Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
Патент на изобретение №2475538

(19)

RU

(11)

2475538

(13)

C2

(51) МПК C12N11/08 (2006.01)

C12N11/12 (2006.01)

C12M1/40 (2006.01)

C12P17/06 (2006.01)

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ Статус: по данным на 18.02.2013 - нет данных Пошлина:

(21), (22) Заявка: 2010122385/10, 18.11.2008

(24) Дата начала отсчета срока действия патента:

18.11.2008

Приоритет(ы):

(30) Конвенционный приоритет:

19.11.2007 PL P383819

(43) Дата публикации заявки: 27.12.2011

(45) Опубликовано: 20.02.2013

(56) Список документов, цитированных в отчете о

поиске: KOSZELEWSKI D; KUREK W; OSTASZEWSKI R. The studies on immobilization of lovastatin esterase. Biotechnology. 2006, p.888-892. BLAIS В W., YAMAZAKI H. Activation of polyester cloth for the immobilization of a polysaccharide antigen. BIOTECHNOLOGY TECHNIQUES, 1990, v.4, 1, p.11-14. US 4556637 A, 03.12.1985. WO 2005040107 A2, 06.05.2005.

(85) Дата начала рассмотрения заявки PCT на национальной фазе: 21.06.2010

(86) Заявка PCT:

PL 2008/000086 20081118

(87) Публикация заявки PCT:

WO 2009/067032 20090528

Адрес для переписки:

190000, Санкт-Петербург, ООО "Перфект-Ассистант", ВОХ-сервис 1125, пат. пов. М.И. Ниловой, рег. 378

(72) Автор(ы):

ОСТАШЕВСКИЙ Ришард (PL),

КОШЕЛЕВСКИЙ Доминик (PL),

КУРЕК Вальдемар (PL),

ПАТРАЛЬСКАЯ Дорота (PL)

(73) Патентообладатель(и):

ИНСТИТУТ ХЕМИ ОРГАНИЧНЕЙ, ПОЛЬСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК (PL)

(54) ФЕРМЕНТ ЛОВАСТАТИН ЭСТЕРАЗА, ИММОБИЛИЗОВАННЫЙ НА ТВЕРДОМ НОСИТЕЛЕ, СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ ФЕРМЕНТА, БИОКАТАЛИЗИРУЕМЫЙ ПРОТОЧНЫЙ РЕАКТОР И СПОСОБ ОЧИСТКИ СИМВАСТАТИНА

(57) Реферат:

Изобретение относится к области биохимии. Предложен фермент ловастатин эстераза, иммобилизованный на водонерастворимом твердом носителе, активированном бифункциональным агентом. При этом твердый носитель представляет собой модифицированную ди-(С 1-6 алкил)амино-С 1-6 алкилцеллюлозу, в другом варианте твердый носитель представляет собой модифицированный амино-С 1-6 алкил-три(С 1-6 алкокси)силаном силикагель, а бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой O-сульфонат циануровой кислоты или галогенангидрид циануровой кислоты. В третьем варианте твердый носитель представляет собой агарозу, а бифункциональный агент представляет собой соединение, соответствующее формуле , как определено в формуле. Предложены способы (варианты) иммобилизации фермента ловастатин эстеразы на указанных водонерастворимых твердых носителях. Согласно способам при механическом перемешивании бифункциональный активирующий агент приводят в контакт с твердым носителем в растворителе. Активированный твердый носитель отделяют фильтрованием, затем сушат и суспендируют в водной смеси, содержащей фермент ловастатин эстеразу, с осуществлением иммобилизации фермента. Суспендированное вещество отделяют фильтрованием, промывают буферным раствором и сушат. Также предложен способ очистки симвастатина, включающий обработку раствора соли симвастатина, содержащего остаточное количество соли ловастатина, иммобилизованным ферментом ловастатин эстеразой, и предложен биокатализируемый проточный реактор со слоем для осуществления данного способа. Реактор включает корпус реактора (1) с внутренним пространством (2), соединенным с входом жидкости (3) и соединенным с выходом жидкости (4), во внутреннем пространстве находится перфорированная пластина, поддерживающая слой (5), содержащий фермент ловастатин эстеразу, иммобилизованный на водонерастворимом твердом носителе. Иммобилизованная ловастатин эстераза по изобретению проявляет по меньшей мере в 5 раз большую гидролитическую активность по отношению к ловастатину и солям ловастатина в присутствии симвастатина и солей симвастатина, чем к симвастатину и солям симвастатина. 17 з.п. ф-лы, 2 ил., 8 табл., 20 пр.

Настоящее изобретение относится к ферменту ловастатин эстеразе, иммобилизованному на твердом носителе, нерастворимом в воде, способу иммобилизации фермента, применению иммобилизованного фермента, биокатализируемому проточному реактору и способу получения и/или очистки симвастатина.

Симвастатин и ловастатин принадлежат к классу соединений, представляющих собой ингибиторы гидрокси-3-метил-глутарил-коэнзим A (HMG-CoA) редуктазы, называемых статинами. Статины значительно снижают риск заболеваний коронарной недостаточности, инсультов мозга и периферического атеросклероза. Вследствие уменьшения отложений холестерина статины стабилизируют атеросклеротические бляшки, улучшают функцию эндотелия сосудов, замедляют рост и миграцию гладкомышечных клеток, также оказывают благоприятное влияние на свертывание крови, фибринолиз и активность тромбоцитов, а также проявляют противовоспалительные свойства. [Tobert J.A. et al., Journal of Clinical Investigations, 1982, April, 69 (4), 913-919; Pedersen T. et al. Lancet (1994) 344, 1383-89; Czynniki Ryzyka. Kwartalnik Polskiego Towarzystwa Bada nad Mia d yc (Risk Factors. Polish Society of Atherosclerosis Research Quarterly) 2003, 40, 5-13].

Ловастатин, соединение, соответствующее формуле I, получают ферментацией с использованием штамма Aspergillus terreus. Симвастатин, соединение, соответствующее формуле II, обладающий более высокой фармакологической активностью и меньшей токсичностью по сравнению с ловастатином, получают полусинтетическим путем из ловастатина.

В патенте США 4,582,915 предложен способ получения симвастатина, который заключается в модификации боковой цепи ловастатина, в соответствии со следующей схемой.

Ловастатин подвергают щелочному гидролизу, и образовавшуюся калийную соль обрабатывают сильным основанием, таким как н-бутиллитий, в присутствии вторичного амина, и далее метилирующим агентом (например, метилиодидом). Итоговая конверсия не превышает 95%. Выделение симвастатина в чистом виде затруднительно, так как примесь остаточного ловастатина может быть отделена, в принципе, только с использованием ВЭЖХ.

Фермент ловастатин эстераза позволяет селективно подвергать гидролизу соли ловастатина в присутствии солей симвастатина. Данный фермент продуцируется гифообразующим грибом Clonostachys compactiuscula (ATCC 38009, АТСС 74178). После конверсии в аммонийные соли смесь симвастатина и ловастатина подвергают реакции ферментативного гидролиза, катализируемой ловастатин эстеразой, что приводит к селективному гидролизу соли ловастатина в «триол», не затрагивая соль симвастатина. Лактонизация смеси кислот в кислых условиях приводит к образованию смеси лактонов, которая может быть разделена кристаллизацией.

Проведение реакции ферментативного гидролиза с использованием природного фермента ловастатин эстеразы приводит к потере фермента, что увеличивает стоимость превращения ловастатина в симвастатин. Применение цельноклеточного материала культуры Clonostachys compactiuscula допустимо, но это усложняет выделение продукта.

Иммобилизация фермента на твердом носителе позволяет устранить эти недостатки. Попытки иммобилизовать ловастатин эстеразу на твердом носителе, нерастворимой в воде, описаны Ostaszewski R. et al., Biotechnology (2006, 888-892). Тем не менее, полученные катализаторы проявляли низкую активность, и иммобилизованный фермент характеризовался отсутствием или значительным снижением селективности гидролиза ловастатина относительно симвастатина, то есть ферментативный процесс приводил к гидролизу и ловастатина, и симвастатина.

Задачей настоящего изобретения является обеспечение фермента ловастатин эстеразы, иммобилизованного на твердом носителе, нерастворимом в воде, способ иммобилизации фермента, применение иммобилизованного фермента, биокатализируемый проточный реактор и способ получения и/или очистки симвастатина.

Фермент ловастатин эстераза, иммобилизованный на водонерастворимом твердом носителе, согласно настоящему изобретению, отличается тем, что фермент ковалентно связан с твердым носителем, активированным по меньшей мере бифункциональным связывающим агентом, при этом иммобилизованная ловастатин эстераза проявляет гидролитическую активность к ловастатину и солям ловастатина, в присутствии симвастатина и/или солей симвастатина, по меньшей мере в 5 раз превышающую активность к симвастатину и солям симвастатина.

Преимущественно, твердый носитель представляет собой полисахарид или модифицированный полисахарид. Полисахарид главным образом представляет собой полигалактозид. В частности, модифицированный полисахарид представляет собой ди-(С 1-6 алкил)амино-С 1-6 алкилцеллюлозу, предпочтительно диэтиламиноэтилцеллюлозу.

Преимущественно, твердый носитель представляет собой силикагель или модифицированный силикагель. В частности, модифицированный силикагель представляет собой силикагель, модифицированный амино-С 1-6 -алкил-три(С 1-6 алкокси)силаном, предпочтительно аминопропилсиланизованный силикагель.

Преимущественно, по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой соединение, соответствующее формуле , где Y представляет собой -SO 2 - или -SO 2 -(CHR) n -SO 2 -, где n представляет собой целое число от 1 до 18, R представляет собой атом водорода или C 1-6 алкил, или Y представляет собой -SO 2 -Ar-SO 2 -, где Ar представляет собой бивалентный арильный радикал, образующийся при удалении двух атомов водорода, непосредственно связанных с атомами углерода ароматического кольца, при этом бивалентный арильный радикал может содержать C 1-6 алкильные заместители. В частности, указанный по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой соединение, соответствующее формуле где Y представляет собой -SO 2 -.

Преимущественно, по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой галогенангидрид циануровой кислоты и/или O-сульфонат циануровой кислоты. В частности, по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой галогенангидрид циануровой кислоты, предпочтительно цианурхлорид.

Преимущественно, твердый носитель представляет собой полигалактозид, и по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой соединение, соответствующее формуле , где Y представляет собой -SO 2 -.

Преимущественно, твердый носитель представляет собой диэтиламиноэтилцеллюлозу, и по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой цианурхлорид.

Преимущественно, твердый носитель представляет собой аминопропилсиланизованный силикагель, и по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой цианурхлорид.

В частности, фермент представляет собой фермент, продуцируемый Clonostachys compactiuscula ATTC 38009, АТСС 74178.

Способ иммобилизации фермента ловастатин эстеразы на твердой нерастворимой в воде подложке согласно настоящему изобретению, характеризуется тем, что в способе используют механическое перемешивание, приводят во взаимодействие галогенангидрид циануровой кислоты с твердым носителем в растворителе, отделяют фильтрованием активированный твердый носитель, сушат активированный твердый носитель и суспендируют в водной смеси, содержащей фермент ловастатин эстеразу до иммобилизации фермента, отделяют суспендированное вещество фильтрованием, промывают буферным раствором и сушат.

Преимущественно, полисахарид или модифицированный полисахарид используют в качестве твердого носителя. В частности, модифицированный полисахарид представляет собой ди-(С 1-6 алкил)амино-С 1-6 алкилцеллюлозу, предпочтительно диэтиламиноэтилцеллюлозу.

Преимущественно, силикагель или модифицированный силикагель используют в качестве твердого носителя. В частности, силикагель, модифицированный амино-C 1-6 алкил-три(С 1-6 алкокси)силаном, предпочтительно аминопропилсиланизованный силикагель, используют в качестве модифицированного силикагеля.

Преимущественно, используемый галогенангидрид циануровой кислоты представляет собой цианурхлорид.

В частности, используют автоклавированный твердый носитель.

Возможно, механическое перемешивание представляет собой встряхивание.

Преимущественно, отфильтрованное вещество промывают водой перед промыванием в буферном растворе.

В частности, галогенангидрид циануровой кислоты приводят в контакт с твердым носителем в присутствии основания и/или буферного раствора.

Используемый водный раствор, содержащий фермент, представляет собой, предпочтительно, протеиновую фракцию вещества, экстрагированного из Clonostachys compactiuscula ATTC 38009, АТСС 74178.

Способ иммобилизации фермента ловастатин эстеразы на твердом носителе, нерастворимом в воде, в соответствии с изобретением, характеризуется тем, что соединение, соответствующее формуле , где Y представляет собой -SO 2 - или -SO 2 -(CHR) n -SO 2 -, где n представляет собой целое число от 1 до 18, R представляет собой атом водорода или C 1-6 алкил, или Y представляет собой -SO 2 -Ar-SO 2 -, где Ar представляет собой бивалентный арильный радикал, образующийся при удалении двух атомов водорода, непосредственно связанных с атомами углерода ароматического кольца, при этом бивалентный арильный радикал возможно содержит C 1-6 алкильные заместители, приводят в контакт с твердым носителем на основе полигалактозы в растворителе при механическом перемешивании, активированный твердый носитель отделяют фильтрованием, активированную твердую подложку сушат и суспендируют в водном растворе, содержащем фермент ловастатин эстеразу, суспендированное вещество отделяют фильтрованием, промывают буферным раствором и сушат.

Преимущественно, соединение, соответствующее формуле , представляет собой соединение, где Y представляет собой -SO 2 -.

В частности, встряхивание используют в качестве механического перемешивания.

Перед промыванием буферным раствором отфильтрованное вещество возможно промывают водой.

Используемый водный раствор, содержащий фермент, представляет собой, предпочтительно, протеиновую фракцию вещества, экстрагированного из Clonostachys compactiuscula ATTC 38009, АТСС 74178.

В соответствии с изобретением фермент ловастатин эстераза, иммобилизованный на твердом носителе, нерастворимом в воде, используют для получения, и/или выделения, и/или очистки симвастатина.

Преимущественно, фермент используют для очистки и/или выделения симвастатина из его смеси с ловастатином.

В частности, фермент используют для селективного гидролиза аммонийной соли ловастатина в триольную соль, в присутствии аммонийной соли симвастатина. Фермент используют, возможно, для селективного гидролиза аммонийной соли ловастатина в триольную соль, в присутствии аммонийной соли симвастатина, в периодичном технологическом процессе. Фермент используют, в частности, для селективного гидролиза аммонийной соли ловастатина в триольную соль, в присутствии аммонийной соли симвастатина, в непрерывном технологическом процессе.

Биокатализируемый проточный реактор с подложкой в соответствии с изобретением отличается тем, что реактор состоит из тела реактора с внутренним пространством, соединенным с подводом жидкости и соединенным с отводом жидкости, во внутреннем пространстве которого находится подложка, содержащая иммобилизованный фермент ловастатин эстеразу.

Преимущественно, подложка содержит фермент, иммобилизованный на твердом носителе, нерастворимом в воде, фермент ковалентно связан с твердым носителем, активированным по меньшей мере бифункциональным связывающим агентом.

В частности, твердый носитель представляет собой полисахарид или модифицированный полисахарид. Полисахарид представляет собой, главным образом, полигалактозид, В частности, модифицированный полисахарид представляет собой ди-(С 1-6 алкил)амино С 1-6 алкилцеллюлозу, предпочтительно диэтиламиноэтилцеллюлозу.

Преимущественно, по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой соединение, соответствующее формуле , где Y представляет собой -SO 2 - или -SO 2 -(CHR) n -SO 2 -, где n представляет собой целое число от 1 до 18, R представляет собой атом водорода или C 1-6 алкил, или Y представляет собой -SO 2 -AC-SO 2 -, где Ar представляет собой бивалентный арильный радикал, образующийся при удалении двух атомов водорода, непосредственно связанных с атомами углерода ароматического кольца, при этом бивалентный арильный радикал может содержать C 1-6 алкильные заместители. В частности, по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой соединение, соответствующее формуле , где Y представляет собой -SO 2 -.

Преимущественно, по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой галогенангидрид циануровой кислоты и/или O-сульфонат циануровой кислоты. В частности, по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой галид циануровой кислоты, предпочтительно цианурхлорид.

Преимущественно, твердый носитель представляет собой полигалактозид, и по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой соединение, соответствующее формуле , где Y представляет собой -SO 2 -.

Преимущественно, твердый носитель представляет собой диэтиламиноэтилцеллюлозу, и по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой цианурхлорид.

Указанный фермент представляет собой фермент, продуцируемый, главным образом, Clonostachys compactiuscula ATTC 38009, ATCC 74178.

Способ получения и/или очистки симвастатина, включающий обработку раствора соли симвастатина, содержащего остаточное количество соли ловастатина, ферментом ловастатин эстеразой до прохождения гидролиза ловастатина для образования триола, отделение триола и выделение симвастатина, по существу не содержащего ловастатин, согласно настоящему изобретению, отличается тем, что раствор соли симвастатина, содержащий остаточное количество соли ловастатина, приводят во взаимодействие с ферментом ловастатин эстеразой, иммобилизованным на твердом носителе, нерастворимом в воде.

Преимущественно, фермент ковалентно связан с твердым носителем, активированным по меньшей мере бифункциональным связывающим агентом.

Преимущественно, твердый носитель представляет собой полисахарид или модифицированный полисахарид. Полисахарид представляет собой, главным образом, полигалактозид. В частности, модифицированный полисахарид представляет собой ди-(С 1-6 алкил)амино С 1-6 алкилцеллюлозу, особенно диэтиламиноэтилцеллюлозу.

Преимущественно, твердый носитель представляет собой силикагель или модифицированный силикагель. В частности, модифицированный силикагель представляет собой силикагель, модифицированный амино-С 1-6 алкил-три(С 1-6 алкокси)силаном, предпочтительно аминопропилсиланизованный силикагель.

Преимущественно, по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой соединение, соответствующее формуле , где Y представляет собой -SO 2 - или -SO 2 -(CHR) n -SO 2 -, где n представляет собой целое число от 1 до 18, R представляет собой атом водорода или C 1-6 алкил, или Y представляет собой -SO 2 -Ar-SO 2 -, где Ar представляет собой бивалентный арильный радикал, образующийся при удалении двух атомов водорода, непосредственно связанных с атомами углерода ароматического кольца, при этом бивалентный арильный радикал может содержать C 1-6 алкильные заместители. В частности, по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой соединение, соответствующее формуле , где Y представляет собой -SO 2 -.

Преимущественно, по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой галогенангидрид циануровой кислоты и/или O-сульфонат циануровой кислоты. В частности, по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой галид циануровой кислоты, особенно цианурхлорид.

Преимущественно, твердый носитель представляет собой полигалактозид, по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой соединение, соответствующее формуле , где Y представляет собой -SO 2 -.

Преимущественно, твердый носитель представляет собой диэтиламиноэтилцеллюлозу, по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой цианурхлорид.

Преимущественно, твердый носитель представляет собой аминопропилсиланизованный силикагель, по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой цианурхлорид.

В частности, взаимодействие раствора соли симвастатина, содержащего остаточное количество соли ловастатина, с ферментом, иммобилизованным на твердом носителе, нерастворимом в воде, проводят при температуре от 26°С до 50°С.

Взаимодействие раствора соли симвастатина, содержащего остаточное количество соли ловастатина, с ферментом, иммобилизованным на твердом носителе, нерастворимом в воде, проводят предпочтительно непрерывно в проточном реакторе.

В частности, фермент представляет собой фермент, продуцируемый Clonostachys compactiuscula ATTC 38009, АТСС 74178.

Иммобилизация фермента делает возможным повторное применение одного и того же фермента без потери активности при правильно настроенных параметрах процесса.

Особенно важно то, что увеличивается сопротивляемость протеолитическому разложению, что позволяет проводить процесс без использования антисептических условий, и таким образом стоимость процесса значительно уменьшается.

Согласно одному варианту реализации изобретения, иммобилизованный фермент содержится в проточном реакторе. В реактор подают смесь статинов, состоящую из 15% ловастатина и 85% симвастатина. Указанная смесь представляет собой типичную смесь, получаемую в процессе химического синтеза. Концентрация соли симвастатина изменяется не более чем на 1%, при этом аммонийная соль ловастатина гидролизуется примерно на 87%. Степень конверсии не меняется в течение длительного гидролиза, а технологическая стабильность поддерживается в течение по меньшей мере 6 месяцев. Таким образом, иммобилизация фермента ловастатин эстеразы приводит к получению стабильного биокатализатора, обладающего стабильностью, достаточной для технологического применения при синтезе симвастатина.

Техническое решение согласно настоящему изобретению проиллюстрировано на фигурах, где на Фигуре 1 представлен разрез биокатализируемого проточного реактора в соответствии с изобретением, на Фигуре 2 представлены изменения степени конверсии ловастатина в зависимости от температуры.

В описании настоящего изобретения и пунктах формулы изобретения термин «триол» обозначает соединение, соответствующее формуле III,

где М представляет собой атом водорода, а также где М представляет собой катион металла или катион аммония, то есть соединение в форме кислоты или в форме соли, соответственно, если не указано иное значение. Так как соединение III в форме кислоты (М=Н) легко превращается в лактон, термин «триол» также может включать форму лактон-диола, соответствующую формуле IV, если не указано иное значение.

Термины «ловастатин» и «симвастатин» относятся к соединениям, обозначаемым формулами 1 и II, соответственно.

В описании настоящего изобретения и пунктов формулы изобретения термины «ловастатин» и «симвастатин» включают формы карбоксильных кислот данных соединений, обозначаемые формулами IV и V (М=Н) соответственно,

,

а также соли соединений, обозначаемых формулами IV и V, если не указано иного значения. Термин «соль ловастатина» представляет собой соединение, соответствующее формуле IV, где М представляет собой катион металла или катион аммония, термин «соль симвастатина» представляет собой соединение, соответствующее формуле V, где М представляет собой катион металла или катион аммония.

В описании настоящего изобретения и пунктах формулы изобретения термин «ловастатин эстераза» относится к пористым или непористым веществам природного или рекомбинантного происхождения, обладающим ферментной активностью, которая заключается в катализе гидролиза ловастатина и солей ловастатина с получением указанного выше триола или соли триола в условиях, при которых соли симвастатина не подвергаются ферментативному гидролизу или подвергаются ферментативному гидролизу со скоростью меньшей по меньшей мере на один порядок.

В описании настоящего изобретения и формуле изобретения водонерастворимый твердый носитель, нерастворимый в воде, представляет собой гранулированную или волокнистую твердый носитель, которая принципиально не подвергается растворению в воде, то есть не образует жидкого раствора или псевдораствора в воде, содержащего больше 0,1 г подложки на 100 г воды.

В описании настоящего изобретения и пунктах формулы изобретения ферментативная активность представляет собой микромолярное количество субстрата (ловастатина или симвастатина), которое гидролизуется в течение одной минуты одним миллиграммом фермента.

В описании настоящего изобретения и пунктах формулы изобретения протеиновая фракция представляет собой порцию смеси, полученной очисткой биологического препарата, в которой определенная общая концентрация протеинов больше нуля.

Гидролитическая активность фермента ловастатин эстеразы к ловастатину и солям ловастатина представляет собой способность гидролизующихся ловастатина и солей ловастатина образовывать указанный выше триол.

Гидролитическая активность фермента ловастатин эстеразы к симвастатину и солям симвастатина представляет собой способность гидролизующихся симвастатина и солей симвастатина образовывать указанный выше триол.

Гидролитическая активность фермента ловастатин эстеразы к ловастатину и солям ловастатина по меньшей мере на один порядок выше, чем гидролитическая активность фермента ловастатин эстеразы к симвастатину и солям симвастатина. Указанная активность может быть изменена путем иммобилизации фермента ловастатин эстеразы на твердом носителе, в частности на твердой нерастворимой в воде подложке. Не ограничивая сущность изобретения конкретной теорией, можно предположить, что вследствие химического связывания вышеуказанного фермента с поверхностью твердого носителя могут произойти модификации пространственной конфигурации фермента, что приводит к изменению относительного расположения активных групп фермента. Поэтому гидролитическая активность фермента ловастатин эстеразы, так же как и активность фермента после иммобилизации на твердом носителе, может отличаться от активности фермента в водной смеси. Такое различие проявляется в потере селективности гидролитической активности после иммобилизации на твердом носителе и/или в уменьшении активности.

Неожиданно было обнаружено, что именно сочетание водонерастворимого твердого носителя с по меньшей мере бифункциональным связывающим агентом обеспечивает возможность получения фермента, иммобилизованного на твердом носителе, нерастворимом в воде, что приводит к гидролитической активности по отношению к ловастатину и солям ловастатина по меньшей мере в 5 раз большей, в присутствии симвастатина и солей симвастатина, чем к симвастатину и солям симвастатина, причем фермент является достаточно активным для того, чтобы быть использованным для очистки и/или выделения симвастатина из смеси с ловастатином.

В способе согласно настоящему изобретению фермент ловастатин эстеразу иммобилизуют на полигалактозном носителе, такой как агароза (предпочтительно Sepharose В4), с использованием по меньшей мере бифункционального агента, соответствующего формуле , где Y представляет собой -SO 2 - или -SO 2 -(CHR) n -SO 2 -, где n представляет собой целое число от 1 до 18, R представляет собой атом водорода или C 1-6 алкил, или Y представляет собой -SO 2 -Ar-SO 2 -, где Ar представляет собой бивалентный арильный радикал, образующийся при удалении двух атомов водорода, непосредственно связанных с атомами углерода ароматического кольца, при этом бивалентный арильный радикал может содержать С 1-6 алкильные заместители. В частности, по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой соединение, соответствующее формуле , где Y представляет собой -SO 2 -, например, дивинилсульфон.

Способ активации твердого носителя на основе полигалактозы, в соответствии с изобретением, заключается во взаимодействии носителя с соединением, соответствующим формуле , предпочтительно дивинилсульфоном, приводящим к образованию активированного твердого носителя. Затем смесь, содержащая фермент ловастатин эстеразу, приготовленная в соответствии с известной техникой, с использованием буферного раствора, приводят в контакт с активированным твердым носителем при механическом перемешивании, в течение периода, достаточного для иммобилизации фермента на твердом носителе. После иммобилизации полученный биокатализатор отделяют фильтрованием, предпочтительно промывают водой и/или буферным раствором. Иммобилизованный фермент, в соответствии с изобретением, затем используют в способах очистки и/или отделения симвастатина.

Фермент, иммобилизованный на твердом носителе с использованием дивинилсульфона в качестве связывающего агента, использовали в реакции гидролиза смеси статинов, содержащей 15% ловастатина и 85% симвастатина, которая представляет собой типичную смесь, полученную в процессе получения симвастатина из ловастатина посредством химического синтеза. Для проведения реакции был разработан и произведен проточный реактор, представленный в разрезе на Фигуре 1. Проточный реактор, в соответствии с изобретением, состоит из тела 1 реактора с внутренним пространством 2, соединенным с подводом жидкости 3 и соединенным с отводом жидкости 4. Во внутреннем пространстве реактора находится подложка 5, содержащая иммобилизованный фермент. Процесс гидролиза проводили непрерывно, подавая раствор смеси аммонийных солей ловастатина и симвастатина через подвод жидкости 3 и получая продукт через отвод жидкости 4. Последовательные порции выходящего продукта были проанализированы при помощи ВЭЖХ с подтверждением того, что концентрация соли симвастатина менялась в течение процесса не более чем на 1% по отношению к первоначальной концентрации. Степень гидролиза аммонийной соли ловастатина составила по меньшей мере 87%. Степень конверсии не изменялась в течение процесса, проводившегося непрерывно в течение 120 часов, подтверждая, что проточный реактор, согласно настоящему изобретению, с подложкой 5, содержащей иммобилизованный фермент ловастатин эстеразу, может быть эффективно использован в способе получения, выделения и/или очистки симвастатина из смеси статинов, содержащей симвастатин и ловастатин.

Технологическую стабильность реактора, в соответствии с изобретением, проверили повторением эксперимента, заключающегося в гидролизе смеси статинов, содержащей 15% ловастатина и 85% симвастатина, после 6-месячного простоя реактора при +4°С. Процесс гидролиза проводили непрерывно, подавая раствор смеси аммонийных солей ловастатина и симвастатина через подвод жидкости 3 с получением продукта из отвода жидкости 4. Последовательные порции выходящего продукта были проанализированы при помощи ВЭЖХ, с подтверждением того, что концентрация соли симвастатина менялась в течение процесса не более чем на 1% по отношению к первоначальной концентрации. Степень гидролиза аммонийной соли ловастатина составила по меньшей мере 96%. Данные, представленные в Таблице 3, показывают, что время простоя проточного реактора значительно не сказывается на его рабочих характеристиках. В течение 25 часов степень конверсии ловастатина оставалась практически неизменной, подтверждая то, что иммобилизованный фермент, согласно настоящему изобретению, сохранял свою активность, так же как и селективность гидролиза солей ловастатина в присутствии солей симвастатина. Следовательно, иммобилизация фермента на твердом носителе приводит к получению стабильного биокатализатора, обладающего стабильностью, достаточной для использования в способе получения, выделения и/или очистки симвастатина.

В другом варианте реализации способа иммобилизации фермента на твердом носителе, согласно настоящему изобретению, активировали твердую нерастворимую в воде подложку, представляющую собой силикагель, модифицированный амино-C 1-6 алкил-три(С 1-6 алкокси)силаном, предпочтительно силикагель, модифицированный аминопропилсилильными группами. Для активации использовали по меньшей мере бифункциональный активирующий агент, представляющий собой производное циануровой кислоты (1,3,5-триазин-2,4,6-триол производное), такое как галогенангидрид циануровой кислоты, или в котором по меньшей мере гидроксильные группы были замещены заместителем галогеном или O-сульфонатной группой, такое как галогенангидрид циануровой кислоты и/или O-сульфонат циануровой кислоты.

Силикагель, модифицированный амино-С 1-6 алкил-три(С 1-6 алкокси)силаном, активировали посредством обработки раствором производного циануровой кислоты с последующим суспендированием в буферном растворе и добавлением смеси, содержащей фермент ловастатин эстеразу, механического перемешивания в течение времени, достаточного для иммобилизации фермента на твердом носителе. Иммобилизацию проводили как с использованием неочищенного фермента, так и фермента, очищенного посредством хроматографии. При использовании аминопропилсиланизованного силикагеля в качестве предпочтительной твердого носителя и цианурхлорида в качестве предпочтительного связывающего агента было определено, что применение очищенного фермента приводит к увеличенной эффективности иммобилизации фермента. Кроме того, иммобилизованный фермент, в соответствии с изобретением, полученный с использованием неочищенного фермента, приводит к активности меньшей, чем у иммобилизованного фермента согласно настоящему изобретению, полученного с использованием очищенного фермента.

В другом варианте реализации способа иммобилизации фермента согласно настоящему изобретению активируют твердый носитель, нерастворимый в воде, такой как целлюлоза, модифицированная ди-(С 1-6 алкил)амино-С 1-6 алкильными группами. Примером такого твердого носителя является диэтиламиноэтилцеллюлоза. Для активации используют по меньшей мере бифункциональный активирующий агент, предпочтительно представляющий собой производное циануровой кислоты (1,3,5-триазин-2,4,6-триол производное), в котором по меньшей мере две гидроксильные группы замещены галогеном или O-сульфонатной группой, такое как галогенангидрид циануровой кислоты и/или O-сульфонат циануровой кислоты.

Целлюлозу, модифицированную ди-(С 1-6 алкил)амино-С 1-6 алкильными группами, активировали с использованием раствора производного циануровой кислоты, возможно в присутствии основания, с получением активированного твердого носителя. Твердый носитель суспендировали в буферном растворе и добавляли смесь, содержащую фермент ловастатин эстеразу, при механическом перемешивании в течение периода, достаточного для иммобилизации фермента на твердом носителе. Иммобилизованный фермент, в соответствии с изобретением, затем используют в процессах получения, выделения и/или очистки симвастатина.

Фермент, иммобилизованный на целлюлозе, модифицированной диэтилоаминоэтильными группами, с использованием хлорангидрида циануровой кислоты в качестве связывающего агента, использовали в процессе гидролиза смеси статинов, смеси аммонийных солей ловастатина и симвастатина, с достижением очень высокой степени конверсии (>99%) соли ловастатина в триол в течение нескольких часов. Фермент, иммобилизованный на твердом носителе диэтиламиноэтилцеллюлозы, обладающий даже большей активностью, получили с использованием активированного твердого носителя диэтиламиноэтилцеллюлозы, предварительно прокаленного в автоклаве.

Полученный иммобилизованный фермент согласно настоящему изобретению использовали в качестве носителя для реактора, в соответствии с изобретением, как показано на Фигуре 1. Реактор поместили в термостатируемый корпус, обладающий температурой, зафиксированной на 28°С. Процесс гидролиза проводили непрерывно, подавая раствор смеси аммонийных солей ловастатина и симвастатина через подвод жидкости 3 и собирая выходящий продукт через отвод жидкости 4. Последовательные порции выходящего продукта анализировали при помощи ВЭЖХ каждые 4 часа. В течение работы реактора скорость потока модифицировали и записывали изменения в степени конверсии ловастатина. Было обнаружено, что уменьшение степени конверсии ловастатина происходит при скорости потока, превышающей предельную скорость потока (т.е. максимальную скорость потока, при которой степень конверсии ловастатина составляет 100%). Для скоростей потока, превышающих предельную скорость потока (когда степени конверсии значительно ниже, чем при предельной скорости потока) были определены изменения степени конверсии ловастатина в зависимости от температуры реактора. Измерения проводили для серий температур. Результаты представлены на диаграмме (Фигура 2).

Было определено, что при 37°С фермент ловастатин эстераза, иммобилизованный на твердом носителе, нерастворимом в воде, в соответствии с изобретением проявляет наибольшую активность (Фигура 2).

Техническое решение согласно настоящему изобретению раскрыто более подробно в нижеследующих примерах. Далее по тексту термин «LE фермент» означает фермент ловастатин эстераза.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Выделение и очистка фермента

LE фермент продуцируется грибом рода Clonostachys compactiuscula, депонированным под номером АТСС 38009. Гриб получали в соответствии с процедурой, описанной в литературе (патент США 5,223,415).

1а. Выделение LE фермента из мицелия

Мицелий Clonostachys compactiuscula (59 г) растирали стеклянной дробью (0,4 г) в жидком азоте в течение 8 часов, затем его экстрагировали фосфатным буфером (60 мл, рН 6,5), а твердые компоненты отделили с помощью центрифугирования (12000 об/мин; 10 минут; 4°С). Супернатант отделили и повторили процедуру экстракции в буферном растворе (40 мл). Супернатанты объединили и отфильтровали через обычный фильтр до выхода фильтрата 110 мл, далее в описании обозначаемого как супернатант Х1 (C протеин =4180 мкг/мл).

1b. Очистка ловастатин эстеразы посредством высаливания активной протеиновой фракции

К супернатанту Х1 (20 мл) добавили сульфат аммония до достижения концентрации 40% (4,62 г, 1 час, 0°С). Далее раствор оставили на 1 час (0°С) и отцентрифугировали (12000 об/мин; 20 мин; 4°С). Супернатант отделили и добавили сульфат аммония до достижения концентрации 85% (6 г; 1 час; 0°С) и отцентрифугировали (12000 об/мин; 20 минут; 4°С). Образовавшийся осадок собрали и растворили в фосфатном буферном растворе (рН 7,8; 20 ммоль; 0,5 моль NaCl) для получения 0,72 мл раствора LE, называемого в дальнейшем раствор Х2 (C протеин =2980 мкг/мл), обладающего специфической активностью 6,62 мкмоль/мин·мг.

1с. Очистка ловастатин эстеразы с помощью хроматографии

Гидрофобную обменную колонку, наполненную Phenyl Sepharose 6-fast flow (26 мл) привели в равновесие с фосфатным буферным раствором (рН 6,5; 1 мл/мин; 5 часов). Далее раствор Х2 (15 мл) поместили в колонку, элюировали фосфатным буферным раствором (рН 6,5; 1,4 мл/мин), бидистиллированной водой (1,4 мл/мин), собирая фракции, содержащие LE фермент. После разделения колонку снова промыли фосфатным буферным раствором (рН 6,5; 1,4 мл/мин; 30 минут). Активные фракции, содержащие LE фермент, объединили и к ним добавили карбонатный буферный раствор (1 мл, рН 9,4; 50 ммоль) с получением 12,5 мл раствора (С протеин =21 мкг/мл), в дальнейшем именуемого раствор Х3, обладающего специфической активностью 290 мкмоль/мин·мг (по данным ВЭЖХ).

Пример 2. Иммобилизация LE фермента на Sepharose 84 (гель агароза)

2а. Активация твердого носителя

Sepharose B4 (5 мл) промыли водой (20×5 мл), фосфатным буферным раствором (1/15 М, рН 5,6, 20×5 мл), водой (20×5 мл), карбонатным буферным раствором (50 ммоль, рН 9,6, 20×5 мл). 100-миллиграммовую навеску полученного носителя осушили и проанализировали.

ИК (KBr): 3436 (35%), 2901 (60%), 1650 (55%), 1474 (55%), 1415 (55%), 1376 (50%), 1307 (55%), 1250 (55%), 1190 (35%), 1157 (35%), 1071 (30%), 1042 (%), 988 (55%), 966 (50%), 931 (40%), 891 (45%), 870 (60%), 788 (60%), 772 (55%), 741 (50%), 716 (50%), 693 (50%), 538 (50%), 483 (50%) см -1 .

Элементный анализ: С 41,61%; Н 6,47%; N 0,0%.

Полученный твердый носитель суспендировали в карбонатном буферном растворе (10 мл, 50 ммоль, рН 9,6), добавили дивинилсульфон (1 мл, 10 ммоль), и смесь встряхивали в течение 70 минут. Твердый носитель промыли водой (20×5 мл), фосфатным буферным раствором (20×5 мл, 1/15 М, рН 5,6), водой (20×5 мл) и карбонатным буферным раствором (20×5 мл, 50 ммоль, рН 9,6). 100-миллиграммовую навеску полученного твердого носителя осушили и проанализировали.

ИК: (KBr): 3436 (40%), 2902 (65%), 1651 (55%), 1475 (60%), 1413 (55%), 1377 (50%), 1302 (60%), 1251 (60%), 1183 (40%), 1157 (40%), 1076 (30%), 1044 (30%), 988 (60%), 966 (60%), 931 (50%), 891 (60%), 772 (70%), 741 (70%), 715 (70%) см -1 .

Элементный анализ: С 43,50%; Н 6,76%; N 0%; S 0,88%.

2b. Иммобилизация LE фермента на твердом носителе

К активированному твердому носителю, промытому водой (20×5 мл), добавили карбонатный буферный раствор (5 мл, 50 ммоль, рН 9,6) и супернатант Х1, экстрагированный из микроорганизмов Clonostachys compactiuscula, (C протеин =21178 мкг/мл, активность = 13,2 мкмоль/мг·мл) в карбонатном буферном растворе (0,5 мл, 50 ммоль, рН 9,6), смесь встряхивали в течение 18 часов. Твердый носитель отделили фильтрованием, суспендировали в глициновом буферном растворе (10 мл, 50 ммоль, рН 9,6), встряхивали в течение 2 часов, промыли водой (20 ×5 мл), фосфатным буферным раствором (20×5 мл, 1/15 моль, рН 5,6), снова водой (20×5 мл) и глициновым буферным раствором (20×5 мл, 50 ммоль, рН 9,6). Количество иммобилизованного протеина составило 910 мкг.

Пример 3. Гидролиз смеси аммонийных солей статинов с LE ферментом, иммобилизованным на твердом носителе, в периодическом процессе

LE фермент, иммобилизованный на твердом носителе Sepharose B4 (полученной в Примере 2b, масса сухого вещества 9,2 мг), суспендировали в смеси аммонийных солей статинов (1 мл, С станины =0,8 мг/мл), растворенной в глициновом буферном растворе (10 мл, 50 ммоль, рН 9,6). Суспензию встряхивали в течение 90 минут при 30°С. Иммобилизованный LE фермент отделили фильтрованием, и гидролитическую активность к аммонийной соли ловастатина (гидролитическая активность L) и к аммонийной соли симвастатина (гидролитическая активность S), а также соответствующие степени конверсии, определили при помощи ВЭЖХ. Иммобилизованный LE фермент промыли водой (5×5 мл) и периодический процесс гидролиза повторили снова. После 4 повторов получили 5,7 мг иммобилизованного LE фермента (после осушения до постоянной массы). Результаты анализа для данного биокатализатора представлены в Таблице 1.

Таблица 1

Повторение

Степень конверсии L (%)

Гидролитическая активность Л(мкМ/мг·мл)

Степень конверсии С (%)

Гидролитическая активность S (мкМ/мг·мл)

Селективность Л/С

Природный LE фермент

10,71

0,06

>100

1

33,4

4,66

8,3

0,81

5,75

2

31,1

4,36

9,9

0,97

4,49

3

28,5

3,97

9,3

0,91

4,36

4

19,4

2,72

9,0

0,88

3,09

Пример 4. Гидролиз смеси аммонийных солей статинов с использованием проточного реактора

В соответствии с процедурой, описанной в Примере 3, иммобилизацию провели с использованием 10 мл Sepharose B4 и раствора Х3 очищенного LE фермента из Примера 1с (С протеин =46,1 мкг/мл, активность = 56,1 нмоль/мг·мин). Количество иммобилизованного протеина составило 123,1 мкг.

Полученный биокатализатор использовали для приготовления проточного реактора. Корпус реактора представлял собой трубку из кислотоустойчивой стали (такой же, которую используют для изготовления колонок для хроматографии высокого давления), содержащую перфорированные пластины, расположенные перпендикулярно оси колонки выше отверстия для стока жидкости, которые поддерживали слой. В Примере использовали хроматографическую колонку диаметром 3,7 мм и длиной 149 мм (объем внутреннего пространства 1,6 мл), защищенную гайкой и фриттой на дне и заканчивающуюся сверху уплотнительным кольцом. Полученный выше иммобилизованный фермент, суспендированный в глициновом буферном растворе (рН 9,4, 20 мМ, 5 мл) поместили в данную установку. Слой формировали посредством пропускания элюента (скорость потока 0,4 мл/мин, глициновый буферный раствор рН 9,4, 20 мМ, 5 мл). Формирование слоя считали завершенным после достижения стабилизации давления и стабилизации степени абсорбции (которую определяли посредством УФ-детектора при =254 нм). Затем уплотнительное кольцо удаляли и закрепили открытый слой с помощью гайки и фритты. Слой в реакторе кондиционировали (скорость потока 0,4 мл/мин) посредством пропускания глицинового буферного раствора (рН 9,4, 20 мМ, 5 мл).

Далее в реактор подавали смесь аммонийных солей статинов, содержащую 15% ловастатина и 85% симвастатина при скорости потока 0,4 мг/мл. Пробы выходящего продукта отбирали каждые 6 часов и анализировали при помощи ВЭЖХ. Результаты анализа, пересчитанные на степень гидролиза, обобщены в Таблице 2. В течение всего процесса концентрация соли симвастатина изменялась не более чем на 1%. Степень гидролиза аммонийной соли ловастатина составила примерно 87%. Указанная степень конверсии оставалась неизменной в течение свыше 120 часов.

Таблица 2

Гидролиз смеси статинов в проточном реакторе со слоем, содержащим фермент LE, иммобилизованный на твердом носителе

Время, прошедшее до отбора навески выходящего продукта (часы)

Конверсия Л (%)

Конверсия С (%)

Селективность (конверсия Л/конверсия С)

0

87,9

<0,1

>100

6

86,6

<0,1

>100

12

86,1

<0,1

>100

18

87,4

<0,1

>100

24

87,0

<0,1

>100

30

86,8

<0,1

>100

36

86,6

<0,1

>100

42

86,9

<0,1

>100

48

86,9

<0,1

>100

54

87,7

<0,1

>100

60

87,1

<0,1

>100

66

86,6

<0,1

>100

72

88,8

<0,1

>100

78

88,4

<0,1

>100

84

87,9

<0,1

>100

90

87,0

<0,1

>100

96

90,6

<0,1

>100

102

87,2

<0,1

>100

108

87,6

<0,1

>100

114

86,6

<0,1

>100

120

87,6

<0,1

>100

126

87,9

<0,1

>100

Пример 5. Оценка технологической стабильности реактора со слоем, содержащим фермент LE, иммобилизованный на твердом носителе

Вход и выход проточного реактора, использованного в Примере 4, плотно закрыли заглушками, и оставили реактор на хранение в течение 6 месяцев при 4°С. После стабилизации реактор снова использовали для гидролиза аммонийных солей статинов в соответствии с процедурой Примера 4. Результаты конверсии соли ловастатина и соли симвастатина обобщены в Таблице 3.

Таблица 3

Гидролиз смеси статинов в проточном реакторе со слоем, содержащим фермент LE, иммобилизованный на твердом носителе (в реакторе, повторно использующемся после 6-месячного хранения при 4°С)

Время, прошедшее до отбора навески выходящего продукта (часы)

Конверсия Л (%)

Конверсия С (%)

Селективность (конверсия Л/конверсия С)

0

97,1

<0,1

>100

2

97,7

<0,1

>100

3

98,0

<0,1

>100

5

97,6

<0,1

>100

7

97,3

<0,1

>100

9

97,5

<0,1

>100

11

96,6

<0,1

>100

13

96,8

<0,1

>100

15

96,4

<0,1

>100

17

96,2

<0,1

>100

19

96,1

<0,1

>100

21

96,0

<0,1

>100

23

96,7

<0,1

>100

25

96,6

<0,1

>100

Пример 6. Иммобилизация LE фермента на твердом носителе (силикагеле) с использованием цианурхлорида

- ловастатин эстераза

6а. Модификация силикагеля

Силикагель (50 г; 200-300 меш) поместили в воронку из спеченного стекла и промыли азотной кислотой (5%, 15 мл) и водой (15 мл). Навеску геля (30 г) далее залили толуолом (210 мл) и сушили посредством отгонки азеотропной смеси (вода-толуол, 110°С; 4 часа). После охлаждения до 80°С добавили (3-аминопропил)триметоксисилан (6 мл, 34,3 ммоль), и смесь нагревали при 80°С в течение 2 часов. Полученный твердый носитель отфильтровали и промыли толуолом (20 мл), гексаном (20 мл), тетрагидрофураном (20 мл) и снова толуолом (20 мл). Вещество сушили при 80°С до постоянной массы с получением 24 г твердого носителя. Элементный анализ: найдено С 4,99%; Н 1,12%; N 1,69%.

6b. Активация твердого носителя и иммобилизация фермента LE

Аминопропилсиланизованный силикагель, полученный в Примере 6а (250 мг, 200-300 меш, содержащий 1 ммоль аминогрупп на 1 г твердого носителя), добавили к раствору цианурхлорида (62,8 мг, 0,34 ммоль) в смеси диоксана и (5 мл) и толуола (1 мл) при 12°С и встряхивали во встряхивающем устройстве в течение 3 часов. Твердый носитель отфильтровали, промыли толуолом (15 мл) и ацетоном (15 мл) и осушили при пониженном давлении. Супернатант Х1, полученный в Примере 1а (11,5 мл, С протеин =4180 мкг/мл), добавили к таким образом полученному твердому носителю и встряхивали во встряхивающем устройстве в течение 2,5 часов. Полученный биокатализатор (LE фермент на твердом носителе) отфильтровали и промыли карбонатным буферным раствором (50 ммоль, рН 9,4; 5×5 мл) с образованием иммобилизованного фермента и фильтрата. Выход иммобилизации составил 16%.

Полученный биокатализатор использовали для гидролиза смеси аммонийных солей статинов, обеспечивая степень конверсии ловастатина 7,1% через 90 минут. Селективность полученного биокатализатора составила >100. Реакция гидролиза, проводившаяся с использованием неиммобилизованного фермента (оставшегося в фильтрате), проходила с выходом 11,5%.

Пример 7. Иммобилизация LE фермента на твердом носителе (модифицированном силикагеге) с использованием цианурхлорида

Аминопропилсиланизованный силикагель, полученный в Примере 6а (500 мг, 200-300 меш, содержащий 1 ммоль аминогрупп на 1 г подложки), добавили к раствору цианурхлорида (125,9 мг, 0,68 ммоль) в смеси диоксана (5 мл) и толуола (1 мл), при 9°С, и встряхивали во встряхивающем устройстве в течение 3 часов. Затем активированный твердый носитель отфильтровали, промыли толуолом (25 мл) и ацетоном (25 мл), осушили при пониженном давлении. Порцию активированного твердого носителя (250 мг) суспендировали в растворе Х2, полученном в Примере 1с (11,5 мл, C протеин =21 мкг/мл), и встряхивали во встряхивающем устройстве в течение 2,5 часов. Полученный биокатализатор (LE фермент на твердом носителе) отфильтровали и промыли карбонатным буферным раствором (50 ммоль, рН 9,4, 5×5 мл) с образованием иммобилизованного фермента и фильтрата. Выход иммобилизации составил 52%.

Полученный биокатализатор использовали для гидролиза смеси аммонийных солей статинов, обеспечивая степень конверсии ловастатина 34,1% через 90 минут. Селективность биокатализатора составила >100. Аналогичная реакция, проводимая с использованием фильтрата, не прошла, что свидетельствует о завершении иммобилизации LE на твердом носителе.

Пример 8. Иммобилизация LE фермента на твердом носителе (модифицированный силикагель) с использованием цианурхлорида

Аминопропилсиланизованный силикагель, полученный в Примере 6а (500 мг, 200-300 меш, содержащий 1 ммоль аминогрупп на 1 г подложки), добавили к раствору цианурхлорида (9,3 мг, 0,05 ммоль) в смеси диоксана (5 мл) и толуола (1 мл), при 9°С, и встряхивали во встряхивающем устройстве в течение 3 часов. Активированный твердый носитель отфильтровали, промыли толуолом (25 мл) и ацетоном (25 мл) и сушили при пониженном давлении. Далее твердый носитель (250 мг) суспендировали в растворе Х3 LE фермента, полученного в Примере 1с (11,5 мл, C протеин =21 мкг/мл), и встряхивали во встряхивающем устройстве в течение 2,5 часов. Полученный биокатализатор отфильтровали и промыли карбонатным буферным раствором (50 ммоль, рН 9,4, 5×5 мл) с образованием иммобилизованного фермента и фильтрата. Выход иммобилизации составил 52%.

Полученный биокатализатор использовали для гидролиза смеси аммонийных солей статинов, обеспечивая степень конверсии ловастатина 16,3% через 90 минут. Селективность биокатализатора составила >100. Аналогичная реакция, проводимая с использованием фильтрата, не прошла, что свидетельствует о завершении иммобилизации LE на твердом носителе.

После вышеописанного гидролиза смеси аммонийных солей статинов биокатализатор промыли карбонатным буферным раствором (50 ммоль, рН 9,4, 5×5 мл) и хранили 7 дней при 4°С. Далее биокатализатор снова использовали для гидролиза смеси аммонийных солей статинов, конверсия ловастатина составила 26,1% через 90 минут. Селективность биокатализатора составила >100.

Пример 9. Иммобилизация LE фермента на твердом носителе (диэтиламиноэтилцеллюлоза) с использованием цианурхлорида

- ловастатин эстераза

Диэтиламиноэтилцеллюлозу (0,5 г) промыли водой (10 мл), суспендировали в растворе гидроксида натрия (1 моль, 10 мл), встряхивали (15 минут, 250 об/мин), отфильтровали, промыли водой (10 мл) и суспендировали в диоксане (10 мл). Раствор цианурхлорида (1 г, 5,4 ммоль) в толуоле (10 мл) добавили к полученной суспензии. Суспензию встряхивали (30 минут, 250 об/мин), отфильтровали, осадок промыли диоксаном (2×10 мл), смесью уксусная кислота/вода/диоксан (2/2/4 мл), водой (10 мл), ацетоном (2×10 мл) и осушили при пониженном давлении (0,2 Topр). Раствор Х3, полученный в Примере 1с (13 мл, специфическая активность 313 мкмоль·мин -1 ·мг -1 ), добавили к активированному твердому носителю. Суспензию встряхивали в виброгрохоте в течение 18 часов (250 об/мин), затем биокатализатор отфильтровали, промыли водой (2×10 мл), карбонатным буферным раствором (2×10 мл, 50 ммоль, рН 9,4). Выход иммобилизации составил 37,2%. Активность полученного иммобилизованного фермента проверили гидролизом 8 мл смеси аммонийных солей статинов, получив значение специфической активности 311 мкмоль·мин -1 ·мг -1 . Селективность биокатализатора составила >100.

Полученный вышеуказанный иммобилизованный LE фермент добавили к раствору аммонийных солей симвастатина (294 мг, 0,67 ммоль) и ловастатина (21,7 мг, 0,05 ммоль) в карбонатном буферном растворе (150 мл, 50 ммоль, рН 9,4) при 30°С, при перемешивании магнитной мешалкой (250 об/мин). Степень прохождения реакции и селективность гидролиза проанализировали при помощи ВЭЖХ.

Таблица 4

Конверсия соли ловастатина в реакции, катализируемой LE ферментом, иммобилизованным на диэтиламиноэтилцеллюлозе, активированной хлоридом циануровой кислоты

Время гидролиза (мин)

Конверсия (%)

Селективность Л/С

0

0

10

11,0

>100

15

14,9

>100

22

18,2

>100

37

30,5

>100

57

39,6

>100

69

44,5

>100

360

100

>100

Пример 10. Иммобилизация LE фермента на твердом носителе (диэтиламиноэтилцеллюлоза) с использованием цианурхлорида

Процедуру, описанную в Примере 9, повторили с использованием предварительно автоклавированной диэтиламиноэтилцеллюлозы без первоначальной очистки и LE фермента, обладающего специфической активностью (L) 61,2 мкмоль·мин -1 ·мг -1 .

Полученный иммобилизованный LE фермент использовали для препаративного гидролиза смеси аммонийных солей статинов, в соответствии с процедурой, описанной в Примере 9.

Таблица 5

Конверсия соли ловастатина в реакции, катализируемой LE ферментом, иммобилизованным на диэтиламиноэтилцеллюлозе, активированной цианурхлоридом

Время гидролиза (часы)

Конверсия ловастатина (%)

Селективность L/S

Автоклавированная целлюлоза

Неавтоклавированная целлюлоза

0

0

0

1,3

15,5

15,5

>100

19,3

85,7

62,8

>100

Было установлено, что автоклавирование твердого носителя перед иммобилизацией LE фермента увеличивало активность биокатализатора на 35%, по сравнению с LE ферментом, иммобилизованным на неавтоклавированной целлюлозе. Селективность биокатализатора составила >100.

Пример 11. Гидролиз смеси аммонийных солей статинов с использованием проточного реактора

Корпус хроматографической колонки (диаметр 0,58 см, длина 9,6 см, объем внутреннего пространства 2,5 мл) закрыли с одного конца фриттой. Уплотнительное кольцо поместили с другого конца. Иммобилизованный фермент LE, полученный в Примере 9, в виде суспензии в карбонатном буферном растворе (10 мл, 50 ммоль, рН 9,4; 0,2 мг/мл NaN 3 , 0,3 мг/мл ЭДТА) подавали в полученную установку. После стекания буферного раствора с фритты уплотнительное кольцо удалили, и открытый слой закрыли второй фриттой (количество подложки соответствовало массе продукта, полученного из 0,8 г диэтиламиноэтилцеллюлозы, и содержало 0,62 мг иммобилизованного протеина). Слой в реакторе формировали при помощи пропускания карбонатного буферного раствора (0,4 мл/мин, 50 ммоль, рН 9,4, 0,2 мг/мл NaN 3 , 0,3 мг/мл ЭДТА) в течение одного часа. Далее раствор аммонийных солей симвастатина (0,74 мг/мл) и ловастатина (0,06 мг/мл) прокачали через реактор, термостатируемый при 28°С. Каждые 4 часа содержимое аммонийных солей статинов в выходящем продукте определяли при помощи ВЭЖХ.

Эксперименты проводили со скоростями потока, меняющимися от 0,175 мл/мин до 0,2 мл/мин.

Таблица 6

Влияние скорости потока на конверсию соли ловастатина в реакции, катализируемой LE ферментом, иммобилизованным на диэтиламиноэтилцеллюлозе, активированной цианурхлоридом

Скорость потока (мл/мин)

Конверсия ловастатина (%)

Селективность Л/С

0,175

100

>100

0,185

92

>100

0,2

86

>100

При помощи контроля температуры термостатируемой колонки определили температурную зависимость конверсии ловастатина.

Таблица 7

Влияние температуры на конверсию соли ловастатина в реакции, катализируемой LE ферментом, иммобилизованным на диэтиламиноэтилцеллюлозе, активированной цианурхлоридом

Температура (°С)

Конверсия ловастатина (%)

Селективность Л/С

28

52,1

>100

30

50,6

>100

32

50,8

>100

34

58,0

>100

36

61,1

>100

38

59,9

>100

40

41,3

>100

42

31,2

>100

44

20,6

>100

Результаты, представленные в Таблице 7, показали, что иммобилизованный LE фермент обладает наивысшей активностью при 37°С.

СРАВНИТЕЛЬНЫЕ ПРИМЕРЫ

Сравнительный Пример 1. Иммобилизация фермента LE на модифицированном силикагеле.

10 г силикагеля добавили к смеси -аминопропилтриэтоксисилана и толуола (2% по объему, 100 мл), смесь нагревали в сосуде с обратным холодильником в течение 10 часов. Затем гель отфильтровали, промыли ацетоном (2×5 мл), водой (5 мл), снова ацетоном (2×5 мл) и сушили в осушенном воздухе в течение 10 часов. Полученный таким образом гель (100 мг) суспендировали в карбонатном буферном растворе (2 мл, 50 мМ, рН 9,4), и далее добавили дивинилсульфон (0,25 мл, 2,50 ммоль) при 20°С. Через 30 минут твердый носитель отделили и сушили в вакууме в течение 2 часов, затем промыли дистиллированной водой (4×20 мл), суспендировали в карбонатном буферном растворе (2 мл, 50 мМ, рН 9,4) и пропитали раствором LE фермента (1 мл, 0,225 мг/мл). Смесь оставили на 20 часов при 20°С. Твердый носитель с нанесенным на нее ферментом LE отфильтровали и промыли дистиллированной водой (2×10 мл).

Сравнительный Пример 2. Иммобилизация LE фермента на шерсти.

Небольшие куски шерсти (50 мг) суспендировали в карбонатном буферном растворе (2 мл, 50 мМ, рН 9,4), дивинилсульфон (0,25 мл, 2,5 ммоль) добавили при 20°С. Через 30 минут шерсть отделили, осушили в вакууме (2 часа) и промыли дистиллированной водой (4×20 мл). Твердый носитель снова суспендировали в карбонатном буферном растворе (1 мл, 50 мМ, рН 9,4), пропитали раствором LE фермента (1 мл, 0,225 мг/мл) и оставили на 10 часов при комнатной температуре. Твердый носитель с нанесенным на него ферментом LE отфильтровали и промыли дистиллированной водой (2×10 мл).

Сравнительный Пример 3. Иммобилизация LE фермента при помощи золь-гель технологии.

Раствор LE фермента (0,5 мл, 0,225 мг/мл) смешали с Трис-буфером (0,5 мл, 0,1 М, рН 7,5) и поместили во встряхивающее устройство (10 минут). Далее добавили водный раствор поливинилового спирта (100 мкл, 4% по объему), фторида натрия (50 мкл, 1 М) и изопропилового спирта (100 мкл). Через 5 минут добавили изобутилтриметоксисилан (2,5 ммоль) и TMOS (0,5 ммоль, 74 мкл, 76 мг) и смесь поместили во встряхивающее устройство. Смесь оставили сушиться в открытом сосуде на ночь при комнатной температуре, после чего добавили изопропиловый спирт (10 мл). Гель отделили и промыли водой (10 мл), изопропиловым спиртом (10 мл) и н-пентаном (10 мл). Полученный гель растолкли и оставили сушиться на ночь при комнатной температуре.

Сравнительный Пример 4. Иммобилизация LE фермента при помощи золь-гель технологии.

Использовали способ в соответствии со Сравнительным Примером 3, отличающийся тем, что к раствору фермента добавляли Tween ® 80 (0,1 мл) фермент.

Сравнительный Пример 5. Иммобилизация LE фермента при помощи золь-гель технологии.

Использовали способ в соответствии со Сравнительным Примером 3, отличающийся тем, что к раствору фермента добавляли аммонийную соль ловастатина (50 мг) фермент.

Сравнительный Пример 6. Иммобилизация LE фермента на Eupergit ® С.

Осушенный при заморозке LE фермент (17 мг, содержание протеина 2,6%) растворили в карбонатном буферном растворе (1 мл, 50 мМ, рН 9,4), к раствору добавили Eupergit ® С (50 мг, сополимер метакриламида и глицидилметакрилата, поперечно сшитый с N,N'-метиленбисакриламидом) и оставили на 1 сутки при комнатной температуре. Далее иммобилизованный фермент отфильтровали и промыли дистиллированной водой (2×10 мл).

Сравнительный Пример 7. Иммобилизация LE фермента посредством инкапсулирования в альгинат кальция.

Раствор очищенного LE фермента (0,8 мл, 0,225 мг/мл) тщательно смешали с водным раствором альгината кальция (8 мл, 2% масса альгината кальция/объем раствора). Полученный таким образом раствор добавили по каплям к водному раствору хлорида кальция (10 мл, 280 мМ), перемешивали в течение 20 минут, осадок отфильтровали, промыли дистиллированной водой (2×10 мл). Полученный иммобилизат хранили в дистиллированной воде при 4°С.

Сравнительный Пример 8. Иммобилизация LE фермента посредством инкапсулирования в альгинат кальция.

Раствор очищенного LE фермента (0,8 мл, 0,225 мг/мл) тщательно смешали с водным раствором альгината кальция (8 мл, 2% масса альгината кальция/объем раствора). Полученный таким образом раствор добавили по каплям к водному раствору хлорида кальция (10 мл, 280 мМ), перемешивали в течение 20 минут, осадок отфильтровали, промыли дистиллированной водой (2×10 мл). Полученное вещество суспендировали в тетраметоксисилане (1,0 мл) и перемешивали в течение 15 минут при 4°С. Смесь оставили полимеризоваться в течение 12 часов. Иммобилизованный фермент отфильтровали, промыли дистиллированной водой (2×10 мл) и сушили при комнатной температуре.

Сравнительный Пример 9.

Иммобилизованные LE ферменты, полученные в Сравнительных Примерах 1-8, добавили к раствору аммонийных солей симвастатина (294 мг, 0,67 ммоль) и ловастатина (21,7 мг, 0,05 ммоль) в карбонатном буферном растворе (150 мл, 50 ммоль, рН 9,4) при 30°С, при перемешивании магнитной мешалкой (250 об/мин). Степень прохождения реакции и селективность гидролиза проанализировали при помощи ВЭЖХ. Результаты, полученные для веществ, полученных в Сравнительных Примерах 1-8, представлены в Таблице 8.

Таблица 8

Сравнитель

ный Пример

Выход иммобилизации (%) а

Специфическая LE активность b

Селективность c

Ловастатин

Симвастатин

Природный LE фермент

-

15

0

>99

1

80

<0,5

<0,5

н/о

2

54

<0,5

<0,5

н/о

3

74

0,9

3,0

0,3

4

67

10

17,8

0,6

5

61

7,4

6,2

1,2

6

80

8,5

4,2

2,0

7

н/о

н/о

н/о

3,5

8

н/о

<0,5

<0,5

н/о

н/о - не определено

а) выход иммобилизации определяли как:

количество иммобилизованного протеина / общее количество протеина · 100%;

b) количество соответствующего субстрата, гидролизованного ферментом в течение одной минуты на один миллиграмм протеина (мкМ/мин·мг);

с) специфическая LE активность к ловастатину / специфическая LE активность к симвастатину.

Формула изобретения

1. Фермент ловастатин эстераза, иммобилизованный на водонерастворимом твердом носителе, причем указанный фермент ковалентно связан с твердым носителем, активированным по меньшей мере бифункциональным связывающим агентом, причем твердый носитель таким образом связан с по меньшей мере бифункциональным связывающим агентом, что иммобилизованная ловастатин эстераза проявляет по меньшей мере в 5 раз большую гидролитическую активность к ловастатину и солям ловастатина в присутствии симвастатина и/или солей симвастатина, чем к симвастатину и солям симвастатина, при этом:

указанный твердый носитель представляет собой модифицированный полисахарид, представляющий собой ди-(С 1-6 алкил)амино-С 1-6 алкилцеллюлозу, а указанный по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой O-сульфонат циануровой кислоты или галогенангидрид циануровой кислоты; или

указанный твердый носитель представляет собой модифицированный силикагель, предпочтительно модифицированный амино-С 1-6 алкил-три(С 1-6 алкокси)силаном, а указанный по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой O-сульфонат циануровой кислоты или галогенангидрид циануровой кислоты; или

указанный твердый носитель представляет собой агарозу, а по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой соединение, соответствующее формуле ,

где Y представляет собой -SO 2 - или -SO 2 -(CHR) n -SO 2 -, где n представляет собой целое число от 1 до 18, R представляет собой атом водорода или C 1-6 алкил, или Y представляет собой -SO 2 -Ar-SO 2 -, где Аr представляет собой бивалентный арильный радикал, образованный при удалении двух атомов водорода, непосредственно связанных с атомами углерода ароматического кольца, при этом бивалентный арильный радикал, содержит С 1-6 алкильные заместители.

2. Фермент ловастатин эстераза по п.1, при этом указанный твердый носитель представляет собой диэтиламиноэтилцеллюлозу, а указанный по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой цианурхлорид.

3. Фермент ловастатин эстераза по п.1, при этом указанный твердый носитель представляет собой аминопропилсиланизованный силикагель, и указанный по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой цианурхлорид.

4. Фермент ловастатин эстераза по п.1, при этом указанный твердый носитель представляет собой агарозу, а указанный по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой соединение, соответствующее формуле , где Y представляет собой -SO 2 -.

5. Фермент ловастатин эстераза по любому из пп.1, 2, 3 или 4, при этом указанный фермент представляет собой фермент, продуцируемый Clonostachys compactiuscula ATCC 38009, АТСС 74178.

6. Способ иммобилизации фермента ловастатин эстеразы на водонерастворимом твердом носителе, согласно которому при механическом перемешивании галогенангидрид циануровой кислоты приводят в контакт с твердым носителем, который представляет собой модифицированный полисахарид - ди-(С 1-6 алкил)амино-С 1-6 алкилцеллюлозу, или твердым носителем, который представляет собой силикагель, модифицированный амино-С 1-6 алкил-три(С 1-6 алкокси)силаном, в растворителе, активированный твердый носитель отделяют фильтрованием, затем сушат и суспендируют в водной смеси, содержащей фермент ловастатин эстеразу, с осуществлением иммобилизации фермента, суспендированное вещество отделяют фильтрованием, промывают буферным раствором и сушат.

7. Способ по п.6, согласно которому указанный твердый носитель представляет собой диэтиламиноэтилцеллюлозу.

8. Способ по п.6, согласно которому указанный твердый носитель представляет собой аминопропилсиланизованный силикагель.

9. Способ по п.6, согласно которому используемый галогенангидрид циануровой кислоты представляет собой цианурхлорид.

10. Способ по пп.7, 8 или 9, согласно которому используют автоклавированный твердый носитель.

11. Способ по п.6, согласно которому используемый водный раствор, содержащий фермент, представляет собой белковую фракцию вещества, экстрагированного из Clonostachys compactiuscula АТСС 38009, АТСС 74178.

12. Способ иммобилизации фермента ловастатин эстеразы на водонерастворимом твердом носителе, согласно которому соединение, соответствующее формуле , где Y представляет собой -SO 2 - или -SO 2 -(CHR) n -SO 2 -, где n представляет собой целое число от 1 до 18, R представляет собой атом водорода или С 1-6 алкил, или Y представляет собой -SO 2 -Ar-SO 2 -, где Аr представляет собой бивалентный арильный радикал, образованный при удалении двух атомов водорода, непосредственно связанных с атомами углерода ароматического кольца, при этом бивалентный арильный радикал может содержать С 1-6 алкильные заместители,

приводят в контакт с твердым носителем на основе агарозы в растворителе при механическом перемешивании, активированный твердый носитель отделяют фильтрованием, далее сушат и суспендируют в водной смеси, содержащей фермент ловастатин эстеразу, с осуществлением иммобилизации фермента, суспедированное вещество отделяют фильтрованием, промывают буферным раствором и сушат.

13. Способ по п.12, согласно которому соединение, соответствующее формуле , представляет собой соединение, где Y представляет собой -SO 2 -.

14. Способ по п.12, согласно которому используемый водный раствор, содержащий фермент, представляет собой белковую фракцию вещества, экстрагируемого из Clonostachys compactiuscula ATCC 38009, АТСС 74178.

15. Способ очистки симвастатина, включающий обработку раствора соли симвастатина, содержащего остаточное количество соли ловастатина, ферментом ловастатин эстеразой с осуществлением гидролиза ловастатина в триол, отделение триола и выделение симвастатина, по существу, не содержащего ловастатин, в котором раствор соли симвастатина, содержащий остаточное количество соли ловастатина, приводят в контакт с ферментом ловастатин эстеразой, иммобилизованным на водонерастворимом твердом носителе, при этом указанный фермент ковалентно связан с твердым носителем, активированным по меньшей мере бифункциональным связывающим агентом, причем твердый носитель таким образом связан с по меньшей мере бифункциональным связывающим агентом, что иммобилизованная ловастатин эстераза проявляет по меньшей мере в 5 раз большую гидролитическую активность к ловастатину и солям ловастатина в присутствии симвастатина и/или солей симвастатина, чем к симвастатину и солям симвастатина, согласно которому:

указанный твердый носитель представляет собой агарозу, а указанный по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой соединение, соответствующее формуле , где Y представляет собой -SO 2 -; или

указанный твердый носитель представляет собой диэтиламиноэтилцеллюлозу, а указанный по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой цианурхлорид; или

указанный твердый носитель представляет собой аминопропилсиланизованный силикагель, а указанный по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой цианурхлорид.

16. Способ очистки симвастатина по п.15, согласно которому фермент представляет собой фермент, продуцируемый Clonostachys compactiuscula АТСС 38009, АТСС 74178.

17. Биокатализируемый проточный реактор со слоем для осуществления способа по п.15 или 16, содержащий корпус (1) реактора с внутренним пространством (2), соединенным с входом жидкости (3) и соединенным с выходом жидкости (4), при этом во внутреннем пространстве (2) находится перфорированная пластина, поддерживающая слой (5), содержащий фермент ловастатин эстеразу, иммобилизованный на водонерастворимом твердом носителе, при этом указанный фермент ковалентно связан с твердым носителем, активированным по меньшей мере бифункциональным связывающим агентом, причем твердый носитель таким образом связан с по меньшей мере бифункциональным агентом, что иммобилизованная ловастатин эстераза проявляет по меньшей мере в 5 раз большую гидролитическую активность к ловастатину и солям ловастатина в присутствии симвастатина и солей симвастатина, чем к симвастатину и солям симвастатина, в котором:

указанный твердый носитель представляет собой агарозу, а указанный по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой соединение, соответствующее формуле , где Y представляет собой -SO 2 -; или

указанный твердый носитель представляет собой диэтиламиноэтилцеллюлозу, а указанный по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой цианурхлорид.

18. Биокатализируемый проточный реактор по п.17, отличающийся тем, что фермент представляет собой фермент, продуцируемый Clonostachys compactiuscula АТСС 38009, АТСС 74178.

РИСУНКИ