Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
Патент на изобретение №2473540

(19)

RU

(11)

2473540

(13)

C1

(51) МПК C07C323/18 (2006.01)

A61K31/095 (2006.01)

A61P39/06 (2006.01)

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ Статус: по данным на 17.01.2013 - нет данных Пошлина:

(21), (22) Заявка: 2011122906/04, 06.06.2011

(24) Дата начала отсчета срока действия патента:

06.06.2011

Приоритет(ы):

(22) Дата подачи заявки: 06.06.2011

(45) Опубликовано: 27.01.2013

(56) Список документов, цитированных в отчете о

поиске: WO 2008053360 A2, 08.05.2008. SU 1351052 A1, 20.10.1997.

Адрес для переписки:

414025, г.Астрахань, ул. Татищева, 16, ФГОУ "Астраханский государственный технический университет", патентный отдел

(72) Автор(ы):

Кудрявцев Константин Викторович (RU),

Берберова Надежда Титовна (RU),

Осипова Виктория Павловна (RU),

Антонова Наталья Александровна (RU)

(73) Патентообладатель(и):

Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Астраханский государственный технический университет (ФГОУ ВПО АГТУ) (RU)

(54) АМИДЫ 2-(2-ГИДРОКСИФЕНИЛТИО)УКСУСНОЙ КИСЛОТЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ

(57) Реферат:

Изобретение относится к амидам 2-(2-гидроксифенилтио)уксусной кислоты, обладающих антиоксидантной активностью, представляющих собой производные фенола, содержащие в орто-положении тиоацетамидный фрагмент, общей формулы:

где R 1 =H, Me; R 2 =H, CH 2 COOMe, CH(Me)COOMe, CH(Et)COOMe, CH(i-Pr)COOMe, CH(i-Bu)COOMe, CH(Bn)COOMe, CH(4-HOBn)COOMe, CH(CH 2 CH 2 SMe)COOMe, CH 2 COOH, CH(Me)COOH, CH(Et)COOH, CH(i-Pr)COOH, CH(i-Bu)COOH, CH(Bn)COOH, CH(4-HOBn)COOH, CH(CH 2 CH 2 SMe)COOH, CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH(NH 2 )COOH, CH 2 CH 2 CH 2 CH(NH 2 )COOH; R 3 =H; R 2 ,R 3 =CH 2 CH 2 N(C(O)CH 2 S(2-OHPh))CH 2 CH 2 ; R 2 ,R 3 =CH 2 CH 2 CH 2 CH(COOMe); R 2 , R 3 =CH 2 CH 2 CH 2 CH(COOH). А также к способу их получения. Соединения обладают антиоксидантной активностью, что позволяет использовать их для снижения скорости пероксидного окисления липидов. 2 н.п. ф-лы, 3 табл., 8 пр.

Изобретение относится к медицинской и органической химии и медицине, в частности к новым производным фенолов, содержащим в орто-положении тиоацетамидный фрагмент, общей формулы:

где R 1 =Н, Me; R 2 =Н, СН 2 СООМе, СН(Ме)СООМе, CH(Et)COOMe, CH(i-Pr)COOMe, CH(i-Bu)COOMe, CH(Bn)COOMe, CH(4-HOBn)COOMe, CH(CH 2 CH 2 SMe)COOMe, СН 2 СООН, СН(Ме)СООН, CH(Et)COOH, CH(i-Pr)COOH, CH(i-Bu)COOH, СН(Bn)СООН, CH(4-HOBn)COOH, CH(CH 2 CH 2 SMe)COOH, CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH(NH 2 )COOH, CH 2 CH 2 CH 2 CH(NH 2 )COOH; R 3 =Н; R 2 ,R 3 =CH 2 CH 2 N(C(O)CH 2 S(2-OHPh))CH 2 CH 2 ; R 2 ,R 3 =CH 2 CH 2 CH 2 CH(COOMe); R 2 ,R 3 =СН 2 СН 2 СН 2 СН(СООН). Соединения обладают антиоксидантной активностью, что позволяет использовать их для снижения скорости пероксидного окисления липидов.

Пространственно-затрудненные фенолы по структуре и биологической активности являются наиболее близкими аналогами [Зайцев В.Г., Островский О.В., Закревский В.И. Связь между химическим строением и мишенью действия как основа классификации антиоксидантов прямого действия // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2003. - Т.66. - 4. - С.66-70.], но недостатками данных соединений является то, что их необходимо использовать в достаточно высоких дозах, так как они расходуются в ходе защитных реакций, и проявление в определенных условиях прооксидантных свойств.

Прототипом патентуемого класса соединений является ионол (2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенол) - липофильный препарат, антиоксидантные свойства которого объясняются образованием стабильного феноксильного радикала, способного связывать активные формы и соединения кислорода, не вовлекаясь в цепи окислительных превращений, тем самым прерывая цепи окисления в субстрате [Rice-Evans С.A., Diplock A.T. Current status of antioxidant therapy // Free Radical Biol. Med. - 1993. - Vol. 15. - P.77-96.]. При применении ионола в высоких дозах отмечается подавление ферментной антиоксидантной системы за счет образования продуктов окислительной модификации и увеличение образования кислородных радикалов, то есть установлена инверсия антиоксидантного действия в прооксидантное.

Техническим результатом, на достижение которого направлено данное изобретение, является получение новых производных фенола, содержащих в opто-положении тиоацетамидный фрагмент, обладающих выраженной антиоксидантной активностью в минимальных концентрациях, увеличение растворимости препаратов в водных средах за счет образования фенолятов, солей между аминным фрагментом соединений в заместителях R 2 и/или R 3 и неорганическими и органическими кислотами, солей между карбоксильной группой соединений в заместителях R 2 и/или R 3 и неорганическими и органическими основаниями; способ получения новых производных фенола, содержащих в орто-положении тиоацетамидный фрагмент.

Технический результат достигается тем, что предложены производные фенолов, содержащие в opто-положении тиоацетамидный фрагмент, общей формулы:

где R 1 =Н, Me; R 2 =Н, CH 2 COOMe, СН(Ме)СООМе, CH(Et)COOMe, СН(i-Pr)СООМе, СН(i-Bu)СООМе, СН(Bn)СООМе, СН(4-HOBn)СООМе, CH(CH 2 CH 2 SMe)COOMe, CH 2 COOH, СН(Ме)СООН, CH(Et)COOH, CH(i-Pr)COOH, СН(i-Bu)СООН, СН(Bn)СООН, CH(4-HOBn)COOH, CH(CH 2 CH 2 SMe)COOH, CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH(NH 2 )СООН, CH 2 CH 2 CH 2 CH(NH 2 )COOH; R 3 =Н; R 2 ,R 3 =CH 2 CH 2 N(C(O)CH 2 S(2-OHPh))CH 2 CH 2 ; R 2 ,R 3 =CH 2 CH 2 CH 2 CH(COOMe); R 2 ,R 3 =CH 2 CH 2 CH 2 CH(СООН), обладающие антиоксидантной активностью.

Предлагаемое изобретение представлено химической структурой новых соединений класса амидов 2-(2-гидроксифенилтио)уксусной кислоты общей формулы:

где R 1 =Н, Me; R 2 =Н, CH 2 COOMe, СН(Ме)СООМе, CH(Et)COOMe, CH(i-Pr)COOMe, СН(i-Bu)СООМе, CH(Bn)COOMe, CH(4-HOBn)COOMe, CH(CH 2 CH 2 SMe)COOMe, СН 2 СООН, СН(Ме)СООН, CH(Et)COOH, CH(i-Pr)COOH, CH(i-Bu)COOH, СН(Bn)СООН, CH(4-HOBn)COOH, CH(CH 2 CH 2 SMe)COOH, CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH(NH 2 )COOH, CH 2 CH 2 CH 2 CH(NH 2 )COOH; R 3 =Н; R 2 ,R 3 =CH 2 CH 2 N(C(O)CH 2 S(2-OHPh))CH 2 CH 2 ; R 2 ,R 3 =СН 2 СН 2 СН 2 СН(СООМе); R 2 ,R 3 =СН 2 СН 2 СН 2 СН(СООН), обладающих антиоксидантной активностью.

Заявляемые соединения представляют собой бесцветные или слабоокрашенные кристаллические вещества, хорошо растворимые в хлористом метилене, хлороформе, тетрагидрофуране, спирте, диметилсульфоксиде, воде. Улучшение растворимости в воде может быть достигнута путем солеобразования с эквимолярным количеством неорганических (соляная, серная и др.) или органических (щавелевая, трифторуксусная и др.) кислот или неорганических (NaOH, KOH и др.) или органических (триэтиламин, пиперидин и др.) оснований. Структура и индивидуальность заявляемых соединений подтверждены элементным анализом, данными ЯМР 1 Н, ЯМР 13 C, тонкослойной хроматографии.

Технический результат достигается также тем, что предложен способ получения ранее неизвестных амидов 2-(2-гидроксифенилтио)уксусной кислоты, обладающих выраженной антиоксидантной активностью, при котором в качестве ключевой стадии использована реакция взаимодействия аминов различного строения и гетероциклических лактонов общей формулы:

где R 1 =Н, Me.

Предлагаемый способ заключается в том, что растворы гетероциклического лактона и соответствующего амина смешивают в атмосфере аргона и нагревают при перемешивании с последующим фильтрованием осадка или концентрированием органической фазы при пониженном давлении, и очисткой остатка при помощи хроматографии на силикагеле с использованием CHCl 3 /МеОН в качестве элюента.

Пример 1. Получение метилового эфира (S)-2-(2-(2-гидроксифенилтио)ацетамидо)-4-(метилтио)бутановой кислоты (I)

К раствору 1.550 г 1,4-бензооксатиин-2(3H)-она в 35 мл четыреххлористого углерода при нагревании до +50°C и перемешивании добавляют раствор 1.300 г метилового эфира L-метионина в 15 мл четыреххлористого углерода и перемешивают при температуре +50°C 6 часов. После охлаждения до комнатной температуры выпавший осадок фильтруют, промывают 5 мл четыреххлористого углерода и сушат на воздухе. Получают 2.500 г (81%) заявленного соединения в виде бесцветных кристаллов, т.пл. 71-72°C. [ ] D 20 +19.67 (с=1, CHCl 3 ). 1 H ЯМР (400 MHz; CDCl 3 ): 8.17 (br.s, 1H), 7.47 (d, J 7.8, 1H), 7.28-7.24 (m, 1H). 6.96 (d, J 8.1, 1H), 6.92 (d, J 7.6, 1H), 6.84 (t, J 7.8. 1H), 4.74-4.69 (m, 1H), 3.75 (s, 3Н), 3.55-3.47 (m, 2H), 2.39 (ddd, J 19.4, 13.4, 6.2, 2H), 2.14 (td, J 13.4, 7.2, 1H), 2.06 (s, 3H), 1.96 (dq, J 14.6, 7.2, 1H). 13 С ЯМР (100 MHz; CDCl 3 ): 172.05, 169.63, 157.83, 136.01, 131.65, 120.71, 118.50, 116.47, 52.71, 52.17, 40.53, 31.35, 29.76, 15.42. Вычислено, %: C 14 H 19 NO 4 S 2 : С, 51.04; Н, 5.81; N, 4.25. Найдено, %: C, 50.92; H, 5.71; N, 4.39.

Получено новое производное фенола, содержащего в opто-положении тиоацетамидный фрагмент, обладающее выраженной антиоксидантной активностью.

Пример 2. Получение 1,1'-(пиперазин-1,4-диил)бис(2-(2-гидроксифенилтио)этанона) (II).

К раствору 1.900 г 1,4-бензооксатиин-2(3H)-она в 25 мл бензола при нагревании до +40°C и перемешивании добавляют раствор 0.450 г пиперазина в 25 мл хлороформа и перемешивают при температуре +50°C 3 часа. После охлаждения до комнатной температуры выпавший осадок фильтруют, промывают 5 мл четыреххлористого углерода и сушат на воздухе. Получают 1.680 г (77%) заявленного соединения в виде бесцветных кристаллов, т.пл. 111-113°C. 1 Н ЯМР (400 MHz; ДМСО-d 6 ): 9.94 (br.s, 2H), 7.30 (d, J 7.5, 2H), 7.08 (t, J 7.8, 2H), 6.83 (d, J 7.8, 2H), 6.77 (t, J 7.5, 2H), 3.85 (d, J 5.3, 4H), 3.55 (s, 2H), 3.46 (s, 4H), 3.41 (s, 2H). 13 C ЯМР (100 MHz; ДМСО-d 6 ): 167.55, 156.43, 131.55, 128.47. 121.25, 120.03, 115.53, 46.03, 45.65, 42.02, 41.68, 35.04. Вычислено, %: C 20 H 22 N 2 O 4 S 2 : С, 57.40; Н, 5.30; N, 6.69. Найдено, %: С, 57.53; Н, 5.32; N, 6.49.

Получено новое производное фенола, содержащего в орто-положении тиоацетамидный фрагмент, обладающее выраженной антиоксидантной активностью.

Пример 3. Получение метилового эфира (S)-1-(2-(2-гидроксифенилтио)ацетил)пирролидин-2-карбоновой кислоты (III)

К раствору 2.000 г 1,4-бензооксатиин-2(3H)-она в 35 мл четыреххлористого углерода при нагревании до +50°C и перемешивании добавляют раствор 1.600 г метилового эфира L-пролина в 15 мл четыреххлористого углерода и перемешивают при температуре +50°C 6 часов. После охлаждения до комнатной температуры выпавший осадок фильтруют, промывают 5 мл четыреххлористого углерода и сушат на воздухе. Получают 3.380 г (95%) заявленного соединения в виде бесцветных кристаллов, т.пл. 153-154°C. [ ] D 20 -51.43 (с=1.23, CH 2 Cl 2 ). 1 Н ЯМР (400 MHz; CDCl 3 ): 9.19 (br.s, 1H). 7.52-7.48 (m, 1H), 7.29-7.24 (m, 1H), 7.00-6.96 (m, 1H), 6.83-6.78 (m, 1H), 4.53 (dd, J 8.5, 3.7, 1H), 3.73 (s, 3H), 3.68-3.64 (m, 1H), 3.64-3.54 (m, 2H), 3.43-3.38 (m, 1H), 2.22-1.88 (m, 4H). Вычислено, %: C 14 H 17 NO 4 S: С, 56.93; Н, 5.80; N, 4.74. Найдено, %: С, 57.02; Н, 5.73; N, 4.59.

Получено новое производное фенола, содержащего в opто-положении тиоацетамидный фрагмент, обладающее выраженной антиоксидантной активностью.

Пример 4. Получение метилового эфира (S)-2-(2-(2-гидроксифенилтио)ацетамидо)-4-метилпентановой кислоты (IV)

К раствору 1.000 г 1,4-бензооксатиин-2(3H)-она в 15 мл четыреххлористого углерода при нагревании до +50°C и перемешивании добавляют раствор 0.870 г метилового эфира L-лейцина в 5 мл четыреххлористого углерода и перемешивают при температуре +50°C 6 часов. После охлаждения до комнатной температуры выпавший осадок фильтруют, промывают 5 мл четыреххлористого углерода и сушат на воздухе. Получают 1.457 г (78%) заявленного соединения в виде бесцветных кристаллов, т.пл. 93-95°C. [ ] D 20 -22.00 (с=1.05, CH 2 Cl 2 ). 1 H ЯМР (400 MHz; CDCl 3 ): 8.32 (br.s, 1Н), 7.46 (dd, J 7.6, 1.6, 1H), 7.27-7.22 (m, 1H), 6.96 (dd, J 8.1, 1.3, 1H), 6.83 (td, 7.6, 1.3, 1H), 6.68 (d, J 8.3, 1H), 4.67-4.61 (m, 1H), 3.73 (s, 3H), 3.54-3.45 (m, 2H), 1.67-1.58 (m, 1H), 1.56-1.47 (m, 2H), 0.91 (d, J 6.4, 3H), 0.89 (d, J 6.4, 3H). 13 С ЯМР (100 MHz; CDCl 3 ): 173.23, 169.66, 157.87, 135.93, 131.51, 120.59, 118.62, 116.51, 52.47, 51.34, 41.52, 40.42, 24.71, 22.71, 21.89. Вычислено, %: C 15 H 21 NO 4 S: С, 57.86; Н, 6.80; N, 4.50. Найдено, %: С, 57.97; Н. 6.83; N, 4.59.

Получено новое производное фенола, содержащего в орто-положении тиоацетамидный фрагмент, обладающее выраженной антиоксидантной активностью.

Пример 5. Получение (5)-2-амино-6-(2-(2-гидроксифенилтио)ацетамидо)гексановой кислоты (V)

К раствору 1.500 г 1,4-бензооксатиин-2(3H)-она в 12 мл метанола при нагревании до +40°C и перемешивании добавляют раствор 0.700 г L-лизина в 40 мл 80%-ного метанола и перемешивают при температуре +50°C 10 часов. После охлаждения до комнатной температуры добавляют 150 мл ацетона, выпавший осадок фильтруют, промывают 15 мл ацетона и сушат в вакууме. Получают 1.680 г (40%) заявленного соединения в виде кремовых кристаллов, т.пл. 198-199°C. 1 Н ЯМР (400 MHz; D 2 O): 7.29 (dd, J 8.0, 1.5, 1H), 7.18 (td, J 8.0, 1.5, 1H), 6.86 (d, J 8.0, 1H), 6.83 (t, J 8.0, 1H), 3.55 (t, J 6.5, 1H), 3.41 (s, 2H), 2.95 (t, J 6.5, 1H), 1.80-1.00 (m, 8H). 13 С ЯМР (100 MHz; ДМСО-d 6 ): 171.59, 168.79, 156.46, 130.73, 128.12, 121.97, 119.75, 115.75, 54.39, 39.19, 36.80, 31.03, 29.06, 22.83. Вычислено, %: C 14 H 20 N 2 O 4 S: С, 53.83; Н, 6.45; N, 8.97. Найдено, %: С, 54.14; Н, 6.52; N, 8.75.

Получено новое производное фенола, содержащего в орто-положении тиоацетамидный фрагмент, обладающее выраженной антиоксидантной активностью.

Пример 6. Исследование синтезированных соединений в качестве антиоксидантов

Антиоксидантная активность соединений изучена на примере модельной системы пероксидного окисления липидов гомогената печени гибрида белорыбицы и севрюги по накоплению ТБК-зависимых продуктов.

Навеску 0.5 г печени гомогенизировали в 19.5 мл охлажденного до 0-4°C раствора хлорида калия, поместив стакан гомогенизатора в лед или снег. Полученный гомогенат сливали в емкость. Исследуемый антиоксидант вносили в гомогенат печени в виде раствора в хлороформе. Конечная концентрация исследуемого соединения составляла 1·10 -4 моль/л. Изменение скорости пероксидного окисления липидов в гомогенате печени осетра в присутствии исследуемых соединений оценивали в течение 24 часов путем отбора 2 мл гомогената из соответствующей емкости и выполнением всех необходимых операций. Брали 3 сухие пробирки. В первую пробирку (холостая проба без добавки антиоксиданта) наливали 2.0 мл гомогената и по 0.1 мл растворов аскорбиновой кислоты и соли Мора, добавляли 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты. Во вторую пробирку (рабочая проба с добавкой антиоксиданта) наливали 2.0 мл гомогената с антиоксидантом и по 0.1 мл растворов аскорбиновой кислоты и соли Мора, 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты. В третьей пробирке готовили контрольную пробу (без гомогената). Для этого в пробирку наливали 2 мл раствора хлорида калия, 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты и 1 мл раствора тиобарбитуровой кислоты.

Первую и вторую пробирки помещали на 10 мин в водяную баню при 37°C, затем центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. После этого отбирали в чистые пробирки по 2 мл надосадочной жидкости, приливали по 1 мл раствора тиобарбитуровой кислоты, помещали пробы в кипящую водяную баню на 10 мин вместе с контрольной пробиркой и затем охлаждали все пробирки в ледяной воде до комнатной температуры. После того как пробы охладились, в первую и вторую пробирки добавляют 1.0 мл хлороформа для получения прозрачного раствора и ставили центрифугировать на 15 мин при частоте оборотов 3000 об/мин.

Верхнюю фазу отбирали и измеряли экстинкцию пробы по сравнению с контрольным раствором на спектрофотометре СФ-103 в кювете с толщиной слоя 1.0 см.

Расчет проводили по формуле:

Х=(Е·3·3.2)/(0.156·2),

где x - содержание малонового диальдегида в исходном гомогенате печени, нмоль; Е - экстинкция проб; 3.2 - общий объем исследуемых проб, мл; 2 - объем надосадочной жидкости, взятой на определение малонового диальдегида, мл; 3 - объем проб, взятых на фотометрию, мл; 0.156 - экстинкция 1 нмоль малонового диальдегида в 1 мл при 532 нм.

В отдельном эксперименте было подтверждено отсутствие в данных условиях влияния хлороформа на скорость ПОЛ в печени.

Для исследованных соединений рассчитана эффективность антиоксидантного действия (ЭАД) по формуле:

ЭАД=[(С 0 -С 1 )/С 0 ]·100%,

где С 0 - концентрация ТБК-зависимых продуктов к гомогенате печени (контроль), С 1 - концентрация ТБК-зависимых продуктов в гомогенате печени, содержащем исследуемое соединение.

При положительном значении показателя ЭАД тестируемое вещество проявляет антиоксидантное действие; при отрицательном значении - прооксидантное действие. Данные опытов представлены в таблице 1.

Таблица 1

ЭАД (%) некоторых соединений при пероксидном окислении липидов гомогената печени гибрида белорыбицы и севрюги in vitro

Соединение

ЭАД%

1 ч

3 ч

24 ч

I

18

23

41

II

9

23

56

III

41

47

49

IV

32

20

44

V

14

33

51

ионол

52

63

51

тролокс

10

10

44

Проведенные исследования показали, что все синтезированные соединения в концентрации 1·10 -4 М эффективно снижают уровень пероксидного окисления липидов гомогената печени гибрида белорыбицы и севрюги, что свидетельствует об антиоксидантной активности исследуемых соединений.

Пример 7. Исследование синтезированных соединений в качестве антиоксидантов. Антиоксидантная активность соединений изучена на примере модельной системы пероксидного окисления липидов спермы русского осетра по накоплению ТБК-зависимых продуктов. Скорость ПОЛ определяли по методу, описанному в примере 6, по накоплению в сперме карбонильных продуктов, определяемых с помощью тиобарбитуровой кислоты (ТБК).

Сперму в количестве 1 мл смешивали с 19.5 мл охлажденного до 0-4°C раствором хлорида калия, полученный раствор сливали в емкость.

Исследуемый антиоксидант вносили в полученный раствор спермы с хлоридом калия в виде раствора в хлороформе. Конечная концентрация исследуемого соединения составляла 1·10 -4 моль/л. Изменение скорости пероксидного окисления липидов спермы русского осетра в присутствии исследуемых соединений оценивали в течение суток путем отбора 2 мл раствора из соответствующей емкости и выполнением всех необходимых операций. Брали 3 сухие пробирки. В первую пробирку (холостая проба без добавки антиоксиданта) наливали 2.0 мл раствора спермы и по 0.1 мл растворов аскорбиновой кислоты и соли Мора, добавляли 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты. Во вторую пробирку (рабочая проба с добавкой антиоксиданта) наливали 2.0 мл раствора спермы с антиоксидантом и по 0.1 мл растворов аскорбиновой кислоты и соли Мора, 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты. В третьей пробирке готовили контрольную пробу (без спермы). Для этого в пробирку наливали 2 мл раствора хлорида калия, 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты и 1 мл раствора тиобарбитуровой кислоты.

Первую и вторую пробирки помещали на 10 мин в водяную баню при 37°C, затем центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. После этого отбирали в чистые пробирки по 2 мл надосадочной жидкости, приливали по 1 мл раствора тиобарбитуровой кислоты, помещали пробы в кипящую водяную баню на 10 мин вместе с контрольной пробиркой и затем охлаждали все пробирки в ледяной воде до комнатной температуры. После того как пробы охладились, в первую и вторую пробирки добавляют 1.0 мл хлороформа для получения прозрачного раствора и ставили центрифугировать на 15 мин при частоте оборотов 3000 об/мин.

Верхнюю фазу отбирали и измеряли экстинкцию пробы по сравнению с контрольным раствором на спектрофотометре СФ-103 в кювете с толщиной слоя 1.0 см.

Расчет проводили по формуле:

Х=(Е·3·3.2)/(0.156·2),

где x - содержание малонового диальдегида в исходном растворе спермы, нмоль; Е - экстинкция проб; 3.2 - общий объем исследуемых проб, мл; 2 - объем надосадочной жидкости, взятой на определение малонового диальдегида, мл; 3 - объем проб, взятых на фотометрию, мл; 0.156 - экстинкция 1 нмоль малонового диальдегида в 1 мл при 532 нм.

В отдельном эксперименте было подтверждено отсутствие в данных условиях влияния хлороформа на скорость ПОЛ спермы.

Для исследованных соединений рассчитана эффективность антиоксидантного действия (ЭАД) по формуле:

ЭАД=[(С 0 -С 1 )/С 0 ]·100%,

где С 0 - концентрация ТБК-зависимых продуктов в сперме (контроль), С 1 - концентрация ТБК-зависимых продуктов в сперме, содержащей исследуемое соединение.

При положительном значении показателя ЭАД тестируемое вещество проявляет антиоксидантное действие; при отрицательном значении - прооксидантное действие. Данные опытов представлены в таблице 2.

Таблица 2 -

ЭАД (%) некоторых соединений при пероксидном окислении липидов спермы русского осетра in vitro

Соединение

ЭАД %

1 ч

3 ч

24 ч

I

26

70

61

II

16

69

65

III

32

41

65

IV

56

22

26

v

24

37

45

ионол

-12

30

10

тролокс

-24

11

19

Проведенные исследования показали, что все синтезированные соединения в концентрации 1·10 -4 М эффективно снижают уровень пероксидного окисления липидов спермы русского осетра, что свидетельствует об антиоксидантной активности исследуемых соединений.

Пример 8. Исследование синтезированных соединений в качестве антиоксидантов Антиоксидантная активность соединений изучена на примере модельной системы пероксидного окисления липидов жабр гибрида белорыбицы и севрюги по накоплению ТБК-зависимых продуктов в течение суток. Скорость ПОЛ определяли по методу, описанному в примере 6, по накоплению в гомогенате жабр карбонильных продуктов, определяемых с помощью тиобарбитуровой кислоты (ТБК).

Навеску 0.5 г жабр гомогенизировали в 19.5 мл охлажденного до 0-4°C раствора хлорида калия, поместив стакан гомогенизатора в лед или снег. Полученный гомогенат сливали в емкость.

Исследуемый антиоксидант вносили в гомогенат жабр в виде раствора в хлороформе. Конечная концентрация исследуемого соединения составляла 1·10 -4 моль/л. Изменение скорости пероксидного окисления липидов гомогената жабр осетровых в присутствии исследуемых соединений оценивали в течение 24 часов путем отбора 2 мл гомогената из соответствующей емкости и выполнением всех необходимых операций. Брали 3 сухие пробирки. В первую пробирку (холостая проба без добавки антиоксиданта) наливали 2.0 мл гомогената и по 0.1 мл растворов аскорбиновой кислоты и соли Мора, добавляли 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты. Во вторую пробирку (рабочая проба с добавкой антиоксиданта) наливали 2.0 мл гомогената с антиоксидантом и по 0.1 мл растворов аскорбиновой кислоты и соли Мора, 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты. В третьей пробирке готовили контрольную пробу (без гомогената). Для этого в пробирку наливали 2 мл раствора хлорида калия, 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты и 1 мл раствора тиобарбитуровой кислоты.

Первую и вторую пробирки помещали на 10 мин в водяную баню при 37°C, затем центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. После этого отбирали в чистые пробирки по 2 мл надосадочной жидкости, приливали по 1 мл раствора тиобарбитуровой кислоты, помещали пробы в кипящую водяную баню на 10 мин вместе с контрольной пробиркой и затем охлаждали все пробирки в ледяной воде до комнатной температуры. После того как пробы охладились, в первую и вторую пробирки добавляют 1.0 мл хлороформа для получения прозрачного раствора и ставили центрифугировать на 15 мин при частоте оборотов 3000 об/мин.

Отбирали верхнюю фазу и измеряли экстинкцию пробы по сравнению с контрольным раствором на спектрофотометре СФ-103 в кювете с толщиной слоя 1.0 см.

Расчет проводили по формуле:

Х=(Е·3·3.2)/(0.156·2),

где x - содержание малонового диальдегида в исходном гомогенате, нмоль; Е - экстинкция проб; 3.2 - общий объем исследуемых проб, мл; 2 - объем надосадочной жидкости, взятой на определение малонового диальдегида, мл; 3 - объем проб, взятых на фотометрию, мл; 0.156 - экстинкция 1 нмоль малонового диальдегида в 1 мл при 532 нм.

В отдельном эксперименте было подтверждено отсутствие в данных условиях влияния хлороформа на скорость ПОЛ гомогената жабр.

Для исследованных соединений рассчитана эффективность антиоксидантного действия (ЭАД) по формуле:

ЭАД=[(С 0 -С 1 )/С 0 ]·100%,

где С 0 - концентрация ТБК-зависимых продуктов в гомогенате жабр (контроль), С 1 - концентрация ТБК-зависимых продуктов в гомогенате жабр, содержащем исследуемое соединение.

При положительном значении показателя ЭАД тестируемое вещество проявляет антиоксидантное действие; при отрицательном значении - прооксидантное действие. Данные опытов представлены в таблице 3.

Таблица 3

ЭАД (%) некоторых соединений при пероксидном окислении липидов гомогената жабр гибрида белорыбицы и севрюги in vitro

Соединение

ЭАД %

1 ч

3 ч

24 ч

I

34

47

40

II

8

43

43

III

58

37

46

IV

39

37

40

V

19

47

29

Проведенные исследования показали, что все синтезированные соединения в концентрации 1·10 -4 М эффективно снижают уровень пероксидного окисления липидов гомогената жабр гибрида белорыбицы и севрюги, что свидетельствует об антиоксидантной активности исследуемых соединений.

Формула изобретения

1. Амиды 2-(2-гидроксифенилтио)уксусной кислоты, обладающие антиоксидантной активностью, представляющие собой производные фенола, содержащие в орто-положении тиоацетамидный фрагмент, общей формулы:

где R 1 =H, Me; R 2 =H, СН 2 СООМе, СН(Ме)СООМе, CH(Et)COOMe, CH(i-Pr)COOMe, CH(i-Bu)COOMe, CH(Bn)COOMe, CH(4-HOBn)COOMe, CH(CH 2 CH 2 SMe)COOMe, CH 2 COOH, CH(Me)COOH, CH(Et)COOH, CH(i-Pr)COOH, CH(i-Bu)COOH, CH(Bn)COOH, CH(4-HOBn)COOH, CH(CH 2 CH 2 SMe)COOH, CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH(NH 2 )COOH, СН 2 СН 2 СН 2 СН(NH 2 )СООН; R 3 =H; R 2 ,R 3 =CH 2 CH 2 N(C(O)CH 2 S(2-OHPh))CH 2 CH 2 ; R 2 ,R 3 =CH 2 CH 2 CH 2 CH(COOMe); R 2 ,R 3 =CH 2 CH 2 CH 2 CH(COOH).

2. Способ получения амидов 2-(2-гидроксифенилтио)уксусной кислоты, общей формулы:

где R 1 =H, Me; R 2 =H, CH 2 COOMe, CH(Me)COOMe, CH(Et)COOMe, CH(i-Pr)COOMe, CH(i-Bu)COOMe, CH(Bn)COOMe, CH(4-HOBn)COOMe, CH(CH 2 CH 2 SMe)COOMe, CH 2 COOН, СН(Ме)СООН, CH(Et)COOH, CH(i-Pr)COOH, CH(i-Bu)COOH, CH(Bn)COOH, CH(4-HOBn)COOH, CH(CH 2 CH 2 SMe)COOH, CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH(NH 2 )COOH, CH 2 CH 2 CH 2 CH(NH 2 )COOH; R 3 =H; R 2 ,R 3 =CH 2 CH 2 N(C(O)CH 2 S(2-OHPh))CH 2 CH 2 ; R 2 ,R 3 =CH 2 CH 2 CH 2 CH(COOMe); R 2 ,R 3 =CH 2 CH 2 CH 2 CH(СООН), при котором растворы гетероциклического лактона общей формулы:

где R 1 =H, Me, и соответствующего амина смешивают в атмосфере аргона и нагревают при перемешивании с последующим фильтрованием осадка или концентрированием органической фазы при пониженном давлении и очисткой остатка при помощи хроматографии на силикагеле с использованием CHCl 3 /МеОН в качестве элюента.