Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
Патент на изобретение №2465588

(19)

RU

(11)

2465588

(13)

C1

(51) МПК G01N33/48 (2006.01)

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ Статус: по данным на 17.10.2012 - нет данных Пошлина:

(21), (22) Заявка: 2011116025/15, 22.04.2011

(24) Дата начала отсчета срока действия патента:

22.04.2011

Приоритет(ы):

(22) Дата подачи заявки: 22.04.2011

(45) Опубликовано: 27.10.2012

(56) Список документов, цитированных в отчете о

поиске: RU 2379683 C1, 20.01.2010. SU 1064952 A1, 07.01.1984. RU 2303781 C1, 27.07.2007. RU 2282854 C1, 27.08.2006.

Адрес для переписки:

644001, г.Омск, ул. Лермонтова, 93, Государственное научное учреждение ВНИИ бруцеллеза и туберкулеза животных Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИБТЖ Россельхозакадемии), патентный отдел

(72) Автор(ы):

Власенко Василий Сергеевич (RU),

Морозова Ольга Владимировна (RU),

Бажин Михаил Аристоклевич (RU),

Новиков Артем Николаевич (RU),

Дудоладова Татьяна Сергеевна (RU)

(73) Патентообладатель(и):

Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных Российской академии сельскохозяйственный наук (ГНУ ВНИИБТЖ Россельхозакадемии) (RU)

(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

(57) Реферат:

Изобретение относится к ветеринарии. Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота, выявление положительно реагирующих в реакции иммунодиффузии животных, гематологический метод исследования. определение процентного содержания Т-лимфоцитов методом спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (%Е-РОК). Дополнительно в крови определяют процентное содержание Т-лимфоцитов после инкубации с левамизолом в конечной концентрации 0,5 мкг/мл с помощью спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана. Затем вычисляют индекс сдвига (ИС) по формуле:

% Е - РОК до инкубации с левамизолом при ИС, равном 1, 2 и более, животное считают больным лейкозом крупного рогатого скота и выводят из стада. Изобретение обеспечивает повышение точности и достоверности диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Способ диагностики выявляет на 11,8% больше животных, больных лейкозом крупного рогатого скота, является более точным и повышает достоверность. Способ может быть использован для диагностики лейкоза у животных, которым были введены иммуностимулирующие средства. 4 табл., 3 пр.

Изобретение относится к ветеринарии, а именно - к лабораторной диагностике иммунологическими методами, и может быть использовано для выявления больного и инфицированного вирусом лейкоза крупного рогатого скота.

Известен гематологический способ выявления больного лейкозом крупного рогатого скота, включающий предварительное выявление животных, положительно реагирующих в реакции иммунодиффузии (РИД), основанное на обнаружении в сыворотке крови специфических антител к антигенам вируса лейкоза крупного рогатого скота. Животных, сыворотки крови которых дали положительный результат в РИД, признают зараженными вирусом лейкоза и исследуют гематологическим методом, заключающимся в подсчете лейкоцитов в единице объема крови. При обнаружении повышенного их количества выводят лейкоцитарную формулу и оценивают статус животного по лейкозу согласно «лейкозному ключу» как здорового, подозрительного по заболеванию лейкозом или больного лейкозом. Больных животных выводят из стада [Методические указания по диагностике лейкоза крупного скота / Департамент ветеринарии, Минсельхоз России - 2000 - 13-7-2/2130].

Используемый для прижизненной диагностики гематологический метод позволяет выявить только 60-65% больных лейкозом. 35-40% животных не имеют лейкозных изменений, и это затрудняет эффект проводимых оздоровительных мероприятий. Из хозяйств выбывают животные с лейкемоидными реакциями, а больные лейкозом нередко остаются [Нахмансон В.М. Меры профилактики и борьбы с лейкозом крупного рогатого скота из генетически устойчивых линий и семейств [В.М.Нахмансон, Е.А.Дун и др. // Тр. ВИЭВ. - 1986. - Т.59. - С.82-86].

При некоторых патологических состояниях, таких как лимфогранулематоз, онкологические заболевания, кратковременная инкубация лимфоцитов in vitro в среде с левамизолом приводит к повышению числа Е-РОК, что свидетельствует о модификации рецепторов к эритроцитам барана на Т-лимфоцитах больных. Авторы рассматривают наблюдавшийся эффект как свидетельство устранения блокады Т-клеток [Дондоладзе М.Б. Анализ диагностической значимости модификации поверхности Т-клеток при лимфопролиферативных заболеваниях / М.Б.Дондоладзе, А.А.Ярилин, Н.З.Пирадашвили // Иммунология. - 1986. - 2. - С.66-68].

Известен способ определения чувствительности лимфоцитов к левамизолу [авторское свидетельство СССР SU 1064952; МПК A61K 39/00], который предусматривает использование левамизола в концентрации 0,01 мкг/мл среды.

Наиболее близким к изобретению является способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота, включающий выявление положительно реагирующих в реакции иммунодиффузии животных и гематологический метод исследования, у инфицированных животных определяют процентное содержание общего числа лимфоцитов в мазке крови и Т-лимфоцитов методом спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана, определяют коэффициент отношения (К о ) содержания лимфоцитов к числу Т-лимфоцитов, при К о , равном 4,3 и более, животное считают больным и с повышенным риском к заболеванию вирусом лейкоза крупного рогатого скота и выводят из стада [патент РФ RU 2379683; МПК G01N 33/48].

Недостатком метода является то, что сниженная экспрессия рецепторов к эритроцитам барана Т-лимфоцитов может наблюдаться при многих инфекционных заболеваниях и других состояниях организма, сопровождающихся вторичными иммунодефицитами. Введение иммуномодуляторов, стимулирующих Т-систему организма, также затрудняет выявление животных с повышенным риском к заболеванию лейкозом.

Техническим результатом является повышение точности и достоверности диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

Указанный технический результат достигается тем, что способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота включает выявление положительно реагирующих в реакции иммунодиффузии животных, гематологический метод исследования, у инфицированных животных определение процентного содержания Т-лимфоцитов методом спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана, дополнительно в крови определяют процентное содержание Т-лимфоцитов после инкубации с левамизолом в конечной концентрации 0,5 мкг/мл с помощью спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана, вычисляют индекс сдвига (ИС) по формуле:

при ИС, равном 1,2 и более, животное считают больным лейкозом крупного рогатого скота и выводят из стада.

Способ осуществляется следующим образом. У животных осуществляют забор проб крови, выявляют положительно реагирующих в реакции иммунодиффузии животных, проводят гематологический метод исследования, определяют процентное содержание Т-лимфоцитов, используя реакцию спонтанного розеткообразования (Е-РОК). Реакцию ставят параллельно с двумя пробами лимфоцитов: чистой взвесью (контрольная) и с обработанными левамизолом (опытная). Лимфоциты опытной пробы обрабатывают левамизолом в концентрации 0,5 мкг/мл среды 199, содержащей 1·10 5 лимфоцитов, и инкубируют 1 час при 37°C.

Постановку реакции Е-розеткообразования проводят путем 5-минутного центрифугирования смеси суспензии лимфоцитов с 0,4%-ной взвесью эритроцитов барана и двухэтапной инкубацией: 30 мин в термостате при 37°C и 18-20 ч в холодильнике при 10°C.

В опытной и контрольной группах подсчитывают процент розеток и высчитывают индекс сдвига (ИС), вызванного инкубацией с левамизолом, при ИС, равном 1,2 и более, животное считают больным лейкозом крупного рогатого скота и выводят из стада.

Вычисление индекса сдвига (ИС) применяется для оценки влияния левамизола на активность клеток в тесте [Лебедев К.А. Иммунная недостаточность (выявление и лечение) / К.А.Лебедев, И.Д.Понякина. - М.: Медицинская книга, Н.Новгород: Изд-во НГМА, 2003. - С.405-407].

Увеличение ИС свидетельствует о наличии Т-клеточного дефицита, вызванного вирусом лейкоза крупного рогатого скота. Если ИС 1,0, то животное считают здоровым, если ИС 1,2, то животное считают больным.

Сущность изобретения поясняется на конкретных примерах выполнения способа.

Пример 1. В неблагополучном по лейкозу хозяйстве исследуют 20 коров, из которых формируют 3 группы: 1 группа - 6 коров вирусоносителей (РИД-положительные); 2 группа - 4 больные коровы, положительно реагирующие в РИД и подтвержденные гематологическим методом исследования, и 3 группа - 10 здоровых (не реагирующих в РИД) коров. В периферической крови определяют число Т-лимфоцитов с помощью спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (Е-РОК) при постановке реакции со средой 199 (контроль), а также количество Е-РОК при воздействии левамизола in vitro, используя различные его концентрации: 50 мкг/мл, 0,5 мкг/мл и 0,01 мкг/мл.

Определение чувствительности лимфоцитов к левамизолу осуществляли по методике В.В.Казимирчука с соавторами [авторское свидетельство SU 1064952, МПК A61K 39/00], по мнению авторов, оптимальной концентрацией левамизола при исследовании чувствительности к ним лимфоцитов (in vitro) является 0,01 мкг/мл.

Другими исследователями для изучения действия левамизола in vitro на Т-лимфоциты у больных лимфогранулематозом людей предлагается использовать концентрацию 50 мкг/мл [Пантелеева Е.С. О причинах дефицита Т-лимфоцитов периферической крови у больных лимфогранулематозом / Е.С.Пантелеева, А.А.Ярилин, Г.С.Неприна, Г.Д.Байсоголов // Иммунология. - 1981. - 1. - С.70-74].

С целью выбора оптимальной концентрации для изучения действия левамизола in vitro на Т-лимфоциты носителей ВЛКРС и больных лейкозом коров были взяты различные концентрации препарата (табл.1).

Из таблицы 1 видно, что при определении чувствительности in vitro Е-РОК к левамизолу в концентрации 50 мкг/мл отмечено подавление розеткообразования у животных всех групп, наиболее выраженное при повышенном уровне этих клеток в периферической крови (РИД-отрицательные).

Таблица 1.

Изучение действия различных концентраций левамизола в реакции Е-РОК на лимфоциты in vitro у крупного рогатого скота с разной степенью компрометации к лейкозу

Группа животных

Символы статисти-

ки

Е-РОК, %

Контроль(без левамизола)

с левамизолом, мкг/мл

50

0,5

0,01

Вирусоносители

M±m

20,16±1,08

12,66±1,3

32,83±3,34

21,16±2,36

(РИД+)

P

<0,001

<0,01

>0,05

Гембольные

M±m

19,5±2,06

15,0±1,15

32,0±1,22

21,25±2,53

P

>0,05

<0,01

>0,05

Здоровые (РИД-)

M±m

30,0±2,30

10,7±1,50

22,8±2,84

19,8±1,92

P

<0,001

>0,05

<0,01

При воздействии левамизола на Т-лимфоциты in vitro в концентрации 0,5 мкг/мл у вирусоносителей и больных лейкозом животных наблюдается достоверное повышение Т-розеткообразования, тогда как у РИД-отрицательных их количество оказалось сниженным.

Концентрация левамизола 0,01 мкг/мл существенно не повышала количества Е-РОК у вирусоносителей и больных лейкозом коров, в то же время подавляла розеткообразование у РИД-отрицательных животных.

Таким образом, для изучения чувствительности in vitro Е-РОК к левамизолу у носителей вируса лейкоза и больных лейкозом животных предпочтительно применение препарата в конечной концентрации 0,5 мкг/мл. При использовании этой концентрации препарата происходит стимуляция in vitro Т-лимфоцитов у животных со сниженным уровнем этих клеток в периферической крови (вирусоносители и больные), в то же время существенного влияния на лимфоциты здоровых животных не выявлено. Это может являться прогностическим критерием для характеристики индивидуально больных.

Пример 2. Исследуют 40 коров и по результатам серологических (РИД) и гематологических исследований разделяют на 3 группы: 1-я - 11 коров носителей вируса лейкоза крупного рогатого скота (РИД-положительные); 2-я - 12 больных лейкозом коров; 3-я - 17 здоровых, не реагирующих в РИД животных. Проводят исследование крови путем постановки реакции розеткообразования параллельно с двумя пробами лимфоцитов: чистой взвесью (контрольная) и с обработанными левамизолом (опытная). Лимфоциты опытной пробы обрабатывают левамизолом в концентрации 0,5 мкг/мл среды 199, содержащей 1·10 5 лимфоцитов, и инкубируют 1 час при 37°C. Затем вычисляют индекс сдвига по формуле: ИС=%Е-РОК после инкубации с левамизолом/% Е-РОК до инкубации с левамизолом.

Также проводят исследование крови известным способом [патент RU 2379683, МПК G01N 33/48], выводя коэффициент отношения количества общего числа лимфоцитов к количеству Т-лимфоцитов (табл.2).

Таблица 2.

Сравнительная характеристика иммунного статуса крупного рогатого скота с разной степенью компрометации к лейкозу, проведенная по известному и предлагаемому способу, М±m

Изучаемые величины

Здоровые

Вирусоносители

P

Больные

P

Индекс сдвига

0,56±0,07

2,45±0,33

<0,001

2,12±0,22

<0,001

Коэффициент отношения (прототип)

2,68±0,28

7,70±1,70

<0,01

7,37±1,15

<0,01

Из таблицы 2 видно, что индекс нагрузки у носителей вируса лейкоза и больных по отношению к здоровым животным с высокой степенью достоверности увеличивается (Р<0,001). Также достоверно увеличивается у инфицированных и больных животных коэффициент отношения.

При анализе изучаемых величин у каждого отдельного животного устанавливают, что ИС среди здоровых животных не превышает 0,95, в то же время среди вирусоносителей и больных животных составлял от 1,2 и выше. Следует отметить, что коэффициент отношения у всех гематологически больных и у большинства вирусоносителей составил 4,3.

В таблице 3 представлены результаты исследований животных, проведенных по известному и предлагаемому способу, в зависимости от степени компрометации к лейкозу.

Таблица 3.

Результаты исследования животных, проведенных по известному и предлагаемому способу

Группа животных

Количество животных

Выявлено

известный способ

Предлагаемый способ

дополнительно

ИС 1,2

ИС 1,2

животных

%

Вирусоносители (РИД+)

11

8

-

11

-

-

Гембольные

12

12

-

12

-

-

Здоровые (РИД-)

17

3

12

5

2

11,8

Полученные результаты подтверждают, что предлагаемый способ диагностики лейкоза наиболее точен и достоверен, так как подтвердил диагноз у всех носителей вируса лейкоза и больных лейкозом животных (табл.3). Также удалось дополнительно выявить 2 (11,8%) больных коров среди не реагирующих в РИД.

Пример 3. Проводят опыт на 20-ти коровах, которым 3 месяца ранее был введен иммуномодулятор, стимулирующий Т-систему организма.

Проводят исследование крови путем постановки реакции розеткообразования параллельно с двумя пробами лимфоцитов: чистой взвесью (контрольная) и с обработанными левамизолом (опытная). Затем вычисляют индекс сдвига. Также проводят серологические, гематологические исследования и высчитывают коэффициент отношения по известному способу.

Результаты исследований представлены в таблице 4.

Таблица 4.

Результаты исследования животных неблагополучного стада после предварительного введения иммуномодулятора, стимулирующего Т-систему организма, с использованием различных способов диагностики лейкоза

Количество животных

Выявлено

Дополнительно

РИД+

Гематологически

Известный способ

Предлагаемый способ

животных

%

20

7

2

2

7

2

10

Из таблицы 4 видно, что исследование животных с помощью известного способа через 3 месяца после введения иммуномодулятора, стимулирующего Т-систему организма, затрудняет диагностику, о чем свидетельствуют только 2 выявленных из 7 инфицированных животных, тогда как предлагаемый способ позволил выявить 5 из 7 инфицированных животных, а также 2 дополнительно.

Предлагаемый способ диагностики крупного рогатого скота выявляет на 11,8% больше животных больных лейкозом крупного рогатого скота, является более точным и повышает достоверность. Также может быть успешно использован для диагностики лейкоза у животных, которым были введены иммуностимулирующие средства.

Формула изобретения

Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота, включающий выявление положительно реагирующих в реакции иммунодиффузии животных, гематологический метод исследования, у инфицированных животных определение процентного содержания Т-лимфоцитов методом спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (%Е-РОК), отличающийся тем, что дополнительно в крови определяют процентное содержание Т-лимфоцитов после инкубации с левамизолом в конечной концентрации 0,5 мкг/мл с помощью спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана, вычисляют индекс сдвига (ИС) по формуле

при ИС, равном 1, 2 и более, животное считают больным лейкозом крупного рогатого скота и выводят из стада.