Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
Патент на изобретение №2477316

(19)

RU

(11)

2477316

(13)

C1

(51) МПК C12P7/02 (2006.01)

C12P7/22 (2006.01)

C12P11/00 (2006.01)

C12R1/00 (2006.01)

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ Статус: по данным на 06.03.2013 - нет данных Пошлина:

(21), (22) Заявка: 2011154122/10, 29.12.2011

(24) Дата начала отсчета срока действия патента:

29.12.2011

Приоритет(ы):

(22) Дата подачи заявки: 29.12.2011

(45) Опубликовано: 10.03.2013

(56) Список документов, цитированных в отчете о

поиске: JP 64-002590, 06.01.1989. JP 61-265098, 22.11.1986. ЕЛЬКИН А.А., ГРИШКО В.В. и др. Окислительная биотрансформация тионизола актинобактериями рода rhodococcus / Молодежная школа-конференция с международным участием "Актуальные аспекты современной микробиологии", 26-27 октября, 2009, стр.107-108. ЕЛЬКИН А.А., ГРИШКО В.В. и др. Биокаталитическийсинтез оптически активных арилакилсульфоксидов / III Всероссийский с международным участием конгресс студентов и аспирантов- биологов "Симбиоз - Россия 2010". - Нижний Новгород: 2010, стр.53-54. ЕЛЬКИН А.А., ГРИШКО В.В. и др. Биотрансформация арилалкильных сульфидов целыми клетками Rhodococcus rhodochrous ИЭГМ 66 // Вестник Пермского Университета, Серия биология, Выпуск 1 (1). Пермь: 2010, стр.27-31. ЕА 9385, 28.12.2007. RU 2353622, 27.04.2009.

Адрес для переписки:

614081, г.Пермь, ул. Голева, 13, И.Б.Ившиной

(72) Автор(ы):

Ившина Ирина Борисовна (RU),

Гришко Виктория Викторовна (RU),

Елькин Андрей Анатольевич (RU)

(73) Патентообладатель(и):

Учреждение Российской академии наук Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН (RU)

(54) БИОКАТАЛИТИЧЕСКИЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ (R)-ФЕНИЛМЕТИЛОВОГО СУЛЬФОКСИДА

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии. Способ предусматривает биотрансформацию фенилметилсульфида с помощью свободных или иммобилизованных в матрице криогеля на основе поливинилового спирта клеток Gordonia terrae ВКПМ АС-1897, и процесс ведут в среде, содержащей н-гексадекан или глицерин соответственно. Изобретение позволяет повысить химический выход и оптическую чистоту (R)-фенилметилового сульфоксида и снизить концентрации н-гексадекана. 3 пр.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения оптически активных арилалкилсульфоксидов, в частности (R)-фенилметилсульфоксида с использованием бактериальной культуры G. terrae ИЭГМ 136.

Оптически активные (энантиомерно однородные, хиральные) органические сульфоксиды находят широкое применение в химической и фармацевтической практике. В асимметрическом синтезе сульфоксидная группа используется в качестве активного центра, способного с высокой степенью стереоселективности определять направление химических реакций [Толстиков А.Г., Гришко В.В., Ившина И.Б. Энантиоселективное биокаталитическое окисление органических сульфидов в хиральные сульфоксиды // Современные проблемы асимметрического синтеза / Под ред. А.Г.Толстикова. - Екатеринбург: УрО РАН, 2003. - С.165-205].

Известны способы получения оптически активных сульфоксидов с использованием интактных клеток родококков. Так, попытка Холанда с соавт. [Holland H.L., Brown F.M., Kerridge A., Pienkos P., Arensdor J. // J. Mol. Catal. B: Enzymatic. 2003. V.22. 3-4. P.219-223] получить целевой фенилметилсульфоксид с использованием свободных клеток R. erythropolis IGTS ВКО-53 в присутствии глюкозы (2%) привела к образованию рацемического сульфоксида. При этом химический выход фенилметилсульфоксида не превышал 70%. Кроме того, применение данного штамма для биоокисления тиоанизола ограничивается ввиду низкой концентрации трансформируемого фенилметилового сульфида (0,5 г/л) и высокой плотности используемой бактериальной суспензии (20,0 г кл./л).

Японские специалисты при использовании штамма R. equi IFO 3730 осуществили полную биоконверсию тиоанизола (1,0 г/л) в течение 72 часов в присутствии н-гексадекана [Ohta H., Okamoto Y., Tsuchihashi G. Asymmetric synthesis of chiral sulfoxides via microbial oxidation of sulfides // Chem. Lett. - 1984. - V.13. - 2. - P.205-208]. Степень конверсии (R)-фенилметилсульфоксида составила 75%. В качестве основных недостатков описанного процесса необходимо отметить низкий химический выход сульфоксида тиоанизола (не более 20%), высокую (2,0 об.%) концентрацию используемого н-гексадекана, который как балластный компонент осложняет стадию очистки оптически активного (R)-сульфоксида, а также патогенную природу представителей R. equi.

Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, заключается в повышении химического выхода и оптической чистоты целевого (R)-фенилметилсульфоксида, снижении концентрации используемого в качестве источника углерода н-гексадекана и повышении концентрации исходного трансформируемого тиоанизола.

Сущность изобретения заключается в том, что оптически активный (R)-сульфоксид тиоанизола получают путем микробиологической трансформации соответствующего прохирального сульфида, где в качестве биокатализатора используют свободные или иммобилизованные клетки Gordonia terrae ВКПМ AC-1897.

Поставленная задача решается заявляемым способом получения (R)-фенилметилсульфоксида путем микробиологической трансформации фенилметилсульфида, в котором используют клетки Gordonia terrae ВКПМ AC-1897 в свободном виде или иммобилизованные в матрицу криогеля на основе поливинилового спирта, и процесс ведут в среде, содержащей соответственно н-гексадекан или глицерин.

В заявленном способе в качестве биокатализатора используются клетки штамма актинобактерий Gordonia terrae ВКПМ AC-1897, выделенного из нефтезагрязненной почвы Украины и депонированного во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ).

Способ осуществляют следующим образом.

Бактерии выращивают в колбах Эрленмейера объемом 250 мл, в которые вносят 100 мл минеральной среды. Культивирование проводят на орбитальной качалке Certomat IS ("Sartorius", Германия) (160 об/мин). В опытах по биотрансформации тиоанизола интактными клетками используют минеральную среду следующего состава г/л: KNO 3 - 1,0; K 2 HPO 4 - 1,0; KH 2 PO 4 - 1,0; NaCl - 1,0; MgSO 4 ·7H 2 O - 0,2; CaCl 2 ·2H 2 O - 0,02; FeCl 3 - 0,001. В среду добавляют 0,1% дрожжевого экстракта ("Микроген", Россия) и раствор микроэлементов по Постгейту. В качестве источника углерода добавляют н-гексадекан (0,1 об.% - при трансформации тиоанизола и 1,0 об.% - при выращивании бактериальной биомассы для иммобилизации). При биотрансформации тиоанизола иммобилизованными клетками используют глицеринсодержащую среду, которая включала г/л: (NH 4 ) 2 SO 4 - 2,0; K 2 HPO 4 - 2,0; CaCl 2 ·2H 2 O - 0,01; FeSO 4 ·7H 2 O - 0,01; MgSO 4 ·7H 2 O - 0,1; глицерин - 1,0 или 10,0; дрожжевой экстракт - 4,0. Тиоанизол (0,5, 1,0, 1,5 г/л) в культуральную среду добавляют в виде раствора в изопропаноле (1:10 v/v).

Для иммобилизации бактериальных клеток в качестве полимерного носителя используют криогель на основе поливинилового спирта (ПВС) марки 40/2. ПВС в количестве 12 г суспендируют в 100 мл дистиллированной воды, полученную суспензию стерилизуют автоклавированием (120°С, 15 мин). Для иммобилизации используют клеточные суспензии, полученные в гексадекансодержащей среде. Остаточное содержание н-гексадекана составляет не более 0,1 об.%. Иммобилизацию клеток, выращенных в гексадекансодержащей среде, осуществляют путем внесения клеточной суспензии в раствор ПВС в объемном соотношении 1:2 согласно известной методике [Kuyukina M.S., Ivshina I.B., Gavrin A.Yu., Podorozhko E.A., Lozinsky V.I., Jeffree C.E., Philp J.C. Immobilization of hydrocarbon-oxidizing bacteria in poly(vinyl alchohol) cryogels hydrophobized using a biosurfactant // J. Microbiol. Methods. - 2006. - V.65. - P.596-603]. Полученный полимерный композит по 10 мкл раскапывают в микролуночные иммунологические планшеты. Образцы замораживают при -15°С в течение 12 ч, а затем оттаивают при 4°С на протяжении 5 ч.

Анализ фенилметилового сульфоксида. Качественный и количественный анализ продуктов биотрансформации проводят методами тонкослойной хроматографии (ТСХ), хромато-масс-спектрометрии (ХМС) и полярометрии. Экстракцию продуктов биотрансформации фенилметилсульфида осуществляют с помощью этилацетата. Объединенные этилацетатные вытяжки обезвоживают над Na 2 SO 4 . Растворитель удаляют в вакууме роторного испарителя ("Heidolph", Германия). Качественный состав продуктов биотрансформации контролируют методом ТСХ на пластинах с флуоресцентной добавкой ("Sigma-Aldrich", США), нанося аликвоты экстракта на расстоянии 10 мм от края. Наличие продуктов окисления в УФ (254 нм) фиксируют при сравнении хроматографической подвижности (Rf) с эталонным соединением, в качестве которых используют фенилметилсульфид ("Alfa Aesar", США) и продукты их окисления.

Образцы продуктов окисления фенилметилсульфида - соответствующий сульфоксид и сульфон получают с помощью метода химического окисления. Раствор 1 мМ фенилметилсульфида в 5 мл смеси ацетон:уксусная кислота (9:1) нагревают до 45-50°С и добавляют 0,9 мл 30% Н 2 О 2 . Смесь выдерживают 2 ч при комнатной температуре. После нейтрализации реакционной смеси насыщенным раствором бикарбоната натрия продукты реакции экстрагируют хлороформом. Целевой сульфоксид выделяют методом колоночной хроматографии.

Анализ продуктов биотрансформации осуществляют методом хромато-масс-спектрометрии с помощью газового хроматографа 6890N, Agilent, США, с кварцевой капиллярной колонкой RTX-5MS "United Instruments" (Австралия) с внутренним диаметром 0,25 мм и длиной 30 м с предколонкой 5 м (неподвижная фаза - 5% фенилполисилфениленсилоксан; газ-носитель - гелий) и квадрупольным масс-спектрометром MSD 5973N в качестве детектора. Для анализа используют 1 мкл экстракционного раствора. Анализ продуктов биотрансформации фенилметилсульфида проводят в температурном режиме: 80°С в течение 2 мин, затем температуру повышают до 178°С со скоростью 7,55°С/мин, после чего выдерживают при 280°С в течение 5 мин. Температура испарителя - 280, источника ионов - 170, интерфейса между газовым хроматографом и масс-спектрометром - 280°С.

Продукты биоконверсии фенилметилсульфида выделяют с использованием метода колоночной хроматографии на силикагеле ("Merck", Германия) при соотношении вещества и сорбента 1:12. В качестве элюента используют смесь гексана с градиентом 5-40% этилацетата. Показатель [ D ] образцов тиоанизола в хлороформе измеряют на поляриметре модели 341 ("Perkin-Elmer", США) при длине волны 589 нм.

Оптическую чистоту (р) целевого сульфоксида определяют по формуле:

p=([ ]/[ ]max)·100%,

где величина [ ] соответствует значению определяемого удельного угла вращения плоскости поляризации света для исследуемого образца, [ ]max соответствует значению максимального (абсолютного) удельного угла вращения плоскости поляризации света для энантиомерно чистого образца.

Выход продукта выражают в процентах от теоретически возможного, исходя из разницы молекулярных весов субстрата и продукта (100%-ный выход продукта из 1 М сульфидного субстрата равен 1 М, т.е. в весовом выражении, 100% выход сульфоксида: из 124 г фенилметилсульфида составляет 140 г).

Пример 1.

Биотрансформацию фенилметилсульфида проводят свободными клетками Gordonia terrae ВКПМ AC-1897. Культивирование проводят на орбитальной качалке Certomat IS ("Sartorius", Германия) (160 об/мин) при 28°С. В экспериментах используют питательную среду следующего состава, г/л: KNO 3 - 1,0; K 2 HPO 4 - 1,0; KH 2 PO 4 - 1,0; NaCl - 1,0; MgSO 4 ·7H 2 O - 0,2; CaCl 2 ·2H 2 O - 0,02; FeCl 3 - 0,001. В среду добавляли 0,1% дрожжевого экстракта ("Микроген", Россия) и раствор микроэлементов по Постгейту. В качестве источника углерода добавляли н-гексадекан (0,1 об.%). Фенилметилсульфид (0,5 г/л) в культуральную среду добавляют в виде раствора в изопропаноле (1:10 v/v) через 48 ч роста бактериальной культуры.

Степень конверсии исходного сульфидного субстрата через 94 ч трансформации составляет 91-100%, при этом химический выход целевого фенилметилсульфоксида достигает 85-90%, оптическая чистота сульфоксида - 85-90%.

Пример 2.

Биотрансформацию фенилметилсульфида проводят иммобилизованными в ПВС-криогель клетками Gordonia terrae ВКПМ AC-1897 в колбах Эрленмейера объемом 250 мл, в которые вносят 100 мл питательной среды. Перед использованием полученный биокатализатор регидратировали в 0,5%-ном растворе NaCl в течение 24 ч и добавляли из расчета 200 гранул (5,0±0,6×10 6 кл./мл) на 100 мл среды. Культивирование проводят на орбитальной качалке Certomat IS ("Sartorius", Германия) (160 об/мин) при 28°С. В экспериментах используют питательную среду следующего состава, г/л: (NH 4 ) 2 SO 4 - 2,0; K 2 HPO 4 - 2,0; CaCl 2 ·2H 2 O - 0,01; FeSO 4 ·7H 2 O - 0,01; MgSO 4 ·7H 2 O - 0,1; глицерин - 10,0; дрожжевой экстракт - 4,0. Фенилметилсульфид (0,5 г/л) в культуральную среду добавляют в виде раствора в изопропаноле (1:10 v/v).

Степень конверсии исходного сульфидного субстрата через 24 ч трансформации составляет 98-100%, при этом химический выход целевого фенилметилсульфоксида достигает 83-92%, оптическая чистота сульфоксида - 86-93%.

Пример 3.

Способ осуществляют по примеру 2, но в среду культивирования добавляют 1,5 г/л фенилметилсульфида. Выход целевого сульфоксида через 24 ч составляет 30-36% (степень превращения субстрата - 35-40%). 100%-ная степень превращения субстрата достигается через 72 ч, при этом регистрируется 75-84% выход сульфоксида с оптической чистотой 85-92%.

Формула изобретения

Способ получения (R)-фенилметилсульфоксида путем микробиологической трансформации фенилметилсульфида, отличающийся тем, что используют клетки Gordonia terrae ВКПМ АС-1897 в свободном виде и процесс ведут в среде, содержащей н-гексадекан или клетки Gordonia terrae ВКПМ АС-1897, иммобилизованные в матрицу криогеля на основе поливинилового спирта, и процесс ведут в среде, содержащей глицерин.