Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
Патент на изобретение №2473351

(19)

RU

(11)

2473351

(13)

C2

(51) МПК A61K31/728 (2006.01)

C08B37/08 (2006.01)

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ Статус: по данным на 17.01.2013 - нет данных Пошлина:

(21), (22) Заявка: 2011101130/10, 12.01.2011

(24) Дата начала отсчета срока действия патента:

12.01.2011

Приоритет(ы):

(22) Дата подачи заявки: 12.01.2011

(43) Дата публикации заявки: 20.07.2012

(45) Опубликовано: 27.01.2013

(56) Список документов, цитированных в отчете о

поиске: ЛУКИНА Е.С. Конъюгация гликозаминогликанов с аминами и карбоновыми кислотами // Автореф. дисс.на соиск. степ.канд. наук. Уфа, 2007, с.5-10. KURISAWA M. et al. Injectable biodegradable hydrogels composed of hyaluronic acid-tyramine conjugates for drug delivery and tissue engineering // Chem. Commun., 2005. 4312-4314. BULPITT P., AESCHLIMANN D. Newstrategy for chemical modification of hyaluronic acid: preparation offunctionalized derivatives and their use in the formation of novel biocompatible hydrogels // J Biomed Mater Res. 1999 Nov; 47(2), pp.152-169. ПОНЕДЕЛЬКИНА И.Ю., ОДИНОКОВ В.Н, ВАХРУШЕВА Е.С. и др. Модификация гиалуроновой кислоты ароматическими аминокислотами // Биоорг. химия. 2005. Т.31. 1. С.90-95. RU 2350625 С2, 27.03.2009.

Адрес для переписки:

450075, Республика Башкортостан, г.Уфа, пр-кт Октября, 141, ООО Инновационный центр Института Нефтехимии и Катализа "ИНКИ"

(72) Автор(ы):

Понеделькина Ирина Юрьевна (RU),

Лукина Елена Сергеевна (RU),

Петренко Елена Геннадьевна (RU)

(73) Патентообладатель(и):

Общество с ограниченной ответственностью Инновационный Центр Института Нефтехимии и Катализа "ИНКИ" (RU)

(54) КОНЪЮГАТ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ С НОВОКАИНОМ С АМФОТЕРНЫМИ СВОЙСТВАМИ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области биохимии. Предложен конъюгат гиалуроновой кислоты с новокаином структуры, как определено в формуле изобретения, с содержанием 20-50% остатков новокаина. Конъюгат растворим в воде, обладает амфотерными свойствами и не содержит побочных O-ацилизомочевин. 3 табл., 3 пр.

Изобретение относится к новым химическим веществам, а именно к модифицированной гиалуроновой кислоте, которая может быть использована в косметической, пищевой индустрии, в фармакологии, ветеринарной практике и фармацевтической промышленности.

Гиалуроновая кислота (ГК) - гетерополисахарид линейного строения, относится к классу кислых гликозаминогликанов, находится в соединительных тканях животных и человека и состоит из звеньев D-глюкуроновой кислоты и N-ацетил-D-глюкозамина. Молекулярная масса ГК 10 4 -2×10 6 Да.

На основе ГК выпускаются следующие фармакопейные препараты. Высокомолекулярная ГК (М=10 6 Да) входит в состав гелей «Provisk» (Швеция) и «Healon» (Канада), применяющихся в офтальмохирургии при операциях экстракции катаракты, является действующим веществом в пленках «Seprafilm» для предупреждения спаечной болезни брюшины. Низкомолекулярной ГК пропитывают салфетки «Гиаплюс», предназначенные для лечения ожоговой болезни. Для лечения трофических язв и угрей применяют цинковую соль ГК (лекарственное средство «Куриозин» (в виде раствора и геля), а препарат «Цистистат» предназначается для восстановления поврежденной слизистой оболочки мочевого пузыря при интерстициальном цистите. ГК является составным компонентом косметических шампуней, кремов и тоников для стимуляции роста волос. Запатентовано также применение ГК в лечении герпеса, псориаза, а также для изготовления суппозиториев различного назначения [Понеделькина И.Ю., Лукина B.C., Одиноков В.Н. Кислые гликозаминогликаны и их химическая модификация (обзор) // Биоорг. химия. 2008. Т.34. 1. С.5-28].

ГК является отрицательно заряженным полиэлектролитом. Введение в структуру ГК групп с противоположным зарядом придает молекулам ГК амфотерные свойства, при этом усиливаются внутри- и межмолекулярное взаимодействие макромолекул. ГК приобретает способность образовывать гидрогели, обладающие влагоудерживающими свойствами. Также полиамфолиты на основе ГК могут применяться как носители для других молекул, например, ДНК [Asayama S., Nogawa M., Takei Y., Akaike Т., Mamyama A. Synthesis of novel polyampholyte comb-type copolymers consisting of a poly(L-lysine) backbone and hyaluronic acid side chains for a DNA carrier // Bioconjug Chem. 1998. V.9. 4. P.476-81].

Среди известных синтезированных ранее производных ГК амфотерными по структуре являются конъюгаты ГК с карбодиимидами различного строения [Vercruysse K.P., Prestwich G.D. Hyauronate derivatives in drug delivery // Therapeutic Drug Carrier Systems. 1998. V. 15. 5. P.513-555], с гидразидом изоникотиновой кислоты [Лукина Е.С. Автореф. дисс. на соиск. степ. канд. наук. Уфа, 2007. 110 С.(www.anrb.ru/ink, диссер. совет)] и гексаметилендиамином [Yeom J., Bhang S., Kim B-S., Seo M.S., Hwang E.J., Cho I.H., Park J.K., Hahn S.K. Effect of cross-linking reagents for hyaluronic acid hydrogel dermal fillers on tissue augmentation and regeneration // Bioconjugate Chem. 2010. V.21, P. 240-247]. Амфотерные свойства этих конъюгатов не исследованы.

Одним из способов получения ГК с амфотерными свойствами является ковалентное связывание ГК с -диэтиламиноэтиловым эфиром пара-аминобензойной кислоты (новокаином). Новокаин относится к классу местноанестезирующих препаратов. Кроме анестезирующего действия, новокаин при непосредственном введении в ток крови оказывает общее влияние на организм: уменьшает образование ацетилхолина и понижает чувствительность периферических холинорецепторов, проявляет блокирующее влияние на вегетативные ганглии, ослабляет спазмы гладкой мускулатуры, возбудимость мышцы сердца и моторных зон коры большого мозга [Машковский М.Д. Лекарственные средства. - Харьков: Торсинг. 1997. Т.2. С.590]. В организме новокаин относительно быстро гидролизуется, образуя п-аминобензойную кислоту (витамин Hi) и диэтиламиноэтанол (оказывает умеренное сосудорасширяющее действие), которые сами являются фармакологически-активными веществами.

Конъюгаты гликозаминогликанов (ГАГ) (хондроитин-сульфатов, гепарина и окисленной по первичной гидроксигруппе гиалуроновой кислоты) с новокаином являются известными [1-8, см. ниже ссылки]. Они были получены реакцией ГАГ с новокаином в присутствии конденсирующего реагента водорастворимого 1-этил-3-[3-(диметиламино)пропил]карбодиимида (КДИ) и содержали (в зависимости от соотношения реагентов), по данным ЯМР-спектроскопического анализа, 33-38% остатков новокаина (в расчете на 100 дисахаридных звеньев) в модифицированном хондроитинсульфате, 66-90% - в модифицированном гепарине, 60% - в окисленной ГК (схема 1). Ссылки 1-8:

1. Понеделькина И.Ю., Одиноков В.Н., Лукина B.C., Тюмкина Т.В., Халилов Л.М., Джемилев У.М. Химическая модификация гепарина // Биоорг. химия. 2006. Т.32. 5. С.524-529;

2. Понеделькина И.Ю., Лукина Е.С., Одиноков В.Н. Кислые гликозаминогликаны и их химическая модификация (обзор) // Биоорг. химия. 2008. Т.34. 1. С.5-28;

3. Понеделькина И.Ю., Одиноков В.Н., Лукина Е.С., Джемилев У.М. Конъюгация хондроитинсульфатов с аминами // Биоорг. химия. 2008. Т.34. 5. С.704-710;

4. Понеделькина И.Ю., Одиноков В.Н. Лукина Е.С., Суфиярова Р.Ш. Парфенова Т.И., Башкатов С.А., Сибагатуллин Н.Г., Джемилев У.М. // Пат. РФ 2283320. Опубл. 10.09.2006. БИ 25;

5. Понеделькина И.Ю., Одиноков В.Н. Лукина Е.С.Сибагатуллин Н.Г., Суфияров И.Ф., Серик Е.М., Джемилев У.М. // Пат. РФ 2298406. Опубл. 10.05.2007. БИ 13;

6. Понеделькина И.Ю., Одиноков В.Н., Лукина Е.С., Джемилев У.М., Иванова О.В, Саитгалина Э.А. // Пат. РФ 2318830. Опубл. 10.03.2008. БИ 7;

7. Понеделькина И.Ю., Саитгалина Э.А., Лукина Е.С., Одиноков В.Н., Джемилев У.М. // Патент РФ 2350625. Опубл. 27.03.2009. БИ 9;

8. Понеделькина И.Ю., Суфияров И.Ф., Лукина Е.С., Саитгалина Э.А., Одиноков В.Н., Джемилев У.М. // Пат. РФ 2343932. Опубл. 20.01.2009. БИ 2.

Схема 1

Кроме остатков новокаина, конъюгаты хондроитинсульфатов из пупочных канатиков новорожденных содержали 3% O-ацилизомочевин (продуктов присоединения КДИ по карбокси-группам), конъюгаты гепарина -3-10%, конъюгаты дерматансульфата из кожи свиньи - 32%.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является конъюгат ГК, содержащий, в зависимости от соотношения реагентов, 10-53% остатков новокаина и 18-36% уреидных остатков (O-ацилизомочевин) [Лукина Е.С. Автореф. дисс. на соиск. степ. канд. наук. Уфа, 2007. 110 С. (www.anrb.ru/ink. диссер. совет)] (рис.1). Он был получен согласно схеме 1 и при большом содержании O-ацилизомочевин практически не растворялся в воде.

Главным недостатком упоминаемого конъюгата является наличие в его составе побочных продуктов присоединения карбодиимида (рис.1), вследствие чего растворимость соединения практически сводилась к минимуму.

Рис.1.

Задачей предлагаемого изобретения является получение обладающего амфотерными свойствами водорастворимого конъюгата ГК с новокаином, не содержащего побочных продуктов. Это достигается следующим образом. Реакцию ГК с новокаином проводят в присутствии КДИ и N-гидроксибензотриазола (HOBt) как добавки, препятствующей образованию побочных O-ацилизомочевин. Синтез осуществляют в водной среде (рН 4.7-4.8) при комнатной температуре в течение 30-60 мин при соотношении реагентов ГК:новокаин:НОВt:КДИ=1:1-2:0.5-2:0.75-2 и получают водорастворимые продукты с 20-50% остатков новокаина, не содержащие O-ацилизомочевин (схема 2). Следует отметить, что HOBt применяется в пептидном синтезе и иногда используется в карбодиимидном синтезе некоторых производных ГК (в 1-5-кратном избытке по отношению к СООН-группе субстрата) [Kurisawa М., Chung J.E., Yang Y.Y., Gaoa Sh.J., Uyama H. Injectable biodegradable hydrogels composed of hyaluronic acid-tyramine conjugates for drug delivery and tissue engineering // Chem. Commun. 2005. P. 4312-4314; Bulpitt P., Aeschlimann D. New strategy for chemical modification of hyaluronic acid: preparation of functionalized derivatives and their use in the formation of novel biocompatible hydrogels // J. Biomed. Mater. Res. 1999. V.47. P.152-169; Crescenzi V., Francescangeli A., Taglienti A., Capitani D., Mannina L. Synthesis and partial characterization of hydrogels obtained via glutaraldehyde crosslinked of acetylated chitosan and of hyaluronan derivatives // Biomacromolecules. 2003. V.4. P.1045-1054; Crescenzi V., Francescangeli A., Taglienti A. New gelatin-based hydrogels via enzymatic net working // Biomacromolecules. 2002. V.3. P.1384-1391].

Схема 2

Все образцы конъюгатов ГК с 20-50% остатков новокаина проявляли свойства полиамфолитов [Asayama S., Nogawa M., Takei Y., Akaike Т., Maruyama A. // Bioconjug. Chem. 1998. V.9. 4. P.476-481.], т.е. измеренная при 500 нм мутность их водных растворов (при концентрации 4 мг/мл) изменялась при варьировании рН от 2 до 11. Максимальное поглощение растворов образцов наблюдалось при рН 2-5.5 (табл.1).

Предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. 0.1 г (0.25 ммоль) ГК, 0.07 г (0.25 ммоль) новокаина, 0.016 г (0.125 ммоль) HOBt помещают в стеклянную емкость объемом 100 см 3 , оборудованную магнитной мешалкой. Затем добавляют 25 мл дистиллированной воды. Все компоненты перемешивают при комнатной температуре до полного растворения. Доводят раствор до рН 4.75 с помощью 0.1 М NaOH, прибавляют 0.036 г (0.19 ммоль) водорастворимого КДИ и интенсивно перемешивают реакционную массу в течение 0.5 ч, поддерживая рН 4.7-4.8 титрованием 0.1 М НСl. Далее к охлажденной до 0-5°С реакционной массе добавляют 0.1 М NaOH (до рН 7), 3-5 мл насыщенного раствора NaCl и 75 мл этилового спирта. Образовавшийся осадок центрифугируют при 3000 об/мин в течение 2-5 мин. Полученный осадок растворяют в 15 мл 6% NaCl и добавляют 45 мл этилового спирта. Вновь образовавшийся осадок центрифугируют при 3000 об/мин в течение 2-5 мин, промывают этиловым спиртом, затем диэтиловым эфиром и высушивают в вакууме. Таким образом получают модифицированную ГК с новокаином со степенью замещения карбоксильных групп полимера 20% мол. (схема 2).

Для получения конъюгатов с новокаином использовали ГК с молекулярной массой от 40 кДа [Понеделькина И.Ю., Одиноков В.Н., Вахрушева B.C., Голикова М.Т., Халилов Л.М., Джемилев У.М. Модификация гиалуроновой кислоты ароматическими аминокислотами // Биоорган. химия. 2005 г. Т. 31. 1. С.90-95]) и выше.

Конверсию карбоксильных групп ГК в амидные определяли по данным 1 Н-ЯМР-спектроскопии, используя интегральные интенсивности характеристических сигналов протонов остатков новокаина (сигнал с 1.4 м.д. (т, J=14.1 и 7.0 H 2 , NCF 2 CH 3 )) по отношению к интенсивности сигнала метильных протонов ацетамидной группы ГК в области 5 2 м.д. в качестве внутреннего стандарта. Спектры 1 H-ЯМР и 13 С-ЯМР регистрировали для растворов в D 2 O на спектрометре Bruker АМХ-400 (рабочая частота для 1 Н-ЯМР - 400 МГц), в качестве стандарта использовали ацетон. Спектры в видимой области (500 нм) получали на спектрофотометре Specord M-40. Контроль рН растворов проводили с помощью рН-метра «рН-340».

Амфотерные свойства конъюгата ГК с 20% остатков новокаина в зависимости от рН (от 2 до 11) исследовали по методике, приведенной в работе Asayama S., Nogawa M., Takei Y., Akaike Т., Maruyama A. // Bioconjug. Chem. 1998. V.9. 4. P.476-481. Готовили несколько растворов образца с концентрацией 4 мг/мл, рН каждого раствора доводили до нужного значения и измеряли поглощение (мутность) при 500 нм. Максимальное поглощение растворов образцов наблюдалось при рН 2-5.5.

Таблица 1.



А ( 500 нм )



А ( 500 нм )

2

0.1702

7

0.1170

3

0.1623

7.5

0.1168

4

0.1592

8

0.1171

5

0.1411

9

0.1150

5.5

0.1317

10

0.1121

6

0.1193

11

0.1102

Пример 2. Конъюгат ГК с содержанием остатков новокаина 35% мол. получен аналогично Примеру 1, но при соотношении реагентов ГК:новокаин:НОВt:КДИ=1:1.5:1.5:1.5.

Таблица 2.

рН

А ( 500 нм )

РН

А ( 500 нм )

2

0.2110

7

0.1523

3.5

0.2003

7.5

0.1512

4.5

0.1932

8

0.1509

5

0.1734

9.5

0.1493

5.5

0.1738

10

0.1496

6

0.1702

11

0.1498

Пример 3. Конъюгат ГК с содержанием остатков новокаина 50% мол. получен аналогично Примеру 1, но при соотношении реагентов ГК:новокаин:НОВt:КДИ=1:1:2:2.

Таблица 3.

рH

А ( 500 нм )



А ( 500 нм )

2

0.2601

7

0.2421

3.5

0.2545

7.5

0.2437

4

0.2567

8.5

0.2408

5

0.2543

9

0.2396

5.5

0.2510

10

0.2398

6

0.2432

11

0.2379

Как видно из результатов (табл.1-3), при увеличении степени замещения карбоксильных групп полисахарида на остатки новокаина с 20% до 50% мол. оптическая плотность (мутность) растворов образцов пропорционально увеличивается и максимальное значение имеет при рН 2-5.5. При рН 6-11 значение оптической плотности практически не изменялось.

Водорастворимые конъюгаты ГК с новокаином, обладающие амфотерными свойствами, могут применяться в качестве биоматериала с репаративно-регенеративными свойствами в медицине, носителя для других молекул (как кислот, так и оснований по природе), а также в косметической продукции.

Формула изобретения

Конъюгат гиалуроновой кислоты с новокаином формулы

где n=20-50%, m=50-80%,

обладающий амфотерными свойствами.