Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
Патент на изобретение №2468807

(19)

RU

(11)

2468807

(13)

C2

(51) МПК A61K35/74 (2006.01)

A61K31/202 (2006.01)

A61P29/00 (2006.01)

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ Статус: по данным на 07.12.2012 - нет данных Пошлина:

(21), (22) Заявка: 2009135871/15, 22.02.2008

(24) Дата начала отсчета срока действия патента:

22.02.2008

Приоритет(ы):

(30) Конвенционный приоритет:

28.02.2007 US 60/904,122

(43) Дата публикации заявки: 10.04.2011

(45) Опубликовано: 10.12.2012

(56) Список документов, цитированных в отчете о

поиске: WO 2004069156 А1, 29.12.2004. WO 2006113034 А1, 26.10.2006. WO 2004112508 А1, 29.12.2004. RU 2291899 С2, 20.01.2007.

(85) Дата начала рассмотрения заявки PCT на национальной фазе: 28.09.2009

(86) Заявка PCT:

US 2008/054717 20080222

(87) Публикация заявки PCT:

WO 2008/106373 20080904

Адрес для переписки:

119019, Москва, Гоголевский б-р, 11, Гоулингз Интернэшнл Инк.

(72) Автор(ы):

ХЕРЦ Удо (US),

МАКМЭХОН Роберт Дж. (US),

РАССЕЛЛ Уильям Майкл (US),

НОЙ Джозеф (US)

(73) Патентообладатель(и):

МЕД ДЖОНСОН НУТРИШЕН КОМПАНИ (US)

(54) ДЕТСКОЕ ПИТАНИЕ, СОДЕРЖАЩЕЕ ИНАКТИВИРОВАННЫЙ ПРОБИОТИК

(57) Реферат:

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и представляет собой питательный состав для ребенка или младенца для профилактики или уменьшения системного воспаления, включающий: источник липидов, источник углеводов, источник белка, витамины, минеральные вещества и по меньшей мере один инактивированный тепловой обработкой Lactobacillus rhamnosus GG, при этом питательный состав обеспечивает доставку ребенку или младенцу от примерно 1×10 4 до примерно 1×10 10 клеточных эквивалентов инактивированного Lactobacillus rhamnosus GG на кг веса в день. Изобретение обеспечивает сохранение клеточных и молекулярно-биологических свойств реактивности живого пробиотика, которые являются полезными для лечения, уменьшения или профилактики системного воспаления, 2 н. 8 з.п. ф-лы, 2 пр., 1 табл., 6 ил.

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение в общем относится к продукту, содержащему по меньшей мере один инактивированный пробиотик, и к способу, использующему по меньшей мере один инактивированный пробиотик.

Уровень техники

Воспалительная ответная реакция представляет собой попытку организма восстановить и поддерживать гомеостаз после инвазии инфицирующего агента, действия антигена или физического, химического или травматического повреждения. Локализованное воспаление имеет место в конкретной области и может характеризоваться различными симптомами, включая покраснение, опухоль, выделение тепла и боль.

В то время как воспалительная ответная реакция рассматривается как здоровая реакция на повреждение, иммунная система может проявлять нежелательный физиологический ответ, если не осуществлять ее соответствующее регулирование. В этой ситуации обычно нормально функционирующая защитная иммунная система организма вызывает повреждение своих собственных тканей вследствие действия на здоровую ткань как на инфицированную или аномальную. Или же, если есть повреждение, воспалительная ответная реакция может быть несоизмеряемой с угрозой, вызывающей повреждение. Когда это возникает, воспалительная ответная реакция может вызвать гораздо более сильное повреждение организма, чем вызывает сам агент.

Было установлено, что воспалительная ответная реакция частично состоит из увеличенной экспрессии как провоспалительных цитокинов, так их противовоспалительных цитокинов. Цитокины имеют низкий молекулярный вес и являются биологически активными белками, вовлеченными в процесс координации иммунологических и воспалительных ответов и коммуникации между специфическими популяциями иммунных клеток. Ряд видов клеток продуцирует цитокины во время воспалительных реакций, включая нейтрофилы, моноциты и лимфоциты.

Существует много механизмов, по которым цитокины, образовавшиеся в воспалительных сайтах, влияют на воспалительную ответную реакцию. Если, однако, провоспалительная ответная реакция не уравновешивается успешно противовоспалительными цитокинами, может возникнуть неконтролируемое системное воспаление.

В противоположность локализованному воспалению системное воспаление распространено по всему организму. Этот тип воспаления может включать локализованное воспаление в специфических сайтах, но может также быть связано с общими симптомами, "похожими на грипп", включая жар, озноб, усталость или потерю энергии, головную боль, потерю аппетита и ригидность мышц. Системное воспаление может привести к разрушению белков, катаболизму и гиперметаболизму. Как следствие этого, структура и функция основных органов, таких как мышцы, сердце, иммунная система и печень, могут быть ослаблены и могут привести к повреждению многих органов и к смерти. Jescoke, et al., Insulin Attenuates the Systemic Inflammatory Response to Thermal Trauma, Mol. Med. 8(8):443-450 (2002). Хотя был достигнут огромный успех в понимании механизмов системного воспаления, показатель смертности из-за такого повреждения остается неприемлемо высоким.

Инфекционные заболевания дыхательного тракта встречаются очень часто, особенно среди младенцев. В течение первого года жизни они склонны к повторяющимся инфекционным заболеваниям дыхательных путей и часто болеют инфекционными заболеваниями от трех до шести раз только в течение этого года. Около 6% детей грудного возраста попадают в больницы с инфекционными заболеваниями дыхательных путей каждый год только в Соединенных штатах Америки.

Инфекционные болезни дыхательных путей и их симптомы могут колебаться от слабых до сильных в зависимости от вида вируса и локализации инфекции. Инфекционные заболевания верхних дыхательных путей часто проявляются в виде обычных простуд, вызывающих воспаление и распухание носовой оболочки, горла и околоносовых пазух носа. Грипп является очень заразным инфекционным вирусным заболеванием верхних дыхательных путей. Симптомы гриппа включают лихорадочное состояние, озноб, головную боль, боль в мышцах, головокружение, кашель, боль в горле, насморк, тошноту и диарею.

Другая инфекция верхних дыхательных путей, круп, вызывает очень сильный кашель и затрудненное дыхание различной степени тяжести, в основном, во время вдоха.

Инфекции нижних дыхательных путей обычно считаются более серьезными, чем инфекционные болезни верхних дыхательных путей. Респираторный синцитиальный вирус (RSV) является наиболее частой причиной инфекционных заболеваний нижних дыхательных путей у младенцев и детей, возраст которых составляет менее 4 лет. Van Woensel, J., et al., Viral Lower Respiratory Tract Infection in infants and Young Children, BMJ 327:36-40 (2003). Он представляет собой такой распространенный вирус, что фактически все дети к трем годам бывают инфицированы RSV. У большей части младенцев и детей RSV вызывает легкую респираторную инфекцию, которая неотличима от обычной простуды. Он обычно вызывает ощущение "заложенного" носа, выделения из носа и кашель.

Защита от RSV включает ответную реакцию как Т-клеток, так и В-клеток, ответ антител (IgM, IgG и IgA), а также другие ответы иммунной системы, которые активируются бактериальными и вирусными инфекциями. Предполагают, что существует связь между инфекцией RSV в младенчестве и развитием повторяющихся стесненного дыхания, астмы и атопии позднее в детстве. Таким образом, ограничение RSV инфекций может предотвратить серьезные осложнения после респираторных заболеваний, которые наблюдаются в детстве.

Бронхит представляет собой инфекционную болезнь нижних дыхательных путей, которая поражает бронхиальные трубки, вызывая сужение и распухание вследствие вирусного воспаления. Бронхиолит похож на бронхит, но возникает в основном у младенцев. Он представляет собой воспаление более мелких трубок разветвленной сети бронхов. Эта инфекция вызывает затрудненное дыхание, частый и очень сильный кашель и свистящее дыхание и может потребовать госпитализации.

Инфекцией нижних дыхательных путей, которая, по всей вероятности, представляет собой наибольшую опасность для младенцев, является воспаление легких. Воспаление легких или пневмония вызывается инфекцией в альвеолах, что вызывает их заполнение жидкостью, часто густой и гнойной по природе, которая мешает соответствующему обмену двуокиси углерода. Степень серьезности пневмонии зависит от количества пораженной легочной ткани.

Большинство инфекций верхних и нижних дыхательных путей вызывается вирусами, предотвратить распространение которых или вылечить в настоящее время не представляется возможным. Некоторые респираторные инфекции, включая грипп, можно предотвратить путем вакцинации. Однако, хотя были разработаны вакцины для конкретных респираторных инфекций, они являются дорогими и не общедоступными. Точно так же лекарства для лечения этих инфекций доступны ограниченно и являются дорогими. Таким образом, было бы полезно разработать немедицинский способ лечения или профилактики респираторных инфекций у младенцев.

Частые инфекции дыхательных путей часто связаны с острым средним отитом (АОМ), известным также как инфекция среднего уха. АОМ характеризуется острым коротким периодом воспаления и накоплением жидкости в среднем ухе. АОМ может сопровождаться ринитом, кашлем, лихорадочным состоянием, болью в горле, болью в ухе, гипоакузией, беспокойством, раздражительностью, потерей аппетита, рвотой или диареей. Считается, что АОМ сопровождается также гнойной отореей.

К первому году жизни пятьдесят процентов детей болеют АОМ по меньшей мере один раз. К третьему году жизни по меньшей мере один раз АОМ болеют восемьдесят процентов детей. 35% детей в возрасте от одного до трех лет имеют повторяющиеся случаи заболевания АОМ.

АОМ может быть вызван вирусами или бактериями. Наиболее распространенными бактериальными штаммами, которые вызывают АОМ, являются Streptococcus pneumoniae (35% случаев), Haemophilus influenzae (30% случаев) и Moraxella catarrhalis (10% случаев). Поскольку бактериальные штаммы часто вызывают инфекции, АОМ обычно лечат путем введения антибиотиков. В действительности, в младенчестве антибиотики выписывают гораздо чаще для лечения АОМ, чем для лечения других болезней.

Очень часто вопрос о том, является ли цитокиновый ответ провоспалительным или противовоспалительным, зависит от баланса индивидуальных микроорганизмов, которые образуют колонии в кишечной полости в любое данное время. Хорошо известно, что поверхность слизистой оболочки кишечного тракта содержит колонии чрезвычайно большой, сложной и динамической коллекции микроорганизмов. Состав кишечной микрофлоры меняется при прохождении вдоль пищеварительного тракта, как и в различных местах обитания микроорганизмов, таких как слой эпителиальной слизистой оболочки, глубокий слой слизистой оболочки крипты и поверхность эпителиальных клеток слизистой оболочки. Специфическая колонизация зависит от внешних и внутренних факторов, включая доступные в просветах молекулы, качество слизистой оболочки и взаимодействие организма-хозяина с микробами и микробов друг с другом. Murch, S.H., Toll of Allergy Reduced by Probiotics, Lancet, 357:1057-1059 (2001).

Эти микроорганизмы, которые образуют кишечную микрофлору, активно участвуют в иммунной ответной реакции. Они реагируют с эпителием в условиях взаимных благоприятных отношений для обоих партнеров (симбиоз) или в условиях, благоприятных для одного партнера и не вредных для другого партнера (комменсализм). Hooper, et ah, How Host-Microbial Interactions Shape the Nutrient Environment of the Mammalian Intestine, Annu. Rev. Nutr. 22:283-307 (2002). В действительности, появляются значительные доказательства, которые показывают сильное взаимодействие или "взаимное влияние" между кишечной микрофлорой и различными популяциями клеток слизистой оболочки кишечника. Bourlioux, et al., The Intestine and its Microflora are Partners for the Protection of the Host: Report on the Danone Symposium "The Intelligent Intestine", held in Paris, June 14, 2002, Am. J. Clin. Nutr. 78:675 (2003); Hooper, L.V. & Gordon, J.I., Commensal Host-Bacterial Relationships in the Gut, Sci. 292: 1115 (2001); Haller, et al., Non-Pathogenic Bacteria Elicit a Differential Cytokine Response by Intestinal Epithelial Cell/Leucocyte Co-Cultures, GUT 47:79 (2000); Walker, W.A., Role of Nutrients and Bacterial Colonization in the Development of Intestinal Host Defense, J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 30: S2 (2000). Кроме того, было показано, что микрофлора в кишечнике вызывает специфичные иммунные ответные реакции как на локальном, так и на системном уровне у взрослых. Isolauri, E., et al., Probiotics: Effects on Immunity, A, J. Clin. Nutr. 73: 444S - 50S (2001).

Известно, что кишечная микрофлора у младенцев гораздо менее развита, чем у взрослых. В то время как микрофлора у взрослого человека состоит из более чем 10 13 микроорганизмов и почти 500 видов, при этом некоторые из них бывают вредными и некоторые являются полезными, микрофлора у ребенка содержит только часть этих микроорганизмов как в абсолютном выражении, так и в отношении разнообразия видов микроорганизмов. Дети рождаются со стерильным кишечником и приобретают кишечную флору из родовых путей, из первоначальной среды и из того, что они усваивают. Ввиду того, что популяция кишечной микрофлоры очень нестабильная в ранней неонатальной жизни, часто кишечнику ребенка трудно поддерживать хрупкий баланс между вредными и полезными бактериями, что снижает способность иммунной системы функционировать нормально.

Особенно трудно поддерживать этот баланс младенцам, которых кормят молочной смесью вследствие разницы между видами бактерий в кишечнике детей, получающих молочные смеси, и детей, вскармливаемых грудным молоком. Стул у детей, вскармливаемых грудью, в основном содержит Bifidobacterium со Streptococcus и Lactobacillus в качестве менее распространенных компонентов. В противоположность этому микрофлора детей, получающих молочные смеси, является более разнообразной, и содержит Bifidobacterium и Bacteroides, а также более патогенные виды, представляющие собой Staphilococcus, Escherichia coli и Clostridia. Различные виды Bifidobacterium в стуле вскармливаемых грудью детей и детей, получающих молочные смеси, также отличаются. Разнообразие факторов было предложено считать причиной различной флоры в кале детей, вскармливаемых грудью, и детей, получающих молочные смеси, включая более низкое содержание и различный состав белков в грудном молоке людей, более низкое содержание фосфора в грудном молоке у людей, большое разнообразие олигосахаридов в этом молоке и различные гуморальные и клеточные медиаторы иммунологической функции в грудном молоке. Agostoni, et al., Probiotic Bacteria in Dietetic Products for Infants: A Commentary by the ESPGHAN Committee on Nutrition, J. Pediatr. Gastro. Nutr. 38:365-374 (Apr. 2004).

Вследствие того, что микрофлора у младенцев, которых кормят грудными смесями, является такой нестабильной и кишечная микрофлора в значительной степени участвует в стимуляции кишечного иммунитета, дети, получающие молочные смеси, более подвержены воспалительным заболеваниям. Многие из основных болезней, которые поражают детей, включая хроническую болезнь легких, околожелудочковую лейкомаляцию, неонатальный менингит, неонатальный гепатит, сепсис и некротизирующий энтероколит, являются воспалительными по природе. В зависимости от конкретного заболевания сопутствующее воспаление может возникнуть в конкретном органе, таком как легкие, мозг, печень или кишечник, или же воспаление может быть системным по природе.

Например, хроническая болезнь легких приводит к возникновению воспаления в тканях в легких, в то время как неонатальный менингит включает воспаление выстилок в мозгу и в спинном мозге. Околожелудочковая лейкомаляция вызывается воспалительным повреждением околожелудочковой области в развивающемся мозге. Некротизирующий энтероколит вызывает воспаление в кишечнике, которое может привести к разрушению части или всего кишечника, а неонатальный гепатит включает воспаление печени, которое возникает в раннем грудном возрасте. Сепсис, который известен также как системный воспалительный ответный синдром, представляет собой очень серьезное заболевание, вызванное очень сильной инфекцией в токе крови, вызванной бактериями, продуцирующими токсины. При этой болезни патогены в потоке крови вызывают воспалительную ответную реакцию во всем организме.

У недоношенных и смертельно больных детей также с трудом развивается кишечный иммунитет и часто возникает системное воспаление. Недоношенные или смертельно больные дети часто сразу же помещаются в стерильные инкубаторы, где на них не действуют популяции бактерий, воздействию которых обычно подвергаются здоровые, доношенные дети. Это может замедлить природный процесс колонизации или повредить ему. Эти дети также часто подвергаются лечению антибиотиками с широким спектром действия, которые убивают комменсальные бактерии, пытающиеся образовать колонии в кишечном тракте ребенка. Кроме того, этих детей часто кормят детскими молочными смесями, а не материнским молоком. Каждый из этих факторов может вызвать неправильное развитие кишечной микрофлоры ребенка, тем самым вызывая или ускоряя системное воспаление, опасное для жизни.

В последние годы было предложено введение пробиотических бактерий в пищу детей, получающих молочные смеси, с целью облегчения колонизации кишечника полезными микроорганизмами. Пробиотические бактерии представляют собой живые микроорганизмы, которые оказывают благоприятное воздействие на здоровье организма хозяина. Fuller, R. Probiotics in Man and Animals, J. Appl. Bacteriol. 66:365-78 (1989).

Хотя жизнеспособные пробиотические бактерии могут быть эффективными при нормализации кишечной микрофлоры, существует очень мало опубликованных исследований, в которых оценивается их безопасность для недоношенных детей и детей после иммуносупрессивной терапии. Эти особые популяции создают преждевременный защитный барьер в кишечнике, который увеличивает риск транслокации бактерий просвета, вызывая потенциально возросший риск возникновения инфекций. Во многих случаях жизнеспособные пробиотики не рекомендуются пациентам после иммуносупрессивной терапии, пациентам после хирургического вмешательства, пациентам с дисфункцией поджелудочной железы или пациентам со стулом с прожилками крови. Сообщалось о по меньшей мере одной смерти, последовавшей после введения пробиотиков в пищу субъекту после иммуносупрессивной терапии. MacGregor G., et al. Yoghurt biotherapy: contraindicated in immunosuppressed patients? Postgrad Med J. 78:366-367 (2002).

Таким образом, для пациентов с ослабленным иммунитетом или для недоношенных детей было бы полезно создать нежизнеспособную добавку, которая может способствовать лечению или профилактике системного воспаления. Нежизнеспособная альтернатива живым пробиотикам может иметь дополнительные преимущества, такие как большая жизнеспособность. Живые пробиотики являются чувствительными к нагреванию, влаге и свету и в идеале их нужно охлаждать для поддержания жизнеспособности. Даже если принять эту меру предосторожности, жизнеспособность типичного пробиотика будет довольно непродолжительной. Нежизнеспособная альтернатива живым пробиотикам устранит необходимость охлаждения и обеспечит продукт, имеющий более длительную жизнеспособность. Этот продукт будет затем распространяться в тех районах мира, где достаточное охлаждение недоступно. Нежизнеспособная альтернатива пробиотикам дополнительно обеспечит меньший риск взаимодействия с другими компонентами пищи, такого как ферментация и изменения во вкусе, структуре и свежести продукта. Соответственно, было бы полезно создать способ уменьшения или предотвращения системного воспаления у детей, которых кормят молочными смесями, включающий введение инактивированных пробиотиков.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Следовательно, вкратце, данное изобретение предусматривает новый продукт, содержащий по меньшей мере один инактивированный пробиотик, при этом пробиотик в нежизнеспособных, но клеточных компонентах инактивированного пробиотика сохраняет те же или похожие биологические признаки, как и жизнеспособные или не инактивированные клетки пробиотика.

Согласно другим вариантам настоящее изобретение предусматривает способ лечения, профилактики или уменьшения системного и/или респираторного воспаления у субъекта, при этом способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного инактивированного пробиотика, при этом пробиотик в его жизнеспособном виде используют для лечения, профилактики или уменьшения такого системного и/или респираторного воспаления у субъекта.

Согласно дальнейшим вариантам изобретение направлено на способ лечения, профилактики или уменьшения респираторного воспаления у субъекта, при этом способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного инактивированного пробиотика, при этом пробиотик в его жизнеспособном виде используют для лечения, профилактики или уменьшения такого респираторного воспаления у субъекта.

Согласно другим вариантам данное изобретение направлено на способ уменьшения или предотвращения системного высвобождения одного или более провоспалительных питокинов или хемокинов у субъекта, при этом способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного инактивированного пробиотика.

Согласно другому варианту настоящее изобретение направлено на способ лечения, профилактики или уменьшения системного или респираторного воспаления у субъекта, при этом способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества инактивированной LGG в комбинации с по меньшей мере одной LCPUFA и/или по меньшей мере одним жизнеспособным пробиотиком. По конкретным вариантам LCPUFA может представлять собой докозагексановую кислоту (DHA) или арахидоновую кислоту (ARA).

Среди нескольких преимуществ, достигаемых при осуществлении данного изобретения, можно назвать то, что оно уменьшает или предотвращает системное воспаление. Изобретение может уменьшить воспаление в печени, плазме крови, в легких и в кишечнике. Кроме того, данное изобретение снижает или предотвращает высвобождение различных провоспалительных цитокинов и хемокинов, включая интерлейкин-1 (IL-1 ), IL-8, CINC-1 и онкоген, связанный с ростом (GRO/KC). Так как данное изобретение можно использовать для улучшения состояния, связанного с воспалением, оно может также предотвращать начало причиняющих вред инфекций или болезней.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Для более полного понимания данного изобретения ниже приведено описание со ссылкой на прилагаемые фигуры.

На Фиг.1 показано влияние активного и инактивированного пробиотиков на цитокин - индуцируемое продуцирование нейтрофильного хемоаттрактанта-1 (CINC-1), пептида, в печени, изученное методом фермент-связанного иммуносорбентного анализа (ELISA). Инактивированная Lactobacillus rhamnosus (LGG) обозначена как "LGG, прошедшая тепловую обработку".

На Фиг.2 показано влияние активного и инактивированного пробиотиков на цитокин - индуцируемое продуцирование нейтрофильного хемоаттрактанта-1 (CINC-1), пептида в плазме крови, изученное методом фермент-связанного иммуносорбентного анализа (ELISA). Инактивированная LGG обозначена как "LGG, прошедшая тепловую обработку".

На Фиг.3 показано влияние активного и инактивированного пробиотиков на цитокин-индуцируемое продуцирование нейтрофильного хемоаттрактанта-1 (CINC-1), пептида в легких, изученное методом фермент-связанного иммуносорбентного анализа (ELISA). Инактивированная LGG обозначена как "LGG, прошедшая тепловую обработку".

На Фиг.4 показано влияние активного и инактивированного пробиотиков на продуцирование связанного с ростом онкогена (GRO/KC) в печени, изученное методом мультиплексного анализа профиля цитокинов. Инактивированная LGG обозначена как "LGG, прошедшая тепловую обработку".

На Фиг.5 показано влияние активного и инактивированного пробиотиков на продуцирование связанного с ростом онкогена (GRO/KC) в легких, изученное методом мультиплексного анализа профиля цитокинов. Инактивированная LGG обозначена как "LGG, прошедшая тепловую обработку".

На Фиг.6 показано влияние активного и инактивированного пробиотиков на уровень IL-1 в печени, изученное методом мультиплексного анализа питокинового профиля. Инактивированная LGG обозначена как "LGG, прошедшая тепловую обработку".

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ

Далее варианты данного изобретения будут описаны более подробно с приведением одного или более примеров. Каждый пример служит для объяснения изобретения, но не ограничивает его. В действительности, специалистам очевидно, что, не выходя за рамки изобретения и его объем, можно осуществить различные его модификации и вариации. Например, признаки, проиллюстрированные или описанные как часть одного варианта, могут быть использованы в другом варианте, что приводит к получению еще одного варианта.

Таким образом, подразумевается, что данное изобретение охватывает такие модификации и вариации, которые входят в объем изобретения, определенный прилагаемыми формулой изобретения и их эквивалентами. Другие цели, признаки и аспекты данного изобретения описаны в заявке или очевидны из следующего подробного описания. Специалисту в данной области очевидно, что данное обсуждение основано на описании только примерных вариантов изобретения и не ограничивает более широкие аспекты данного изобретения.

В данном описании применены следующие сокращения: LGG, Lactobacillus rhamnosus GG; LCPUFA, длинноцепочечная полиненасыщенная жирная кислота; LPS, липополисахарид; IL, интерлейкин; CINC-1, цитокин-индуцируемый нейтрофильный хемоаттрактант-1; GRO/KC, рост-ассоциированный онкоген; ELISA, фермент-связанный иммуносорбентный анализ; RT-PCR, обратная транскрипционная полимеразная цепная реакция; ANOVA, анализ вариантности; SD, стандартное отклонение; RMS, заменитель крысиного молока; TLRs-толл-подобные рецепторы; Nuclear Factor kappa В, NF-кВ; ЕРА, эйкозапентановая кислота; DHA, докозагексановая кислота; ARA, арахидоновая кислота.

TLR's представляют собой семейство рецепторов позвоночного распознавания. Они являются ключевыми соединениями в создании врожденного и приобретенного иммунитета. Они играют ключевую роль в распознавании сохраненных микробных компонентов. Компоненты клеточных стенок организма, ДНК и двухнитевая РНК распознаются различными TLRs. Эти компоненты бактериального происхождения (будут ли это LPC, пептидогликан или CpG ДНК) являются природными TLR лигандами, которые сохраняют сильные иммуномодуляторные свойства в отсутствие патогенных последствий, которые обычно являются результатом нормальной пролиферации бактерий (диарея, разрушение тканей, системное воспаление, барьерная проницаемость). Бактериальные компоненты обычно действуют на ответную реакцию приобретенного приоритета, в то время как сами бактерии реагируют на врожденную иммунную ответную реакцию.

Термин "пробиотик" означает живой, активный или жизнеспособный организм, который оказывает благоприятное воздействие на организм хозяина.

Термин "пребиотик" означает неусвояемый ингредиент пищи, который стимулирует рост и/или активность пробиотиков.

Используемый термин "лечение" означает ослабление, улучшение состояния или излечивание болезни или состояния.

Термин "уменьшение" означает снижение степени, количества или градусов.

Термин "профилактика" означает остановку или предотвращение болезни, расстройства или симптома болезни или состояния путем совершения какого-либо действия.

Применяемый термин " системный " означает относящийся ко всему организму или затрагивающий весь организм.

Термины "респираторная инфекция" или "респираторная болезнь" означают болезнь или инфекцию, затрагивающую группу органов, ответственных за доставку кислорода из воздуха в поток крови и за вытеснение двуокиси углерода.

Термины "инактивированный пробиотик" или "инактивированная LGG" означают, что внутренняя метаболическая активность или репродуктивная способность пробиотика или организма LGG была снижена или разрушена. Однако полагают, что "инактивированный пробиотик" или "инактивированная LGG" все еще сохраняют по меньшей мере часть их природных TLR лигандов на клеточном уровне, лиганды же в свою очередь сохраняют по меньшей мере часть их иммуномодуляторных свойств. Применяемый в данной заявке термин "инактивированный" является синонимом термина "нежизнеспособный".

Термин "терапевтически эффективное количество" относится к количеству, которое приводит к улучшению или излечению болезни, расстройства или симптомов болезни или состояния.

Термин "недоношенный" означает ребенка, родившегося до истечения 37 недели беременности.

Термин "младенец" означает человека, возраст которого составляет менее примерно 1 года.

Термин "ребенок" означает человека в возрасте, составляющем от примерно 1 года до 12 лет. Согласно некоторым вариантам ребенок означает человека в возрасте от примерно 1 года до 6 лет. По другим вариантам возраст "ребенка" составляет от примерно 7 до 12 лет.

Применяемый в данной заявке термин "детская молочная смесь" означает композицию, которая удовлетворяет требованиям к питанию ребенка, являясь заменителем грудного молока женщины.

В соответствии с данным изобретением предусмотрен новый продукт и способ применения пробиотика. Эти продукт и способ включают применение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного инактивированного пробиотика и введение его субъекту. По некоторым вариантам субъектом является младенец.

Предыдущие попытки эффективно ввести инактивированные пробиотики натолкнулись на значительные препятствия. Например, Kirjavainen P. et al., сообщили, что при сравнении с живой и инактивированной путем тепловой обработки LGG почти 40% детей, которым давали инактивированную LGG, страдали от сильной диареи. Probiotic Bacteria in the Management of Atopic Disease: Underscoring the importance of Viability, J. Ped. Gastro. 36:223-227 (2003).

При введении плацебо или жизнеспособной LGG не наблюдались неблагоприятные реакции. Id, 225. Поскольку диарея в значительной степени связана с воспалением, как показало исследование Kirjavainen, инактивированная LGG действительно может вызывать воспаление желудочно-кишечного тракта. В указанной работе отмечено, что "способ инактивации путем тепловой обработки может привести к денатурации поверхностных пептидов и экспрессии хит-шокового белка, тем самым модифицируя иммуностимуляторные свойства LGG таким образом, что инактивированная путем тепловой обработки форма будет индуцировать воспалительные ответные реакции и соответственно увеличивать проницаемость кишечника", Id, 226. В противоположность этому изобретатели разработали новый способ лечения или профилактики воспалений путем введения по меньшей мере одного инактивированного пробиотика за счет усвоения продукта, содержащего такой(-ие) инактивированный(-ые) пробиотик(-и).

Изобретатели обнаружили, что инактивированный пробиотик может быть применен для достижения тех же или похожих благоприятных эффектов у человека при его усвоении, что и при усвоении того же живого или жизнеспособного продукта. Инактивированные пробиотики по изобретению сохраняют клеточные и молекулярные свойства и индуцируют такие же или похожие биологические ответные реакции в организме хозяина, усваивающего эти продукты, в отличие от репродуктивных и других активных свойств, четко связанных с живым организмом. Как таковой, инактивированный пробиотик по изобретению может быть любым пробиотиком или комбинацией любых пробиотиков, известных из уровня техники.

По другим вариантам изобретения инактивированный пробиотик может быть членом рода Lactobacillus. Например, инактивированный пробиотик может быть L.acidiphilu, L.amylovorus, L.bulgaricus, L.crispatus, L.delbrueckii, L.rhamnosus, L. casei, L. gallinarum, L.fermentum, L.gasseri, L.helveticus, L.jugurti, L.johnsonii, L.leichmannii, L.plantarum, L.reuteri или L.salivarius. По некоторым вариантам инактивированным пробиотиком могут быть L.acidophilus LA-5®, L.acidophilus NCFM, L.acidophilus AS-1, L.acidophilus DDS-1, L.acidophilus HP10, L.acidophilus HP100, L.acidophilus HP101, L.acidophilus HP102, L.acidophilus HP103, L.acidophilus HP104, L.acidophilus HP15, L.acidophilus PIM703, L.acidophilus SBT2062, L.casei DN - 114001, L.casei LC10, L.casei PIM61, L.casei 431® (CRL 431), L.casei F19, L.casei Shirota, L.casei immunitass, L.crispatus BG2FO4, L.delbrueckii ssp. Bulgaricus, L.delbrueckii ssp. Bulgaricus 2038, L.delbrueckii ssp. Bulgaricus MR120, L.delbrueckii ssp. Bulgaricus PIM695, L.plantarum 299V, L.reuteri 1063-S, L.reuteri 11284, L.reuteri SD2112, L.reuteri T-1, L.reuteri ARRC 55730, L.reuteri SD2112, L.reuteri RC-14®, L.rhamnosus GG (LGG) ATCC 53013, L.rhamnosus GR-1®, L.rhamnosus LB21, L.rhamnosus R-011, L.rhamnosus R-049, L.rhamnosus MX1, L.gasseri ADH, L.helveticus MR220, L.helveticus NCK388, L.johnsonii 11088 (NCK 088), L.johnsonii La-1, L.salivarius UCC500, L.salivarius UCC118 или L.lactis San.

Как указано выше, согласно конкретному варианту изобретения инактивированным пробиотиком может быть LGG. LGG представляет собой пробиотический штамм, выделенный из здоровой кишечной флоры человека. Он был описан в патенте США 5032399 на имя Gorbach et al., который полностью включен в данную заявку в качестве ссылки. LGG стабильна к большинству антибиотиков, стабильна в присутствии кислоты и желчи и прикрепляется быстро к клеткам слизистой оболочки кишечного тракта человека. Она способна выживать 1-3 дня у большинства людей и до 7 дней у 30% субъектов. В дополнение к ее способности к колонизации LGG влияет также благоприятно на иммунные ответные реакции слизистой оболочки. LGG депонирована в коллекции American Type Culture Collection под номером АТСС 53103.

Согласно другим вариантам инактивированный пробиотик может быть членом рода Bifidobacterium. Например, инактивированный пробиотик может быть В.animalis, В.breve, В.infantis, В.lactis, В.suis или В.longum. По дальнейшим вариантам инактивированный пробиотик может быть Bifidobacterium animalis ssp. animalis, В.animalis DN-173010, В.animalis ssp.lactis (BB-12®), B.breve Yakult, B.breve R-070, B.infantis BBI, B.infantis 35624, B.lactis HN019 (DR10). B.longum или В.longum BB536.

Как уже отмечено, инактивированным пробиотиком может быть В. animalis ssp.lactis (BB-12®), доступный в Chr. Hansen Biosystems, расположенной в Milwaukee, WI. BB-12® является грамположительной анаэробной палочкообразной бактерией, которую можно обнаружить в толстой кишке большинства млекопитающих, включая людей.

Согласно дальнейшим вариантам инактивированный пробиотик может быть Escherichia coli, Enterococcus faecium, Saccharomyces cerevisiae, Lactococcus lactis, Bacillus coagulans, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici, Streptococcus sanguis или Streptococcus thermophilus. По конкретному варианту инактивированным пробиотиком может быть Е.coli Nissle 1917. По другому варианту инактивированным пробиотиком может быть Saccharomyces cerevisiae (boulardii) lyo. Согласно еще одному варианту инактивированным пробиотиком может быть S.thermophilus TH-4 .

Согласно одному из вариантов изобретения можно применять более одного инактивированного пробиотика. Согласно этому варианту может быть любая комбинация инактивированных пробиотиков, при условии, что эта комбинация приводит к желаемому результату. По конкретному варианту такая комбинация может включать один или более членов рода Lactobacillus и один или более членов рода Bifidobacterium, например, можно применять LGG и BB-12®. По еще одному варианту можно использовать комбинацию BB-12® и LA-5®.

В способе по изобретению терапевтически эффективное количество инактивированного пробиотика означает количество, достаточное для уменьшения или профилактики системного воспаления у субъекта. Это количество может соответствовать примерно 1×10 4 -1×10 12 клеточных эквивалентов на кг веса в день. Согласно другому варианту данное изобретение предусматривает введение примерно 1×10-1×10 9 клеточных эквивалентов на кг веса в день. Согласно еще одному варианту данное изобретение включает введение примерно 1×10 9 клеточных эквивалентов на кг веса в день. По другому варианту данное изобретение включает введение примерно 1×10 10 клеточных эквивалентов на кг веса в день.

Согласно данному изобретению можно применять по меньшей мере один пробиотик, который был инактивирован. Инактивацию можно проводить любым методом, известным в настоящее время, или методом, который будет разработан. Инактивацию можно проводить, например, путем тепловой обработки, лиофилизации, воздействия УФ-света, гамма-облучения, давления, химического расщепления или механического расщепления. Например, пробиотик может быть инактивирован путем тепловой обработки при хранении при температуре 80°С-100°С в течение 10 мин. Пробиотик можно также инактивировать УФ-светом при облучении в течение 5 мин на расстоянии 5 см от лампы мощностью 30 ватт. Или же пробиотик может быть инактивирован путем гамма-облучения 2 кг - Грей (kGy) с применением источника Кобальт-60 на расстоянии 20 см.

Форма введения инактивированного пробиотика согласно способу по изобретению не является критической до тех пор, пока вводится терапевтически эффективное количество. По некоторым из вариантов по меньшей мере один инактивированный пробиотик вводят субъекту в виде таблеток, пилюль, капсул, каплетов, гелькапов, масляных капель или саше. По другому варианту инактивированный пробиотик инкапсулирован в сахар, жир или полисахарид. Согласно другому варианту инактивированный пробиотик добавляется к пище или напитку, которые используют для кормления. Пищевой продукт или напиток может быть искусственным детским пищевым продуктом, таким как продукт, принимаемый после приема пищи, молоко, напиток, йогурт, фруктовый сок, напиток на основе фруктов, жевательная таблетка, печенье, крекер или порошковое молоко. По другим вариантам продукт может быть питательным составом для младенцев, таким как грудная смесь для младенцев или усилитель женского молока.

Если в смеси для грудных младенцев вводится по меньшей мере один инактивированный пробиотик, эта смесь должна содержать все питательные вещества и включать подходящие виды и количества липида, углевода, белка, витаминов и минералов. Количество липида или жира обычно может меняться от примерно 3 до примерно 7 г/100 ккал. Источники липидов могут представлять собой известные из уровня техники источники, например, растительные масла, такие как пальмовое масло, соевое масло, пальмолеин (жидкая фракция пальмового масла), кокосовое масло, среднецепочечные триглицериды, подсолнечное масло с высоким содержанием олеиновой кислоты, сафлоровое масло с высоким содержанием олеиновой кислоты и т.п.

Количество белка обычно может колебаться от примерно 1 до примерно 5 г/100 ккал. Источниками белка могут быть любые, известные из уровня техники, например, обезжиренное молоко, сывороточный белок молока, казеин, соевый белок, гидролизованный белок, аминокислоты и т.п. Количество углевода обычно может составлять от примерно 8 до примерно 12 г/100 ккал. Источниками углеводов также могут быть известные из уровня техники, например лактоза, глюкоза, твердые вещества кукурузного сиропа, мальтодекстрины, сахароза, крахмал, твердые вещества рисового сиропа и т.п. Обычно может быть использована коммерчески доступная смесь для новорожденных. Например, могут быть дополнены подходящим количеством инактивированной LGG Enfamil®, Enfamil® Premature Formula, Engamil® with Iron, Lactofree®, Nutramigen®, Pregestimil® и ProSobee® (доступна в Mead Johnson & Company, Evansville, IN, U.S.A.), которые можно применять в практике осуществления данного изобретения.

Согласно одному из вариантов изобретения по меньшей мере один инактивированный пробиотик можно соединить с одним или несколькими жизнеспособными пробиотиками для лечения или профилактики системного воспаления у искусственно вскармливаемых грудных детей. По этому варианту приемлемым является любой жизнеспособный пробиотик, известный из уровня техники, при условии, что он позволяет достичь намеченного результата. Согласно конкретному варианту жизнеспособный пробиотик может быть выбран из пробиотиков любого вида, которые были обсуждены в данной заявке.

Если жизнеспособный пробиотик вводят в комбинации с инактивированным пробиотиком, количество жизнеспособного пробиотика может соответствовать примерно 1×10 4 -1×10 12 колониеобразующих единиц (КОЕ) на кг веса в день. Согласно другому варианту живые пробиотики могут содержать примерно 1×10 6 -1×10 9 КОЕ на кг веса в день. Согласно еще одному варианту живые пробиотики могут содержать примерно 1×10 10 КОЕ на кг веса в день.

Согласно другому варианту изобретения по крайней мере один инактивированный пробиотик может сочетаться с одним или несколькими пребиотиками для лечения или профилактики системного или респираторного воспаления у искусственно вскармливаемых младенцев. По этому варианту приемлемым является любой пребиотик, известный из уровня техники, при условии, что его применение приводит к желаемому результату. Пребиотики, пригодные по данному изобретению, могут включать лактозу, глюко-олигосахарид, инулин, полидекстрозу, галакто-олигосахарид, фрукто-олигосахарид, изомальто-олигосахарид, олигосахариды соевых бобов, лактосахароза, ксило-олигосахарид и гентио-олигосахариды.

Согласно еще одному варианту данного изобретения грудная смесь может содержать другие активные агенты, такие как длинноцепочечные полиненасыщенные жирные кислоты (LCPUFA). Подходящие LCPUFA включают, но без ограничения, -линолевую кислоту, -линолевую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, эйкозапентановую кислоту (ЕРА), ARA и DHA. По одному из вариантов инактивированную LGG вводят в сочетании с DHA. По другому варианту инактивированную LGG вводят в сочетании с ARA. Согласно еще одному варианту инактивированную LGG вводят в сочетании с DHA и ARA. Коммерчески доступная смесь для грудных младенцев, которая содержит DHA, ARA или их сочетание, может быть дополнена инактивированной LGG и применена согласно данному изобретению. Например, Enfamil® LIPIL®, которая содержит эффективные количества DHA и ARA, является коммерчески доступной и в нее может быть добавлена инактивированная LGG, после чего ее используют согласно данному изобретению.

Согласно одному из вариантов изобретения и DHA, и ARA применяют в комбинации с по меньшей мере одним инактивированным для лечения системного воспаления у младенцев. По этому варианту весовое отношение ARA: DHA обычно составляет от примерно 1:3 до примерно 9:1. По одному из вариантов данного изобретения это отношение равно от примерно 1:2 до примерно 4:1. Согласно еще одному варианту это отношение составляет от примерно 2:3 до примерно 2:1. По одному конкретному варианту это отношение равно примерно 2:1. Согласно другому конкретному варианту настоящего изобретения это отношение составляет примерно 1:1,5. По другим вариантам оно составляет примерно 1:1,3. Согласно еще одному варианту это отношение равно примерно 1,5:1. По другому варианту это отношение равно 1,47:1.

Согласно некоторым вариантам изобретения содержание DHA составляет от примерно 0,0% до примерно 1,00% вес. в расчете на жирные кислоты.

Содержание DHA может составлять примерно 0,32% вес. Согласно некоторым вариантам содержание DHA может равняться примерно 0,33% вес. Согласно другому варианту содержание DHA может составлять примерно 0,64% вес. Согласно еще одному варианту содержание DHA может равняться примерно 0,67% вес. Согласно другому варианту содержание DHA может составлять примерно 0,96% вес. Согласно еще одному варианту содержание DHA может составлять примерно 1,00% вес.

Согласно изобретению количество ARA составляет от 0,0% до 0,67% в расчете на весовое содержание жирных кислот. По одному из вариантов содержание ARA равно примерно 0,67% вес. По другому варианту содержание ARA может составлять примерно 0,5% вес. Согласно еще одному варианту содержание DHA может быть равным от примерно 0,47% до 0,48% вес.

Эффективное количество DHA по одному из вариантов данного изобретения составляет обычно от примерно 3 мг на кг веса в день до примерно 150 мг на кг веса в день. По одному из вариантов изобретения это количество может равняться от примерно 6 мг на кг веса вдень до примерно 100 мг на кг веса в день. По другому варианту это количество равно от примерно 10 мг на кг веса в день до примерно 60 мг на кг веса в день. По еще одному варианту это количество может составлять от примерно 15 мг на кг веса в день до примерно 30 мг на кг веса в день.

Эффективное количество ARA согласно изобретению может равняться обычно от примерно 5 мг на кг веса в день до примерно 150 мг на кг веса в день. По одному из вариантов данного изобретения это количество может составлять от примерно 10 мг на кг веса в день до примерно 120 мг на кг веса в день. По другому варианту это количество меняется от примерно 15 мг на кг веса в день до примерно 90 мг на кг веса в день. Согласно еще одному варианту это количество меняется от примерно 20 мг на кг веса в день до примерно 60 мг на кг веса в день.

Количество DHA в смесях для грудных детей согласно изобретению обычно колеблется от примерно 5 мг/100 ккал до примерно 80 мг/100 ккал. По одному из вариантов данного изобретения количество DHA составляет от примерно 10 мг/100 ккал до примерно 50 мг/ккал; и согласно еще одному варианту оно равно от примерно 15 мг/100 ккал до примерно 20 мг/100 ккал. Согласно конкретному варианту данного изобретения количество DHA равно около 17 мг/100 ккал.

Количество ARA в смесях для грудных детей, используемых по данному изобретению, обычно меняется от примерно 10 мг/100 ккал до примерно 100 мг/100 ккал. По одному из вариантов данного изобретения количество ARA составляет от примерно 15 мг/100 ккал до примерно 70 мг/100 ккал. По другому варианту это количество может равняться от примерно 20 мг/100 ккал до примерно 40 мг/100 ккал. Согласно конкретному варианту данного изобретения количество ARA равно примерно 34 мг/100 ккал.

Смесь для грудных детей, дополненная маслами, содержащими DHA и ARA, применяемая по данному изобретению, может быть приготовлена стандартными методами, известными из уровня техники. Например, масла могут быть добавлены к смеси путем замены эквивалентного количества, масла, такого как подсолнечное масло с высоким содержанием олеинового компонента, обычно содержащегося в смеси. Другим примером можно считать добавление масел, содержащих DHA и ARA, к смеси путем замены эквивалентного количества остального количества всей смеси жиров без DHA и ARA, обычно содержащейся в смеси.

Источником DHA и ARA, если она применяются, может быть любой источник, известный из уровня техники, такой как осветительное масло, рыбий жир, масла из одноклеточных культур, липид яичного желтка, липид из мозга и т.п. Согласно некоторым вариантам источником DHA и ARA могут быть масло Мартека (Martec), DHASCO® или их вариации. DHA и ARA могут быть в природном виде, при условии, что остальная часть источника LCPUFA не приводит к значительному вредному воздействию на грудного ребенка. Альтернативно, DHA и ARA могут применяться в рафинированном виде.

По одному из вариантов изобретения источником DHA и ARA служат масла из одноклеточных культур, описанные, например, в патентах США 5374567, 5550156 и 5397591, содержание которых включено полностью в качестве ссылок в данную заявку. Однако данное изобретение не ограничивается только такими маслами.

По одному из вариантов источник LCPUFA, которая содержит ЕРА, применяется в комбинации с по меньшей мере одним инактивированным пробиотиком. По другому варианту LCPUFA не содержит практически ЕРА. Например, по одному из вариантов смесь для грудных детей содержит менее примерно 16 мг ЕРА/100 ккал; еще по одному варианту - менее примерно 5 мг ЕРА/100 ккал. Согласно одному конкретному варианту этот источник практически не содержит ЕРА. По другому варианту он не содержит даже следов ЕРА.

Считают, что комбинация по меньшей мере одного инактивированного пробиотика с DHA и/или ARA обеспечивает появление дополнительных или синергических эффектов в отношении противовоспалительных свойств составов, содержащих эти агенты. Не ограничиваясь какой-либо определенной теорией, можно считать, что инактивированные пробиотики усиливают противовоспалительные свойства, частично предотвращая убиквитинирование ингибиторного-kB (IkB). В нормальной клетке IkB связывает ядерный фактор - kB (NFkB) в цитоплазме. Когда убиквитинирование IkB происходит, высвобождается NFkB, который попадает в ядро клетки и активирует гены, которые являются ответственными за воспалительную ответную реакцию. Полагают, что это специфическое взаимодействие и возникающее в результате изменение в экспрессии генов вовлечены в модулирование воспаления. Считается, что инактивированные пробиотики предотвращают убиквитинирование IkB, тем самым препятствуя высвобождению NFkB и уменьшая или предотвращая воспаление.

В противоположность этому, омега-3 жирные кислоты, такие как DHA, как полагают, способствуют противовоспалительному действию за счет изменения продуцирования медиаторов на основе жирных кислот, широко известных как эйкозаноиды. Омега-6 жирные кислоты, такие как ARA, которые содержатся в фосфолипидном пуле клеточных мембран, высвобождаются во время воспалительной ответной реакции и освобождают пул свободной ARA. Этот пул ARA затем действует на два класса ферментов, известных как липоксигеназы и циклооксигеназы, которые продуцируют специфический круг эйкозаноидов, включая 2-серии простаноидов, таких как простагландины, тромбоксаны и лейкотриены.

Эти экзозаноиды, как известно, оказывают очень сильное провоспалительное действие во многих типах клеток и органов. Известно, что пищевые продукты, богатые омега-3 жирными кислотами, такими как ЕРА и DHA, являются конкурентами омега-6 жирных кислот на нескольких стадиях процесса и поэтому являются модераторами провоспалительного действия ARA. Например омега-3 жирные кислоты модулируют удлинение омега-6 жирных кислот до ARA, введение ARA в фосфолипидный пул клеточных мембран и продуцирование провоспалительных эйкозаноидов из ARA. Следовательно, комбинация DHA и ARA обеспечивает выраженное, но дополнительное действие на ослабление воспалительной ответной реакции во многих тканях.

Кроме того, согласно некоторым вариантам изобретения жизнеспособные и инактивированные пробиотики вводятся в комбинации друг с другом. Полагают, что комбинация жизнеспособных и инактивированных пробиотиков приводит к появлению дополнительных или синергических эффектов, относящихся к противовоспалительным свойствам составов, содержащих эти агенты. Не желая ограничиваться какой-либо теорией, можно считать, что жизнеспособные пробиотики оказывают противовоспалительно действие, отчасти за счет взаимодействия со специфичными рецепторами, известными как толл-подобные рецепторы (TLRs), на поверхности специфичных иммунных клеток. Непосредственное или косвенное взаимодействие между жизнеспособными пробиотиками и этими рецепторами инициирует каскад внутриклеточной сигнальной трансдукции, который приводит к изменению экспрессии генов в этих целевых клетках. Считают, что именно это специфическое взаимодействие и получающееся в результате изменение в экспрессии генов и других клеточных эффектов вовлечены в модуляцию воспаления. Таким образом, вследствие того, что как полагают, жизнеспособные и инактивированные пробиотики действуют по разным механизмам, можно считать, что комбинация этих компонентов обеспечивает появление дополнительного или синергического противовоспалительного действия.

Согласно некоторым вариантам данного изобретения субъект нуждается в лечении, уменьшении или профилактике системного воспаления. Субъект может входить в группу людей, которые рискуют приобрести системное воспаление вследствие генетического предрасположения, питания, стиля жизни, наличия болезней, расстройств и т.п. Например, недоношенный младенец или младенец с угнетенным приоритетом может заболеть системным воспалением и, следовательно, может нуждаться в таких лечении, уменьшении или профилактике системного воспаления.

Согласно некоторым вариантам инактивированный пробиотик можно вводить младенцу или ребенку для предотвращения, лечения или уменьшения системного воспаления. По одному из вариантов младенцу может быть менее одного года. По другому варианту возраст ребенка может составлять от одного до шести лет. Еще по одному варианту ребенку может быть от семи до двенадцати лет.

По одному из вариантов данного изобретения субъектом является младенец, получающий искусственное питание. По другому варианту он получает искусственное питание с момента рождения. По другому варианту младенца кормит грудью мать с момента рождения до возраста менее одного года и затем получает искусственное питание и с этого момента начинается добавление инактивированного пробиотика.

Согласно конкретному варианту данного изобретения способ включает лечение или профилактику системного воспаления у недоношенного младенца, получающего искусственное питание. Согласно этому способу инактивированный пробиотик вводят недоношенному ребенку в виде молочной смеси или в другом подходящем виде. Кроме того, если желательно, инактивированный пробиотик можно вводить недоношенному ребенку в комбинации с DHA, ARA и/или одним или несколькими жизнеспособными пробиотиками с целью получения возможно синергического противовоспалительного эффекта.

Согласно способу по данному изобретению инактивированный пробиотик уменьшает или предотвращает системное высвобождение одного или более провоспалительных цитокинов или хемокинов. Применяемые по изобретению "провоспалительные" цитокины или хемокины включают такие агенты, которые, как известно, участвуют в ап-регуляции воспалительных реакций. Примеры включают, но без ограничения, TNF- , IL-1 , IL-6, IL-8, IL-18 и GRO/KC.

Хемокины представляют собой группу цитокинов, которые обеспечивают миграцию лейкоцитов из крови в ткани в месте воспаления. При образовании хемокинов в большом количестве они могут приводить к повреждению здоровой ткани. Рост-связанный онкоген (GRO/KC) является хемокином, который направляет иммунные клетки в район воспаления. Он является человеческим дубликатом крысиного цитокин-индуцированного нейтрофильного хемоаттрактанта (CINC-1) и функционально относится к семейству интерлейкина-8.

Согласно еще одному варианту изобретения инактивированные пробиотики, как было показано, ингибируют транслокацию ядерного фактора-kB (NFkB). NFkB представляет собой первичный фактор транскрипции, обнаруженный во всех видах клеток, который, как считается, играет важную роль в начале воспаления. В большинстве клеток NF-kB находится в виде латентного, неактивного ингибиторного комплекса, связанного с kB, в цитоплазме. Когда клетка получает любой из множества внеклеточных сигналов, например, от цитокинов, бактериальных антигенов или свободных радикалов, NF-kB быстро входит в ядро и активирует гены, которые являются ответственными за воспалительную ответную реакцию. Было показано, что ингибирование NFkB в начале воспаления приводит к уменьшению воспалительной ответной реакции. Lawrence, et al., Possible New Role for NFkB in the Resolution of Inflammation, Nature Med. 7:1291 (2001). Таким образом, ингибирование NFkB путем добавления инактивированного пробиотика согласно данному изобретению способствует уменьшению или предотвращению системного воспаления.

Как будет видно из примеров, было показано, что инактивированные пробиотики уменьшают системное воспаление у младенцев с искусственным питанием. Уровни CINC-1 и различных цитокинов у младенцев, получающих искусственное питание, снижались до величин, похожих на соответствующие величины у младенцев, вскармливаемых матерью, с добавлением инактивированных пробиотиков.

Из примеров будет видно, что инактивированные пробиотики значительно снижают продуцирование EL-8, уменьшают транслокацию NF-kB и увеличивают продуцирование IkB в кишечном эпителии. Изобретатели неожиданно обнаружили, что инактивированные пробиотики дополнительно предотвращают убиквитинирование IkB в отличие от жизнеспособных пробиотиков.

Следующие ниже примеры описывают различные варианты данного изобретения. Другие варианты в объеме данного изобретения будут очевидны специалистам в данной области из рассмотрения описания или при осуществлении описанного в данной заявке изобретения. Данное описание вместе с примерами следует рассматривать только как приводимое в качестве примера, объем этого изобретения определяется формулой изобретения, следующей за примерами. В примерах все проценты даны как весовые, если не указано иное.

Пример 1

Этот пример иллюстрирует влияние добавки инактивированного пробиотика на системное воспаление у новорожденных крысят, получающих искусственное питание. В качестве пробиотика применяли в этом примере LGG.

Материалы и способы

В двух отдельных опытах детеныши крыс Sprague-Dawley (Taconic, Germantown, NY) произвольно разделили на четыре группы по пять крыс в группе: контрольная группа (нет LPS или LGG в пище), группа, получавшая LPS, группа, получавшая LPS плюс живая LGG, и группа, получавшая LPS плюс инактивированную LGG. Детеныши крыс того же возраста, вскармливаемые матерью, использовались в качестве контрольных животных. Кормление через гастростомические трубки с применением "pup-in-the-cup" модели "один детеныш на кормушку" начинали на 7-й день жизни детенышей крыс. Питающие гастростомические трубки изготавливали из полиэтиленовых трубок (секции по 24 см), которые вводили в желудок крысят. Введение гастростомических трубок осуществляли под анестезией изофураном. Шприцы-насосы с таймерами были соединены с питающими трубками, кормление крысят проводили в течение первых 20 мин каждый час со скоростью, зависящей от веса.

Во время 2-дневного периода акклиматизации детенышей крыс кормили заменителем крысиного молока (RMS) при помощи гастростомических трубок. По окончании периода акклиматизации детенышам в одной из групп, получавших RMS, вводили добавку, равную 1×10 8 клеточных эквивалентов на кг веса в день инактивированной LGG. LGG была инактивирована путем тепловой обработки, убивающей бактерии. Детенышам второй группы давали живую LGG в количестве 1×10 8 КОЕ на г веса в день. Крысятам в третьей группе добавляли в корм RMS без LGG любого вида. Такое кормление всех крысят продолжали в течение 6 дн. Все животные с гастростомическими трубками получали одинаковое количество жиров и углеводов и белок в количестве, требующемся для нормального роста. Крысята того же возраста, вскармливаемые матерью, использовались как контрольные животные.

Липополисахарид (LPS) из Escherichia coli 0127: В8 (LPS; Sigma, St. Louis, МО) растворяли в воде с концентрацией 2 мг/мл при встряхивании. Крысятам, вскармливаемым через гастростомические трубки, давали от 0,25 до 0,5 мг/кг/день LPS через гастростомическую трубку, начиная через 2 дня после начала искусственного вскармливания. Детенышам крыс давали LPS в течение 6 дн. Эта доза была определена в ходе пилотных исследований, она приводила к временной дрожи, пилоэрекции и небольшому увеличению веса, но не была связана со значительным увеличением смертности в течение 6 дней.

В конце 6-дневного периода детенышей крыс умерщвляли сверхдозой натриевой соли пентобарбитала. Удаляли тонкую кишку и разделяли ее на три части: подвздошную кишку, тощую кишку и 12-перстную кишку, хранили их при температуре -80°С для проведения ферментного анализа и ELISA или фиксировали в 10% нейтральном буферированном растворе формалина для анализа морфологии кишечника. Легкие, печень и плазму хранили при температуре -80°С для проведения ферментного анализа и ELISA.

Для анализа изменения веса применяли программу Sigmastat (SPSS, Chicago, IL) для обработки статистических данных, ELISA применяли для определения CINC-1, а также результатов мультиплексного анализа цитокинов/хемокинов. Все данные были средними ± стандартное отклонение (SD). Односторонний анализ вариантности между группами (ANOVA) применяли для определения наличия значительной разницы среди всех групп животных. В тех случаях, когда согласно ANOVA уровень значимость p был<0,05, применяли метод Holm-Sidak для попарного сравнения результатов.

Результаты и обсуждение

Рост

Этот пример иллюстрирует влияние введения пробиотика на рост детенышей крыс после кормления при помощи гастростомических трубок. Детенышей крыс взвешивали ежедневно после кормления и сравнивали с животными, вскармливаемыми матерью. Последние росли гораздо быстрее, чем детеныши, которым давали LPS при помощи гастростомических трубок. Добавление к пище живого или инактивированного пробиотика и LPS не приводило к увеличению веса крыс.

CINC-1

Жизнеспособный и инактивированный пробиотик приводили к снижению уровня CINC-1. Уровень CINC-1 определяли методом иммунометрического анализа TiterZyme Enzyme с применением набора для определения рост-ассоциированного онкогена / CINC-1 (Assay Design, Ann Arbor, MI). Образцы тканей выделяли из клеточных экстрактов целых тканей в печени, кишечнике, плазме и легких. Определяли абсорбцию при длине волны 450 нм и рассчитывали концентрацию, применяя уравнение, выведенное из стандартной линейной кривой.

Как показано на Фиг.1-3, результаты ELISA свидетельствовали, что LPS приводил к повышению уровней CINC-1 в печени, легких и плазме. Как живая, так и инактивированная LGG снижала LPS-индуцированное образование CINC-1 в печени (Фиг.1) и в плазме (Фиг.2) (p<0,05), наблюдалась также тенденция к изменению (р=0,09) в легких (Фиг.3).

Фиг.1 показывает, что добавка жизнеспособного пробиотика приводила к снижению уровня CINC-1 в печени примерно на 50% по сравнению с группой, получавшей LPS. Однако инактивированная LGG понижала уровень CINC-1 в печени примерно на 75% по сравнению с этим показателем у животных, получавших LPS. Таким образом, инактивированный пробиотик проявляет значительно большее действие, понижая уровень CINC-1 в печени, по сравнению с жизнеспособными пробиотиками, что свидетельствует о более сильном противовоспалительном действии.

Точно так же Фиг.2 иллюстрирует более низкий уровень CINC-1 в плазме у животных в группе, получавшей инактивированный пробиотик по сравнению с животными, которым давали живую LGG. В легких и живой, и инактивированный пробиотики, понижали уровень CINC-1 в одинаковой степени (Фиг.3).

GRO/KC

Как показано на Фиг.4 и 5, данные мультиплексного анализа цитокинового профиля свидетельствовали о похожем уменьшении уровня GRO/KC в печени и в легких. Инактивированная LGG снижала уровень GRO/KC в большей степени, чем живая LGG в печени, что свидетельствовало о более сильном противовоспалительном действии (Фиг.4). И живой, и инактивированный пробиотики снижали уровень GRO/KC в легких в одинаковой степени (Фиг.5).

Уменьшенное содержание CINC-1 и GRO/KC, наблюдаемое в легких в данном опыте, показало, что противовоспалительное действие инактивированных пробиотиков распространяется на периферические органы. Таким образом, противовоспалительное действие инактивированных пробиотиков в действительности является системным по природе.

В печени при введении добавки инактивированных пробиотиков уровень CINC-1 снижался до величины, которая была ниже, чем этот показатель у крысят, вскармливаемых материнским молоком. В легких и в плазме инактивированные пробиотики приводили к снижению уровня CINC-1 до величины, близкой к этому показателю у крысят, вскармливаемых материнским молоком. Эти результаты показывают, что инактивированные пробиотики обладают способностью снижать системное воспаление у крысят, получавших искусственную смесь, до уровня, похожего на соответствующую величину у детенышей крыс, вскармливаемых материнским молоком, а в некоторых случаях этот показатель был ниже.

Цитокины и хемокины

Жизнеспособные и инактивированные пробиотики также снижали уровень цитокинов и хемокинов. Наборы для мультиплексного анализа были куплены в LINCO Research Inc. (St. Charles, МО, USA). Профиль цитокинов/хемокинов анализировали при помощи набора, который включая: гранулоцит - мкакрофаговый колониестимулирующий фактор (GMCSF), интерферон-гамма (IFN- ), интерлейкин-1 (IL-1 ). IL-1 , IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-18, моноцитарный хемоаттрактантный протеин-1 (MCP-1), GRO/KC (крысиный CINC-1) и TNF- . Мультиплексный анализ проводили в соответствии с инструкциями производителя. Получали стандартные кривые для каждого цитокина/хемокина с применением стандартных концентраций от производителей. Необработанные данные (средняя интенсивность флуоресценции) анализировались при помощи программы MasterPlex Quantitation Software (MiraiBio, Inc., Alameda, CA, USA) для получения величин концентрации.

Как видно из Фиг.6, уровень IL-1 в печени был значительно выше у животных, получавших LPS через гастростомические трубки, чем у контрольных животных. И жизнеспособный, и инактивированный пробиотики значительно снижали вызванное введением LPS повышение содержания IL-1 . В действительнбости, инактивированные пробиотики уменьшали уровень IL-1 в большей степени, чем жизнеспособные пробиотики. Инактивированные пробиотики понижали экспрессию IL-1 до уровня, величина которого была похожа на величину соответствующего показателя у контрольных животных. Таким образом, эта часть опыта также иллюстрирует системное противовоспалительное действие инактивированных пробиотиков.

В заключение можно указать, что эти результаты свидетельствуют о том, что добавка инактивированного пробиотика снижает системное воспаление. Кроме того, эти результаты показывают, что инактивированные пробиотики уменьшают системное воспаление у новорожденных, получающих искусственное питание, до величины, похожей на этот показатель у новорожденных, получающих материнское молоко. Это иллюстрируется результатами, описанными в данной заявке, путем сравнения животных, получавших инактивированный пробиотик, и животных, питавшихся исключительно материнским молоком. В нескольких случаях введение инактивированных пробиотиков приводит к воспалительной ответной реакции, которая очень похожа на реакцию у животных в группе, получавшей материнское молоко.

Пример 2

Этот пример также показывает влияние инактивированного пробиотика на воспаление у новорожденных детенышей крыс, получавших искусственное питание.

Кишечные эпителиальные клетки предварительно обрабатывали живой или УФ-инактивированной LGG в концентрации 1×10 8 КОЕ/л и затем стимулировали флагеллином (500 мг/мл). Образование IL-8 анализировали методом ELISA. Степень экспрессии IkB и убиквитинированного IkB (UbQ-IkB) определяли методом вестерн-блоттинга и методом иммуноосаждения. Локализацию NFkB оценивали методом иммунофлуоресцентного окрашивания.

Во время опыта флагеллин индуцировал значительное увеличение продуцирования IL-8 в клетках (p<0,05). Клетки, предварительно обработанные или живой LGG, или ЕА-инактивированной LGG и затем стимулированные флагеллином, показали, что произошло значительное (p<0,05) изменение содержания IL-8, NFkB-ядерной транслокации, IkB и UbQ-DcB. Результаты приведены в Таблице 1. Стрелки, направленные вверх, показывают увеличение параметра, в то время как стрелки, направленные вниз, показывают уменьшение параметра.

Таблица 1.

Изменение экспрессии, вызыванные добавками живой или инактивированной LGG

IL-8

NFkB транслокация

IkB

UbQ-IkB

Один флагеллин

Жизнеспособная LGG

Инактивированная LGG

Как показывает Таблица 1, флагеллин индуцировал значительное увеличение образования IL-8 в эпителиальных клетках кишечника (p<0,05). Продуцирование IL-8 в значительной степени подавлялось в присутствии как живой, так и инактивированной LGG. Кроме того, клетки, стимулированные флагеллином, характеризовались NFkB-ядерной транслокацией, что предотвращалось путем добавления как живой, так и инактивированной LGG. Флагеллин снижал образование IkB, но этот эффект становился обратным при предварительной обработке клеток как живой, так и инактивированной LGG (p<0,05). Флагеллин и живая LGG увеличивали уровень UbQ-IkB (p<0,05), в то время как инактивированная LGG снижала уровень UbQ-IkB.

Этот пример показывает, что и жизнеспособный, и инактивированный пробиотики являются эффективными при уменьшении образования IL-8, провоспалительного цитокина, и тем самым оказывают противовоспалительное действие. Поскольку флагеллин и жизнеспособный пробиотик увеличивали образование UbQ-IkB, a инактивированный пробиотик снижал образование UbQ-IkB, инактивированный пробиотик, по всей вероятности, действует по механизму, который предотвращает убиквитинирование IkB, в то время как жизнеспособные пробиотики, по всей видимости, не оказывают такого воздействия. Таким образом, этот пример также показывает, что и жизнеспособный, и инактивированный пробиотики, по-видимому, действуют по разным механизмам и могут характеризоваться синергическим эффектом при совместном введении.

Данное изобретение, как было показано, приводит к уменьшению воспаления в печени, плазме и в легких. Так как данное изобретение может быть использовано для ослабления воспаления, оно может также предотвращать возникновение опасных инфекций или болезней.

Все ссылки, цитировавшиеся в данной заявке, включая без ограничения все сообщения, публикации, патенты, заявки на патент, презентации, тексты, рукописи, брошюры, книги, интернет-сообщения, статьи в журналах, периодические издания и т.п., включены полностью в качестве ссылок в данную заявку. Обсуждение этих ссылок предназначено только для обобщения утверждений их автором и не сделано ни одного заявления, что какая-либо ссылка относится к предшествующему уровню техники. Заявители сохраняют за собой право подвергнуть сомнению точность и уместность процитированных ссылок.

Эти и другие модификации и изменения данного изобретения могут быть осуществлены специалистом в данной области не выходя за рамки и объем данного изобретения, охарактеризованного в прилагаемой формуле изобретения. Кроме того, следует иметь в виду, что аспекты различных вариантов данного изобретения могут быть изменены как полностью, так и частично. Далее, специалистам очевидно, что изложенное выше описание может быть только примером и не ограничивает данное изобретение, описанное в формуле изобретения. Следовательно, замысел и объем настоящего изобретения, описанные в формуле изобретения, не должны ограничиваться описанием предпочтительных вариантов, содержащихся в нем.

Формула изобретения

1. Питательный состав для ребенка или младенца для профилактики или уменьшения системного воспаления, включающий:

источник липидов;

источник углеводов;

источник белка;

витамины;

минеральные вещества; и

по меньшей мере, один инактивированный тепловой обработкой Lactobacillus rhamnosus GG, при этом питательный состав обеспечивает доставку ребенку или младенцу от примерно 1·10 4 до примерно 1·10 10 клеточных эквивалентов инактивированного Lactobacillus rhamnosus GG на кг веса в день.

2. Питательный состав по п.1, обеспечивающий доставку от примерно 1·10 5 до примерно 1·10 9 клеточных эквивалентов на кг веса в день.

3. Питательный состав по п.1, обеспечивающий доставку примерно 1·10 9 клеточных эквивалентов на кг веса в день.

4. Питательный состав по п.1, дополнительно включающий, по меньшей мере, один жизнеспособный пробиотик.

5. Питательный состав по п.4, в котором жизнеспособный пробиотик выбран из группы, состоящей из Lactobacillus rhamnosus GG (LGG), В. animalis ssp.lactis (BB-12®) и их комбинаций.

6. Питательный состав по п.1, дополнительно включающий, по меньшей мере, одну длинноцепочечную полиненасыщенную жирную кислоту.

7. Питательный состав по п.6, в котором длинноцепочечная полиненасыщенная жирная кислота выбрана из группы, состоящей из докозагексаеновой кислоты (DHA), арахидоновой кислоты (ARA) и их комбинаций.

8. Способ лечения, профилактики или уменьшения воспаления у субъекта, включающий введение субъекту питательного состава по п.1.

9. Способ по п.8, в котором субъект представляет собой младенца.

10. Способ по п.8, в котором субъект представляет собой ребенка.

РИСУНКИ