Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
Патент на изобретение №2472794

(19)

RU

(11)

2472794

(13)

C1

(51) МПК C07D487/04 (2006.01)

A61P39/06 (2006.01)

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ Статус: по данным на 17.01.2013 - нет данных Пошлина:

(21), (22) Заявка: 2011121184/04, 25.05.2011

(24) Дата начала отсчета срока действия патента:

25.05.2011

Приоритет(ы):

(22) Дата подачи заявки: 25.05.2011

(45) Опубликовано: 20.01.2013

(56) Список документов, цитированных в отчете о

поиске: RU 2384579 C2, 20.03.2010. Tetrahedron Letters, v.37, 21, 3671-3674.

Адрес для переписки:

414025, г.Астрахань, ул. Татищева, 16, ФГОУ "Астраханский государственный технический университет", патентный отдел

(72) Автор(ы):

Кудрявцев Константин Викторович (RU),

Берберова Надежда Титовна (RU),

Осипова Виктория Павловна (RU),

Антонова Наталья Александровна (RU)

(73) Патентообладатель(и):

Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Астраханский государственный технический университет (ФГОУ ВПО АГТУ) (RU)

(54) НОВЫЕ БИЦИКЛИЧЕСКИЕ ПРОИЗВОДНЫЕ ПИРРОЛИДИНОВ, ОБЛАДАЮЩИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ

(57) Реферат:

Изобретение относится к средству, обладающему пролонгированной антиоксидантной активностью, которое представляет собой производные пирролидинов, содержащих фрагмент пространственно-затрудненного фенола, общей формулы:

где R 1 означает Н, Me, Et; R 2 означает Me, Et, i-Pr, i-Bu; Ar означает Ph, 2-HalPh, 3-HalPh, 4-HalPh (где Hal означает F, Cl, Br, I), 2,6-diMePh, 2,3,5,6-tetraFPh, 2-MeOPh, 3-MeOPh, 4-MeOPh, (нафталин-1-ил), (нафталин-2-ил), 2-NO 2 Ph, 3-NO 2 Ph, 4-NO 2 Ph. Соединения получают смешением раствора азометина формулы:

где значения R 1 , R 2 приведены выше, с N-замещенным малеимидом на воздухе и индуцируют их взаимодействие каталитическими количествами N-трет-бутоксикарбонильных производных альфа-аминокислот (глицина, аланина, фенилаланина) с последующим концентрированном органический фазы при пониженном давлении и очисткой остатка при помощи хроматографии на силикагеле с использованием CHCl 3 /МеОН в качестве элюента. 2 н.п. ф-лы, 2 табл., 9 пр.

Изобретение относится к медицинской и органической химии и медицине, в частности к новым производным пирролидинов, содержащим фрагмент пространственно-затрудненного фенола, общей формулы:

где R 1 означает Н, Me, Et; R 2 означает Me, Et, i-Pr, i-Bu; Ar означает Ph, 2-HalPh, 3-HalPh, 4-HalPh (где Hal означает F, Cl, Br, I), 2,6-diMePh, 2,3,5,6-tetraFPh, 2-MeOPh, 3-MeOPh, 4-MeOPh, (нафталин-1-ил), (нафталин-2-ил), 2-NO 2 Ph, 3-NO 2 Ph, 4-NO 2 Ph. Соединения обладают антиоксидантной активностью, что позволяет использовать их для снижения скорости пероксидного окисления липидов.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Наиболее близкими аналогами по структуре и биологической активности являются пространственно-затрудненные фенолы [Зайцев В.Г., Островский О.В., Закревский В.И. Связь между химическим строением и мишенью действия как основа классификации антиоксидантов прямого действия. // Экспериментальная и клиническая фармакология. -2003. - Т.66. - 4. - С.66-70], недостатками которых являются либо необходимость использования их в достаточно высоких дозах, поскольку они расходуются в ходе защитных реакций, либо проявление в определенных условиях прооксидантных свойств.

Прототипом патентуемого класса соединений является ионол (2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенол) - липофильный препарат, антиоксидантные свойства которого сопряжены с его способностью связывать активные формы и соединения кислорода с образованием стабильного феноксильного радикала, не принимающего участия в цепи окислительных превращений и прерывающего цепи окисления в субстрате [Эмануэль Н.М. Кинетика экспериментальных опухолевых процессов. М.: Наука. - 1977. - 419 с.; Rice-Evans C.A., Diplock A.T. Current status of antioxidant therapy // Free Radical Biol. Med. - 1993. - Vol.15. - P.77-96]. Однако установлено, что продукты окислительной модификации ионола подавляют ферментную антиоксидантную систему, увеличивают образование кислородных радикалов, при применении его в высоких дозах происходит инверсия антиоксидантного действия в прооксидантное.

Техническим результатом, на достижение которого направлено данное изобретение, является получение новых производных пространственно-затрудненного фенола, содержащих пирролидиновый фрагмент, обладающих выраженной пролонгированной антиокеидантной активностью в минимальных концентрациях, увеличение растворимости препаратов в водных средах за счет образования солей между вторичным аминным фрагментом соединений и неорганическими и органическими кислотами, и способ их получения.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Технический результат достигается тем, что предложены производные пирролидинов, содержащие пространственно-затрудненный фенольный фрагмент, общей формулы:

где R 1 означает Н, Me, Et; R 2 означает Me, Et, i-Pr, i-Bu; Ar означает Ph, 2-HalPh, 3-HalPh, 4-HalPh (где Hal означает F, Cl, Br, I), 2,6-diMePh, 2,3,5,6-tetraFPh, 2-MeOPh, 3-MeOPh, 4-MeOPh, (нафталин-1-ил), (нафталин-2-ил), 2-NO 2 Ph, 3-NO 2 Ph, 4-NO 2 Ph, обладающие пролонгированной антиоксидантной активностью.

Предлагаемое изобретение представлено химической структурой новых соединений класса бициклических производных пирролидина, содержащих пространственно-затрудненный фенольный фрагмент, общей формулы:

где R 1 означает Н, Me, Et; R 2 означает Me, Et, i-Pr, i-Bu; Ar означает Ph, 2-HalPh, 3-HalPh, 4-HalPh (где Hal означает F, Cl, Br, I), 2,6-diMePh, 2,3,5,6-tetraFPh, 2-MeOPh, 3-MeOPh, 4-MeOPh, (нафталин-1-ил), (нафталин-2-ил), 2-NO 2 Ph, 3-NO 2 Ph, 4-NO 2 Ph, обладающих пролонгированной антиоксидантной активностью.

Заявляемые соединения представляют собой бесцветные или слабоокрашенные кристаллические вещества, хорошо растворимые в хлористом метилене, хлороформе, тетрагидрофуране, спирте, диметилсульфоксиде. Растворимость в воде может быть достигнута путем солеобразования с эквимолярным количеством неорганических (соляная, серная и др.) или органических (щавелевая, трифторуксусная и др.) кислот. Структура и индивидуальность заявляемых соединений подтверждены элементным анализом, рентгеноструктурным анализом, данными ЯМР 1 Н, ЯМР 13 С, тонкослойной хроматографии.

2. Технический результат достигается также тем, что предложен способ получения ранее не известных производных пирролидина, содержащих фрагмент пространственно-экранированного фенола, общей формулы:

где R 1 означает Н, Me, Et; R 2 означает Me, Et, i-Pr, i-Bu; Ar означает Ph, 2-HalPh, 3-HalPh, 4-HalPh (где Hal означает F, Cl, Br, I), 2,6-diMePh, 2,3,5,6-tetraFPh, 2-MeOPh, 3-MeOPh, 4-MeOPh, (нафталин-1-ил), (нафталин-2-ил), 2-NO 2 Ph, 3-NO 2 Ph, 4-NO 2 Ph, при котором растворы азометина формулы:

где R 1 означает Н, Me, Et; R 2 означает Me, Et, i-Pr, i-Bu, и соответствующего N-замещенного малеимида смешивают на воздухе и индуцируют их взаимодействие каталитическими количествами N-трет-бутоксикарбонильных производных альфа-аминокислот (глицина, аланина, фенилаланина) с последующим концентрированием органической фазы при пониженном давлении и очисткой остатка при помощи хроматографии на силикагеле с использованием CHCl 3 /МеОН в качестве элюента.

Пример 1. Получение метилового эфира (1S*,3R*,3aS*,6aR*)-3-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)-5-(2,6-диметилфенил)-1-метил-4,6-диоксооктагидропирроло[3,4-с] пиррол-1-карбоновой кислоты (I)

К раствору 0.506 г метилового эфира 2-((3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксибензилиден)амино)пропионовой кислоты в 10 мл хлористого метилена добавляют раствор 0.316 г Н-(2,6-диметилфенил)малеимида и перемешивают при комнатной температуре 15 мин. В реакционную смесь вносят одной порцией 0.030 г N-трет-бутоксикарбонилглицина и перемешивают 48 ч при комнатной температуре. Раствор концентрируют в вакууме и хроматографируют на силикагеле 60, элюент хлороформ/метанол 10:1. Упариванием содержащей продукт реакции фракции получают 0.620 г (76%) заявленного соединения в виде бесцветных кристаллов, т.пл. 126-128°С. 1 Н ЯМР (400 MHz; CDCl 3 ): 7.22 (s, 2H), 7.16-7.20 (m, 1H), 7.06-7.10 (m, 2H), 5.18 (s, 1H), 4.90 (dd, J 9.1, 9.1, 1H), 3.86 (s, 3H), 3.76 (dd, J 9.1, 7.8, 1H), 3.52 (d, J 7.8, 1H), 2.86 (d, J 9.1, 1H), 2.11 (s, 3H), 2.01 (s, 3H), 1.72 (s, 3H), 1.45 (s, 18H). 13 С ЯМР (100 MHz; CDCl 3 ): 174.84, 173.16, 172.73, 153.38, 135.77, 135.47 (2C), 135.32, 130.28, 129.42, 128.50, 128.36, 125.82, 123.53 (2C), 67.76, 62.77, 56.36, 52.79, 50.18, 34.37, 30.29 (3C), 23.81, 18.40, 17.70. Вычислено, % C 31 H 40 N 2 O 5 : С 71.51; Н 7.74; N 5.38. Найдено, %: С 71.58; Н 7.70; N 5.63.

Получено новое бициклическое производное пирролидина, содержащее фрагмент пространственно-экранированного фенола, обладающее выраженной пролонгированной антиоксидантной активностью.

Пример 2. Получение метилового эфира (1S*,3R*,3aS*,6aR*)-3-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)-1-метил-4,6-диоксо-5-(2,3,5,6-тетрафторфенил)октагидропирроло[3,4-с]пиррол-1-карбоновой кислоты (II)

К раствору 0.497 г метилового эфира 2-((3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксибензилиден)амино)пропионовой кислоты в 10 мл хлористого метилена добавляют раствор 0.385 г N-(2,3,5,6-тетрафторфенил)малеимида и перемешивают при комнатной температуре 15 мин. В реакционную смесь вносят одной порцией 0.030 г N-трет-бутоксикарбонилаланина и перемешивают 48 ч при комнатной температуре. Раствор концентрируют в вакууме и хроматографируют на силикагеле 60, элюент хлороформ/метанол 10:1. Упариванием содержащей продукт реакции фракции получают 0.476 г (54%) заявленного соединения в виде бесцветных кристаллов, т.пл. 220-222°С. 1 Н ЯМР (400 MHz; CDCl 3 ): 7.13-7.21 (m, 1H), 7.15 (s, 2H), 5.20 (s, 1H), 4.83 (dd, J 8.8, 8.8, 1Н), 3.86 (s, 3H), 3.76 (dd, J 8.8, 7.8, 1H), 3.56 (d, J 7.8, 1H), 2.86 (d, J 8.8, 1H), 1.69 (s, 3H), 1.43 (s, 18H). 13 C ЯМР (100 MHz; CDCl 3 ): 172.91, 172.13, 171.14, 153.77, 135.77 (2C), 125.72, 123.70 (4C), 107.61, 107.39 (2C), 107.16, 68.07, 63.66, 56.76, 52.79, 51.28, 34.32, 30.15 (3C), 23.91. Вычислено, % C 29 H 32 F 4 N 2 O 5 : С 61.70; Н 5.71; N 4.96. Найдено, %: С 61.52; Н 5.76; N 5.18.

Получено новое бициклическое производное пирролидина, содержащее фрагмент пространственно-экранированного фенола, обладающее выраженной пролонгированной антиоксидантной активностью.

Пример 3. Получение метилового эфира (1S*,3R*,3aS*,6aR*)-3-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)-1-метил-4,6-диоксо-5-фенилоктагидропирроло[3,4-с]пиррол-1 -карбоновой кислоты (III)

К раствору 0.596 г метилового эфира 2-((3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксибензилиден)амино)пропионовой кислоты в 10 мл хлористого метилена добавляют раствор 0.323 г N-фенилмалеимида и перемешивают при комнатной температуре 15 мин. В реакционную смесь вносят одной порцией 0.019 г N-трет-бутоксикарбонилглицина и перемешивают 48 ч при комнатной температуре. Раствор концентрируют в вакууме и хроматографируют на силикагеле 60, элюент хлороформ/метанол 10:1. Упариванием содержащей продукт реакции фракции получают 0.543 г (59%) заявленного соединения в виде бесцветных кристаллов, т.пл. 10б-108°С. 1 Н ЯМР (400 MHz; CDCl 3 ): 7.35-7.39 (m, 3H), 7.29-7.33 (m, 1H), 7.18 (s, 2H), 7.04 (d, J 7.8, 2H), 5.21 (s, 1H), 4.85 (d, J 9.1, 1H), 3.90 (s, 3H), 3.68 (dd, J 9.1, 7.6, 1H), 3.46 (d, J 7.6, 1H), 2.74 (br, 1H), 1.65 (s, 3H), 1.40 (s, 18H). 13 С ЯМР (100 MHz; CDCl 3 ): 174.92, 173.55, 173.01, 153.76, 135.78 (2C), 131.60, 128.88 (2C), 128.33, 127.32, 125.95 (2C), 123.92 (2C), 67.49, 63.32, 56.10, 52.72, 50.46, 34.35, 30.21 (3C), 24.53. Вычислено, % C 29 H 36 N 2 O 5 : С 70.71; Н 7.37; N 5.69. Найдено, %: С 70.79; Н 7.29; N 5.66.

Получено новое бициклическое производное пирролидина, содержащее фрагмент пространственно-экранированного фенола, обладающее выраженной пролонгированной антиоксидантной активностью.

Пример 4. Получение метилового эфира (1S*,3R*,3aS*,6aR*)-3-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)-5-(4-метоксифенил)-1-метил-4,6-диоксооктагидропирроло[3,4-с] пиррол-1-карбоновой кислоты (IV)

К раствору 0.505 г метилового эфира 2-((3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксибензилиден)амино)пропионовой кислоты в 10 мл хлористого метилена добавляют раствор 0.319 г N-(4-метоксифенил)малеимида и перемешивают при комнатной температуре 15 мин. В реакционную смесь вносят одной порцией 0.030 г N-трет-бутоксикарбонилаланина и перемешивают 48 ч при комнатной температуре. Раствор концентрируют в вакууме и хроматографируют на силикагеле 60, элюент хлороформ/метанол 10:1. Упариванием содержащей продукт реакции фракции получают 0.504 г (61%) заявленного соединения в виде светло-желтых кристаллов, т.пл. 107-109°С. 1 Н ЯМР (400 MHz; CDCl 3 ): 7.17 (s, 2H), 6.95 (d, J 8.8, 2H), 6.86 (d, J 8.8, 2H), 5.20 (s, 1H), 4.83 (d, J 9.1, 1H), 3.89 (s, 3H), 3.78 (s, 3H), 3.66 (dd, J 9.1, 7.6, 1H), 3.43 (d, J 7.6, 1H), 2.74 (br, 1H), 1.64 (s, 3H), 1.40 (s, 18H). 13 С ЯМР (100 MHz; CDCl 3 ): 175.07, 173.70, 172.97, 159.19, 153.67, 135.70 (2C), 127.28, 127.17 (2C), 124.27, 123.86 (2C), 114.13 (2C), 67.42, 63.27, 56.05, 55.40, 52.65, 50.38, 34.29, 30.17 (3C), 24.48. Вычислено, % C 30 H 38 N 2 O 6 : С 68.94; Н 7.33; N 5.36. Найдено, %: С 68.91; Н 7.27; N 5.32.

Получено новое бициклическое производное пирролидина, содержащее фрагмент пространственно-экранированного фенола, обладающее выраженной пролонгированной антиоксидантной активностью.

Пример 5. Получение метилового эфира (1S*,3R*,3aS*,6aR*)-3-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)-1-метил-5-(нафталин-1-ил)-4,6-диоксооктагидропирроло[3,4-с]пиррол-1-карбоновой кислоты (V)

К раствору 0.500 г метилового эфира 2-((3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксибензилиден)амино)пропионовой кислоты в 10 мл хлористого метилена добавляют раствор 0.351 г N-(нафталин-1-ил)малеимида и перемешивают при комнатной температуре 15 мин. В реакционную смесь вносят одной порцией 0.030 г N-трет-бутоксикарбонилаланина и перемешивают 48 ч при комнатной температуре. Раствор концентрируют в вакууме и хроматографируют на силикагеле 60, элюент хлороформ/метанол 10:1. Упариванием содержащей продукт реакции фракции получают 0.467 г (55%) заявленного соединения в виде бесцветных кристаллов, т.пл. 140-141°С. 1 Н ЯМР (400 MHz; CDCl 3 ): 7.83-7.91 (m), 7.37-7.61 (m), 7.29-7.33 (m, 1H), 7.28 (br), 7.23 (br), 6.93 (d, J 7.3), 5.21 (s), 5.13 (s), 4.86-4.94 (m, 1H), 3.87 (s), 3.86-3.90 (m), 3.81 (s), 3.75 (t, J 8.1), 3.66 (d, J 7.8), 3.51 (d, J 8.1), 2.75-2.85 (m, 1H), 1.76 (s), 1.71 (s), 1.44 (s), 1.31 (s). 13 C ЯМР (100 MHz; CDCl 3 ): 175.28, 173.79, 172.72, 153.58, 135.58, 134.34, 129.98, 129.85, 128.62, 128.30, 127.37, 127.01, 126.44, 126.34, 125.92, 125.16, 124.05, 123.94, 122.93, 121.95, 67.54, 63.38, 63.32, 56.26, 56.11, 52.78, 50.88, 50.51, 34.41, 34.29, 30.28, 30.23, 24.86, 23.91. Вычислено, % C 33 H 38 N 2 O 5 : С 73.04; Н 7.06; N 5.16. Найдено, %: С 73.19; Н 7.29; N 5.01.

Получено новое бициклическое производное пирролидина, содержащее фрагмент пространственно-экранированного фенола, обладающее выраженной пролонгированной антиоксидантной активностью.

Пример 6. (1S*,3R*,3aS*,6aR*)-5-(4-бромфенил)-3-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)-1-метил-4,6-диоксооктагидропирроло[3,4-с]пиррол-1-карбоновой кислоты (VI)

К раствору 0.501 г метилового эфира 2-((3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксибензилиден)амино)пропионовой кислоты в 10 мл хлористого метилена добавляют раствор 0.395 г N-(4-бромфенил)малеимида и перемешивают при комнатной температуре 15 мин. В реакционную смесь вносят одной порцией 0.030 г N-трет-бутоксикарбонилаланина и перемешивают 48 ч при комнатной температуре. Раствор концентрируют в вакууме и хроматографируют на силикагеле 60, элюент хлороформ/метанол 10:1. Упариванием содержащей продукт реакции фракции получают 0.665 г (75%) заявленного соединения в виде бесцветных кристаллов, т.пл. 195-197°С. 1 Н ЯМР (400 MHz; CDCl 3 ): 7.48 (d, J 8.8, 2H), 7.16 (s, 2H), 6.93 (d, J 8.8, 2H), 5.22 (s, 1H), 4.85 (m, 1H), 3.89 (s, 3H), 3.68 (dd, J 9.2, 7.6, 1H), 3.44 (d, J 7.6, 1H), 2.69 (br, 1H), 1.65 (s, 3H), 1.40 (s, 18H). 13 С ЯМР (100 MHz; CDCl 3 ): 174.60, 173.24, 172.96, 153.79, 135.83 (2С), 132.04 (2С), 130.57, 127.45 (2С), 127.28, 123.86 (2С), 122.07, 67.47, 63.20, 55.98, 52.74, 50.40, 34.34, 30.22 (3С), 24.54. Вычислено, % C 29 H 35 BrN 2 O 5 : С 60.95; Н 6.17; N 4.90. Найдено, %: С 61.23; Н 6.27; N 4.71.

Получено новое бициклическое производное пирролидина, содержащее фрагмент пространственно-экранированного фенола, обладающее выраженной пролонгированной антиоксидантной активностью.

Пример 7. Получение метилового эфира (1S*,3R*,3aS*,6aR*)-3-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)-1-метил-5-(2-нитрофенил)-4,6-диоксооктагидропирроло[3,4-с]пиррол-1-карбоновой кислоты (VII)

К раствору 0.500 г метилового эфира 2-((3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксибензилиден)амино)пропионовой кислоты в 10 мл хлористого метилена добавляют раствор 0.341 г N-(2-нитрофенил)малеимида и перемешивают при комнатной температуре 15 мин. В реакционную смесь вносят одной порцией 0.030 г N-трет-бутоксикарбонилаланина и перемешивают 48 ч при комнатной температуре. Раствор концентрируют в вакууме и хроматографируют на силикагеле 60, элюент хлороформ/метанол 10:1. Упариванием содержащей продукт реакции фракции получают 0.364 г (43%) заявленного соединения в виде светло-желтых кристаллов, т.пл. 249°С. 1 Н ЯМР (400 MHz; CDCl 3 ): 8.09 (d, J 8.1, 1H), 7.62 (t, J 7.0, 1H), 7.53 (t, J 7.6, 1H), 7.21 (s, 2H), 6.89 (d, J 6.8, 1H), 5.21 (s, 1H), 4.88 (d, J 8.9, 1H), 3.87 (s, 3H), 3.77-3.82 (m, 1H), 3.55 (d, J 7.6, 1H), 2.78 (br, 1H), 1.67 (s, 3H), 1.41 (s, 18H). 13 С ЯМР (100 MHz; CDCl 3 ): 174.13, 173.03, 172.48, 153.70, 144.96, 135.77 (2C), 134.04, 130.38, 129.92 (2C), 127.31, 125.68, 123.89 (2C), 67.37, 62.93, 56.39, 52.75, 50.97, 34.37, 30.25 (3C), 24.63. Вычислено, % C 29 H 35 N 3 O 7 : С 64.79; Н 6.56; N 7.82. Найдено, %: С 64.93; Н 6.62; N 7.66.

Получено новое бициклическое производное пирролидина, содержащее фрагмент пространственно-экранированного фенола, обладающее выраженной пролонгированной антиоксидантной активностью.

Пример 8. Исследование синтезированных соединений в качестве антиоксидантов

Антиоксидантная активность соединений изучена на примере модельной системы пероксидного окисления липидов гомогената печени русского осетра по накоплению ТБК-зависимых продуктов. В работе использованы модельные системы с длительным протеканием пероксидного окисления липидов (ПОЛ) для выявления действия исследуемых соединений при продолжительном окислительном стрессе организма, когда интенсивность ПОЛ возрастает, а концентрация антиоксидантов падает.

Навеску 0.5 г печени гомогенизировали в 19.5 мл охлажденного до 0-4°С раствора хлорида калия, поместив стакан гомогенизатора в лед или снег. Полученный гомогенат сливали в емкость.

Исследуемый антиоксидант вносили в гомогенат печени в виде раствора в хлороформе. Растворы гомогената печени с антиоксидантом и без хранили в холодном темном месте в течение 2 суток. Конечная концентрация исследуемого соединения составляла 1·10 -4 моль/л. Изменение скорости пероксидного окисления липидов в гомогенате печени осетра в присутствии исследуемых соединений оценивали в течение 2 суток путем отбора 2 мл гомогената из соответствующей емкости и выполнением всех необходимых операций. Брали три сухие пробирки. В первую пробирку (холостая проба без добавки антиоксиданта) наливали 2.0 мл гомогената и по 0.1 мл растворов аскорбиновой кислоты и соли Мора, добавляли 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты. Во вторую пробирку (рабочая проба с добавкой антиоксиданта) наливали 2.0 мл гомогената с антиоксидантом и по 0.1 мл растворов аскорбиновой кислоты и соли Мора, 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты. Начальная концентрация соединения в реакционной среде составляла 1·10 -4 моль/л. В третьей пробирке готовили контрольную пробу (без гомогената). Для этого в пробирку наливали 2 мл раствора хлорида калия, 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты и 1 мл раствора тиобарбитуровой кислоты.

Первую и вторую пробирки помещали на 10 мин в водяную баню при 37°С, затем центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. После этого отбирали в чистые пробирки по 2 мл надосадочной жидкости, приливали по 1 мл раствора тиобарбитуровой кислоты, помещали пробы в кипящую водяную баню на 10 мин вместе с контрольной пробиркой и затем охлаждали все пробирки в ледяной воде до комнатной температуры. После того, как пробы охладились, в первую и вторую пробирки добавляют 1.0 мл хлороформа для получения прозрачного раствора и ставили центрифугировать на 15 минут при частоте боротов 3000 об/мин.

Отбирали верхнюю фазу и измеряли экстинкцию пробы по сравнению с контрольным раствором на спектрофотометре СФ-103 в кювете с толщиной слоя 1.0 см.

Расчет проводили по формуле:

Х=(Е·3·3.2)/(0.156·2),

где X - содержание малонового диальдегида в исходном гомогенате, нмоль; Е - экстинкция проб; 3.2 - общий объем исследуемых проб, мл; 2 - объем надосадочной жидкости, взятой на определение малонового диальдегида, мл; 3 - объем проб, взятых на фотометрию, мл; 0.156 - экстинкция 1 нмоль малонового диальдегида в 1 мл при 532 нм.

В отдельном эксперименте было подтверждено отсутствие в данных условиях влияния хлороформа на скорость ПОЛ в печени.

Для исследованных соединений рассчитана эффективность антиоксидантного действия (ЭАД) по формуле:

ЭАД=[(С 0 -С 1 )/С 0 ]·100%,

где С 0 - концентрация ТБК-зависимых продуктов в гомогенате печени (контроль), С 1 - концентрация ТБК-зависимых продуктов в гомогенате печени, содержащей исследуемое соединение.

В случае положительного значения показателя ЭАД тестируемое вещество проявляет антиоксидантное действие; в случае отрицательного значения показателя ЭАД - прооксидантное действие. Данные опытов представлены в таблице 1.

Таблица 1

ЭАД (%) некоторых соединений при длительном пероксидном окислении липидов гомогената печени русского осетра in vitro

Соединение

1 ч

3 ч

24 ч

48 ч

I

12

41

59

54

II

3

44

57

67

III

-3

20

19

38

IV

23

27

31

46

V

5

51

40

49

VI

4

14

31

40

VII

3

4

45

37

ионол

35

35

42

39

Проведенные исследования показали, что все синтезированные соединения в концентрации 1·10 -4 М эффективно снижают уровень пероксидного окисления липидов гомогената печени русского осетра на всех этапах, что свидетельствует о пролонгированной антиоксидантной активности исследуемых соединений.

Пример 9. Исследование синтезированных соединений в качестве антиоксидантов

Антиоксидантная активность соединений изучена на примере модельной системы пероксидного окисления липидов спермы русского осетра по накоплению ТБК-зависимых продуктов. Скорость ПОЛ определяли по методу, описанному в примере 8, по накоплению в сперме карбонильных продуктов, определяемых с помощью тиобарбитуровой кислоты (ТБК).

Сперму в количестве 1 мл смешивали с 19.5 мл охлажденного до 0-4°С раствора хлорида калия, полученный раствор сливали в емкость.

Исследуемый антиоксидант вносили в полученный раствор спермы с хлоридом калия в виде раствора в хлороформе. Растворы спермы с антиоксидантом и без хранили в холодном темном месте в течение 2 суток. Конечная концентрация исследуемого соединения составляла 1·10 -4 моль/л. Изменение скорости пероксидного окисления липидов в гомогенате спермы осетра в присутствии исследуемых соединений оценивали в течение 2 суток путем отбора 2 мл раствора из соответствующей емкости и выполнением всех необходимых операций. Брали три сухие пробирки. В первую пробирку (холостая проба без добавки антиоксиданта) наливали 2.0 мл раствора спермы и по 0.1 мл растворов аскорбиновой кислоты и соли Мора, добавляли 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты. Во вторую пробирку (рабочая проба с добавкой антиоксиданта) наливали 2.0 мл раствора спермы с антиоксидантом и по 0.1 мл растворов аскорбиновой кислоты и соли Мора, 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты. Начальная концентрация соединения в реакционной среде составляла 1·10 -4 моль/л. В третьей пробирке готовили контрольную пробу (без спермы). Для этого в пробирку наливали 2 мл раствора хлорида калия, 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты и 1 мл раствора тиобарбитуровой кислоты.

Первую и вторую пробирки помещали на 10 мин в водяную баню при 37°С, затем центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. После этого отбирали в чистые пробирки по 2 мл надосадочной жидкости, приливали по 1 мл раствора тиобарбитуровой кислоты, помещали пробы в кипящую водяную баню на 10 мин вместе с контрольной пробиркой и затем охлаждали все пробирки в ледяной воде до комнатной температуры. После того, как пробы охладились, в первую и вторую пробирки добавляют 1.0 мл хлороформа для получения прозрачного раствора и ставили центрифугировать на 15 минут при частоте оборотов 3000 об/мин.

Отбирали верхнюю фазу и измеряли экстинкцию пробы по сравнению с контрольным раствором на спектрофотометре СФ-103 в кювете с толщиной слоя 1.0 см.

Расчет проводили по формуле:

Х=(Е·3·3.2)/(0.156·2),

где X - содержание малонового диальдегида в исходном гомогенате, нмоль; Е - экстинкция проб; 3.2 - общий объем исследуемых проб, мл; 2 - объем надосадочной жидкости, взятой на определение малонового диальдегида, мл; 3 - объем проб, взятых на фотометрию, мл; 0.156 - экстинкция 1 нмоль малонового диальдегида в 1 мл при 532 нм.

В отдельном эксперименте было подтверждено отсутствие в данных условиях влияния хлороформа на скорость ПОЛ спермы.

Для исследованных соединений рассчитана эффективность антиоксидантного действия (ЭАД) по формуле: ЭАД=[(C 0 -C 1 )/C 0 ]·100%,

где С 0 - концентрация ТБК-зависимых продуктов в сперме (контроль), С 1 - концентрация ТБК-зависимых продуктов в сперме, содержащей исследуемое соединение.

В случае положительного значения показателя ЭАД тестируемое вещество проявляет антиоксидантное действие; в случае отрицательного значения показателя ЭАД - прооксидантное действие. Данные опытов представлены в таблице 2.

Таблица 2

ЭАД (%) некоторых соединений при длительном пероксидном окислении липидов спермы русского осетра in vitro

Соединение

1 ч

3 ч

24 ч

48 ч

I

27

32

50

52

II

47

21

49

44

III

24

11

25

48

IV

28

32

30

51

V

33

5

60

73

VI

42

51

62

72

VII

33

5

30

64

ионол

-12

31

12

5

Проведенные исследования показали, что все синтезированные соединения в концентрации 1·10 -4 М эффективно снижают уровень пероксидного окисления липидов спермы русского осетра на всех этапах, что свидетельствует о пролонгированной антиоксидантной активности исследуемых соединений.

Источники информации

1. Зайцев В.Г., Островский О.В., Закревский В.И. Связь между химическим строением и мишенью действия как основа классификации антиоксидантов прямого действия. // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2003 - Т.66. - 4. - С.66-70.

2. Эмануэль Н.М. Кинетика экспериментальных опухолевых процессов. М.: Наука. - 1977. - 419 с.

3. Rice-Evans C.A., Diplock A.T. Current status of antioxidant therapy. // Free Radical Biol. Med. - 1993. - Vol.15. - P.77-96. (прототип)

Формула изобретения

1. Средство, обладающее пролонгированной антиоксидантной активностью, представляющее собой производные пирролидинов, содержащих фрагмент пространственно-затрудненного фенола, общей формулы:

где R 1 означает Н, Me, Et; R 2 означает Me, Et, i-Pr, i-Bu; Ar означает Ph, 2-HalPh, 3-HalPh, 4-HalPh, (где Hal означает F, Cl, Br, I), 2,6-diMePh, 2,3,5,6-tetraFPh, 2-MeOPh, 3-MeOPh, 4-MeOPh, (нафталин-1-ил), (нафталин-2-ил), 2-NO 2 Ph, 3-NO 2 Ph, 4-NO 2 Ph.

2. Способ получения новых бициклических производных пирролидина, обладающих антиоксидантной активностью, общей формулы:

где R 1 означает Н, Me, Et; R 2 означает Me, Et, i-Pr, i-Bu; Ar означает Ph, 2-HalPh, 3-HalPh, 4-HalPh, (где Hal означает F, Cl, Br, I), 2,6-diMePh, 2,3,5,6-tetraFPh, 2-MeOPh, 3-MeOPh, 4-MeOPh, (нафталин-1-ил), (нафталин-2-ил), 2-NO 2 Ph, 3-NO 2 Ph, 4-NO 2 Ph, при котором растворы азометина формулы:

где R 1 означает Н, Me, Et; R 2 означает Me, Et, i-Pr, i-Bu, и N-замещенного малеимида смешивают на воздухе и индуцируют их взаимодействие каталитическими количествами N-трет-бутоксикарбонильных производных альфа-аминокислот (глицина, аланина, фенилаланина) с последующим концентрированием органической фазы при пониженном давлении, и очисткой остатка при помощи хроматографии на силикагеле с использованием CHCl 3 /MeOH в качестве элюента.