Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
Патент на изобретение №2475745

(19)

RU

(11)

2475745

(13)

C1

(51) МПК G01N33/49 (2006.01)

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ Статус: по данным на 18.02.2013 - нет данных Пошлина:

(21), (22) Заявка: 2012114034/15, 10.04.2012

(24) Дата начала отсчета срока действия патента:

10.04.2012

Приоритет(ы):

(22) Дата подачи заявки: 10.04.2012

(45) Опубликовано: 20.02.2013

(56) Список документов, цитированных в отчете о

поиске: SU 1666072 A1, 30.07.1991. RU 2057485 C1, 10.04.1996. WO 2002037119 A2, 10.05.2002.

Адрес для переписки:

603950, г.Нижний Новгород, ГСП-847, ул. Ветеринарная, 3, НИВИ НЗ РФ

(72) Автор(ы):

Блохин Андрей Александрович (RU),

Исаев Виталий Владимирович (RU),

Молев Аркадий Иванович (RU)

(73) Патентообладатель(и):

Государственное научное учреждение Научно-исследовательский ветеринарный институт Нечерноземной зоны РФ Российской академии сельскохозяйственных наук (RU)

(54) СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ С СИНДРОМОМ ДИАРЕИ У НОВОРОЖДЕННЫХ ТЕЛЯТ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области ветеринарии. Способ включает морфологический анализ крови методом световой микроскопии. Пробы крови берут у телят 3-дневного возраста. Подсчитывают количество нейтрофилов и лимфоцитов периферической крови со структурными изменениями в условиях спонтанного и митогениндуцированного апоптоза. При значениях спонтанного апоптоза нейтрофилов >204,87×10 6 кл./л и лимфоцитов >79,57×10 6 кл./л и митогенидуцированного апоптоза нейтрофилов >603,6×10 6 кл./л и лимфоцитов >419,07×10 6 кл./л прогнозируют высокий риск развития желудочно-кишечных заболеваний с синдромом диареи различной этиологии. Способ позволяет с высокой точностью прогнозировать риск заболеваний. 1 табл., 6 пр.

Изобретение относится к ветеринарной медицине, касается способа прогнозирования заболеваний у новорожденных телят и может быть использовано для ранней диагностики и прогнозирования течения желудочно-кишечных заболеваний с синдромом диареи.

Состояние теленка и окружающая среда находятся в неустойчивом равновесии и, если оно нарушается, то у новорожденных телят запускается весь комплекс патологических процессов, что находит свое проявление в развитии болезней аппарата пищеварения. В нозологическом профиле патологии крупного рогатого скота раннего постнатального периода болезни органов пищеварения составляют 28-65%, гибель телят может достигать 60-80%. На долю молодняка приходится 75-80% падежа по сравнению со взрослыми животными, что свидетельствует о необходимости ранней диагностики и своевременной и этиопатогенетически обоснованной профилактики этих заболеваний.

Известны способы прогнозирования вероятного заболевания телят на основе физиологического состояния коров-матерей по показателям крови коров в сухостойном периоде (уровень общего белка, неорганического фосфора, кальция, щелочной резерв) [1] и по уровню метгемоглобина в крови сухостойных коров-матерей на последнем месяце стельности [2]. Однако при этом не учитываются разнообразие ответных реакций на неблагоприятные условия содержания и кормления, обусловленных генотипическими и фенотипическими особенностями организма теленка, а также взаимовлиянием факторов внешней среды.

Известен также способ прогнозирования риска развития патологического процесса по результатам оценки иммунного статуса. При оценке иммунного статуса выявляют дефекты в фагоцитозе (определяют абсолютное число нейтрофилов и моноцитов, оценивают функциональное состояние фагоцитов), клеточном (определяют абсолютное и относительное количество лимфоцитов в периферической крови, процент и абсолютное число Т-лимфоцитов, пролиферативный ответ на основные Т-митогены) и гуморальном (определяют количество основных классов иммуноглобулинов IgG, IgM, IgA в сыворотке крови, процента и абсолютного количества В-лимфоцитов) [3]. Основными недостатками способа является необходимость проведения комплекса исследований, низкая стандартизация вследствие субъективной оценки результатов, отсутствие точных значений и низкая вероятность прогноза.

Цель изобретения - повышение точности и достоверности прогнозирования за счет исключения субъективности в оценке результатов.

Поставленная цель достигается способом прогнозирования желудочно-кишечных болезней у новорожденных телят по показателям апоптоза клеток периферической крови.

Апоптоз - форма гибели клетки, проявляющаяся в уменьшении ее размера, конденсации и фрагментации хроматина, уплотнении наружной и ци-топлазматических мембран без выхода содержания клетки в окружающую среду. Биологическое значение апоптоза заключается в поддержании внутреннего гомеостаза организма на клеточном, тканевом и системном уровнях. Первые события, связанные с осуществлением апоптоза, начинаются в ядре. К ним относятся конденсация хроматина с формированием скоплений, прилежащих к ядерной мембране, и проявление вдавлений ядерной мембраны, приводящих к фрагментации ядра и образованию апоптотических телец внеклеточных фрагментов ядра, окруженных мембраной. В цитоплазме происходит конденсация и сморщивание гранул. От поверхности апоптотической клетки отщепляются небольшие везикулы, наполненные содержимым цитоплазмы (митохондрии, рибосомы и др.) и окруженные мембранным липидным бислоем. Клетка постепенно уменьшается в объеме, округляется и теряет межклеточные контакты. Апоптотические клетки и их фрагменты (апоптотические тельца, везикулы) поглощаются макрофагами, нейтрофилами. Пусковыми факторами апоптоза могут быть как внешние (внеклеточные) факторы, так и внутриклеточные сигналы. При различных патологических процессах в организме могут наблюдаться как ускорение (нейродегенеративные заболевания, токсические заболевания печени, гипо- и апластическая анемия, миелодисплазии), так и замедление (опухолевые заболевания, аутоиммунные заболевания, вирусные инфекции, вызываемые вирусами группы герпеса и аденовирусами) апоптоза [4]. Наиболее информативным методом изучения апоптоза является оценка структурных изменений клеток с помощью светового микроскопа.

Способ осуществляется следующим образом.

Подсчитывают количество нейтрофилов и лимфоцитов периферической крови телят 3-дневного возраста в условиях спонтанного и митогениндуцированного апоптоза методом световой микроскопии и при значениях спонтанного апоптоза нейтрофилов >204,87×10 6 кл./л и лимфоцитов >79,57×10 6 кл./л и митогениндуцированного апоптоза нейтрофилов >603,6×10 6 кл./л и лимфоцитов >419,07×10 6 кл./л прогнозируют высокий риск развития желудочно-кишечных заболеваний.

Сущность способа поясняется примерами.

Пример 1. В условиях хозяйства, благополучного по желудочно-кишечным болезням новорожденных телят, у теленка 3-дневного возраста брали кровь для прогнозирования желудочно-кишечных болезней по структурным изменениям основных популяций лейкоцитов - нейтрофилов и лимфоцитов. Уровень апоптоза определяли путем оценки структурных изменений основных популяций лейкоцитов - нейтрофилов и лимфоцитов - с помощью иммерсионной системы светового микроскопа по показателям спонтанного и митогениндуцированного апоптоза. В первом случае готовили мазки и окрашивали их по Филипсону. Во втором случае для индукции апоптоза в качестве митогена использовали 1 млрд. суточную культуру St. aureus (золотистого стафилококка). К 0,05 мл крови добавляли 0,025 мл бактериальной суспензии. Клетки крови с культурой инкубировали в термостате при 37,0°С в течение 4 часов при периодическом помешивании. Затем готовили мазки и окрашивали аналогично, как при исследовании спонтанного апоптоза. Под иммерсией подсчитывали количество клеток с морфологическими признаками апоптоза (фрагментация ядра) в процентах от доли нейтрофилов и лимфоцитов в общей лейкограмме. Популяции лейкоцитов дифференцировали на основании их тинкториальных свойств (темно-фиолетовая, в отдельных случаях, черная окраска фрагментов ядер лимфоцитов, темно-вишневая окраска фрагментов ядер нейтрофилов). Показатели составили: спонтанный апоптоз нейтрофилов - 313,4×10 6 кл./л, лимфоцитов - 111,3×10 6 кл./л, митогениндуцированный апоптоз нейтрофилов - 800,4×10 6 кл./л, лимфоцитов - 470,13×10 6 кл./л. Прогноз неблагоприятный. На 4 сутки у теленка отмечали клинические признаки расстройства пищеварения, характеризовавшиеся как диспепсия (диарея, feces разжижен, желтоватого цвета, имел кислый запах, содержал пузырьки газа). Аппетит у теленка отсутствовал, имели место быть сухость и бледность окраски видимых слизистых оболочек, пульс был учащен, тоны сердца глухие, дыхание учащено.

Пример 2. В условиях хозяйства, благополучного по желудочно-кишечным болезням новорожденных телят, у теленка 3-дневного возраста брали кровь для прогнозирования желудочно-кишечных болезней по структурным изменениям основных популяций лейкоцитов - нейтрофилов и лимфоцитов, как в примере 1. Показатели составили: спонтанный апоптоз нейтрофилов - 317,72×10 6 кл./л, лимфоцитов - 110,0×10 6 кл./л, митогениндуцированный апоптоз нейтрофилов - 898,3×10 6 кл./л, лимфоцитов - 483,6×10 6 кл./л. Прогноз неблагоприятный. На 5 сутки у теленка отмечали клинические признаки токсической диспепсии (постоянный профузный понос, feces разжижен, серого цвета с примесью слизи, зловонный). У теленка отсутствовал аппетит, наблюдалась адинамия.

Пример 3. В условиях хозяйства, неблагополучного по желудочно-кишечным болезням новорожденных телят, у теленка 3-дневного возраста брали кровь для прогнозирования желудочно-кишечных болезней по структурным изменениям основных популяций лейкоцитов - нейтрофилов и лимфоцитов, как в примере 1. Показатели составили: спонтанный апоптоз нейтрофилов - 322,1×10 6 кл./л, лимфоцитов - 115,9×10 6 кл./л, митогениндуцированный апоптоз нейтрофилов - 921,5×10 6 кл./л, лимфоцитов - 484,7×10 6 кл./л. Прогнозировали риск развития желудочно-кишечных заболеваний. На 4 сутки у теленка отмечены клинические признаки расстройства функции пищеварения (профузный понос, feces водянистый, с обилием слизи и следами крови). Диагноз - ротавирусная инфекция.

Пример 4. В условиях хозяйства, неблагополучного по желудочно-кишечным болезням новорожденных телят, у теленка 3-дневного возраста брали кровь для прогнозирования желудочно-кишечных болезней по структурным изменениям основных популяций лейкоцитов - нейтрофилов и лимфоцитов, как в примере 1. Показатели составили: спонтанный апоптоз нейтрофилов - 315,99×10 6 кл./л, лимфоцитов - 118,5×10 6 кл./л, митогениндуцированный апоптоз нейтрофилов - 1105,0×10 6 кл./л, лимфоцитов - 513,49×10 6 кл./л. Прогнозировали риск развития желудочно-кишечных заболеваний с тяжелым течением. На 4 сутки у теленка отмечали понижение аппетита, угнетение общего состояния, малоподвижность. Фекалии при этом водянистые с желтыми комочками, кислого запаха. Температура тела в пределах физиологической нормы. На 2 и 3 день болезни фекалии приобрели грязно-желтый цвет, с примесью крови. Отмечали западение глаз и общую дегидратацию организма. Диагноз: микстинфекция, обусловленная ассоциацией ротавируса и Е. coli. Заболевание протекало тяжело.

Пример 5. В условиях хозяйства, неблагополучного по желудочно-кишечным болезням новорожденных телят, у теленка 3-дневного возраста брали кровь для прогнозирования желудочно-кишечных болезней по структурным изменениям основных популяций лейкоцитов - нейтрофилов и лимфоцитов, как в примере 1. Показатели составили: спонтанный апоптоз нейтрофилов - 461,7×10 6 кл./л, лимфоцитов - 153,9×10 6 кл./л, митогениндуцированный апоптоз нейтрофилов - 1385,1×10 6 кл./л, лимфоцитов - 564,3×10 6 кл./л. Прогнозировали риск развития желудочно-кишечных заболеваний с тяжелым течением. На 4 сутки у теленка отмечали первые признаки диареи: эрозии на носовом зеркале, признаки незначительного угнетения и диареи. Фекалии серого цвета, водянистые, с пузырьками газа. Через сутки после появления первых признаков признаки обезвоживания приобрели ярко выраженный характер. Эрозии на носовом зеркальце сохранялись. Температура тела повышалась до 39,5°С. Через двое суток от начала заболевания в фекалиях телят появилась примесь крови, слизи и пузырьков зловонных газов, резко нарастали признаки дегидратации организма и токсикоза, температура тела повышалась до 40,5-41,5°С. Теленок лежал, был не в состоянии самостоятельно подняться. Диагноз: микстинфекция, обусловленная ассоциацией вируса диареи КРС, ротавируса и Е. coli. Заболевание протекало тяжело, теленок погиб.

Пример 6. В условиях хозяйства, благополучного по желудочно-кишечным болезням новорожденных телят, у теленка 3-дневного возраста брали кровь для прогнозирования желудочно-кишечных болезней по структурным изменениям основных популяций лейкоцитов - нейтрофилов и лимфоцитов, как в примере 1. Показатели составили: спонтанный апоптоз нейтрофилов - 100,44×10 6 кл./л, лимфоцитов - 77,44×10 6 кл./л, митогениндуцированный апоптоз нейтрофилов - 360,5×10 6 кл./л, лимфоцитов - 220,25×10 6 кл./л. Прогноз благоприятный. Клинические наблюдения за теленком в течение 10 дней не выявили нарушений функции пищеварения. Параллельно изучали состояние иммунобиохимического гомеостаза по показателям общего белка (определяли рефрактометрическим методом), глюкозы (определяли ортотолуидиновым методом), общих липидов (определяли по Криницкому А.Ф. в модификации Волгина В.И.), иммуноглобулинов (определяли цинк-сульфатным тестом), бактерицидной активности сыворотки крови (определяли по Смирновой О.В. и Кузьминой Т.А), лизоцимной активности сыворотки крови (определяли по Дорофейчук В.Г.), фагоцитарной активности лейкоцитов (определяли по Плященко С.И., Сидорову В.Г.), Т- и В-лимфоцитов (определяли по Маянскому А.Н., Рассанову С.П.), гемоглобина (определяли гемиглобинцианидным методом), кальция общего (определяли унифицированным колориметрическим методом), фосфора неорганического (определяли молибдатным UV-методом), эритроцитов (определяли турбидиметрическим методом), лейкоцитов (определяли методом подсчета в камере Горяева). Результаты представлены в таблице.

Таблица

Показатели иммунного статуса новорожденного теленка 3-дневного возраста

Показатели

Значение

Спонтанный апоптоз

Абсолютное количество нейтрофилов с признаками апоптоза, 10 6 кл./л

100,44

Абсолютное количество лимфоцитов с фрагментированным ядром, 10 6 кл./л

77,44

Митогениндуцированный апоптоз

Абсолютное количество нейтрофилов с признаками апоптоза, 10 6 кл./л

360,5

Абсолютное количество лимфоцитов с фрагментированным ядром, 10 6 кл./л

220,25

Иммунобиохимические исследования

Общий белок сыворотки крови, г/л

49,6

Глюкоза, ммоль/л

3,72

Общие липиды, г/л

3,1

Кальций общий, мг%

9,68

Фосфор неорганический, мг%

7,77

Общие иммуноглобулины, мг/мл

21,2

Бактерицидная активность сыворотки крови, %

85,4

Лизоцимная активность сыворотки крови, %

1,7

Фагоцитарная активность лейкоцитов крови, %

64,2

Т-лимфоциты, %

34,4

В-лимфоциты, %

11,4

Гемоглобин, г/л

96,7

Эритроциты, 10 12 /л

5,8

Лейкоциты, 10 9 /л

9,35

Как видно из таблицы, у клинически здорового теленка отмечены нарушения метаболического статуса, характеризовавшиеся снижением по отношению к минимальным нормативным пределам для данной возрастной категории уровня общего белка сыворотки крови на 9,81%, глюкозы - на 7,0%, общих липидов - на 11,42%, нарушением кальциево-фосфорного соотношения из-за снижения уровня общего кальция на 6,92% и повышения уровня неорганического фосфора на 14,26%. Также выявлены отклонения от нормативов в показателях гуморального звена иммунной системы и общей резистентности организма, что проявилось снижением содержания общих иммуноглобулинов на 15,2%, бактерицидной активности сыворотки крови на 4,04% и лизоцимной активности сыворотки крови на 15,0%. На основе выявленной негативной динамики метаболического статуса и снижения общей резистентности организма теленка можно было бы прогнозировать вероятное заболевание. Однако показатели апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов периферической крови теленка свидетельствовали об обратном и предопределяли благоприятный прогноз, что подтвердили клинические наблюдения.

Показатели крови, как одной из физиологических систем, являются интеграционным индикатором функционирования организма. Точность и достоверность прогнозирования по структурным изменениям основных популяций лейкоцитов - нейтрофилов и лимфоцитов - объясняется тем, что апоптоз как процесс, активность которого зависит от интенсивности внешних воздействий, активно участвует в процессах адаптации организма. Адаптация - сложный и многогранный процесс, эффективность которого зависит, в первую очередь, от соотношения воздействия факторов окружающей среды и ответной реакции нервной, эндокринной и иммунной систем организма на такое воздействие. Поддерживая адекватный пул функционально активных клеток системы иммунного надзора, апоптоз обеспечивает гомеостаз организма, купируя тем самым развитие заболеваний, имеющих в своей патогенетической основе дисфункцию иммунной системы. Проведенные исследования подтвердили, что показатели апоптоза позволяют прогнозировать индивидуальную вероятность благоприятного адаптационного исхода в процессе раннего онтогенеза новорожденного животного.

Источники информации

1. Информационный листок 29-96, 1994.

2. Патент РФ 2057485 C1, МПК A61B 10/00, A01K 67/02, 1996.

3. Федоров Ю.Н. Иммунологический мониторинг в ветеринарии / Ю.Н.Федоров // С.-х. биология. - 2004. - 2. - С.3-9.

4. А.А.Ярилин. Апоптоз: природа феномена и его роль в норме и патологии // Актуальные проблемы патофизиологии / Под ред. Б.Б.Мороза - М.: Медицина, 2001. - С.13-56.

Формула изобретения

Способ прогнозирования желудочно-кишечных заболеваний с синдромом диареи у новорожденных телят, включающий морфологический анализ крови методом световой микроскопии, отличающийся тем, что пробы крови берут у телят 3-дневного возраста, подсчитывают количество нейтрофилов и лимфоцитов периферической крови со структурными изменениями в условиях спонтанного и митогениндуцированного апоптоза и при значениях спонтанного апоптоза нейтрофилов >204,87·10 6 кл./л и лимфоцитов >79,57·10 6 кл./л и митогениндуцированного апоптоза нейтрофилов >603,6·10 6 кл./л и лимфоцитов >419,07·10 6 кл./л прогнозируют высокий риск развития желудочно-кишечных заболеваний с синдромом диареи различной этиологии.