Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
Патент на изобретение №2473690

(19)

RU

(11)

2473690

(13)

C2

(51) МПК C12N15/54 (2006.01)

C12N9/10 (2006.01)

C12N15/74 (2006.01)

C12P21/00 (2006.01)

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ Статус: по данным на 17.01.2013 - нет данных Пошлина:

(21), (22) Заявка: 2008145487/10, 21.05.2007

(24) Дата начала отсчета срока действия патента:

21.05.2007

Приоритет(ы):

(30) Конвенционный приоритет:

23.05.2006 US 60/808,099

14.06.2006 US 60/813,856

(43) Дата публикации заявки: 27.06.2010

(45) Опубликовано: 27.01.2013

(56) Список документов, цитированных в отчете о

поиске: US 7045337 В, 16.05.2006. CHIN J. ET AL., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, v.99, no.17, pp.11020-11024. US 20030108885 A, 12.06.2003.

(85) Дата начала рассмотрения заявки PCT на национальной фазе: 23.12.2008

(86) Заявка PCT:

US 2007/012361 20070521

(87) Публикация заявки PCT:

WO 2007/139870 20071206

Адрес для переписки:

190068, Санкт-Петербург, ул. Садовая, 51, офис 303, ООО "ПАТЕНТИКА", пат.пов. М.И.Ниловой, рег. 378

(72) Автор(ы):

ВАНГ Джиангюн (US),

КСИ Джианминг (US),

ШУЛЬЦ Питер Г. (US)

(73) Патентообладатель(и):

ЗЕ СКРИПС РЕСЕЧ ИНСТИТЬЮТ (US)

(54) ГЕНЕТИЧЕСКИ КОДИРУЕМЫЕ ФЛЮОРЕСЦЕНТНЫЕ КУМАРИНОВЫЕ АМИНОКИСЛОТЫ

(57) Реферат:

Настоящее изобретение относится к области биохимии, в частности к способам трансляции белка, и может быть использовано в различных тест-системах, предназначенных для детектирования соединений полипептидной природы. Предложена ортогональная пара, включающая тРНК (О-тРНК) и аминоацил-тРНК синтетазу (О-РС), в которой О-тРНК является супрессорной тРНК, распознающей амбер-кодон, а О-РС представляет собой мутантную форму тирозил-тРНК синтетазы Methanococcus janaschii, предпочтительно аминоацилирующую указанную тРНК неприродной аминокислотой L-(7-гидроксикумарин-4-ил)-этилглицином. Описана система трансляции, обеспечивающая введение в любое выбранное положение интересующего белка, синтезируемого в этой системе, неприродной аминокислоты L-(7-гидроксикумарин-4-ил)-этилглицина, которая включает ортогональную пару по изобретению, названную неприродную аминокислоту и нуклеиновую кислоту, которая кодирует представляющий интерес белок и содержит в выбранном положении селекторный кодон, распознаваемый О-тРНК. 6 н. и 14 з.п. ф-лы, 9 ил., 5 пр.

Текст описания приведен в факсимильном виде.

Формула изобретения

1. Система трансляции, включающая

(a) первую неприродную аминокислоту, которая представляет собой неприродную аминокислоту L-(7-гидроксикумарин-4-ил)-этилглицин;

(b) первую ортогональную аминоацил-тРНК синтетазу (О-РС), содержащую последовательность аминокислот, указанную в SEQ ID NO:2, или консервативный вариант указанной последовательности, при этом SEQ ID NO:2 или консервативный вариант указанной последовательности дополнительно содержит Glu в положении, соответствующем Tyr32; His в положении, соответствующем Leu65; Gly в положении, соответствующем His70; Tyr положении, соответствующем Phe108; His в положении, соответствующем Gln109; Gly в положении, соответствующем Asp158; и Gly положении, соответствующем Leu162; и

(c) первую ортогональную тРНК (О-тРНК), кодируемую последовательностью SEQ ID NO:1,

причем указанная первая О-РС предпочтительно аминоацилирует указанную первую О-тРНК указанной первой неприродной аминокислотой.

2. Система трансляции по п.1, отличающаяся тем, что указанная первая О-РС получена из аминоацил-тРНК-синтетазы Methanococcus jannaschii.

3. Система трансляции по п.1, отличающаяся тем, что указанная первая О-тРНК представляет собой супрессорную тРНК, распознающую амбер-кодон.

4. Система трансляции по п.1, которая дополнительно включает нуклеиновую кислоту, кодирующую представляющий интерес белок, причем указанная нуклеиновая кислота содержит, по меньшей мере, один селекторный кодон, который распознает указанная первая О-тРНК.

5. Система трансляции по п.4, дополнительно содержащая вторую О-РС и вторую О-тРНК, причем указанная вторая О-РС предпочтительно аминоацилирует вторую указанную О-тРНК второй неприродной аминокислотой, которая отлична от указанной первой неприродной аминокислоты, и указанная вторая О-тРНК распознает селекторный кодон, отличный от селекторного кодона, распознаваемого указанной первой О-тРНК.

6. Система трансляции по п.1, отличающаяся тем, что указанная первая О-РС и указанная первая О-тРНК указанной системы экспрессируются в клетке-хозяине, при этом указанная клетка-хозяин представляет собой клетку эубактерии.

7. Система трансляции по п.6, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин представляет собой клетку E.coli.

8. Система трансляции по п.6, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин содержит полинуклеотид, кодирующий указанную первую О-РС, и полинуклеотид, кодирующий указанную первую О-тРНК.

9. Способ получения в системе трансляции белка, содержащего неприродную аминокислоту в выбранном положении, который включает:

(а) обеспечение системы трансляции, содержащей

(i) первую неприродную аминокислоту, которая представляет собой неприродную аминокислоту L-(7-гидроксикумарин-4-ил)-этилглицин,

(ii) первую ортогональную аминоацил-тРНК синтетазу (О-РС), содержащую последовательность аминокислот, соответствующую SEQ ID NO:2, или консервативный вариант указанной последовательности, при этом SEQ ID NO:2 или консервативный вариант указанной последовательности дополнительно содержит Glu в положении, соответствующем Tyr32; His в положении, соответствующем Leu65; Gly в положении, соответствующем His70; Tyr положении, соответствующем Phe108; His в положении, соответствующем Gln109; Gly в положении, соответствующем Asp158; и Gly положении, соответствующем Leu162;

(iii) первую ортогональную тРНК (О-тРНК), кодируемую последовательностью SEQ ID NO:1, и

(b) обеспечение нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный белок, причем указанная нуклеиновая кислота содержит, по меньшей мере, один селекторный кодон, распознаваемый указанной первой О-тРНК;

(c) обеспечение трансляции указанного белка;

(d) выделение указанного белка.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что указанная О-РС получена из аминоацил-тРНК синтетазы Methanococcus jannaschii, или тирозил-тРНК синтетазы Methanococcus jannaschii дикого типа.

11. Способ по п.9, отличающийся тем, что указанное обеспечение системы трансляции включает обеспечение полинуклеотида, кодирующего указанную О-тРНК.

12. Способ по п.9, в котором указанный белок дополнительно содержит вторую неприродную аминокислоту, которая отлична от указанной первой неприродной аминокислоты, и указанная система трансляции дополнительно содержит вторую О-РС и вторую О-тРНК, причем указанная вторая О-РС предпочтительно аминоацилирует указанную вторую О-тРНК второй неприродной аминокислотой, которая отлична от указанной первой неприродной аминокислоты, и указанная вторая О-тРНК распознает селекторный кодон в нуклеиновой кислоте, который отличен от селекторного кодона, распознаваемого первой О-тРНК.

13. Способ по п.9, отличающийся тем, что указанная первая О-РС и указанная первая О-тРНК указанной системы трансляции экспрессируются в клетке-хозяине, содержащей указанную нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный белок, и при этом указанная клетка-хозяин представляет собой клетку эубактерии.

14. Способ по п.13, отличающийся тем, что указанная клетка-хозяин представляет собой клетку Е.coli.

15. Способ по п.13, отличающийся тем, что указанная клетка-хозяин содержит полинуклеотид, кодирующий указанную первую О-РС, и полинуклеотид, кодирующий указанную первую О-тРНК.

16. Аминоацил-тРНК синтетаза, содержащая последовательность аминокислот, соответствующую SEQ ID NO:4, или консервативный вариант указанной последовательности.

17. Полинуклеотид, кодирующий ортогональную аминоацил-тРНК синтетазу (О-РС) по п.16.

18. Полинуклеотид по п.17, отличающийся тем, что указанный полинуклеотид содержит последовательность нуклеотидов, соответствующую SEQ ID NO:5.

19. Экспрессионный вектор, содержащий полинуклеотид по п.17.

20. Клетка-хозяин для получения белка, содержащего неприродную аминокислоту, содержащая вектор по п.19.

РИСУНКИ