Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
Патент на изобретение №2476218

(19)

RU

(11)

2476218

(13)

C1

(51) МПК A61K31/409 (2006.01)

C07D487/22 (2006.01)

A61P35/00 (2006.01)

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ Статус: по данным на 18.02.2013 - нет данных Пошлина:

(21), (22) Заявка: 2012105449/04, 17.02.2012

(24) Дата начала отсчета срока действия патента:

17.02.2012

Приоритет(ы):

(22) Дата подачи заявки: 17.02.2012

(45) Опубликовано: 27.02.2013

(56) Список документов, цитированных в отчете о

поиске: US 6410568 B1, 25.06.2002. RU 2399622 C2, 20.09.2010.

Адрес для переписки:

123995, Москва, ГСП-5, ул. Б. Садовая, 1, корп.4, ФГУП "ГНЦ "НИОПИК"

(72) Автор(ы):

Дудкин Семен Валентинович (RU),

Ефременко Анастасия Владимировна (RU),

Игнатова Анастасия Александровна (RU),

Кобзева Елена Сергеевна (RU),

Лукъянец Евгений Антонович (RU),

Макарова Елена Александровна (RU),

Морозова Наталья Борисовна (RU),

Плютинская Анна Дмитриевна (RU),

Феофанов Алексей Валерьевич (RU),

Чиссов Валерий Иванович (RU),

Якубовская Раиса Ивановна (RU)

(73) Патентообладатель(и):

Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научный центр "Научно-исследовательский институт органических полупродуктов и красителей" (ФГУП "ГНЦ "НИОПИК") (RU),

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации" (ФГБУ "МНИОИ им. П.А. Герцена Минздравсоцразвития России") (RU)

(54) ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРЫ ДЛЯ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ

(57) Реферат:

Изобретение относится к четвертичным аммониевым солям мезо-тетра[1- (4'-бромбутил)-3-пиридил]бактериохлорина общей формулы

где , . Эти соединения обладают высокой фотоиндуцированной активностью и могут применяться для фотодинамической терапии злокачественных новообразований в качестве фотосенсибилизатора. 3 ил.

Изобретение относится к медицине, а именно к фотосенсибилизаторам для фотодинамической терапии (ФДТ) злокачественных новообразований и ряда других патологических состояний.

Метод ФДТ основан на применении природных или синтетических фотосенсибилизаторов (ФС), которые обладают способностью к избирательному накоплению (тропностью) в опухолевой ткани. При облучении светом определенной длины волны ФС переходит в активированное состояние, которое инициирует образование цитотоксических агентов - синглетного кислорода ( 1 O 2 ) и свободных радикалов, вызывающих разрушение структурных элементов опухолевой ткани.

Успешное применение метода ФДТ для лечения злокачественных новообразований стимулирует поиск новых ФС с улучшенными свойствами. Наиболее перспективны для ФДТ ФС с максимумом поглощения в красном и ближнем инфракрасном диапазоне (650-800 нм), так называемом «терапевтическом окне», где собственное поглощение биологической ткани минимально, что обеспечивает возможность более глубокого проникновения излучения в ткань и, как следствие, высокую эффективность терапии (Bonnett R. J. Heterocyclic Chem. 2002 V.39. P.455-470).

Среди них следует отметить ФС на основе хлоринов (дигидропорфиринов), характеризующиеся интенсивной длинноволновой полосой в области 660 нм, например, водорастворимые моно-L-аспартилхлорин е 6 и другие различные формы хлорина е 6 , в частности, отечественные препараты Фотодитазин, Радахлорин и белорусский Фотолон (Чан Тхи Хай Иен, Г.В.Раменская, Н.А.Оборотова. Росс. Биотерапевт. Ж. 2009. Вып.4. С.99-104), а также синтетические хлорины - 5,10,15,20-тетракис(м-гидроксифенил)хлорин (Темопорфин, m-THPC, Фоскан) и производные бензопорфирина (Бензопорфирин монокислота, кольцо А).

Перспективными ФС являются производные фталоцианина. Так, препарат Фотосенс на основе сульфированного фталоцианина алюминия имеет длинноволновый максимум поглощения при max =675 нм с высоким коэффициентом молярной экстинкции (свыше 100000), высокий квантовый выход флуоресценции (Патент РФ 2220722, A61K 31/409, 2004 г.). Однако Фотосенс обладает недостаточно высокой селективностью накопления в опухолевых клетках, длительным сохранением в тканях, что приводит к фототоксичности кожи.

Перспективными ФС для ФДТ являются бактериохлорины (тетрагидропорфирины), поглощающие в наиболее оптимальном диапазоне «терапевтического окна» - 740-820 нм в зависимости от строения. Проблемой здесь является поиск устойчивых при хранении производных бактериохлорина, поскольку при гидрировании порфиринового кольца одновременно со спектральным смещением уменьшается стабильность молекулы в реакциях окисления. Одним из способов решения этой проблемы является использование металлических комплексов. Так, тукад, палладиевое производное бактериохлорина (Tookad, Израиль-ФРГ-Франция) с максимумом поглощения при 760 нм, разрешен для лечения простаты.

Задачей предлагаемого изобретения является синтез ФС, характеризующихся поглощением в ближнем инфракрасном диапазоне спектра, высокой тропностью к опухолевой ткани и обладающих высокой фотоиндуцированной активностью.

Для решения поставленной задачи синтезирован ФС, представляющий собой положительно заряженные бактериохлорины - соли четвертичных аммониевых оснований на основе мезо-тетра[1-(4'-бромбутил)-3-пиридил]бактериохлорина, октабромидов мезо-тетра [1-(4'-пиридиниобутил)-3-пиридил]бактериохлорина (3-Ру 4 ВС(ВuРу) 4 Вr 8 , соединение 1), мезо-тетра[1-(4'-(диметилэтаноламмониобутил)-3-пиридил]бактериохлорина (3-Py 4 BC(BuDMAE) 4 Br 8 , соединение 2), общей формулы:

где ,

Октабромиды 1 и 2 синтезированы взаимодействием мезо-тетра[1-(4'-бромбутил)-3-пиридил]бактериохлорина тетрабромида с избытком сухого пиридина или диметиламиноэтанола, соответственно, в кипящем метаноле в течение 4,5 ч в инертной атмосфере. Исходный мезо-тетра[1-(4'-бромбутил)-3-пиридил]бактериохлорин тетрабромид получен при кипячении мезо-тетра(3-пиридил)бактериохлорина с избытком 1,4-дибромбутана в нитрометане в инертной атмосфере.

На Фиг.1 приведен 1 Н ЯМР спектр соединения 1 в CD 3 OD в области ароматических протонов.

Синглет -пиррольных протонов расположен при 8,27 м.

Сигналы протонов пиридиниевых колец наблюдаются при 8,16 м. д. (Н-3 1 ), 8,53 м. д. (Н-5), 8,62 м. д. (Н-4 1 ), 9,17 м. д. (Н-6, Н-2 1 ), 9,42 м. д. (Н-4), 9,84 м. д. (Н-2).

Данные фотосенсибилизаторы (1 и 2) легко растворимы в воде и водно-солевых растворах при комнатной температуре. Они стабильны в водных многокомпонентных растворах в течение 1 месяца при варьировании концентраций от 2 до 45 мкМ в темновых условиях (в спектрах поглощения max 763 нм у соединения 1, 762 нм у соединения 2 и в спектрах флуоресценции - max 771 нм). Следует отметить, что в дистиллированной воде красители характеризовались меньшей устойчивостью (отмечено снижение интенсивности поглощения в максимуме на 15-20% за время наблюдения). На Фиг.2 приведены спектры поглощения раствора соединения 1 (14,2 мкМ) в 0,9% растворе NaCl и дистиллированной воде сразу после растворения (черная линия - спектры совпадают) и через месяц хранения раствора при +4°C в 0,9% растворе NaCl (синяя линия) и в дистиллированной воде (красная линия).

Фотосенсибилизаторы обладают способностью генерировать синглетный кислород в водно-солевом растворе с квантовым выходом ( 1 О 2 )=0,30÷0,34. В бесклеточной среде красители подвержены фотовыцветанию, что сопровождалось снижением интенсивности флуоресценции в максимуме без изменения формы спектра.

Для оценки фотосенсибилизирующих свойств было проведено исследование способности соединения 1 к фотоиндуцированной генерации синглетного кислорода в растворе. Установлено, что исследуемое соединение в мономерном состоянии обладает средним квантовым выходом генерации синглетного кислорода ( 1 O 2 )=0,32±0,02. В подтверждение генерации именно 1 O 2 показано, что реакция обесцвечивания 4-нитрозо-N,N-диметиланилина в присутствии гистидина, лежащая в основе определения 1 O 2 , полностью подавляется азидом натрия, известным тушителем 1 O 2 .

Красители обладали фототоксичностью in vitro в отношении опухолевых клеток человека различного эпителиального происхождения: эпидермоидной карциномы гортаноглотки (НЕр2), аденокарциномы легкого (А549) и карциномы толстой кишки (НТ29) при варьировании концентрации раствора красителя от 0,15 до 40 мкМ, времени инкубации до светового воздействия 0,5-6 часов и плотности энергии 2-10 Дж/см 2 .

Настоящее изобретение характеризуется следующими примерами:

Пример 1

мезо-Тетра[1-(4'-пиридиниобутил)-3-пиридил]бактериохлорин октабромид (1). мезо-Тетра[1-(4'-бромбутил)-3-пиридил]бактериохлорин тетрабромид (0,09 г, 0,06 ммоль) растворяют в 4 мл метанола и добавляют 1 мл сухого пиридина. Реакционную массу перемешивают при кипячении в течение 4,5 ч в инертной атмосфере. После охлаждения до комнатной температуры реакционную массу упаривают в вакууме досуха. Остаток растворяют в 5 мл метанола, добавляют 50 мл бензола, выпавший осадок отфильтровывают и промывают бензолом. Получают 0,093 г (85,3%) соединения 1. ЭСП, макс , нм (lg ), метанол: 761 (5,04), 516 (4,70), 421 (4,11), 374 (4,93), 349 (4,95). ЭСП, макс , нм (lg ), вода: 763 (5,02), 518 (4,71), 419 (4,34), 374 (4,95), 351 (4,97). ЭСП, макс , нм (lg ), PBS (pH 7,4): 760 (4,96), 694 (3,89), 515 (4,61), 416 (4,35), 372 (4,91), 348 (4,93). Спектр 1 H ЯМР (CD 3 OD), , м.д.: 2,34-2,42 (м, 16Н, СН 2 ), 4,09-4,38 (м, 8Н, -Н), 5,02-5,04 (м, 8Н, СН 2 ), 8,14-8,18 (м, 8Н, m-Н (Ру)), 8,27 (с, 4Н, -Н), 8,50-8,56 (м, 4Н, Н-5 (Ру)), 8,60-8,64 (м, 4Н, n-Н (Ру)), 9,16-9,18 (м, 12Н, Н-6 (Ру), о-Н (Ру)), 9,42 (д, 4Н, Н-4 (Ру)), 9,83-9,85 (м, 4Н, Н-2 (Ру)).

Пример 2

мeзo-Teтpa[1-(4'-диметилэтаноламмониобутил)-3-пиридил]бактериохлорин октабромид (2). Тетра[1-(4'-бромбутил)-3-пиридил]бактериохлорин тетрабромид (0,09 г, 0,06 ммоль) растворяют в 4 мл метанола и добавляют 1 мл диметилэтаноламина. Реакционную массу перемешивают при кипячении в течение 4,5 ч в инертной атмосфере. Выделение соединения 2 проводят по методике, описанной для соединения 1. Получают 0,09 г (80,9%) соединения 2. ЭСП, макс , нм (lg ), метанол: 763 (4,93), 516 (4,64), 422 (4,44), 373 (4,87), 350 (4,89). ЭСП, макс , нм (lg ), вода: 763 (4,90), 518 (4,55), 419 (4.41), 374 (4,83), 351 (4,85). Спектр 1 H ЯМР (CD 3 OD), , м.д.: 2,09-2,13 (м, 8Н, СН 2 ), 2,34-2,37 (м, 8Н, СН 2 ), 3,24 (с, 24Н, СН 3 ), 3,53-3,59 (м, 8Н, CH 2 ), 3,63-3,66 (м, 8Н, СН 2 ), 3,99-4,04 (м, 8Н, СН 2 ), 4,10-4,38 (м, 12Н, -Н, ОН), 5,03-5,06 (м, 8Н, СН 2 ), 8,27 (с, 4Н, -Н), 9,50-9,53 (м, 4Н, Н-5 (Ру)), 9,18-9,23 (м, 4Н, Н-6 (Ру)), 9,44 (д, 4Н, Н-4(Ру)),9,86 (с, 4Н, Н-2(Ру)).

Пример 3

Определение фотостабильности соединения 1.

Фотостабильность соединения 1 изучали в насыщенном воздухом водном растворе при равномерном облучении непрерывным Nd 3+ -YAG лазером (длина волны генерации 532 нм, мощность 0,82 мВт) в течение 30 мин. Фотодеградацию 1 регистрировали через каждые 10 мин по уменьшению поглощения в максимуме длинноволновой Q-полосы. Квантовый выход фотообесцвечивания ( ф ) определяли по тангенсу угла наклона графика зависимости числа фотообесцвеченных молекул в растворе N мол , определяемого по формуле (1), от числа поглощенных квантов N кв , определяемого по формуле (2).

,

,

где D 0 и D - поглощение в максимуме Q - полосы фотосенсибилизатора до и после облучения. С 0 - концентрация фотосенсибилизатора в растворе до облучения; N А - число Авогадро, I - мощность на образце, - длина волны облучающего света, D - оптическая плотность облучаемого раствора на длине волны лазера, t - время облучения в секундах, с - скорость света, h - постоянная Планка, V - объем раствора в кювете.

Измеренная линейная зависимость количества фотообесцвеченных молекул от числа поглощенных квантов характеризуется тангенсом угла наклона 9,5×10 -4 , который численно равен квантовому выходу фотообесцвечивания . Согласно величине фотообесцвечивание фотосенсибилизатора 1 происходит после поглощения около 1000 квантов света на молекулу, т.е. по фотостабильности он сравним с другими производными бактериохлорина - мезо-тетра(1-метил-3-пиридил)бактериохлорин тетратозилата и мезо-тетра[1-(4'-бромбутил)-3-пиридил]бактериохлорин тетрабромида, для которых соответственно равны 18,5×10 -4 и 8,7×10 -4 .

Пример 4.

Накопление и внутриклеточная локализация соединения 1 в клетках карциномы легкого человека (культура клеток А549).

Изучение внутриклеточной локализации красителя в клетках проведено с применением метода конфокальной микроспектроскопии и реконструкции спектральных изображений (КОМИРСИ). Концентрация фотосенсибилизатора в среде варьировалась от 0,5 до 10 мкМ, время инкубации составляло 1-6 часов. Возбуждение флуоресценции проводили Nd 3+ -YAG лазером с длиной волны генерации 532 нм. Выявлено, что краситель проникает в клетки и накапливается в цитоплазме (диффузное распределение, а также концентрирование в гранулах), но не проникает в ядро. При изучении внутриклеточной кинетики показано, что максимальное накопление соединения 1 в цитоплазме клеток А549 наблюдается после 4 часов инкубации (Фиг3).

Анализ внутриклеточных спектров показал, что в цитоплазме клеток соединение 1 присутствует в различных состояниях, описываемых спектрами с максимумами флуоресценции 771, 773, 776 и 780 нм, отличными от спектра в PBS или в воде. С целью выяснения причин этих изменений было проведено исследование влияния микроокружения на флуоресценцию соединения 1.

Спектр с максимумом 771 нм наиболее близок к спектру 1 в комплексах с БСА и ЧСА, спектр с максимумом 773 - к спектру 1 в комплексах с глобулинами, спектр с максимумом 776 нм - в комплексах с нуклеиновыми кислотами.

Исследована кинетика накопления соединения 1 в клетках А549. Обнаружено, что в клетках соединение 1 накапливается довольно медленно: насыщение внутриклеточного накопления наблюдается только после 4 ч инкубации.

Пример 5.

Фотоиндуцированная активность соединения 1 в отношении клеток карциномы легкого человека (культура клеток А549). Фотосенсибилизатор вносили в культуральную среду в концентрации от 0,3 до 30 мкМ. Время инкубации варьировали от 30 минут до 6 часов. Облучение проводили как в примере 3, уровень ингибирования роста культуры вычисляли по формуле:

ИР (%)=[(П к -П о )/П к ]×100%,

где ИР - ингибирование роста культуры, в процентах;

П о и П к - число жизнеспособных клеток, выраженное в единицах оптической плотности, соответственно, в опытных (с красителем) и контрольных (без красителя) пробах. Биологически значимым эффектом считали ингибирование роста культуры на 50% (ИК 50 ).

Показано, что соединение 1 обладало высокой фототоксичностью в отношении клеток культуры А549. Максимальная фотоиндуцированная активность наблюдалась при 4 часах инкубации (ИK 50 составляла 1,5±0,07 мкМ), при увеличении временного интервала величина ИК 50 изменялась незначительно. Соединение 1 не обладало темновой токсичностью в течение суток наблюдения (ИК 50 >>20 мкг/мл).

Тестирование фотосенсибилизаторов 1 и 2 in vitro показало, что они проявляют высокую фототоксичность и в отношении опухолевых клеток человека НЕр2. Величина ИК 50 составляла 0,67±0,08 мкг/мл и 0,9±0,1 мкг/мл, соответственно. Темновая токсичность отсутствовала.

Таким образом, предложенный ФС обладает всеми свойствами, которые в дальнейшем позволят эффективно применять их для ФДТ злокачественных новообразований.

Формула изобретения

Четвертичные аммониевые соли мезо-тетра[1-(4'-бромбутил)-3-пиридил]бактериохлорина общей формулы

где ,

как фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии.

РИСУНКИ