√лавна€ страница  |  ќписание сайта  |   онтакты
3'-‘ќ—‘ј“, N, P-Ќ≈«јў»ў≈ЌЌџ≈ ‘ќ—‘ќ“»ќј“Ќџ≈ ќЋ»√ќƒ≈«ќ —Ќ” Ћ≈ќ“»ƒџ ¬  ј„≈—“¬≈ »—’ќƒЌџ’ —ќ≈ƒ»Ќ≈Ќ»… ƒЋя ѕќЋ”„≈Ќ»я ‘ќ—‘ќ“»ќј“Ќџ’, ќЋ»√ќЌ” Ћ≈ќ“»ƒЌџ’ –≈ј√≈Ќ“ќ¬ ƒЋя Ѕ»ќ“≈’ЌќЋќ√»„≈— »’ ѕ–ќ÷≈——ќ¬, ‘ќ—‘ќ“»ќј“Ќџ≈ ќЋ»√ќЌ” Ћ≈ќ“»ƒЌџ≈ ѕ–ќ»«¬ќƒЌџ≈, —ќƒ≈–∆јў»≈ 3'- »/»Ћ» 5'- —¬я«јЌЌџ≈ ’»ћ»„≈— »≈ √–”ѕѕ»–ќ¬ » ¬  ј„≈—“¬≈ ‘ќ—‘ќ“»ќј“Ќџ’ ќЋ»√ќЌ” Ћ≈ќ“»ƒЌџ’ –≈ј√≈Ќ“ќ¬ ƒЋя Ѕ»ќ“≈’ЌќЋќ√»„≈— »’ ѕ–ќ÷≈——ќ¬ » —ѕќ—ќЅ »’ ѕќЋ”„≈Ќ»я
3'-‘ќ—‘ј“, N, P-Ќ≈«јў»ў≈ЌЌџ≈ ‘ќ—‘ќ“»ќј“Ќџ≈ ќЋ»√ќƒ≈«ќ —Ќ” Ћ≈ќ“»ƒџ ¬  ј„≈—“¬≈ »—’ќƒЌџ’ —ќ≈ƒ»Ќ≈Ќ»… ƒЋя ѕќЋ”„≈Ќ»я ‘ќ—‘ќ“»ќј“Ќџ’, ќЋ»√ќЌ” Ћ≈ќ“»ƒЌџ’ –≈ј√≈Ќ“ќ¬ ƒЋя Ѕ»ќ“≈’ЌќЋќ√»„≈— »’ ѕ–ќ÷≈——ќ¬, ‘ќ—‘ќ“»ќј“Ќџ≈ ќЋ»√ќЌ” Ћ≈ќ“»ƒЌџ≈ ѕ–ќ»«¬ќƒЌџ≈, —ќƒ≈–∆јў»≈ 3'- »/»Ћ» 5'- —¬я«јЌЌџ≈ ’»ћ»„≈— »≈ √–”ѕѕ»–ќ¬ » ¬  ј„≈—“¬≈ ‘ќ—‘ќ“»ќј“Ќџ’ ќЋ»√ќЌ” Ћ≈ќ“»ƒЌџ’ –≈ј√≈Ќ“ќ¬ ƒЋя Ѕ»ќ“≈’ЌќЋќ√»„≈— »’ ѕ–ќ÷≈——ќ¬ » —ѕќ—ќЅ »’ ѕќЋ”„≈Ќ»я

3'-‘ќ—‘ј“, N, P-Ќ≈«јў»ў≈ЌЌџ≈ ‘ќ—‘ќ“»ќј“Ќџ≈ ќЋ»√ќƒ≈«ќ —Ќ” Ћ≈ќ“»ƒџ ¬  ј„≈—“¬≈ »—’ќƒЌџ’ —ќ≈ƒ»Ќ≈Ќ»… ƒЋя ѕќЋ”„≈Ќ»я ‘ќ—‘ќ“»ќј“Ќџ’, ќЋ»√ќЌ” Ћ≈ќ“»ƒЌџ’ –≈ј√≈Ќ“ќ¬ ƒЋя Ѕ»ќ“≈’ЌќЋќ√»„≈— »’ ѕ–ќ÷≈——ќ¬, ‘ќ—‘ќ“»ќј“Ќџ≈ ќЋ»√ќЌ” Ћ≈ќ“»ƒЌџ≈ ѕ–ќ»«¬ќƒЌџ≈, —ќƒ≈–∆јў»≈ 3'- »/»Ћ» 5'- —¬я«јЌЌџ≈ ’»ћ»„≈— »≈ √–”ѕѕ»–ќ¬ » ¬  ј„≈—“¬≈ ‘ќ—‘ќ“»ќј“Ќџ’ ќЋ»√ќЌ” Ћ≈ќ“»ƒЌџ’ –≈ј√≈Ќ“ќ¬ ƒЋя Ѕ»ќ“≈’ЌќЋќ√»„≈— »’ ѕ–ќ÷≈——ќ¬ » —ѕќ—ќЅ »’ ѕќЋ”„≈Ќ»я

ѕатент –оссийской ‘едерации
—уть изобретени€: »спользование: в качестве исходных соединений дл€ получени€ фосфотиатных олигонуклеотидных реагентов дл€ биотехнологических процессов. —ущность изобретени€: 3'-фосфат, N,P-незащищенные фосфотиатные олигодезоксинуклеотиды I, фосфотиатные олигонуклеотидные производные II, способ получени€ II взаимодействием 3'- или 5'-фосфат, N,P-незащищенных фосфотиатных олигодезоксинуклеотидов с соответствующим азолами или аминопиридинами, или производными алифатических аминов в присутствии трифенилфосфандипиридилдисульфид и N-метилимидазола в качестве катализатора. 1 табл.
ѕоиск по сайту

1. — помощью поисковых систем

   — помощью Google:    

2. Ёкспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. ѕо номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Ќомер патента: 2069214
 ласс(ы) патента: C07H21/00, A61K31/70
Ќомер за€вки: 94010679/04
ƒата подачи за€вки: 29.03.1994
ƒата публикации: 20.11.1996
«а€витель(и): Ќовосибирский институт биоорганической химии —ќ –јЌ
јвтор(ы): јмирханов Ќ.¬.; «арытова ¬.‘.
ѕатентообладатель(и): Ќовосибирский институт биоорганической химии —ќ –јЌ
ќписание изобретени€: √руппа изобретений относитс€ к области биоорганической химии, а именно:
a) к новым химическим соединени€м 3'-фосфат, N,P-незамещенным фосфотиатным олигодезоксинуклеотидам общей формулы (I)
,
где B остаток тимина, цитозина, аденина или гуанина;
n 1-20 (общеприн€то, что к олигонуклеотидам относ€тс€ полинуклеотидные последовательности длиной цепи от 1 до примерно 20);
которые могут быть использованы в качестве исходных дл€ синтеза фосфотиатных олигонуклеотидных реагентов дл€ биотехнологических процессов;
б) к фосфотиатным олигонуклеотидным реагентам, содержащим 3'- и/или 5'-св€занные химические группировки, общей формулы (II)
,
где R'=
B остаток тимина, цитозина, аденина или гуанина;
n 1-20
(3'-реагенты)
(5'-реагенты)
(3'-, 5'-реагенты)
R" остаток аминопиридина, например 4-диметиламинопиридина (DMAP)

или остаток азола, например N-метилимидазола (MeIm)

или остаток алкилирующего амина, например 4-(N-метил-N-2-хлорэтиламино)бензилметиламина (HN(CH3)CH2RCl)

или остаток алифатического амина, например 1,3-пропилендиамина (NH2(CH2)3NH2)
-NH(CH2)3NH2
или аминолинкерна€ группа с остатком интеркалирующего красител€, например N-(2-оксиэтил)феназини€(-NH(CH2)3HN-Phn))

R"' аминолинкерна€ группа с остатком интеркалирующего красител€, например N-(2-оксиэтил)феназини€(-NH(CH2)3HN-Phn)),
получаемых на основе исходных 3'-фосфат, N,P-незащищенных фосфотиатных олигодезоксинуклеотидов общей формулы (I) или на основе 5'-фосфат, N,P-незащищенных фосфотиатных олигодезоксинуклеотидов общей формулы (III) или (IV)

где B остаток тимина, цитозина, аденина или гуанина;
n 1-20;
x аминолинкерна€ группа с остатком интеркалирующего красител€, например N-(2-оксиэтил)феназини€ (-NH(CH2)3HN-Phn));
в) к способу получени€ фосфотиатных олигонуклеотидных реагентов общей формулы (II).
¬ведение различных химических групп в состав природных олигонуклеотидов или их аналогов придает олигонуклеотидной молекуле различные новые свойства и тем самым позвол€ет значительно увеличить биологическую активность этих соединений и расширить область их применени€ в биотехнологических процессах [1-2]   тому же, различные химические группировки могут присоедин€тьс€ как по 3'-, так и по 5'-концу олигонуклеотидной цепи, либо одновременно по 3'- и 5'-концам цепи, что значительно может расширить спектр их действи€.
¬ последнее врем€ широкое применение нашли фосфотиатные аналоги олигонуклеотидов (‘“јќ) [1-4] которые отличаютс€ от природных олигонуклеотидов наличием в межнуклеотидных фосфатных остатках атомов серы -OP(S)(O-)O-. ѕреимущество ‘“јќ по сравнению с обычными природными олигонуклеотидами заключаетс€ в их устойчивости к действию клеточных нуклеаз, а по сравнению с метилфосфонатными аналогами олигонуклеотидов в хорошей растворимости в водных средах. ‘“јќ и их производные про€вили в некоторых случа€х высокую биологическую активность при подавлении развити€ различных вирусных инфекций (особенно развити€ вируса —ѕ»ƒа [3]
»звестно, что незащищенные фосфотиатные остатки (-OP(S)(O-)O-) обладают большей нуклеофильностью по сравнению с природными фосфатами (-OP(O)(O-)O-) и способны легко окисл€тьс€ и подвергатьс€ модификации в ходе синтеза.
Ќесмотр€ на широкий спектр различных производных нормальных олигонуклеотидов, ассортимент известных на сегодн€шний день производных ‘“јќ ограничен лишь несколькими примерами этих соединений. »звестный способ получени€ производных ‘“јќ основан на использовании в качестве исходных соединений, присоединенных к полимерному носителю по 3'-концу цепи, 5'-гидроксил, N,P-защищенных олигонуклеотидов общей формулы (V) [3]
,
где B* остаток тимина, N4-бензоилцитозина, N6-бензоиладенина, N2-изобутирилгуанина;
n 1-20;
ѕ полимерный носитель.
Ќапример, известно 5'-холестероловое производное фосфотиатного олигонуклеотида, получение которого основано на использовании 5'-гидроксил N,P-защищенных олигонуклеотидов, присоединенных к полимерному носителю по 3'-концу цепи (соединени€ общей формулы (V)), остаток стероида к которому присоедин€ют с помощью специально синтезированного стероидсодержащего Ќ-фосфонатного реагента, по 5'-свободной гидроксильной группе олигонуклеотида [3]
ѕолученные 5'-холестероловые производные фосфотиатных олигонуклеотидов были использованы в биотехнологических процессах по подавлению развити€ различных вирусов, в том числе и вирусов —ѕ»ƒа, в клетках. ѕрисоединение остатка холестерола позволило, например, значительно увеличить проникающую способность исходных фосфотиатных олигонуклеотидов и тем самым увеличить степень подавлени€ развити€ вирусной инфекции в клетках [3]
Ќедостатком получени€ производных фосфотиатных олигонуклеотидов на основе 5'-гидроксил, N, P-защищенных олигонуклеотидов €вл€етс€ то, что целевые продукты получаютс€ после жесткой обработки аммиаком (в течение 10 часов при 60oC) необходимой дл€ удалени€ обычно используемых N-защитных ацильных групп. ¬ ходе этих обработок (операций) относительно неустойчивые химические группировки могут подвергатьс€ модификации или отсоединению от полученного фосфотиатного олигонуклеотидного реагента. Ёто приводит к ограничению ассортимента получаемых производных фосфотиатных олигонуклеотидов. ¬ частности, использование присоединенных к полимерному носителю по 3'-концу цепи, 5'-гидроксил, N,P-защищенных олигонуклеотидов общей формулы (V) в качестве исходных соединений не позвол€ет получать:
а) фосфотиатные олигонуклеотидные реагенты, содержащие реакционноспособные (например, алкилирующие, метилимидазолил- или диметиламинопиридилилфосфамидные) группировки, способные активно реагировать с нуклеофилами, поскольку вводимые реакционноспособные группировки при обработке концентрированным аммиаком могут реагировать с ними и образовывать химически не активные соединени€, т.е. могут тер€ть свои реакционноспособные свойства;
б) фосфотиатные олигонуклеотидные реагенты гетерогенного состава (где ¬
остаток тимидина, аденозина, гуанозина или цитозина), содержащие остатки интеркалирующих красителей, поскольку последние при обработке аммиаком отсоедин€ютс€ от фосфотиатного олигонуклеотида.
в) фосфотиатные олигонуклеотидные реагенты, содержащие химические группировки на 3'-конце олигонуклеотидной цепи, поскольку 3'-конец исходных олигонуклеотидов присоединен к полимерному носителю.
«адачей насто€щего изобретени€ €вл€етс€ расширение ассортимента фосфотиатных олигонуклеотидных реагентов, содержащих различные, в том числе и реакционноспособные, химические группы.
ѕоставленна€ задача решаетс€ описываемыми новыми соединени€ми - 3'-фосфат, N, P-незащищенными фосфотиатными олигодезоксинуклеотидами общей формулы (I). ѕри этом использование данных соединений в качестве исходных позвол€ет проводить присоединение различных, в том числе и реакционноспособных, химических групп путем активации концевых фосфатных групп в присутствии конденсирующей пары трифенилфосфин дипиридилдисульфид [5]
ѕолученные производные фосфотиатных олигонуклеотидов общей формулы (II) €вл€ютс€ новыми, ранее не синтезированными фосфотиатными олигонуклеотидными реагентами, которые могут быть использованы в различных биотехнологических процессах.
Ќапример, диметиламинопиримидиновые, метилимидазолидные или алкилирующие производные (соединени€ общей формулы (II), где R" остаток диметиламинопиридина, метилимидазола или алкилирующего амина) €вл€ютс€ реакционноспособными регентами, способными избирательно (не затрагива€ межнуклеотидные фосфотиоатные остатки в самом реагенте) реагировать с различными нуклеофилами (например, с аминами), а N-(2-оксиэтил)феназиниевые производные (см. соединени€ общей формулы (II), где R" R"' остаток N-(2-оксиэтил)феназини€) обладают свойствами интеркалирующего красител€, т.е. €вл€ютс€ интенсивно окрашенными соединени€ми, где остатки N-(2-оксиэтил)феназини€ выступают в качестве олигонуклеотидкрас€щей метки, а в перспективе могут выступать в качестве интеркалирующих остатков, способных стабилизировать комплементарные комплексы, образованные с участием нуклеиновых кислот. —пособность полученных реакционноспособных фосфотиатных олигонуклеотидных реагентов взаимодействовать с различными нуклеофилами может быть использована дл€ направленной модификации нуклеиновых кислот или ферментов в живых организмах. (»звестно, что в качестве нуклеофильных центров в нуклеиновых кислотах могут выступать N7-положение гуанина, N3- и N7-положени€ аденина и N3-положение цитидина, которые способны легко модифицироватьс€ под действием реакционноспособных (например, алкилилирующих) групп в составе олигонуклеотидов [6]   нуклеофильным центрам ферментов можно отнести, например, SH-группы остатков метионина, NH2-группы остатков лизина или остатки гистидина, способные подвергатьс€ модификации под воздействием DMAP-, MeIm- или RCl-алкилирующих фосфамидных производных, например нормальных олигонуклеотидов [7]).
»спользование соединений общей формулы (I) в качестве исходных позвол€ет также получать фосфотиатные олигонуклеотидные реагенты, содержащие различные химические группы на 5'-конце цепи, в том числе и уже известные производные фосфотиатных олигонуклеотидов, содержащих, например, остаток холестерола [3] — этой целью исходные 3'-фосфат, N,P-незащищенные фосфотиоатные олигодезоксинуклеотиды общей формулы (I) вначале подвергают ферментативному 3'-дефосфорилированию известными методами в присутствии, например, фермента щелочной фосфотазы, затем фосфорилирут в присутствии аденозинтрифосфорной кислоты и фермента полинуклеотидкиназы [8] ѕолученные таким образом 5'-фосфат, N,P-незащищенные фосфотиатные олигодезоксинуклеотиды общей формулы (III) далее могут быть использованы в качестве исходных соединений дл€ присоединени€ различных, в том числе и реакционноспособных, а также уже известных холестеролсодержащих, химических групп по 5'-концу цепи, аналогично присоединению химических групп по 3'-концу цепи (см. выше) путем активации 5'-концевой фосфатной группы в присутствии конденсирующей пары трифенилфосфин дипиридилсульфид.
»спользование соединений общей формулы (I) в качестве исходных позвол€ет также получать фосфотиатные олигонуклеотидные реагенты, содержащие различные химические группы одновременно на 3'- и 5'-концах цепи. — этой целью полученные выше фосфотиатные олигонуклеотидные реагенты, содержащие 3'-св€занные химические группировки (например, соединени€ общей формулы (II), где R" остаток интеркалирующего красител€ N-(2-оксиэтил)феназини€), вначале подвергают ферментативному фосфорилированию с помощью аденозинтрифосфорной кислоты в присутствии фермента полинуклеотидкиназы [8] и получают промежуточные 5'-фосфорилированные соединени€ общей формулы (IV) (где X - аминолинкерна€ группа с остатком интеркалирующего красител€), путем активации 5'-концевого фосфата которых в присутствии конденсирующей пары трифенилфосфин -дипиридилдисульфид присоедин€ют различные химические группировки дополнительно по 5'-концу цепи.
—оединени€, содержащие химические группировки на 3'- и 5'-концах цепи, могут обладать одновременно двум€ свойствами, например свойствами интеркалирующих красителей и свойствами реакционноспособных групп, введенных в состав фосфотиатного олигонуклеотида, т.е. могут быть мечеными интеркалирующим красителем соединени€ми, способными в то же самое врем€ взаимодействовать с различными нуклеофилами. ј присоединение по 3'- и 5'-концам цепи одновременно двух одинаковых по функциональному назначению химических групп позвол€ет увеличить степень функциональности вводимых химических групп (например, увеличить степень окрашенности фосфотиатного олигонуклеотидного реагента при введении в его состав двух остатков интеркалирующего красител€ N-(2-оксиэтил)феназини€.
“аким образом, использование 3'-фосфат, N,P-незащищенных фосфотиатных олигодезоксинуклеотидов в качестве исходных соединений дл€ синтеза производных фосфотиатных олигонуклеотидов позвол€ет получать как уже известные реагенты (содержащие, например, остатки холестерола [3]), так и реагенты, содержащие в своем составе реакционноспособные группировки или остатки интеркалирующих красителей, и таким образом позвол€ет значительно расширить ассортимент фосфотиатных олигонуклеотидных реагентов дл€ биотехнологических процессов.
3'-фосфат, N, P-незащищенные фосфотиатные олигодезоксинуклеотиды общей формулы (I) получают последовательной обработкой известных 5'-диметокситритил, 3'-pSMe, N-ацил, P(SMe)-защищенных фосфотиатных олигонуклеотидов [9] общей формулы (VI)
,
где B* остаток тимина, N4-бензоилцитозина, N6-бензоиладенина, N2-изобутирилгуанина;
DMTr 4,4'-диметокситритил;
n 1-20,
раствором йода в водном пиридине дл€ удалени€ 3'-p-концевых SMe-защит [9] (при этом методом 31P-яћ–-спектроскопии нами показано, что межнуклеотидные триэфирные P-SMe группы сохран€ютс€), затем раствором тиофенола в смеси триэтиламина и диоксана дл€ удалени€ Me-групп с межнуклеотидных P-SMe остатков [10] (в результате которого образуютс€ межнуклеотидные фосфотиатные группы) с последующей обработкой водным аммиаком (дл€ удалени€ N-ацильных защит с гетероциклических оснований нуклеотидов) и уксусной кислотой (дл€ удалени€ 5'-O-диметокситритильных защитных групп) с выделением целевого продукта ионообменной хроматографией.
ѕример 1. Cинтез 3'-фосфат дитимидилил фосфотиата.
TpsTp (VIII)
0,1 моль (111 мг) защищенного дитимидилата DMTrTp(SMe)Tp(SMe) (VII) (соединение общей формулы (VI), где B* тимидин, n 1), полученного по известной методике [9] раствор€ют в 10 мл смеси пиридин-вода (3:2), добавл€ют 129 мг йода (1 ммоль). „ерез 20 мин реакционную смесь упаривают, раствор€ют в 10 мл воды и избыток йода удал€ют экстракцией эфиром (3 х 50 мл). ¬одные слои упаривают. ѕолучают промежуточное соединение DMTrTp(SMe)Tp (VIIIa), которое анализируют 31P-яћ–-спектроскопией. ¬ спектрах 31-яћ– (пиридин-вода, 3:2) обнаружено:
1) сигналы в области 32,3 м.д. относ€щиес€ к исходным межнуклеотидным триэфирным SMe-фосфотиатным группам (-O-P(SMe)(O)O-) [11]
2) полное исчезновение сигналов в области 21,1 м.д. относ€щихс€ к 3'-концевой p(SMe) фосфодиэфирной группе (-O-P(SMe)(O)O- [9]
3) по€вление сигналов в области 1,6 м.д. относ€щихс€ к деблокированной моноэфирной 3'-фосфатной группе (-O-P(O)(O-)O-) [12]
Ёти данные свидетельствуют о селективном и количественном деблокировании SMe-защит только с 3'-концевой фосфатной группы и об образовании соединени€ (VIIIa).
ѕолученное промежуточное соединение (VIIIa) раствор€ют в 6 мл смеси: тиофенол-диоксан-триэтиламин (1:2:1). „ерез 48 часов реакционную смесь высаживают (выливают) в 500 мл серного эфира, осадок отдел€ют и сушат, получают промежуточное соединение DMTrTpsTp (VIIIб), которое анализируют 31P-яћ–-спектроскопией. ќтсутствие в спектрах сигналов в области 32,2 м.д. и по€вление сигналов в области 55,7 м.д. на основании литературных данных [4, 11, 12] свидетельствуют о полном деблокировании Me-групп с P-SMe фосфотриэфирных межнуклеотидных остатков (-O-P(SMe)(O)O-) в промежуточном соединении (VIIIa) и об образовании диэфирных фосфотиоатных межнуклеотидных групп (-O-P(S)(O-)O- ps). Ёти данные подтверждают структуру полученного промежуточного соединени€ (VIIIб).
ƒалее реакционную смесь, содержащую промежуточное соединение (VIIIб), выдерживают в 10 мл 80%-ной уксусной кислоты в течение 30 мин и упаривают на ротационном испарителе (стандартные услови€ дл€ удалени€ DMTr-защитных групп), получают соединение (VIII). —оединение (VIII) хроматографируют на колонке с ионообменным носителем (ѕолисил —ј) в градиенте K2HPO4, содержащем 20% -ный ацетонитрил. ÷елевой продукт обессоливают на обращенно фазовой колонке, элюиру€ продукт 50%-ным водным ацетонитрилом, и упаривают.
ѕолучено 1430 OE260 целевого соединени€. ¬ыход 85%
ѕродукт гомогенен по данным ионообменной хроматографии, имеет большее врем€ удерживани€ по сравнению с контрольным динуклеотидом TpTp, не содержащим фосфотиатных групп (см. таблицу). ѕри обращенно фазовой хроматографии полученный продукт (VIII) элюируетс€ в виде двух пиков, представл€ющих собой смесь двух диастереомеров, с большим временем удерживани€, чем врем€ удерживани€ контрольного дитимидилата TpTp. ”‘-спектры полученного соединени€ (VIII) в воде: λmin 240 нм, λmax 270 нм, ε26016,8 x 103 л моль-1 см-1, идентичны спектрам контрольного дитимидилата TpTp. ¬ 31P-яћ–-спектрах (H2O) обнаружены сигналы в области 55,1 и 55,4 м.д. которые соответствуют сигналам, относ€щимс€ к межнуклеотидным фосфотиатным группам (ps) [15, 24] (два диастереомера). –егистрируютс€ также сигналы в области -0,1 м.д. соответствующие сигналам 3'-концевого фосфата [24] —оотношение фосфотиатных и 3'-фосфатных сигналов 0,99:1 (теоретически 1:1). ƒругих сигналов в 31P-яћ–-спектрах не обнаружено.
—умма представленных данных доказывает структуру полученного соединени€ (VIII).
ѕример 2. —интез 3'-фосфат тритимидилил фосфотиата.
TpsTpsTp (IX)
ќбработка 15,4 мг (0,1 ммоль) защищенного тритимидилата DMTrTp(SMe)Tp(SMe)Tp(SMe) (VIIa) раствором йода, смесью тиофенола с триэтиламином и диоксаном, уксусной кислотой и выделение продукта хроматографией в услови€х примера 1 дают 1768 OE260 соединени€ (IX). ¬ыход 71%
ѕродукт гомогенен по данным ионообменной хроматографии и имеет большее врем€ удерживани€ по сравнению с контрольным тритимидилатом TpTpTp и выше полученным динуклеозидфосфотиатом TpsTp (VIII) (см. таблицу). ѕри обращенно-фазовой хроматографии продукт элюируетс€ в виде смеси изомеров, врем€ удерживани€ которых больше, чем врем€ удерживани€ контрольного тритимидилата TpTpTp. ”‘-спектры полученного соединени€ (IX) в воде: λmin 240 нм, λmax 217 нм, ε260 24,9 х 103 л моль-1-1, - идентичны спектрам контрольного тритимидилата TpTpTp. ¬ 31P-яћ–-спектрах (ƒћ‘, триэтиламонийна€ соль) обнаруживаютс€ сигналы в области 55,6-56,2 м.д. соответствующие сигналам межнуклеотиных фосфотиоатных групп (ps) и сигналы в области (-0,9)-(-1,2) м.д. соответствующие 3'-концевому фосфату в соотношении 1,95:1 (теоретически 2: 1).
—умма представленных данных подтверждает структуру полученного соединени€ (IX).
ѕример 3. —интез 3'-фосфат дезоксиоктануклеотид фосфотиата.
CpsApsTpsTpsGpsTpsGpsAp (X).
ќбработка 402 мг (0,1 ммоль) защищенного октануклеотида DMTrCbzp(SMe)Abzp(SMe)Tp(SMe)Tp(SMe)Gibp(SMe) Tp(SMe)Gibp(SMe)-Abzp(SMe) (VIIб) раствором йода, смесью тиофенола с триэтиламином и диоксаном в услови€х примера 1 дает промежуточное соединение DMTrCbzpsAbzpsTpsTpsGibpsTpsGibpsAbzp (Xa), которое содержит неблокированные N-ацильные защитные группы, дл€ удалени€ которых реакционную смесь на этой стадии нагревают в концентрированном аммиаке (20 мл) в течение 6 часов при 50oC. ѕолучают промежуточное соединение DMrTCpsApsTpsTpsGpsTpsGpsAp (’б). ƒалее реакционную смесь, содержащую промежуточное соединение (’б) выдерживают в 10 мл 80%-ной уксусной кислоты в течение 30 мин и упаривают на ротационном испарителе (стандартные услови€ дл€ удалени€ DMTr-защитных групп), получают соединение (’). —оединение (’) хроматографируют на колонке с ионообменным носителем (ѕолисил —ј) в градиенте K2HPO4, содержащем 20%-ный ацетонитрил. ÷елевой продукт обессоливают на обращенно фазовой колонке, элюиру€ продукт 50%-ным водным ацетонитрилом, и упаривают.
ѕолучено 1193 OE260 целевого соединени€. ¬ыход 15%
ѕродукт гомогенен по данным ионообменной хроматографии, имеет большее врем€ удерживани€ по сравнению с контрольным октануклеотидом CpApTpTpGpTpGpAp, не содержащим межнуклеотидных фосфотиатных групп (см. таблицу). ѕри обращенно-фазовой хроматографии полученный продукт (IX) элюируетс€ в виде смеси диастереомеров, врем€ удерживани€ которых больше, чем врем€ удерживани€ контрольного окатнуклеотида CpApTpTpGpTpGpAp. ”‘-спектры полученного соединени€ (X) в воде: λmin 236 нм, λmax 266 нм, ε260 79,5 x 103 л моль-1 см-1, идентичны спектрам контрольного октануклеотида CpApTpTpGpTpGpAp. ¬ 31P-яћ–-спектрах (30% CH3CN в H2O) обнаруживаютс€ сигналы, соответствующие сигналам межнуклеотидных фосфотиатных групп (ps) ((δ 55,4 м.д.) и 3'-концевому фосфату ((δ -0,2 м.д.) в соотношении 6,8:1 (теоретически 7:1).
—умма представленных данных подтверждает структуру полученного соединени€ (X).
Ќаличие концевого 3'-фосфата в полученном соединении (’) доказывают следующим образом. јликвоту соединени€ (’) обрабатывают щелочной фосфотазой в стандартных услови€х [8] получают 3'-дефосфорилированный продукт CpsApsTpsTpsGpsTpsGpsA, который подвергают ионообменной хроматографии (см. таблицу). ”меньшение времени удерживани€ полученного дефосфорилированного продукта (27,1 мин) по сравнению со временем удерживани€ исходного соединени€ (IX) (35,6 мин) свидетельствует о наличии в исходном соединении (’) концевого фосфата. ƒругую аликвоту соединени€ (’) обрабатывают аденозинтрифосфорной кислотой в присутствии фермента полинуклеотид киназы в стандартных услови€х ферментативного фосфорилировани€ олигонуклеотидов [8] ѕолучают 3'-, 5'-дифосфорилированный продукт pCpsApsTpsTpsGpsTpsGpsAp, который подвергают ионообменной хроматографии. ”величение времени удерживани€ полученного продукта (44,2 мин) по сравнению со временем удерживани€ исходного соединени€ (’) (35,6 мин) свидетельствует о наличии в соединении (’) 5'-гидроксильной. —умма этих данных свидетельствует о наличии в соединении (’) 3'-фосфатной (и 5'-гидроксильной) группы.
Ќиже приведены примеры использовани€ 3'-фосфат, N,P-незащищенных фосфотиатных олигодезоксинуклеотидов общей формулы (I) в качестве исходных соединений дл€ получени€ фосфотиатных олигонуклеотидных реагентов, содержащих 3'-св€занные химические группировки общей формулы (II).
ѕример 4. —интез (4-диметиламино)пиридин-3'-фосфамидного производного дитимидилил фосфотиата.
TpsTp-DMAP (XI)
  раствору 19,7 мг (0,01 ммоль) триэтиламмонийной динуклеозидфосфотиоата TpsTp (VIII) в 1 мл диметилформамида добавл€ют 24,4 мг (0,2 ммоль) 4,4'-диметиламинопиридина, 22 мг (0,1 ммоль) 2,2'-дипиридилдисульфида и 26,2 мг (0,1 ммоль) трифенилфосфина. „ерез 20 мин реакционную смесь выливают в 50 мл серного эфира. ќсадок раствор€ют в 1 мл диметилформамида и снова высаживают в эфир. ќсадок промывают эфиром и высушивают.
ѕолучают 247 OE260 соединени€ (XI). ¬ыход 92%
ѕродукт гомогенен по данным ионообменной хроматографии, имеет меньшее врем€ удерживани€ по сравнению с исходным динуклеозидфосфотиатом (VIII) (см. таблицу). ¬ спектрах 31P-яћ– (ƒћ‘) обнаружено:
1) сигналы в области 55,4 и 55,7 м.д. относ€щиес€ к исходным межнуклеотидным фосфотиатным остаткам (ps) (два диастереомера) [4, 12]
2) полное исчезновение сигналов в области -0,3 и -0,4 м.д. относ€щихс€ к 3'-концевой фосфатной группе [5, 12]
3) по€вление сигналов в области -7,2 м.д. относ€щихс€ к диметиоламинопиридин-3'-фосфамидной группе (3'-pDMAP) [5, 12]
Ёти данные свидетельствуют о количественном образовании 3'-pDMAP производного соединени€ (VIII) и о сохранности межнуклеотидных фосфотиатных групп.
—умма полученных данных подтверждает структуру полученного соединени€ (XI).
¬озможность использовани€ соединени€ (XI) в качестве фосфотиатного олигонуклеотидного реагента, способного реагировать с нуклеофилами, провер€ли на примерах реакции соединени€ (XI) с различными аминами (выступающими в данном случае в качестве нуклеофилов) под контролем 31–-яћ–-спектроскопии.
ѕримеры реакций соединени€ (XI) с аминами приведены ниже (примеры 4а-в).
ѕример 4а. –еакци€ фосфотиатного олигонуклеотидного реагента (XI) с бензиламином (NH2Bnz).
  10,6 мг (0,01 ммоль) триэтиламмонийной соли соединени€ (XI) в 1 мл диметилформамида приливают 10,7 мкл (0,1 ммоль) бензиламина. „ерез 10 мин в спектрах яћ– наблюдаютс€ полное исчезновение сигналов в области -7,2 м.д. (соответствующих исходным 3'-pDMAP фосфамидным группам) и по€вление сигналов в области 6,4 и 6,6 м.д. (соответствующих образованию бензиламин-3'-фосфамида [5, 12]), межнуклеотидные фосфотиатные (ps) группы при этом не повреждаютс€ ((δ 55,6 и 55,9 м.д.). Ёти данные свидетельствуют об образовании бензилфосфамидного производного TpsTpNHBnz (XIa) (где Bnz остаток бензиламина). –еакционна€ способность полученного реагента может быть оценена также данными анализа реакционной смеси ионообменной хроматографией. ’роматографические характеристики полученного продукта (XIa) приведены в таблице.
ѕример 4б. –еакци€ фосфотиатного олигонуклеотидного реагента (XI) с пропилендиамином (NH2(CH2)3NH2).
  10,6 мг (0,01 ммоль) соединени€ (’I) в 1 мл диметилформамида приливают 8,3 мкл (0,1 ммоль) пропилендиамина. „ерез 10 мин в спектрах яћ– наблюдаютс€ полное исчезновение сигналов в области -7,2 м.д. и по€вление сигналов в области 7,7 и 7,9 м.д. (соответствующих образованию (3-амино)пропил-3'-фосфамида [5]), межнуклеотидные фосфотиатные (ps) группы при этом не повреждаютс€ ((δ 56,8 и 56,9 м.д.) Ёти данные свидетельствуют об образовании (3-амино)пропил-фосфамидного производного TpsTpNH(CH2)3NH2 (XIб). –еакционна€ способность полученного реагента может быть оценена также данными анализа реакционной смеси ионообменной хроматографией. ’роматографические характеристики полученного продукта (XIб) приведены в таблице.
ѕример 4в. –еакци€ фосфотиатного олигонуклеотидного реагента (XI) с алкилирующим амином (NH(CH3)CH2RCl).
  10,6 мг (0,01 ммоль) соединени€ (XI) в 0,9 мл диметилформамида добавл€ют 21,2 мг (0,1 ммоль) алкилирующего амина NH(CH3)CH2RCl, растворенного в 0,1 мл диметилформамида. „ерез 10 мин в спектрах яћ– наблюдаютс€ полное исчезновение сигналов в области -7,2 м.д. и по€вление сигналов в области 7,3 и 7,4 м. д. (соответствующих образованию 3'-фосфамида соответствующего амина [5] ), межнуклеотидные фосфотиатные (ps) группы при этом не повреждаютс€ ((δ 56,4 и 56,7 м.д.). Ёти данные свидетельствуют об образовании алкилирующего фосфамидного производного TpsTpN(CH3)CH2RCl (XIв). –еакционна€ способность полученного реагента может быть оценена также данными анализа реакционной смеси ионообменной хроматографией. ’роматографические характеристики полученного продукта (XIa) приведены в таблице.
—умма представленных в примерах 4а-в данных свидетельствует о высокой реакционноспособности полученного соединени€ (XI) по отношению к различным аминам (выступающим в данном случае в качестве нуклеофилов) и свидетельствует о возможности использовани€ соединени€ (XI) в качестве фосфотиатного олигонуклеотидного реагента, способного избирательно (не затрагива€ межнуклеотидные фосфотиатные группы в самом реагенте) реагировать с нуклеофилами.
ѕример 5. —интез N-метилимидазол-3'-фосфамидного производного дитимидилил фосфотиата.
TpsTp-MeIm (XII)
–еакци€ 10,7 мг (0,01 ммоль) триэтиламмонийной соли динукеозидфосфотиата TpsTp (VIII) с 16,4 мкл N-метилимидазола, 2,2'-дипиридилдисульфида и трифенилфосфина в услови€х, приведенных в примере 4 дает 198 OE260 соединени€ (XII). ¬ыход 91%
ѕродукт гомогенен по данным ионообменной хроматографии, имеет меньшее врем€ удерживани€ по сравнению с исходным динуклеозидфосфотиатом (VIII) (см. таблицу). ¬ спектрах 31P-яћ–-(ƒћ‘) обнаружено:
1) сигналы в области 55,1 и 55,5 м.д. относ€щиес€ к исходным межнуклеотидным фосфотиатным остаткам (ps) [4, 12]
2) полное исчезновение сигналов в области -0,3 и -0,4 м.д. относ€щихс€ к 3'-концевой фосфатной группе [12]
3) по€вление сигналов в области -11,5 и -11,7 м.д. относ€щихс€ к N-метилимидазол-3'-фосфамидной группе (3'-pMeIm) [5]
Ёти данные свидетельствуют о количественном образовании 3'-pMeIm производного соединени€ (VIII) и о сохранности межнуклеотидных фосфотиатных групп. —умма полученных данных подтверждает структуру полученного соединени€ (XII).
–еакционную способность полученного фосфотиатного олигонуклеотидного реагента (XII) по отношению к нуклеофилам провер€ли реакцией с различными аминами под контролем 31P-яћ–-спектроскопии. –еакци€ соединени€ (XII) с бензиламином, пропилендиамином и алкилирующим амином в услови€х, приведенных в примерах 4а-в, в течение уже 10 мин приводит к количественному образованию соответствующих фосфамидных производных (XIa-в) без повреждени€ межнуклеотидных фосфотиатных групп. Ёти данные свидетельствуют о высокой реакционноспособности соединени€ (XII) и возможности использовани€ соединени€ (XII) в качестве фосфотиатного олигонуклеотидного реагента, способного избирательно (не затрагива€ межнуклеотидные фосфотиатные группы в самом реагенте) реагировать с нуклеофилами.
ѕример 6. —интез 4-(N-метил-N-2-хлорэтиламино)бензилметил 3'-фосфамидного производного тритимидилил фосфотиата TpsTpsTp.
TpsTpsTp-N(CH3)CH2RCl (XIII).
–еакци€ 14,9 мг (0,01 ммоль) триэтиламмонийной соли тринуклеозидфосфотиоата TpsTpsTp (IX) с 16,4 мкл (0,2 ммоль) N-метилимидазола, 2,2'-дипиридилдисульфида, трифенилфосфина и 21,2 мг (0,1 ммоль) алкилирующего 4-(N-метил-N-2-хлорэтиламино)бензилметиламина (NH(CH3)CH2RCl) (растворенного в 0,1 мл диметилформамида) в услови€х, приведенных в примере 4, дает 304 OE260 соединени€ (XIII). ¬ыход 87%
ѕродукт гомогенен по данным ионообменной хроматографии, имеет меньшее врем€ удерживани€ по сравнению с исходным тринуклеозидфосфотиатом (IX) (см. таблицу). ¬ спектрах 31P-яћ–(ƒћ‘) обнаружено:
1) сигналы в области 56,0-57,0 м.д. относ€щиес€ к исходным межнуклеотидным фосфотиатным остаткам (ps) [4, 12]
2) полное исчезновение сигналов в области (-0,8) (-1,1) м.д. относ€щихс€ к 3'-концевой фосфатной группе [12]
3) по€вление сигналов в области 7,6-7,8 м.д. относ€щихс€ к 4-(N-метил-N-2-хлорэтиламино)бензилметил-3'-фосфамидной группе (p-N(CH3)CH2RCl) [5]
Ёти данные свидетельствуют о количественном образовании 3'-p-N(CH3)CH2RCl производного соединени€ (IX) и о сохранности межнуклеотидных фосфотиатных групп.
ѕо данным ионообменной хроматографии при кислотном гидролизе (0,1 ћ HCl, 2 часа при 40oC) [4]) соединение (XIII) практически количественно превращаетс€ в исходной фосфотиат (IX) и остаток алкилирующего амина, что дополнительно свидетельствует о сохранности межнуклеотидных фосфотиатных (ps) групп в полученном алкилирующем производном фосфотиата (XIII) и наличии фосфамидной св€зи в этом соединении. Ёти данные подтверждают структуру полученного фосфотиатного олигонуклеотидного реагента (XIII).
—пособность полученного соединени€ (XIII) избирательно (не затрагива€ межнуклеотидные фосфотиатные группы в самом реагенте) реагировать с нуклеофилами провер€ли на примере реакции алкилировани€ этим соединением этилендиамина [13] или тиосульфата натри€ [14] Ќиже приведены примеры реакции соединени€ (XIII) с этими нуклеофилами.
ѕример 6а. –еакци€ соединени€ (XIII) с этилендиамином [25] и тиосульфатом натри€ (Na2S2O4) [14]
јликвоту соединени€ (XIII) выдерживают в течение 5 часов при 37oC в 1 ћ водном растворе этилендиамина. –еакционную смесь анализируют ионообменной хроматографией в услови€х, приведенных в таблице. ѕродукт алкилировани€ этилендиамина имеет меньшее врем€ удерживани€ (8,5 мин), чем врем€ удерживани€ исходного реагента (XII) (9,5 мин). –еакционна€ способность RCl-групп, определенна€ таким способом, в соединении (XIII) составл€ет 89% ƒалее реакционную смесь подвергают кислотному гидролизу (0,1 г HCl 2 ч при 40o— [5]), и вновь анализируют полученную реакционную смесь ионообменной хроматографией, при этом образуетс€ исходный фосфотиат (IX) со временем удерживани€ 18,5 мин. —охранность составл€ет 95% јналогично провер€ют реакционную способность соединени€ (XIII) по отношению к тиосульфату натри€ (Na2S2O4) [14] котора€ составл€ет 92%
Ёти данные свидетельствует о высокой реакционноспособности соединени€ (XIII) и возможности использовани€ этого соединени€ в качестве фосфотиатного олигонуклеотидного реагента, способного избирательно (не затрагива€ межнуклеотидные фосфотиатные группы в самом реагенте) реагировать с нуклеофилами.
ѕример 7. —интез (3-амино)пропил-3'-фосфамидного производного тритимидилил фосфотиата.
TpsTpsTp-NH(CH2)3NH2 (XIV)
–еакци€ 14,9 мг (0,01 ммоль) триэтиламмонийной соли тринуклеозидфосфотиата TpsTpsTp (IX) с 16,4 мкл (0,2 ммоль) N-метилимидазола, 2,2'-дипиридилдисульфида, трифенилфосфина и 8,3 мкл (0,1 ммоль) пропилендиамина в услови€х, приведенных в примере 4, дает 237 OE260 соединени€ (XIV). ¬ыход 95%
ѕродукт гомогенен по данным ионообменной хроматографии имеет меньшее врем€ удерживани€ по сравнению с исходным тринуклеозидфосфотиатом (IX). 31P-яћ– (ƒћ‘) dps 55,7-57,3 м.д. ѕо данным ионообменной хроматографии при кислотном гидролизе (0,1 ћ HCl 2 часа при 40oC) соединение (XIV) практически количественно превращаетс€ в исходный фосфотиат (IX). Ёти данные подтверждают структуру полученного соединени€. Ќаличие алифатических аминогрупп в полученном соединении подтверждали реакцией с N-(2-оксиэтил)феназинием [14] котора€ количественно завершаетс€ за 10 мин (см. ниже пример 8а) с образованием соединени€ (XV), что показывает возможность использовани€ соединени€ (XIV) в качестве фосфотиатного олигонуклеотидного реагента с аминолинкерной группой.
ѕример 8. —интез производного тритимидилилфосфотиата, содержащего на 3'-конце цепи остаток N-(2-оксиэтил)феназини€.
TpsTpsTp-NH(CH2)3NH-Phn (XV)
а) синтез исход€ из соединени€ (XIV)
14,4 мг (0,01 ммоль) соединени€ (XIV), содержащего концевую алифатическую группу, раствор€ют в 200 мкл 0,05 ћ раствора хлорида N-(2-оксиэтил)феназини€ в 0,1 M Na2CO3^ выдерживают 10 мин и добавл€ют 5 мл 2%-ного раствора LiClO4 в ацетоне. ќсадок отдел€ют, раствор€ют в воде (100 мкл), и процедуру осаждени€ повтор€ют 2 раза. ѕолученное этим методом соединение (XV) выдел€ют ионообменной хроматографией. ѕолучают 307 OE соединени€ (XV). ¬ыход 88%
ѕродукт гомогенен по данным ионообменной хроматографии, имеет меньшее врем€ удерживани€ по сравнению с исходным (IX) и промежуточным (XIV) соединени€ми и элюируетс€ в виде окрашенного в фиолетовый цвет соединени€. ѕри обращенно-фазовой хроматографии продукт элюируетс€ в виде смеси изомеров, врем€ удерживани€ которых больше, чем врем€ удерживани€ исходного и промежуточного соединений (IX) и (XIV). ¬ 31P-яћ–-cпектрах (H2O) обнаруживаютс€ сигналы, соответствующие сигналам межнуклеотидных фосфотиатных групп (ps) ((δ 55,3-55,4 м.д.) и 3'-концевой фосфамидной группе (d 8,7 м.д.). ѕо данным ионообменной хроматографии при кислотном гидролизе (0,1 M HCl 2 часа при 40oC) соединение (XV) практически количественно превращаетс€ в исходный фосфотиат (IX).
—умма приведенных данных свидетельствует о наличии в полученном соединении межнуклеотидных фосфотиатных остатков и наличии фосфамидной св€зи.
Ёлектронные спектры поглощени€ (в воде): lmin 230, 250, 442 нм, λmax 238, 279, 395 и 549 нм; ε260 34,9 x 103, ε395 9,4 x 103, ε530 14,8 x 103 л моль-1-1.
ѕриведенные электронные спектры поглощени€ свидетельствуют о наличии в полученном соединении остатков интеркалирующего красител€ N-(2-оксиэтил)феназини€ [4] Ќаличие в электронных спектрах поглощени€ λmax 395 и 549 нм свидетельствует об окрашенности полученного соединени€ в видимой области светового спектра (продукт окрашен в интенсивный фиолетово-красный цвет) и показывает возможность использовани€ полученного соединени€ (XV) в качестве фосфотиатного олигонуклеотидного реагента, меченного интеркалирующим красителем.
б) синтез исход€ из соединени€ (IX)
–еакци€ 14,9 мг (0,01 ммоль) триэтиламмонийной соли тринуклеозидфосфотиата TpsTpsTp (IX) с 16,4 мкл (0,2 ммоль) N-метилимидазола, 2,2'-дипиридилдисульфида, трифенилфосфина и 32 мг (0,1 ммоль) 1,3-пропилендиаминового производного N-(2-оксиэтил)феназини€ (NH2(CH2)3NH-Phn) в услови€х, приведенных в примере 4, дает 263 OE260 соединени€ (XIV). ¬ыход 75%
ѕродукт гомогенен по данным ионообменной хроматографии и по своим характеристикам (см. таблицу) идентичен продукту, полученному по методу а) (см. пример 8а).
ѕример 9. —интез диметиламинопиридин-3'-фосфамидного производного дезоксиоктануклеотид фосфотиата.
CpsApsTpsTpsGpsTpsGpsAp-DMAP (XVI)
—интез и выделение ведут аналогично описанному в примере 4, исход€ из соединени€ (’).
¬ыход и характеристики целевого продукта приведены в таблице.
–еакци€ полученного реагента с аминами в услови€х, приведенных в примерах 4а-в, количественно завершаетс€ в течение 15-20 мин без повреждени€ межнуклеотидных фосфотиатных групп в самом реагенте. Ёти данные свидетельствует о высокой реакционной способности соединени€ (XVI) и возможности использовани€ этого соединени€ в качестве фосфотиатного олигонуклеотидного реагента, способного избирательно (не затрагива€ межнуклеотидные фосфотиатные группы в самом реагенте) реагировать с нуклеофилами.
ѕример 10. —интез N-метилимидазол-3'-фосфамидного производного дезоксиоктануклеотид фосфотиата.
CpsApsTpsTpsGpsTpsGpsA-pMeIm (XVII)
—интез и выделение ведут аналогично описанному в примере 5, исход€ из соединени€ (’).
¬ыход и характеристики целевого продукта приведены в таблице.
–еакци€ полученного реагента с аминами в услови€х, приведенных в примерах 4а-в, количественно завершаетс€ в течение 10-15 мин без повреждени€ межнуклеотидных фосфотиатных групп в самом реагенте. Ёти данные свидетельствует о высокой реакционной способности соединени€ (XVII) и возможности использовани€ этого соединени€ в качестве фосфотиатного олигонуклеотидного реагента, способного избирательно (не затрагива€ межнуклеотидные фосфотиатные группы в самом реагенте) реагировать с нуклеофилами.
ѕример 11. —интез 4-(N-метил-N-2-хлорэтиламино)бензилметил 3'-фосфамидного производного дезоксиоктануклеотид фосфотиата.
CpsApsTpsTpsGpsTpsGpsAp-N(CH3)CH2RCl (XVIII)
—интез и выделение ведут аналогично описанному в примере 6, исход€ из соединени€ (X).
¬ыход и характеристики целевого продукта приведены в таблице. јктивность RCl-групп при реакции с этилендиамином [13] или тиосульфатом натри€ [14] составл€ет 85 и 90% соответственно, сохранность межнуклеотидных фосфотиатных групп при этом составл€ет 90 и 95% соответственно.
Ёти данные свидетельствует о высокой реакционноспособности соединени€ (XVIII) и возможности использовани€ этого соединени€ в качестве фосфотиатного олигонуклеотидного реагента, способного избирательно (не затрагива€ межнуклеотидные фосфотиатные группы в самом реагенте) реагировать с нуклеофилами.
ѕример 12. —интез (3-амино)пропил-3'-фосфамидного производного дезоксиоктануклеотид фосфотиата.
CpsApsTpsTpsGpsTpsGpsAp-NH(CH2)3NH2 (XIX)
—интез и выделение ведут аналогично описанному в примере 7, исход€ из соединени€ (’).
¬ыход и характеристики целевого продукта приведены в таблице.
Ќаличие алифатических аминогрупп в полученном соединении подтверждали реакцией с N-(2-оксиэтил)феназинием [14] котора€ количественно завершаетс€ за 10 мин (см. ниже пример 13а) с образованием соединени€ (XX), что показывает возможность использовани€ соединени€ (XIX) в качестве фосфотиатного олигонуклеотидного реагента с аминолинкерной группой.
ѕример 13. —интез производного дезоксиоктануклеотид фосфотиата, содержащего на 3'-конце цепи остаток N-(2-оксиэтил)феназини€.
CpsApsTpsTpsGpsTpsGpsAp-NH(CH2)3NH-Phn (XX)
a) синтез исход€ из соединени€ (XIX)
—интез и выделение ведут аналогично описанному в примере 8а, исход€ из (см. пример 12) соединени€ (XIX).
¬ыход и характеристики целевого продукта приведены в таблице.
Ёлектронные спектры поглощени€ (в воде): λmin 228, 245, 442 нм, λmax 237, 268, 395 и 549 нм; ε260 89,5 x 103, ε395 9,4 х 103, ε530 14,8 x 103 л моль-1 см-1.
ѕриведенные электронные спектры поглощени€ свидетельствуют о наличии в полученном соединении остатков интеркалирующего красител€ N-(2-оксиэтил)феназини€ [14] Ќаличие в электронных спектрах поглощени€ λmax 395 и 529 нм свидетельствует об окрашенности полученного соединени€ в видимой области светового спектра (продукт окрашен в интенсивный фиолетово-красный цвет) и показывает возможность использовани€ полученного соединени€ (XIX) в качестве фосфотиатного олигонуклеотидного реагента, меченного интеркалирующим красителем.
б) синтез исход€ из соединени€ (X)
—интез и выделение ведут аналогично описанному в примере 8б, исход€ из соединени€ (X).
ѕродукт гомогенен по данным ионообменной хроматографии и по своим характеристикам (см. таблицу) идентичен продукту, полученному по методу а) (см. пример 13а).
Ќиже приведены примеры использовани€ 3'-фосфат, N,P-незащищенных фосфотиатных олигодезоксинуклеотидов общей формулы (I) в качестве исходных соединений дл€ получени€ фосфотиатных олигонуклеотидных реагентов, содержащих 5'-св€занные химические группировки общей формулы (II).
ѕример 14. —интез 4-(N-метил-N-2-хлорэтиламино)бензилметил 5'-фосфамидного производного дезоксиоктануклеотид фосфотиата.
ClRCH2(CH3)Np-CpsApsTpsTpsGpsTpsGpsA (XXI)
a). —интез дезоксиоктануклеотид фосфотиата
CpsApsTpsTpsGpsTpsGpsA (XXIa)
—оединение (XXa) получают дефосфорилированием исходного 3'-фосфат дезоксиоктануклеотид фосфотиата (’) с помощью фермента щелочной фосфотазы в стандартных услови€х, приведенных дл€ обычных немодифицированных олигонуклеотидов [8] ѕродукт выдел€ют ионообменной хроматографией на носителе ѕолисил —ј. ¬ыход 90% ѕродукт гомогенен при ионообменной хроматографии и имеет меньшее врем€ удерживани€, чем врем€ удерживани€ исходного недефосфорилированного октануклеотид фосфотиата (X).
’арактеристики целевого продукта приведены в таблице.
б). —интез 5'-фосфат дезоксиоктануклеотид фосфотиата
pCpsApsTpsTpsGpsTpsGpsA (XXIб)
—оединение (XXб) получают ферментативным 5'-фосфорилированием полученного дезоксиоктануклеотид фосфотиата (XXIa) с помощью аденозинтрифосфорной кислоты в присутствии фермента полинуклеотидкиназы в стандартных услови€х, приведенных дл€ обычных немодифицированных олигонуклеотидов [8] ѕродукт выдел€ют ионообменной хроматографией на носителе ѕолисил —ј. ¬ыход 85% ѕродукт гомогенен при ионообменной хроматографии и имеет большее врем€ удерживани€, чем врем€ удерживани€ исходного дефосфорилированного октануклеотид фосфотиата (XXIa).
’арактеристики целевого продукта приведены в таблице.
в). —интез 4-(N-метил-N-2-хлорэтиламино)бензилметил 5'-фосфамидного производного дезоксиоктануклеотид фосфотиата.
—lRCH2(CH3)Np-CpsApsTpsTpsGpsTpsGpsA (XXI)
—интез и выделение ведут аналогично описанному в примере 6, исход€ из вышеполученного (см. пример 14б) 5'-фосфат дезоксиоктануклеотид фосфотиата pCpsApsTpsTpsGpsTpsGpsA (XXIб).
¬ыход и характеристики целевого продукта приведены в таблице.
јктивность RCl-групп при реакции с этилендиамином [13] или тиосульфатом натри€ [14] составл€ет 89 и 92% соответственно, сохранность межнуклеотидных фосфотиатных групп при этом составл€ет 90 и 95% соответственно.
Ёти данные свидетельствует о высокой реакционноспособности соединени€ (XXI) и возможности использовани€ этого соединени€ в качестве фосфотиатного олигонуклеотидного реагента, способного избирательно (не затрагива€ межнуклеотидные фосфотиатные группы в самом реагенте) реагировать с нуклеофилами.
ѕример 15. Cинтез производного дезоксиоктануклеотид фосфотиата, содержащего на 5'-конце цепи остаток холестерола (Chol).
Chol-OC(O)(CH2)2NH-p-CpaApsTpsTpsGpsTpsGpsA (XXII)
–еакци€ 34,7 мг (0,01 ммоль) 5'-фосфат дезоксиоктануклеотид фосфотиата pCpsApsTpsTpsGpsTpsGpsA (XXIб) c 16,6 мкл (0,2 ммоль) N-метилимидазола, 2,2'-дипиридилдисульфида, трифенилфосфина и 45,8 мг (0,1 ммоль) холестеролового эфира β-аланина (Chol-OC(O)(CH2)2NH2) в услови€х, приведенных в примере 4, дает 708 OE260 соединени€ (XXII). ¬ыход 89%
ѕродукт гомогенен по данным ионообменной хроматографии и имеет меньшее врем€ удерживани€ по сравнению с исходным соединением (XXIб) (cм. таблицу). ѕри обращенно-фазовой хроматографии продукт элюируетс€ в виде смеси диастереомеров, врем€ удерживани€ которых значительно больше, чем врем€ удерживани€ исходного фосфотиата (XXIб), не содержащего в своем составе остатка холестерола. Ёти данные нар€ду с литературными [3] подтверждают наличие в соединении (XXII) гидрофобного остатка холестерола.
ѕо данным ионообменной хроматографии при кислотном гидролизе (0,1 ћ HCl 2 часа при 40oC [5]) соединение (XXIIa) практически количественно превращаетс€ в исходный фосфотиат (XXIб). Ёти данные показывают наличие в составе соединени€ (XXII) фосфотиатного олигонуклеотида. —умма полученных данных подтверждает структуру синтезированного соединени€ (XXIIa).
ѕример 16. —интез диметиламинопиридин-5'-фосфамидного производного дезоксиоктануклеотид фосфотиата.
DMAP-pCpsApsTpsTpsGpsTpsGpsA (XXIII).
—интез и выделение ведут аналогично описанному в примере 4, исход€ из вышеполученного (см. пример 14б) 5'-фосфат дезоксиоктануклеотид фосфотиата pCpsApsTpsTpsGpsTpsGpsA (XXIб).
¬ыход и характеристики целевого продукта приведены в таблице.
–еакци€ полученного реагента с аминами в услови€х, приведенных в примерах 4а-в, количественно завершаетс€ в течение 15-20 мин без повреждени€ межнуклеотидных фосфотиатных групп в самом реагенте. Ёти данные свидетельствуют о высокой реакционной способности соединени€ (XXIII) и возможности использовани€ этого соединени€ в качестве фосфотиатного олигонуклеотидного реагента, способного избирательно 8 (не затрагива€ межнуклеотидные фосфотиатные группы в самом реагенте) реагировать с нуклеофилами.
ѕример 17. —интез N-метилимидазол-5'-фосфамидного производного дезоксиоктануклеотид фосфотиата.
MeIm-pCpsApsTpsTpsGpsTpsGpsA (XXIV)
—интез и выделение ведут аналогично описанному в примере 5, исход€ из вышеполученного (см. пример 14б) 5'-фосфат дезоксиоктануклеотид фосфотиата pCpsApsTpsTpsGpsTpsGpsA (XXIб).
¬ыход и характеристики целевого продукта приведены в таблице.
–еакци€ полученного реагента с аминами в услови€х, приведенных в примерах 4а-в, количественно завершаетс€ в течение 10-15 мин без повреждени€ межнуклеотидных фосфотиатных групп в самом реагенте. Ёти данные свидетельствует о высокой реакционной способности соединени€ (XXIV) и возможности использовани€ этого соединени€ в качестве фосфотиатного олигонуклеотидного реагента, способного избирательно (не затрагива€ межнуклеотидные фосфотиатные группы в самом реагенте) реагировать с нуклеофилами.
ѕример 18. —интез (3-амино)пропил-5'-фосфамидного производного дезоксиоктануклеотид фосфотиата.
NH2(CH2)3NH-pCpsApsTpsTpsGpsTpsGpsA (XXV)
—интез и выделение ведут аналогично описанному в примере 7, исход€ из вышеполученного (см. пример 14б) 5'-фосфат дезоксиоктануклеотид фосфотиата pCpsApsTpsTpsGpsTpsGpsA (XXIб).
¬ыход и характеристики целевого продукта приведены в таблице.
Ќаличие алифатических аминогрупп в полученном соединении подтверждали реакцией с N-(2-оксиэтил)феназинием [14] котора€ количественно завершаетс€ за 10 мин (см. ниже пример 19а) с образованием соединени€ (XXVI), что показывает возможность использовани€ соединени€ (XXV) в качестве фосфотиатного олигонуклеотидного реагента с аминолинкерной группой.
ѕример 19. —интез производного дезоксиоктануклеотид фосфотиата, содержащего на 5'-конце цепи остаток N-(2-оксиэтил)феназини€.
Phn-NH(CH2)3NH-p-CpsApsTpsTpsGpsTpsGpsA (XXVI)
a) синтез исход€ из соединени€ (XXV)
—интез и выделение ведут аналогично описанному в примере 8а, исход€ из вышеполученного (см. пример 18) соединени€ (XXV). ¬ыход и характеристики целевого продукта приведены в таблице.
Ёлектронные спектры поглощени€ (в воде): λmin 228, 245, 442 нм, λmax 237, 268, 395 и 549 нм; ε260 89,5 x 103, ε395 9,4 x 103, ε530 14,8 x 103 л моль-1 см-1.
ѕриведенные электронные спектры поглощени€ свидетельствуют о наличии в полученном соединении остатков интеркалирующего красител€ N-(2-оксиэтил)феназини€ [14] Ќаличие в электронных спектрах поглощени€ λmax 395 и 549 нм свидетельствует об окрашенности полученного соединени€ в видимой области светового спектра (продукт окрашен в интенсивный фиолетово-красный цвет) и показывает возможность использовани€ полученного соединени€ (XXV) в качестве фосфотиатного олигонуклеотидного реагента, меченного интеркалирующим красителем.
б) синтез исход€ из соединени€ (XXIб)
—интез и выделение ведут аналогично описанному в примере 8б, исход€ из соединени€ (XXIб).
ѕродукт гомогенен по данным ионообменной хроматографии и по своим характеристикам (см. таблицу) идентичен продукту, полученному по методу а) (см. 18а).
Ќиже приведены примеры использовани€ 3'-фосфат, N,P-незащищенных фосфотиатных олигодезоксинуклеотидов общей формулы (I) в качестве исходных соединений дл€ получени€ фосфотиатных олигонуклеотидных реагентов, содержащих одновременно 3'- и 5'-св€занные химические группировки общей формулы (II).
ѕример 20. —интез диметиламинопиридин-5'-фосфамидного производного дезоксиоктануклеотид фосфотиата, содержащего дополнительно на 3'-конце цепи остаток N-(2-оксиэтил)феназини€.
DMAP-pCpsApsTpsTpsGpsTpsGpsAp-NH(CH2)3NH-Phn (XXVII)
a). —интез 5'-фосфат дезоксиоктануклеотид фосфотиатного производного, содержащего на 3'-конце цепи остаток N-(2-оксиэтил)феназини€
p-CpsApsTpsTpsGpsTpsGpsAp-NH(CH2)3NH-Phn (XXVIIa)
—интез и выделение ведут аналогично описанному в примере 14б, путем ферментативного 5'-фосфорилировани€ вышеполученного 5'-гидроксил, 3'-феназиниевого производного дезоксиоктануклеотид фосфотиата (XX).
¬ыход и характеристики целевого продукта приведены в таблице.
б). —интез диметиламинопиридин-5'-фосфамидного производного дезоксиоктануклеотид фосфотиата, содержащего дополнительно на 3'-конце цепи остаток N-(2-оксиэтил)феназини€
DMAP-pCpsApsTpsTpsGpsTpsGpsAp-NH(CH2)3NH-Phn (XXVII)
—интез и выделение ведут аналогично описанному в примере 4, исход€ из вышеполученного (см. пример 20а) 5'-фосфат, 3'-феназиниевого производного дезоксиоктануклеотид фосфотиата (XXVIIa).
¬ыход и характеристики целевого продукта приведены в таблице.
–еакци€ полученного реагента с аминами в услови€х приведенных в примерах 4а-в количественно завершаетс€ в течение 15-20 мин без повреждени€ межнуклеотидных фосфотиатных групп в самом реагенте. Ёти данные свидетельствуют о высокой реакционной способности соединени€ (XXVII) и возможности использовани€ этого соединени€ в качестве фосфотиатного олигонуклеотидного реагента, способного избирательно (не затрагива€ межнуклеотидные фосфотиатные группы в самом реагенте) реагировать с нуклеофилами.
Ёлектронные спектры поглощени€ (в воде): λmin 228, 245, 442 нм, λmax 237, 270, 395 и 549 нм; ε260 99,5 x 103, ε395 9,4 x 103, ε530 14,8 x 103 л моль -1 см-1.
ѕриведенные электронные спектры поглощени€ свидетельствуют о наличии в полученном соединении остатков интеркалирующего красител€ N-(2-оксиэтил)феназини€ [14] Ќаличие в электронных спектрах поглощени€ λmax 395 и 549 нм свидетельствует об окрашенности полученного соединени€ в видимой области светового спектра (продукт окрашен в интенсивный фиолетово-красный цвет) и показывает возможность использовани€ полученного соединени€ (XXVII) в качестве фосфотиатного олигонуклеотидного реагента, меченного интеркалирующим красителем.
ѕример 21. —интез N-метилимидазол-5'-фосфамидного производного дезоксиоктануклеотид фосфотиата, содержащего дополнительно на 3'-конце цепи остаток N-(2-оксиэтил)феназини€.
MeIm-pCpsApsTpsTpsGpsTpsGpsAp-NH(CH2)3NH-Phn (XXVIII)
—интез и выделение ведут аналогично описанному в примере 5, исход€ из вышеполученного (см. пример 20а) 5'-фосфат, 3'-феназиниевого производного дезоксиоктануклеотид фосфотиата (XXVIIa).
¬ыход и характеристики целевого продукта приведены в таблице.
–еакци€ полученного реагента с аминами в услови€х, приведенных в примерах 4а-в, количественно завершаетс€ в течение 10-15 мин без повреждени€ межнуклеотидных фосфотиатных групп в самом реагенте. Ёти данные свидетельствуют о высокой реакционной способности соединени€ (XXVIII) и возможности использовани€ этого соединени€ в качестве фосфотиатного олигонуклеотидного реагента, способного избирательно (не затрагива€ межнуклеотидные фосфотиатные группы в самом реагенте) реагировать с нуклеофилами.
Ёлектронные спектры поглощени€ (в воде): λmin 228, 245, 442 нм, λmax 237, 268, 395 и 549 нм; ε260 94,5 x 103, ε395 9,4 x 103, ε530 14,8 x 103 л моль-1 см-1.
ѕриведенные электронные спектры поглощени€ свидетельствуют о наличии в полученном соединении остатков интеркалирующего красител€ N-(2-оксиэтил)феназини€ [14] Ќаличие в электронных спектрах поглощени€ λmax 395 и 549 нм свидетельствует об окрашенности полученного соединени€ в видимой области светового спектра (продукт окрашен в интенсивный фиолетово-красный цвет) и показывает возможность использовани€ полученного соединени€ (XXVIII) в качестве фосфотиатного олигонуклеотидного соединени€, меченного интеркалирующим красителем.
ѕример 22. —интез 4-(N-метил-N-2-хлорэтиламино)бензилметил 5'-фосфамидного производного дезоксиоктануклеотид фосфотиата, содержащего дополнительно на 3'-конце цепи остаток N-(2-оксиэтил)феназини€.
ClRCH2(CH3)NpCpsApsTpsTpsGpsTpsGpsAp- NH(CH2)3NH-Phn (XXIX)
—интез и выделение ведут аналогично описанному в примере 6, исход€ из вышеполученного (см. пример 20а) 5'-фосфат, 3'-феназиниевого производного дезоксиоктануклеотид фосфотиата (XXVIIa).
¬ыход и характеристики целевого продукта приведены в таблице.
јктивность RCl-групп при реакции с этилендиамином [13] или тиосульфатом натри€ [14] составл€ет 87 и 90% соответственно, сохранность межнуклеотидных фосфотиатных групп при этом составл€ет 90 и 95% соответственно.
Ёти данные свидетельствуют о высокой реакционноспособности соединени€ (XXIX) и возможности использовани€ этого соединени€ в качестве фосфотиатного олигонуклеотидного реагента, способного избирательно (не затрагива€ межнуклеотидные фосфотиатные группы в самом реагенте) реагировать с нуклеофилами.
Ёлектронные спектры поглощени€ (в воде): λmin 228, 245, 442 нм, λmax 237, 268, 395 и 549 нм; ε260=99,5 x 103, ε395 9,4 x 103, ε530 14,8 x 103 л моль-1 см-1.
ѕриведенные электронные спектры поглощени€ свидетельствуют о наличии в полученном соединении остатков интеркалирующего красител€ N-(2-оксиэтил)феназини€ [14] Ќаличие в электронных спектрах поглощени€ λmax 395 и 549 нм свидетельствует об окрашенности полученного соединени€ в видимой области светового спектра (продукт окрашен в интенсивный фиолетово-красный цвет) и показывает возможность использовани€ полученного соединени€ (XXIX) в качестве фосфотиатного олигонуклеотидного реагента, меченного интеркалирующим красителем.
ѕример 23. —интез (3-амино)пропил-5'-фосфамидного производного дезоксиоктануклеотид фосфотиата, содержащего дополнительно на 3'-конце цепи остаток N-(2-оксиэтил)феназини€.
NH2(CH2)3NH-pCpsApsTpsTpsGpsTpsGpsAp- NH(CH2)3NH-Phn (XXX)
—интез и выделение ведут аналогично описанному в примере 7, исход€ из вышеполученного (см. пример 20а) 5%-фосфат, 3'-феназиниевого производного дезоксиоктануклеотид фосфотиата (XXVIIa).
¬ыход и характеристики целевого продукта приведены в таблице.
Ёлектронные спектры поглощени€ (в воде): λmin 228, 245, 442 нм, λmax 237, 268, 395 и 549 нм; ε260 89,5 x 103, ε395 9,4 x 103, ε530 14,8 x 103 л моль-1 см-1.
ѕриведенные электронные спектры поглощени€ свидетельствуют о наличии в полученном соединении остатков интеркалирующего красител€ N-(2-оксиэтил)феназини€ [14]
Ќаличие алифатических аминогрупп в полученном соединении подтверждали реакцией с N-(2-оксиэтил)феназинием [14] котора€ количественно завершаетс€ за 10 мин (см. ниже пример 24а) с образованием соединени€ (XXX), что показывает возможность использовани€ соединени€ (XXIX) фосфотиатного олигонуклеотидного реагента с аминолинкерной группой.
ѕример 24. —интез дезоксиоктануклеотид фосфотиатного производного, содержащего одновременно на 3'- и 5'-концах цепи два остатка N-(2-оксиэтил)феназини€.
Phn-NH(CH2)3NH-pCpsApsTpsTpsGpsTpsGpsAp- NH(CH2)3NH-Phn (XXXI)
a) синтез исход€ из соединени€ (XXX)
—интез и выделение ведут аналогично описанному в примере 8а, исход€ из вышеполученного (см. пример 23) соединени€ (XXX). ¬ыход и характеристики целевого продукта приведены в таблице.
Ёлектронные спектры поглощени€ (в воде): λmin 230, 242, 442 нм, λmax 235, 270, 395 и 549 нм; ε260 99,5 х 103, ε395 18,3 x 103, ε530 28,9 x 103 л моль-1-1.
ѕриведенные электронные спектры поглощени€ свидетельствуют о наличии в полученном соединении остатков интеркалирующего красител€ N-(2-оксиэтил)феназини€ [14] Ќаличие в электронных спектрах поглощени€ λmax 395 и 549 нм и ε395 18,3 x 103, ε530 28,9 x 103 л моль-1 см-1 свидетельствует об увеличении окрашенности полученного соединени€ в видимой области светового спектра по сравнению с исходным соединением (XX), содержащим один остаток феназини€, примерно в два раза и показывает возможность использовани€ полученного соединени€ (XXXI) в качестве фосфотиатного олигонуклеотидного реагента, меченого интеркалирующим красителем.
б) синтез исход€ из соединени€ (XXVIIa)
—интез и выделение ведут аналогично описанному в примере 8б, исход€ из соединени€ (XXVIIa).
ѕродукт гомогенен по данным ионообменной хроматографии и по своим характеристикам (см. таблицу) идентичен продукту, полученному выше по методу а) (см. пример 24а).
a) колонка 4,6 х 250 мм с ѕолисил-—ј, градиент концентрации KH2PO4 (0 __→ 0,3 ћ за 60 мин) в 20% CH3CN, скорость элюции 2 мл/мин.
б) колонка 4,6 х 250 мм с Lichrosorb RP-18, градиент концентрации CH3CN (0 __→ 80% за 80 мин) в 0,05 ћ LiClO4, скорость элюции 2 мл/мин.
* два диастереомера;
** смесь диастереомеров;
межнуклеотидные фосфотиоатные группы;
остаток бензиламина;
остаток алкилирующего амина;
остаток N-(2оксиэтил)феназини€;
остаток холестерола.
‘ормула изобретени€: 1. 3'-‘осфат, N,P-незащищенные фосфотиоатные олигодезокснуклеотиды общей формулы I

где ¬ остаток тимина, цитозина, аденина или гуанина;
n 1 20,
в качестве исходных соединений дл€ получени€ фосфотиоатных олигонуклеотидных реагентов дл€ биотехнологических процессов.
2. ‘осфотиоатные олигонуклеотидные производные, содержащие 3'- и/или 5'-св€занные химические группировки, общей формулы II

где R1 соединение формулы

¬ остаток тимина, цитозина, аденина или гуанина;
n 1 20;
X -H при (3'-реагенты),
при Y -H(5'-реагенты),
(3-, 5'-реагенты);
R'' остаток аминопиридина, например 4-диметиламинопиридина (ƒћј–)

или остаток азола, например N-метилимидазола (MeIm)

или остаток алкилирующего амина, например 4-(N-метил-N-2-хлорэтиламино)бензилметиламина [HN(CH3)CH2RCl]

или остаток алифатического амина, например 1,3-пропилендиамина [NH2(CH2)3NH2]
-NH(CH2)3NH2,
или аминолинкерна€ группа с остатком интеркалирующего красител€, например N-(2-оксиэтил)феназини€ [-NH(CH)3HN-Phn]

R''' аминолинкерна€ группа с остатком интеркалирующего красител€, например N-(2-оксиэтил)феназини€ [-NH(CH2)3)HN-Phn]
в качестве фосфотиоатных олигонуклеотидных реагентов дл€ биотехнологических процессов.
3. —пособ получени€ фосфотиоатных олигонуклеотидных производных общей формулы II, заключающийс€ во взаимодействии 3'- или 5'-фосфат, N,P-незащищенных фосфотиоатных олигодезоксинуклеотидов с соответствующими азолами, или аминопиридинами, или производными алифатических аминов, содержащих остатки алкилирующих или интеркалирующих групп, в присутствии конденсирующей пары трифенилфосфин дипиридилдисульфид и N-метилимидазола в качестве катализатора.