Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
Патент на изобретение №2470656

(19)

RU

(11)

2470656

(13)

C1

(51) МПК A61K36/28 (2006.01)

A61P37/02 (2006.01)

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ Статус: по данным на 27.12.2012 - действует Пошлина:

(21), (22) Заявка: 2011142349/15, 19.10.2011

(24) Дата начала отсчета срока действия патента:

19.10.2011

Приоритет(ы):

(22) Дата подачи заявки: 19.10.2011

(45) Опубликовано: 27.12.2012

(56) Список документов, цитированных в отчете о

поиске: Данилец М.Г. и др. Влияние полисахаридов из растительного сырья на Th1 зависимый иммунный ответ. - Экспериментальная и клиническая фармакология, 2010, т.73, 6, с.19-22. Данилец М.Г. и др. Роль Р38 и Р13К в активации макрофагов водорастворимыми полисахаридами календулы и клевера. - Сибирский медицинский журнал, 2008, т.23, 3, с.92.Хаитов P.M. и др. Иммуномодуляторы: механизмы действия и клиническое применение. - Иммунология, 2003, 3, с.199. RU 2329821 C1, 27.07.2008.

Адрес для переписки:

634028, г.Томск, пр. Ленина, 3, НИИ фармакологии СО РАМН, патентоведу Н.Л. Малюгиной

(72) Автор(ы):

Данилец Марина Григорьевна (RU),

Лигачева Анастасия Александровна (RU),

Трофимова Евгения Сергеевна (RU),

Бельская Наталия Витальевна (RU),

Бельский Юрий Павлович (RU),

Учасова Евгения Геннадьевна (RU),

Иванова Алена Николаевна (RU),

Агафонов Владимир Иванович (RU),

Чурин Алексей Александрович (RU),

Гурьев Артем Михайлович (RU),

Белоусов Михаил Валерьевич (RU),

Юсубов Мехман Сулейманович (RU)

(73) Патентообладатель(и):

Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт фармакологии Сибирского отделения РАМН (RU),

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Сибирский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития России" (RU),

Общество с ограниченной ответственностью "Инновационные коммуникации" (RU)

(54) СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, и может быть использовано для коррекции нарушений в иммунной системе при патологических состояниях, связанных с недостаточностью Тh1 - зависимого типа иммунного ответа (хронические, вялотекущие и рецидивирующие инфекционные, а также онкологические заболевания). Водорастворимые полисахариды с молекулярной массой 310 и 490 кДа, выделенные из фармакопейного сырья календулы лекарственной, являются активаторами воспалительных свойств макрофагов и Th1 - зависимого типа иммунного ответа и могут расширить арсенал средств растительного происхождения, способных стимулировать иммунный ответ при инфекционно-воспалительных процессах и онкологической болезни. 4 табл., 2 пр.

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, и может быть использовано для коррекции нарушений в иммунной системе при патологических состояниях, связанных с недостаточностью Th1 - зависимого типа иммунного ответа (хронические, вялотекущие и рецидивирующие инфекционные, а также онкологические заболевания).

В настоящее время в терапии заболеваний, обусловленных недостаточностью Th1 и имеющих своей мишенью макрофагальные клетки используются препараты на основе нуклеиновых кислот (натрия дезоксирибонуклеат, натрия нуклеинат, оксиметилурацил), препараты, содержащие микроорганизмы или их производные (имудон, ИРС 19, рибомунил) [4]. Наиболее близким (базовым) препаратом является ликопид, поскольку в основе механизма его иммуномодулирующего действия лежит активация антиген-презентирующих клеток и фагоцитов (макрофаги, нейтрофилы) [3]. Ликопид активирует клетки моноцитарно-макрофагального звена, стимулируя продукцию ими воспалительных цитокинов.

Задачей данного изобретения является расширение арсенала иммуно-модулирующих средств растительного происхождения, повышение их эффективности путем избирательной стимуляции продукции макрофагами ин-терлейкина-12 и фактора некроза опухоли-альфа.

Поставленная задача решается путем применения водорастворимых полисахаридов с молекулярной массой 310 и 490 кДа, полученных из фармакопейного сырья календулы лекарственной, в качестве стимулятора продукции макрофагами ИЛ-12 и TNF- , следствием чего является активация Th1 - зависимого типа иммунного ответа.

Принципиально новым в предлагаемом изобретении является применение в качестве иммуномодулирующего средства водорастворимых полиса-харидов с молекулярной массой 310 и 490 кДа, выделенных из фармакопейного сырья календулы лекарственной.

Новое свойство водорастворимых полисахаридов с молекулярной массой 310 и 490 кДа, полученных из фармакопейного сырья календулы лекарственной, было обнаружено в результате экспериментальных исследований.

Доказано, что для эффективного противомикробного и противоопухолевого ответа необходимо, чтобы иммунная система находилась в определенном функциональном состоянии, описываемом термином «поляризация Th1 типа». Маркерной чертой данного типа поляризации является, во-первых, преобладание характерного набора цитокинов, прежде всего, интерферон-гамма, интерлейкин-2, а во-вторых, проявление типичных функций - участие в реакциях гиперчувствительности замедленного типа, переключение продукции В-лимфоцитами антител класса IgG2a, защита от внутриклеточных патогенов, элиминация опухолевых клеток.

В настоящий момент установлено, что уникальным цитокином, вызывающим дифференцировку наивных Т-лимфоцитов в Т-хелперы 1 типа (Th1), является интерлейкин-12 (ИЛ-12). Он является ключевым в индукции образования цитотоксических Т-лимфоцитов, активации макрофагов, подавлении синтеза иммуноглобулинов G1 и Е, в развитии органоспецифического аутоиммунитета, резистентности к бактериальной и вирусной инфекции. Основными клетками-продуцентами ИЛ-12 являются дендритные клетки и макрофаги. Эти же клетки вырабатывают и противоположный по функциональным свойствам цитокин - интерлейкин-10, который подавляет Th1, подавляет воспаление и создает условия для развития толерантности на антиген. Баланс этих двух цитокинов (интерлейкина-12 и интерлейкина-10) является ключевым для направления поляризации по Th1 или Th2 типу.

Кроме ИЛ-12 фактор некроза опухоли альфа (TNF- ) является важнейшим провоспалительным цитокином млекопитающих, который вырабатывают макрофаги в раннюю фазу противомикробного ответа. Таким образом, ИЛ-12 и TNF- , которые вырабатываются макрофагами, являются необходимым условием эффективного противомикробного и противоопухолевого иммунитета [1].

Для стимулирования активности макрофагов мы предлагаем использовать водорастворимые полисахариды с молекулярной массой 310 и 490 кДа, полученные из фармакопейного сырья календулы лекарственной, поскольку известно, что полисахариды могут связываться практически со всеми рецепторами антиген-презентирующих клеток [5]. Кроме того, в ряде работ показано, что полисахариды растительного или микробного происхождения могут оказывать влияние на поляризацию лимфоцитов через соответствующую активацию антиген-презентирующих клеток, при этом полисахариды могут способствовать как развитию Th1-, так и Th2 - зависимого иммунного ответа.

Новое свойство полисахаридов с молекулярной массой 310 и 490 кДа явным образом не вытекает для специалиста из уровня техники и описание его не обнаружено авторами в патентной и научно-медицинской литературе. В качестве иммуномодулирующего средства водорастворимые полисахариды с молекулярной массой 310 и 490 кДа, полученные из фармакопейного сырья календулы лекарственной, можно использовать для коррекции нарушений в иммунной системе при патологических состояниях, связанных с недостаточностью Th1 - зависимого типа иммунного ответа (хронические, вялотекущие и рецидивирующие инфекционные, а также онкологические заболевания).

Таким образом, предлагаемое техническое решение соответствует критериям изобретения, а именно - «новизна», «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».

Изобретение будет понятно из следующего описания: водорастворимые полисахариды (ПС) были выделены из фармакопейного сырья календулы лекарственной (Calendula offficinalis L.). Полисахариды получены по стандартной методике следующим образом. Фармакопейное сырье измельчали и просеивали через сита с размером пор 1 и 3 мм, экстрагировали водой при перемешивании в течение 30-180 мин при нагревании на водяной бане (температура 80-100°С), при соотношении сырье:экстрагент от 1:10 до 1:50. После этого сырье с экстрагентом оставляли на время от 6 до 36 часов в прохладном месте для настаивания. Затем экстрагент отделяли от сырья фильтрованием, экстракцию повторяли вновь в тех же условиях. После фильтрации полученные извлечения объединяли и упаривали до 1/5 объема. Полисахариды осаждали добавлением к полученному раствору двукратного количества 96%-ного этанола. Выпавший осадок центрифугировали, отделяли от раствора, промывали 96% этиловым спиртом и высушивали. Полученные образцы ПС были стандартизованы по содержанию углеводов, белка и нуклеиновых кислот (табл.1).

Таблица 1

Характеристика исследуемых образцов полисахаридов {Х±m}

Название образца

Выход ПС (% от массы воздушно-сухого сырья)

Содержание в образцах:

углеводов (%)

белка (%)

нуклеиновых кислот (%)

ПС календулы

1,48±0,19

97,8±1,06

1,68±0,26

0,165±0,024

Компонентный состав и молекулярно-массовое распределение (ММР) исследуемых образцов определялись методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе Agilent 1100 со спектрофотометрическим детектором (детекция при длине волны 190 нм), разделение проводилось на эксклюзионной колонке TSK-gel GMPXL 300×7.8 mm («Supelco»), подвижная фаза - вода, 1,0 мл/мин. Молекулярная масса ПС, входящих в состав исследуемого образца, определялась по времени удерживания в соответствии с калибровочными значениями, определенными по стандартным образцам декстранов с молекулярной массой 15-20 кДа, 40 кДа, 60-90 кДа, 110 кДа, 250 кДа и 500 кДа («Sigma-Aldrich»). На спекте ВЭЖХ исследуемого образца присутствовало 2 пика, соответствующих молекулярной массе 310 и 490 кДа. Таким образом, полученое вещество представляет собой смесь двух полисахаридов с разными молекулярными массами - 310 и 490 кДа.

Эксперименты проведены на линейных мышах BA1b/с и C57BL/6 в возрасте 6-12 недель. Животные были получены из отдела экспериментальных биомоделей НИИ фармакологии СО РАМН (сертификат качества 188-05). В предварительных экспериментах было выявлено, что оптимальной суточной дозой полисахаридов, полученных из фармакопейного календулы лекарственной, для иммуномодуляции является 10 мг/кг массы тела. Все процедуры (содержание, введение исследуемых веществ, умерщвление) были проведены в соответствии с принципами Европейской конвенции о защите позвоночных животных (от 18 марта 1986 г.; Страсбург; ETS 123).

Макрофаги получали из суспензии перитонеальных клеток, для чего животных забивали дислокацией шейного отдела позвоночника, брюшную полость промывали ледяным изотоническим раствором хлорида натрия (ФР), клетки осаждали, ресуспендировали в культуральной среде и оценивали их жизнеспособность в тесте с 0,1% трипановым синим. Затем эти клетки помещали по 1,5-2,0×106/мл в пластиковые чашки Петри, культивировали 2 ч при 37°С (в атмосфере 5% CO 2 и абсолютной влажности) в среде (среда следующего состава: RPMI 1640 («Sigma») с добавлением 10% ЭТС («Hyclone»), 20 мМ HEPES («Sigma»), 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола («Sigma»), 50 мкг/мл гентамицина (РУП «Борисовский завод медицинских препаратов», Россия), 2 мМ L-глютамина («Sigma»), после чего собирали только прилипшие к пластику клетки. В экспериментах использовали суспензии, содержащие не менее 95% жизнеспособных клеток. Макрофаги (2,5-3,0×10 6 клеток/мл), полученные после прилипания, помещали в плоскодонные 96-луночные планшеты и культивировали в указанных выше условиях в присутствии полисахаридов (20 мкг/мл); 1 мкг/мл ЛПС (серотип O111-B4, «Sigma»); 10 мкг/мл мура-милдипептида (МДП) (N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглютамин, «Calbiochem»). Через 48 ч от начала культивирования собирали из лунок надосадок и замеряли в нем концентрацию цитокинов.

Количественное определение ИЛ-12 и ИЛ-10 в исследуемых супернатантах осуществляли твердофазным иммуноферментным методом при помощи тест-систем («R@D Systems», США) согласно прилагаемым протоколам.

Количественное определение TNF- , вырабатываемого мононуклеарами периферической крови здоровых доноров, взятой утром натощак из локтевой вены, осуществляли следующим образом. Жидкость для сепарации клеток «Histopaque-1077» («Sigma-Aldrich») с плотностью 1,077 помещали в пробирки, затем осторожно наслаивали цельную кровь с добавлением гепарина (10 ЕД/мл) согласно прилагаемой к реактиву инструкции. После 15-минутного центрифугирования при 400 g собирали клетки, сформировавшие кольцо в растворе. Полученные клетки трижды отмывали холодным ФР, ресуспендировали в культуральной среде и оценивали их жизнеспособность. Мононуклеары помещали в 96-луночный планшет (1×10 6 клеток/мл), продукцию монокинов стимулировали добавлением ЛПС (1 мкг/мл) и вносили изучаемые растительные полисахариды (10 мкг/мл). Через 24 ч собирали бесклеточный супернатант и определяли в нем количество TNF- твердофазным иммуноферментным методом при помощи тест-систем («Вектор-Бэст») согласно прилагаемым протоколам.

Для индукции Th1 - зависимого типа иммунного ответа животных иммунизировали эритроцитами барана, водорастворимые полисахариды вводили мышам по 10 мг/кг массы тела ежедневно внутрибрюшинно в течение 10 дней. Через 5 дней от начала введения животных иммунизировали эритроцитами барана (по 5×10 6 внутрибрюшинно при определении числа АОК и титра антител, по 1×10 8 при проведении реакции гиперчувствительности замедленного типа).

В экспериментах in vivo использовали ликопид в рекомендованной терапевтической суточной дозе 2 мг/кг, в экспериментах in vitro использовали фармакологическую субстанцию препарата «ликопид» - мурамилдипептид (МДП) (N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглютамин, «Calbiochem») в концентрации 10 мкг/мл. ПС вводили в оптимальной дозе 10 мг/кг, которую определили в предварительных экспериментах.

Влияние полисахаридов на гуморальное звено иммунитета оценивали по изменению числа антителообразующих клеток (АОК) в селезенке иммунизированных мышей [2]. Для этого животных забивали через 5 дней после иммунизации, лимфоциты получали гомогенизацией селезенок в стеклянном гомогенизаторе, после чего клеточную взвесь фильтровали через 4-слойный капрон, трижды промывали холодным изотоническим раствором хлорида натрия, ресуспендировали в 4 мл среды 199 и подсчитывали количество жизнеспособных клеток. В пробирки, предварительно нагретые до 49-53°С, вносили 0,9 мл среды культивирования (среда 199, 0,7% агар «Difco»), 0,2 мл 20%-ой взвеси эритроцитов барана, 0,2 мл взвеси спленоцитов и 0,1 мл комплемента. После ресуспендирования данной смесью заполняли камеры Горяева, помещали их во влажную камеру, инкубировали 2 ч при 37°С, затем подсчитывали зоны гемолиза при помощи светового микроскопа.

Для оценки действия исследуемого вещества на клеточное звено иммунитета использовали реакцию гиперчувствительности замедленного типа [2]. Для этого на 5-е сутки после иммунизации животным проводили вторую (разрешающую) инъекцию эритроцитов барана в подушечку задней лапы - «опытная лапа» (10 8 эритроцитов барана в 0,02 мл изотонического раствора хлорида натрия). В контрлатеральную лапу вводили 0,02 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия («контрольная лапа»). Животных забивали, обе лапки отрезали по выступу кости ниже сочленения мало- и большеберцовой кости и выше пяточного сустава. Местную воспалительную реакцию оценивали через 24 часа по разнице массы опытной и контрольной лап.

Полученные данные обрабатывали статистически с помощью программного обеспечения Statistics 6.0. Для всех выборок проверена гипотеза нормальности распределения по величине коэффициента асимметрии и коэффициента эксцесса. Для каждой выборки вычисляли среднее значение величины признака Х и ошибку средней величины m. Проверка гипотезы о равенстве средних проводилась с использованием t-критерия Стьюдента. Вычисленное значение t сравнивали с табличным при заданном уровне значимости p<0,05. Если расчетная t больше табличной, то гипотеза о равенстве средних отвергалась.

Пример 1.

Исследуемое вещество, представляющее собой смесь водорастворимых полисахаридов с молекулярной массой 310 и 490 кДа, выделенных из фармакопейного сырья календулы лекарственной, при прямом действии на макрофаги вызывало резкую эскалацию продукции ключевого цитокина, ответственного за эффективный Т-клеточный иммунный ответ, - ИЛ-12 (табл.2). При культивировании макрофагов без добавления каких-либо стимуляторов (контроль 1) не удалось обнаружить сколько-нибудь значимых количеств данного цитокина в супернатантах. При добавлении стандартного активатора макрофагов - липополисахарида из E.coli (серотип O111:B4) макрофаги начинали вырабатывать небольшое количество ИЛ-12. Мурамилдипептид (МДП, фармакологическая субстанция препарата «Ликопид») вдвое повышал ЛПС-стимулированный уровень ИЛ-12, однако изучаемая смесь полисахаридов повышала продукцию ИЛ-12 почти в 12 раз сильнее, чем ЛПС, и в 6 раз сильнее, чем мурамилдипептид. В отсутствие каких-либо стимуляторов макрофаги продуцировали незначительное количество другого цитокина - ИЛ-10. ЛПС стимулировал выработку данного цитокина в 3,2 раза, полисахариды не вызывали увеличения этого ЛПС-стимулированного уровня, а МДП, напротив, еще больше стимулировал эту продукцию - в 3,9 раза.

Все исследуемые вещества стимулировали продукцию TNF- (табл.3). ПС календулы и мурамилдипептид соизмеримо увеличили продукцию цитокина - в 1,6 раза ПС и в 2,4 раза МДП. В данных условиях эксперимента ЛПС незначительно стимулировал продукцию TNF- (с 33,8±0,8 пг/мл до 47,3±4,1 пг/мл, p<0,05).

Таким образом, экспериментально установлено, что полисахариды с молекулярной массой 310 и 490 кДа, выделенные из фармакопейного сырья календулы лекарственной, стимулируют выработку макрофагами ключевого цитокина, активирующего воспалительный ответ и развитие Th1 - зависимого иммунного ответа, - ИЛ-12, а также стимулируют продукцию макрофагами ведущего цитокина противомикробного и противоопухолевого ответа - фактора некроза опухоли-альфа. Следует отметить, что по своему ИЛ-12-стимулирующему действию изученные полисахариды значительно превосходят как ЛПС, так и мурамилдипептид (фармакологическая субстанция препарата «Ликопид»).

Таблица 2

Влияние полисахаридов с молекулярной массой 310 и 490 кДа, выделенных из фармакопейного сырья календулы лекарственной, на продукцию ИЛ-12 и ИЛ-10 перитонеальными макрофагами мыши (Х±m)

Исследуемое вещество

Концентрация ИЛ-12 (пг/мл)

Концентрация ИЛ-10 (мг/мл)

- (контроль 1)

-

0,72±0,07

- (контроль 2)

4,4±5,1

2,28±0,19*

ПС календулы (10 мкг/мл)

52,1±9,0#

2,25±0,05*

МДП (10 мкг/мл)

8,3±4,1

2,84±0,21*

Примечания: * - достоверные различия с контролем 1 (уровень цитокинов, вырабатываемый макрофагами в отсутствии каких-либо веществ), p<0,05;

# - достоверные различия с контролем 2 (уровень цитокинов, вырабатываемый макрофагами в присутствии ЛПС), p<0,05.

Таблица 3

Влияние полисахаридов с молекулярной массой 310 и 490 кДа, выделенных из фармакопейного сырья календулы лекарственной, на ЛПС-стимулированную продукцию TNF- мононуклеарами периферической крови здоровых доноров (Х±m)

Исследуемое вещество

Концентрация TNF-a (пг/мл)

- (контроль 1)

33,8±0,8

-(контроль 2)

47,3±4,1

ПС календулы (10 мкг/мл)

76,8±9,4*#

МДП мкг/мл)

115,5±6,9*#

Примечания: * - достоверные различия с контролем 1 (уровень TNF- , вырабатываемый макрофагами в отсутствии каких-либо веществ), p<0,05;

# - достоверные различия с контролем 2 (уровень TNF- , вырабатываемый макрофагами в присутствии ЛПС), p<0,05.

Пример 2.

Курсовое введение смеси водорастворимых полисахаридов с молекулярной массой 310 и 490 кДа, выделенных из фармакопейного сырья календулы лекарственной, животным на фоне развития у них Th1 - зависимого иммунного ответа, индуцированного введением эритроцитов барана, оказывало стимулирующее действие на гуморальный ответ, индуцированный эритроцитами барана (табл.4). Абсолютное количество АОК после курсового введения изучаемых веществ возрастало: в 2,9 раза (ПС календулы) и в 1,8 раза (ликопид).

Таблица 4

Влияние полисахаридов с молекулярной массой 310 и 490 кДа, выделенные из фармакопейного сырья календулы лекарственной, на количество антителообразующих клеток (АОК) в селезенках иммунизированных мышей (Х±m)

Исследуемое вещество

Группа

Число АОК (10 3 /селезенку)

ПС календулы

контроль

22,3±8,5

опыт

64,3±12,3*

Ликопид

контроль

36,7±6,0

опыт

66,9±9,3*

Примечание: * - различия показателя с контролем достоверны, p<0,05.

Таким образом, экспериментально установлено, что полисахариды с молекулярной массой 310 и 490 кДа, выделенные из фармакопейного сырья календулы лекарственной, стимулируют протекание иммунного ответа, вызванного эритроцитами барана, а следовательно, являются активаторами Th1 типа иммунного ответа.

Водорастворимые полисахариды с молекулярной массой 310 и 490 кДа, выделенные из фармакопейного сырья календулы лекарственной, являются активаторами воспалительных свойств макрофагов и Th1 - зависимого типа иммунного ответа и могут расширить арсенал средств растительного происхождения, способных стимулировать иммунный ответ при инфекционно-воспалительных процессах и онкологической болезни.

Литература

1. Ма X. TNF- and IL-12: a balancing act in macrophage functioning. // Microbes and Infection. 2001. Vol.3. P. 121-129.

2. Хаитов P.M., Гущин И.С., Пинегин Б.В., Зебрев А.И. Экспериментальное изучение иммунотропной активности фармакологических препаратов (методические рекомендации) // Ведомости Фармакологического Комитета. 1999. 1. С.31-36.

3. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Иммуномодуляторы: механизм действия и клиническое применение // Иммунология. 2003. 3. С.199.

4. Энциклопедия лекарств. 2004. 11. Изд-во ООО «РЛС-2004». С.1081-1082.

5. Schepetkin I.A., Quinn M.T. Botanical polysaccharides: macrophage immunomodulation and therapeutic potential // Int. Immunopharmacol. 2006. Vol.6, 3. P.317-733.

Формула изобретения

Применение смеси водорастворимых полисахаридов с молекулярной массой 310 и 490 кДа, выделенных из фармакопейного сырья календулы лекарственной, в качестве средства, обладающего иммуномодулирующей активностью, стимулирующего Th1 - зависимый тип иммунного ответа.