврежден зуб. Таким методом можно лечить и/или облегчать вышеописанные симптомы в месте утраты и/или повреждения зуба.

Другой способ лечения согласно настоящему изобретению включает осуществление только стадии культивирования согласно настоящему изобретению или осуществление стадии размещения и стадии культивирования в месте утраты и/или повреждения зуба. В данном случае сама окружающая ткань в месте утраты и/или повреждения зуба может использоваться в качестве поддерживающего носителя в дополнение к упомянутым выше поддерживающим носителям. Таким образом, благодаря цитокинам и т.п. из окружающих тканей в живом организме лечение и т.п. в месте утраты и/или повреждения зуба можно осуществить быстрее.

ПРИМЕРЫ

Далее описаны примеры воплощения настоящего изобретения, но настоящее изобретение не ограничено ими. Обозначение "%" в разделе «Примеры» относится к мас.%, если не указано иное.

(1) Получение мезенхимных клеток амниотического происхождения

Для оценки зубообразующего потенциала человеческих амниотических мезенхимных клеток получали человеческие амниотические мезенхимные клетки из человеческой амниотической ткани.

Из плаценты, предоставленной после соответствующего информирования и получения согласия, физически выделяли амниотическую ткань. Подходящее количество фосфатного буфера (ФСБ(-)) заливали в 15 см чашку, и ткань вырезали хирургическими ножницами и промывали, используя маленькие щипцы, для удаления кровяных клеток из полученной амниотической ткани. Амниотическую ткань после обработки переносили в новую чашку, снова промывали ФСБ(-) и дополнительно нарезали, после чего переносили в центрифужную пробирку на 50 мл, содержащую 25 мл 0,25% трипсина (изготавливаемого фирмой GIBCO).

Сначала для удаления эпителиальных клеток амниотического происхождения проводили ферментативную обработку, как описано ниже. Используя инкубатор-шейкер, проводили обработку ферментами (200 об/мин, 15 минут, 37°С), и амниотическую ткань после обработки переносили в новую центрифужную пробирку на 50 мл, содержащую 25 мл 0,25% трипсина (изготавливаемого фирмой GIBCO), с последующей реакцией с ферментом (400 об/мин, 15 минут, 37°С). Обработку трипсином затем проводили еще три раза (всего 5 раз) для удаления основной части слоя эпителиальных клеток.

Затем для сбора мезенхимных клеток амниотического происхождения наливали подходящее количество ФСБ(-) в 15 мм чашку и переносили в нее амниотическую ткань после 5-й обработки трипсином и промывали ее, а затем нарезали ножницами на кусочки размером 5 мм × 5 мм. Образец ткани после нарезания затем переносили в центрифужную пробирку на 50 мл, содержащую смесь ферментов (1 мг/мл коллагеназа (изготавливаемая фирмой Sigma), 0,1% диспаза II (изготавливаемая фирмой Roche), 0,01% папаин (изготавливаемый фирмой Worthington) и 0,01% ДНКаза (изготавливаемая фирмой Sigma) в сбалансированном солевом растворе Хэнкса), и реакцию с ферментами (400 об/мин, 1 час, 37°С) проводили в инкубаторе-шейкере. Клеточную суспензию, полученную в результате обработки ферментами, фильтровали с использованием металлического фильтра, и полученный фильтрат переносили в центрифужную пробирку на 50 мл для проведения центрифугирования (2000 об/мин, 10 минут, комнатная температура). Надосадочную жидкость после центрифугирования отбрасывали, и осадок промывали три раза ФСБ(-). После фильтрования с помощью нейлонового фильтра 40 мкм меш проводили центрифугирование (при 2000 об/мин в течение 10 минут при комнатной температуре) с получением амниотических мезенхимных клеток.

Амниотические мезенхимные клетки суспендировали в DMEM/F12 (Sigma) с добавлением 10 нг/мл hLIF (изготавливаемого фирмой Sigma), 0,2 мМ меркаптоэтанола (изготавливаемого фирмой Sigma) и 10% ФСТ (фетальная сыворотка теленка, JRH Biosciences, Lenexa, KS) и высевали в 10 см чашку для клеточных культур при плотности клеток 1-5×10 5 клеток/мл. Клетки диспергировали обработкой трипсином и пересевали соответствующим образом до получения реконструированного зубного зачатка.

(2) Получение эпителиальной ткани зубного зачатка

Из эмбриона (в гестационном возрасте 14,5 суток) мыши C57BL/6-TgN(act-EGFP)OsbC14-Y01-FM131 (приобретенной у RIKEN BioResource Center), которая представляет собой трансгенную мышь по зеленому флуоресцентному белку (EGFP), зубной зачаток нижнего резца извлекали под микроскопом традиционным способом. Ткань зубного зачатка нижнего резца промывали фосфатным буфером без Са 2+ /Мg 2+ (ФСБ(-)) и обрабатывали при комнатной температуре в течение 12,5 минут раствором ферментов, который представляет собой ФСБ(-) с добавлением 1,2 ед./мл (конечная концентрация) диспазы II (изготавливаемой фирмой Roche)). После этого промывали DMEM (Sigma) с добавлением 10% ФСТ (изготавливаемой фирмой JRH) 3 раза. Затем добавляли раствор ДНКазы I (изготавливаемой Takara) до конечной концентрации 70 ед./мл для диспергирования ткани зубного зачатка, и эпителиальную ткань зубного зачатка отделяли хирургическим путем, используя инъекционную иглу 25G (Terumo).

(3) Получение реконструированного зубного зачатка

Получение реконструированного зубного зачатка осуществляли, используя вышеописанную эпителиальную ткань зубного зачатка и человеческие амниотические мезенхимные клетки.

Человеческие амниотические мезенхимные клетки собирали с чашки с помощью обработки трипсином. В пробирку для микропроб на 1,5 мл (изготавливаемую фирмой Eppendorf), на которую была нанесена силиконовая смазка, добавляли человеческие амниотические мезенхимные клетки, суспендированные в DMEM (Sigma) с добавлением 10% ФСТ (изготавливаемой фирмой JRH), и клетки собирали центрифугированием в виде осадков. Надосадочную жидкость среды после центрифугирования удаляли насколько возможно, и центрифугирование проводили снова с последующим полным удалением культуральной среды, оставшейся вокруг клеточных осадков, под стереоскопическим микроскопом, используя наконечник GELoader Tip 0,5-20 мкл (Eppendorf), с получением человеческих амниотических мезенхимных клеток, предназначенных для получения реконструированного зубного зачатка.

В чашку Петри, на которую была нанесена силиконовая смазка, добавляли по каплям 30 мкл 2 мг/мл Cellmatrix типа I-A (Nitta Gelatin Inc.) до получения капли коллагенового геля. К этому раствору добавляли от 0,2 до 0,3 мкл вышеописанных амниотических мезенхимных клеток, используя наконечник для пипетки на 0,1-10 мкл (изготавливаемую фирмой Quality Scientific Plastics) с получением клеточного агрегата. Затем, используя наконечник для пипетки на 10 мкл, эпителиальную ткань зубного зачатка вносили в ту же каплю геля, и с помощью вольфрамовой иглы поверхность отделенной эпителиальной ткани зубного зачатка, которая исходно находилась в контакте с мезенхимной тканью, приводили в тесный контакт с клеточным агрегатом человеческих амниотических мезенхимных клеток. После этого в результате отвердения капли геля связи между эпителиальной тканью зубного зачатка и человеческими амниотическими мезенхимными клетками становились сильнее, в результате чего получили реконструированный зубной зачаток высокой плотности.

Далее описание дается со ссылкой на Фиг.1. На Фиг.1 число 10 обозначает каплю геля (поддерживающий носитель), число 12 обозначает клеточный агрегат (первую клеточную массу), число 14 обозначает клеточный агрегат (вторую клеточную массу), и число 16 обозначает наконечник пипетки.

Клеточный агрегат 12, который был предварительно размещен в капле геля 10 (см. фиг.1(А)) наконечником пипетки 16, образует сферу в капле геля 10 (см. фиг.1(Б)). Затем в результате вдавливания в нее клеточного агрегата 14 сферический клеточный агрегат 12 деформируется и обертывает другой клеточный агрегат 14 (см. фиг.1(В)). После этого в результате отвердения капли геля 10 связи между клетками становятся сильнее (см. фиг.1(Г)).

(4) Культивирование в органной культуре реконструированного зубного зачатка

Реконструированный зубной зачаток высокой плотности, полученный в геле, оставляли стоять в атмосфере СO 2 в инкубаторе на 10 минут для отвердевания Cellmatrix типа I-A (Nitta Gelatin). Сосуд с культурой подготавливали так, чтобы среда DMEM (изготавливаемая фирмой Sigma) с добавлением 10% об/об ФСТ (изготавливаемой фирмой JRH), 0,1 мг/мл L-аскорбиновой кислоты (изготавливаемой фирмой Sigma) и 2 мМ L-глутамина (изготавливаемого фирмой GIBCO) находилась в контакте с Cell Culture Inserts (мембрана ПЭТ (полиэтилентерефталат), имеющая размер пор 0,4 мкм; изготавливаемая фирмой BD). Реконструированный зубной зачаток переносили вместе с окружающим гелем, который представляет собой поддерживающий носитель, на мембрану Cell Culture Inserts в культуральном сосуде для проведения культивирования в органной культуре.

Обычно в случаях, когда развитие зуба анализировали с помощью органной культуры, культивирование проводили в течение 14 суток. При проведении культивирования в органной культуре реконструированный зубной зачаток фиксировали 4% параформальдегидом в фосфатном буфере в течение 6 часов с последующей 24-часовой нейтральной декальцификацией с использованием 4,5% раствора ЭДТА (рН 7,4). Затем осуществляли заключение в парафин традиционным способом с получением срезов 10 мкм. Для гистологического анализа проводили окрашивание гематоксилином-эозином (окрашивание ГЭ) традиционным способом.

В случаях когда использовали зубной зачаток, выделенный из мыши C57BL/6-TgN(act-EGFP)OsbC14-Y01-FM131, этот зубной зачаток подвергали нейтральной декальцификации и обрабатывали 12,5% сахарозой (Wako) в течение 12 часов и 25% сахарозой (Wako) в течение 12 часов с последующим заключением в соединение ОСТ (изготавливаемое фирмой Miles Inc.) для получения срезов размером 10 мкм с использованием криостата (Leica) для наблюдения под флуоресцентным микроскопом (ZEISS). Гистологический анализ проводили с окрашиванием гематоксилином-эозином (окрашиванием ГЭ) традиционным способом.

(5) Оценка культивирования в органной культуре

Как показано на фиг.2, регенерированный зуб формировался культивированием в органной культуре реконструированного зубного зачатка, полученного, как описано выше. Этот регенерированный зуб имел с наружной стороны амелобласты, эмаль, дентин и одонтобласты, а клетки зубной пульпы - в центре. Это расположение клеток является таким же, как в нормальном зубе.

Таким образом, согласно данному Примеру становится ясно, что культивирование человеческих амниотических мезенхимных клеток и эпителиальной ткани зубного зачатка при высокой плотности в условиях компартментализации обеспечивает формирование зуба, обладающего специфичной тканевой структурой, посредством эффективного взаимодействия между мезенхимными клетками и эпителиальной тканью.

После этого происхождение клеток, составляющих сформировавшийся зуб, было подтверждено при использовании интерференционной микроскопии и флуоресцентного микроскопа.

Наблюдение под дифференциальным интерференционным микроскопом показало, что тканевая структура, специфичная для зуба, т.е. амелобласты, эмаль, дентин и одонтобласты - с наружной стороны, а клетки зубной пульпы - в центре, может быть подтверждена, как в случае органной культуры зубного зачатка. Кроме того, как показано на фиг.3, было выявлено при наблюдении GFP под флуоресцентным микроскопом, что амелобласты, локализованные на наружной стороне эмали, были GFP-положительными (яркие участки на фиг.3), тогда как одонтобласты и клетки зубной пульпы, локализованные внутри дентина, были GFP-отрицательными (темные участки на фиг.3).

Эти результаты свидетельствуют о том, что амелобласты, локализованные с наружной стороны эмали, представляют собой клетки, имеющие происхождение от эпителиальных клеток, а одонтобласты и клетки зубной пульпы, локализованные внутри дентина, имеют происхождение от амниотических мезенхимных клеток.

В результате в соответствии с настоящим изобретением компартментализированное культивирование мезенхимных клеток амниотического происхождения и эпителиальной ткани, имеющей происхождение из зубного зачатка, обеспечивает формирование зуба, имеющего специфичное расположение клеток. Кроме того, ясно, что мезенхимные клетки амниотического происхождения применимы для формирования зуба.

Описание изобретения патентной заявки Японии 2007-49128 включено сюда путем ссылки в полном объеме.

Все литературные публикации, патентные заявки и технические стандарты, упомянутые в настоящем описании изобретения, включены сюда путем ссылки, и это указание равноценно тому, как если бы каждая литературная публикация, патентная заявка или технический стандарт были бы конкретно и отдельно описаны как включенные сюда путем ссылки.

Формула изобретения

1. Способ получения зуба, при котором:

размещают в поддерживающем носителе первую клеточную массу, по существу, состоящую из клеток только одного из следующих видов клеток: мезенхимных клеток, имеющих происхождение из амниона, который должен быть выброшен как экскременты при родоразрешении, или эпителиальных клеток, и вторую клеточную массу, по существу, состоящую из клеток другого вида из указанных мезенхимальных клеток, имеющих происхождение из амниона, который должен быть выброшен как экскременты при родоразрешении, и эпителиальных клеток, где указанные первая и вторая клеточные массы не смешаны друг с другом, но приведены в тесный контакт друг с другом; и

культивируют указанные первую и вторую клеточные массы в указанном поддерживающем носителе.

2. Способ по п.1, где указанный амнион имеет происхождение из амниотического плотного слоя.

3. Способ по п.1, где указанные эпителиальные клетки имеют происхождение, по меньшей мере, из одного из следующих источников: зубного зачатка третьего моляра, кожи, слизистой оболочки или десны.

4. Способ получения зуба по п.1, где указанные эпителиальные клетки имеют происхождение из зубного зачатка третьего моляра.

5. Способ по п.1, где указанная первая клеточная масса или вторая клеточная масса, по существу, состоящая из указанных мезенхимных клеток, имеющих происхождение из амниона, который должен быть выброшен как экскременты при родоразрешении, представляет собой клеточную массу, состоящую из отдельных клеток.

6. Способ по п.1, где указанные первая клеточная масса и вторая клеточная масса обе состоят из отдельных клеток.

7. Способ по п.1, где указанный поддерживающий носитель представляет собой, по меньшей мере, один носитель, выбранный из группы, состоящей из коллагена, фибрина, ламинина, смеси внеклеточного матрикса, полигликолевой кислоты (ПГК), полимера молочной кислоты (ПМК), сополимера молочной кислоты и гликолевой кислоты (ПМГК), Cellmatrix (торговое название), Mebiol Gel (торговое название) и Matrigel (торговое название).

8. Способ получения зуба по п.1, где указанное культивирование продолжают до формирования ткани периодонта.

9. Способ лечения или ухода при различных симптомах, с которыми связаны утрата или повреждение зубов, при котором осуществляют трансплантацию зуба и/или ткани периодонта, полученных способом по п.1, в место, где утрачен и/или поврежден зуб.

10. Способ по п.9, дополнительно включающий трансплантацию зуба, полученного способом по п.1, с выравниванием зуба таким образом, чтобы он имел ту же направленность, что и другие зубы в месте трансплантации.

РИСУНКИ