√лавна€ страница  |  ќписание сайта  |   онтакты
ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒ, ќЅЋјƒјёў»… ”–ј“ќ —»ƒј«Ќќ… ј “»¬Ќќ—“№ё, ‘–ј√ћ≈Ќ“ ƒЌ , ќЅ≈—ѕ≈„»¬јёў»… Ё —ѕ–≈——»ё ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒј — ”–ј“ќ —»ƒј«Ќќ… ј “»¬Ќќ—“№ё (¬ј–»јЌ“џ), ¬≈ “ќ– Ё —ѕ–≈——»», —ќƒ≈–∆јў»… ‘–ј√ћ≈Ќ“ ƒЌ , ќЅ≈—ѕ≈„»¬јёў»… Ё —ѕ–≈——»ё ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒј — ”–ј“ќ —»ƒј«Ќќ… ј “»¬Ќќ—“№ё (¬ј–»јЌ“џ), Ў“јћћ, Ё —ѕ–≈——»–”ёў»… ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒ, ќЅЋјƒјёў»… ”–ј“ќ —»ƒј«Ќќ… ј “»¬Ќќ—“№ё (¬ј–»јЌ“џ), —ѕќ—ќЅ ѕќЋ”„≈Ќ»я ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒј, ќЅЋјƒјёў≈√ќ ”–ј“ќ —»ƒј«Ќќ… ј “»¬Ќќ—“№ё
ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒ, ќЅЋјƒјёў»… ”–ј“ќ —»ƒј«Ќќ… ј “»¬Ќќ—“№ё, ‘–ј√ћ≈Ќ“ ƒЌ , ќЅ≈—ѕ≈„»¬јёў»… Ё —ѕ–≈——»ё ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒј — ”–ј“ќ —»ƒј«Ќќ… ј “»¬Ќќ—“№ё (¬ј–»јЌ“џ), ¬≈ “ќ– Ё —ѕ–≈——»», —ќƒ≈–∆јў»… ‘–ј√ћ≈Ќ“ ƒЌ , ќЅ≈—ѕ≈„»¬јёў»… Ё —ѕ–≈——»ё ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒј — ”–ј“ќ —»ƒј«Ќќ… ј “»¬Ќќ—“№ё (¬ј–»јЌ“џ), Ў“јћћ, Ё —ѕ–≈——»–”ёў»… ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒ, ќЅЋјƒјёў»… ”–ј“ќ —»ƒј«Ќќ… ј “»¬Ќќ—“№ё (¬ј–»јЌ“џ), —ѕќ—ќЅ ѕќЋ”„≈Ќ»я ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒј, ќЅЋјƒјёў≈√ќ ”–ј“ќ —»ƒј«Ќќ… ј “»¬Ќќ—“№ё

ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒ, ќЅЋјƒјёў»… ”–ј“ќ —»ƒј«Ќќ… ј “»¬Ќќ—“№ё, ‘–ј√ћ≈Ќ“ ƒЌ , ќЅ≈—ѕ≈„»¬јёў»… Ё —ѕ–≈——»ё ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒј — ”–ј“ќ —»ƒј«Ќќ… ј “»¬Ќќ—“№ё (¬ј–»јЌ“џ), ¬≈ “ќ– Ё —ѕ–≈——»», —ќƒ≈–∆јў»… ‘–ј√ћ≈Ќ“ ƒЌ , ќЅ≈—ѕ≈„»¬јёў»… Ё —ѕ–≈——»ё ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒј — ”–ј“ќ —»ƒј«Ќќ… ј “»¬Ќќ—“№ё (¬ј–»јЌ“џ), Ў“јћћ, Ё —ѕ–≈——»–”ёў»… ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒ, ќЅЋјƒјёў»… ”–ј“ќ —»ƒј«Ќќ… ј “»¬Ќќ—“№ё (¬ј–»јЌ“џ), —ѕќ—ќЅ ѕќЋ”„≈Ќ»я ѕќЋ»ѕ≈ѕ“»ƒј, ќЅЋјƒјёў≈√ќ ”–ј“ќ —»ƒј«Ќќ… ј “»¬Ќќ—“№ё

ѕатент –оссийской ‘едерации
—уть изобретени€: »спользование: биотехнологи€, генна€ инженери€. —ущность изобретени€: новый полипептид с уратоксидазной активностью получен в результете культивировани€ штаммов, трансформированных ƒЌ , содержащими фрагмент ƒЌ  уратоксидазы с выведенной аминокислотной последовательностью, которой необ€зательно предшествует метионин, со специфической уратоксидазной активностью не менее 16 ед/мг, с молекул€рной массой 33,5 кд и изоэлектрической точкой, близкой к 8,0. ¬ способе получени€ полипептида используютс€ штамм бактерий Escherichia coli   12 RR 1/р 466 или штаммы дрожжей Saccharomyces cepevisiae CNCM 1 - 920 или CNCM 1 - 919, или штамм культивируемых животных клеток Cos/pSV 860. 12 с. и 4 з.п. ф-лы, 14 табл., 16 ил.
ѕоиск по сайту

1. — помощью поисковых систем

   — помощью Google:    

2. Ёкспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. ѕо номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Ќомер патента: 2105812
 ласс(ы) патента: C12N15/00, C12N15/53, C12N9/06, C12N1/19, C12N1/21, C12N5/16, C12N1/19, C12R1:865, C12N1/21, C12R1:19
Ќомер за€вки: 4895030/13
ƒата подачи за€вки: 12.03.1991
ƒата публикации: 27.02.1998
«а€витель(и): —анофи (FR)
јвтор(ы): ƒаниель  апю[FR]; ѕаскуаль ‘еррара[AR]; ∆ан- лод √иллемо[FR]; ћурад  агад[FR]; –ишар Ћегу[FR]; ∆ерар Ћуазон[FR]; Ёлизабет Ћарбр[FR]; …оханнес Ћупкер[NL]; ѕаскаль Ћеплатуа[FR]; ћарк —алом[FR]; ѕатрик Ћоран[FR]
ѕатентообладатель(и): —анофи (FR)
ќписание изобретени€: »зобретение касаетс€ нового белка с уратоксидазной активностью, средств генной инженерии, используемых дл€ производства этого белка, и, в частности, кодирующей его последовательности ƒЌ , вектора экспрессии этой последовательности, микроорганизмов и эукариотических клеток, трансформированных этим вектором.
”ратоксидаза (EC 1.7.3.3.), называема€ также уриказой, €вл€етс€ ферментом, участвующим в распаде пуринов. Ётот фермент отсутствует у приматов, в частности, у человека, птиц, некоторых рептилий, большей части насекомых, у некоторых пород собак.
” человека пуриновые основани€ (аденин и гуанин) превращаютс€ в ксантин.  сантин окисл€етс€ ксантиноксидазой до мочевой кислоты, согласно реакции:
кстантин + H2O2 _→ мочева€ кислота + O-2
ѕод действием супероксиддисмутазы радикал O-2 превращаетс€ в перекись водорода.
явл€€сь метаболитом крови, мочева€ кислота присутствует там обычно в виде растворимой мононатриевой соли. ќднако, у некоторых людей мочева€ кислота осаждаетс€ и образует камни. √иперурикеми€ (увеличение содержани€ мочевой кислоты в крови) обусловливает отложение мочевой кислоты в хр€щевой ткани и вызывает подагру. √иперурикеми€ также может вли€ть на функционирование почки: избыток мочевой кислоты в почках может к образованию камней, и к повреждению органа
ѕовышенное образование мочевой кислоты может иметь различные причины: врожденные дефекты обмена, синдром Ћеще-Ќайхана, избыточное потребление пуринов и белков, лечение заболеваний крови, в частности онкологических, с помощью цитолитиков (химиотерапи€) или рентгенотерапи€ (Gutman, A.Bet. yu T. Fu. (1968) Am. J. Med. 45-759-779).
”ратоксидаза фермент, катализирующий распад мочевой кислоты до аллантоина (соединение, в большей степени растворимое по сравнению с мочевой кислотой, не кристаллизующеес€ в биологических жидкост€х), представл€ет таким образом терапевтический интерес. »спользуема€ в виде инъекции она имеет преимущества в лечении гиперурикемии и нефролитиеза и прежде всего высокую скорость гипоурикемического эффекта (снижение гиперурикемии примерно на 50% за 24 ч), большую по сравнению с другими препаратами, такими, как аллопуринол (ингибитор ксантиноксидазы). ¬ насто€щее врем€ этот фермент главным образом используетс€ в качестве помощника цитолитиков в химиотерапии.
”ратоксидаза, используема€ в насто€щее врем€ в качестве лекарства, получена по методике, включающей культивирование гриба Aspergillus flavus, выделение уратоксидазы из культуры экстракцией и многочисленные этапы частичной очистки этого белка(SU, патент 421162, 1967; SU, патент 457723, 1973 и др.). Ётот метод, позвол€ющий получать уратоксидазу со специфической уратоксидазной активностью около 8 ед/мг, лишенную токсичных примесей, ограничиваетс€ р€дом трудностей. ‘изиологи€ и особенно генетика A. flavus часто не имеют устойчивого воспроизведени€ (Woloshuk et al. (1989) Applied. environ. microbiol. Vol. 55, р. 86-90). —ледовательно, отсутствует возможность получени€ посто€нных источников, которые производили бы данный энзим в больших количествах. — другой стороны, A. flavus продуцирует афлатоксины, которые порой трудно отделить. “аким образом, необходим контроль за тем, чтобы очищенный продукт был свободен от токсинов.
“аким образом, существует потребность в источнике более чистой уратоксидазы, обеспечивающем получение фермента в больших количествах.
«а€витель очистил уратоксидазу, выделенную из A. fiavus, называемую ниже экстрактивной, до значительно превосход€щей известную дл€ данного белка степень чистоты, определил частичную последовательность, создал два пула меченых зондов, способных гибридизироватьс€ двум€ участками этого белка, и получил кодирующую фермент последовательность DHK. «атем он создал вектор экспрессии, включающий в себ€ эту кƒЌ  и с его помощью трансформировал штамм. E. coli K12 и убедилс€ в том, что лизат клеток содержал рекомбинантный белок ожидаемой молекул€рной массы, обладающий уратоксидазной активностью (способностью превращать мочевую кислоту в аллантоин).
«а€витель создал также множество векторов экспрессии дл€ эукариотических клеток, содержащих кодирующие уретоксидазу фрагменты кƒЌ  с некоторые вариаци€ми последовательности.
»зобретение также касаетс€ лекарства, которое содержит описанный выше белок в фармакологически приемлемой форме. —огласно показани€м, оно может с успехом заменить экстрактивную уратоксидазу со специфической уратоксидазной активностью около 8 U/mg, имеющуюс€ в продаже под названием ”рикозим (Vidal, 1990).
»зобретение касаетс€ также фрагмента ƒЌ , характеризующегос€ тем, что имеет последовательность нуклеотидов, кодирующую синтез белка с последовательностью аминокислот
ѕоследовательности 1-19 см. в конце описани€.
ѕо причине вырожденности генетического кода существует большое количество видов кодирующей ƒЌ  дл€ белка, аминокислотна€ последовательность которого отвечает формуле, приведенной выше. —реди них наиболее предпочтительна последовательность 3, в частности, приспособленна€ дл€ экспрессии в прокариотах.
ѕоследовательность DHK-4 предназначена дл€ экспрессии в аукариотических клетках, например дрожжевых.
ƒл€ экспрессии в животных клетках предпочтительна ƒЌ -последовательность 5.
≈й предшествует нетранслируема€ 5'-последовательность, способствующа€ экспрессии в животных клетках. Ёта 5'-последовательность представлена олигонуклеотидом AGCTTGCCGCCACT. — помощью этих векторов были трансформированы эукариотические клетки, причем трансформанты были выращены как в малом, так и в большом объемах. «а€витель установил, что лизаты клеток содержали значительное количество рекомбинантного белка ожидаемой молекул€рной массы и обладали уратоксидазной активностью.
«а€витель очистил этот рекомбинантный белок и последовательно сравнил его с уратоксидазой.
“аким образом, изобретение касаетс€ нового белка, который характеризуетс€ тем, что про€вл€етс€ специфическую уратоксидазную активность, равную по меньшей мере 16 ед./мг, и имеет последовательность аминокислот 1, в известных случа€х предвар€емую метионином или содержащую аминокислотные замещени€ без изменени€ активности.
—пецифическа€ уратоксидазна€ активность этого белка преимущественно равна 30 ед./мг.
јнализом на двумерном геле показано, что рассматриваемый белок образует п€тно с молекул€рной массой примерно 33,5 кƒа и изоэлектрической точной, близкой к 8,0.
”ровень очистки данного белка, определенный с помощью жидкостной хроматографии на колонке с привитым кремнием CB, превышает 80%
—ледует отметить, что белок, закодированный описанной выше последовательностью кƒЌ , может подвергнутьс€ воздействию метиониламинопептидазы, котора€ отщепл€ет от него метиониновый аминоконцевой радикал.
»зобретение касаетс€ также вектора экспрессии, который вкупе с элементами, необходимыми дл€ экспрессии, несет ƒЌ -фрагмент, описанный ранее.
ƒл€ экспрессии в прокариотических клетках, в частности в E.coli, кодирующа€ последовательность должна быть включена в вектор экспрессии, состо€щий, в частности, из промотора, следующего за ним сайта св€зывани€ рибосом, наход€щегос€ перед структурным геном, и сайта терминации транскрипции, расположенного после него. ¬ектор должен также включать в себ€ "ориджин" репликации и селективный маркер. ¬се элементы должны подбиратьс€ в зависимости от вида клетки-хоз€ина.
ƒл€ экспрессии в эукариотической клетке вектор экспрессии, согласно изобретению, несет кодирующую последовательность, описанную выше, вкупе с участками, необходимыми дл€ его экспрессии и репликации в эукариотических клетках, а также дл€ селекции трансформированных клеток. ѕредпочтительно, чтобы вектор нес селективный маркер, подобранный так, чтобы, например, дополн€ть мутацию эукариотических клеток-реципиентов и обеспечивать отбор клеток с интегрированной последовательностью.
ƒл€ экспрессии в животных клетках, например, в клетках €ичника китайского хом€ка (CHO), кодирующа€ последовательность ƒЌ  включаетс€ в плазмиду (например, производную pBR 322), имеющую составл€ющие, необходимые дл€ экспрессии. ѕоследовательность вокруг ATG сайта инициации выбираетс€ согласно описанию Kozak (M. Kozak (1978), Cell. 15, 1109-1123) и располагаетс€ перед структурным геном, в то врем€, как последовательность, включающа€ сайт полиаденилировани€, (например, последовательность полиаденилировани€ SV40)- в конце встраиваемого гена. ≈ще одна составл€юща€ включает в себ€ маркер селекци€, например ген, колирующий дегидрофолатредуктазу ( DHFR). ѕлазмида включаетс€ в животные клетки CHO DHFR-, не способные синтезировать DHFR. ѕотомство отбираетс€ по его резистентности к метотрексату.
ƒл€ экспрессии в эукариотических клетках, таких, как дрожжи, например, Saccharomyces cerevisiae, следует разместить кодирующую последовательность между действующим в дрожжах промотором, с одной стороны, и терминатором транскрипции с другой —овокупность промотор=кодирующа€ последовательность-терминатор, называема€ "кассетой экспрессии", клонируетс€ либо в плазмидном монокопийном или поликопийном векторе дл€ дрожжей, либо интегрируетс€ в геном дрожжей.
»зобретение касаетс€ также штаммов культивируемых эукариотических клеток, трансформированных описанным выше вектором экспрессии. —реди них выдел€ют штаммы вида Saccharomyces cerevisiae в частности те, что содержат мутацию в одном из генов, отвечающих за синтез лейцина или урацила, например, ген Leu 2 или ген Leu 3.
»зобретение касаетс€ также линий культивируемых животных клеток, содержащих чужеродный ген вместе с регул€торными област€ми, нужными дл€ экспрессии. ¬ведение в клетку может осуществл€тьс€ через трансфекцию выше упом€нутым вектором, инфекцией несущего его вируса или микроинъекцией.
»зобретение также рассматривает процесс получени€ рекомбинантной уратоксидазы, включающей следующие этапы:
культивирование описанного выше штамма;
лизис клеток;
выделение и очистку рекомбинантной уратоксидазы, содержащейс€ в лизате.
»зобретение легче пон€ть при помощи следующих примеров: больша€ часть изложенных ниже технологий хорошо известна специалистам и детально изложена в работе Maniatis et. al. "Molecular cloning: a Laboratory manual", опубликованной издательством Cold Spring Harbor Press a New York.
ѕример 1. ¬ыделение м–Ќ  из Aspergillus flavus.
Ўтамм ј. flavus, продуцирующий уратоксидазу, был культивирован в услови€х производства уратоксидазы, т.е. в среде, содержащей мочевую кислоту и имеющей следующий состав: глюкоза 15 г/л, MgSO4, 7H2O 1 KH2PO4 0,75, CaCO3 1,2, мочева€ кислота 1,2, KOH 0,5 г/л, соевое масло 0,66 мл/л, FeSO4 7H2O 10 мг/л, CuSO4, 5H2O 1, ZnSO4, 7 H2O 3, MnSO4, H2O 1 мг/л.
pH среды был установлен равным 7,0 с помощью 1 ћ раствора H2SO4; далее проводили стерилизацию при 120oC в течение 80 мин. ¬ колбу Ёрленмейера (5 л) высевали 1,5 л серы с количеством спор, равным примерно 1-(3·10)7).  ультуру инкубировали примерно 40 ч при 30oC и посто€нном перемешивании (120 об/мин). ћицелий выдел€етс€ фильтрацией, промываетс€ водой и замораживаетс€ жидким азотом. 15 мг мицели€ (влажный вес) размораживаетс€ и вновь суспендируетс€ в 45 мл лизирующего буферного раствора, затем повышаетс€ в такой же объем шариков (0,45 μm в диаметре). Ћизирующий буфер состоит из тиоцианата гуанидина. 4M, “рис HCl 10 мћ pH 7,6, Ёƒ“ј 10 мћ, β -меркаптоэтанола 50 мл/л. —успензи€ мицели€ измельчаетс€ в виброгенном измельчителе Zeumiihle в течение 5 мин.
»змельченный мицелий вынимаетс€, а шарики отстаиваютс€. Ќадосадочна€ жидкость извлекаетс€ (примерно 45 мл) и погружаетс€ в 3ћ конечный раствор хлорида лити€. ’ранитс€ при 0oC. „ерез два дн€ провод€т центрифугирование в течение 60 мин при 10000 об/мин. Ќадосадочна€ жидкость удал€етс€, а осадок помещаетс€ в 40 мл LiCl (3ћ) и вновь центрифугируетс€ в течение 1,5 ч при 10000 об/мин). ѕрибавл€етс€ протеинкиназа K (SIGMA), 40 мг/мл додецилсульфата натри€ и Ёƒ“ј до 20 мћ. »нкубируют при 37oC в течение 3 ч. ќсаждение провод€т двум€ объемами этанола, затем осуществл€ют промывание 70%ным этанолом, перерастворение в 0,5 мл буфере TE(трис-HCl 10 мћ Ёƒ“ј, 1 мћ pH 7,5), экстрагирование 2 раза в хлороформе, осаждают этанолом. –Ќ  консервируютс€ при -80oC в спирте.
ѕример 2. ќчистка фракции поли=A+ –Ќ .
ѕримерно 1 мг –Ќ  осаждаетс€ в течение 20 мин, при 4oC (15000 об/мин), затем промываетс€ 70%ным этанолом и высушиваетс€.
ќстаток раствор€ют в 1 мл буфере TE-буфере и вновь суспендируют перемешиванием. ќлиго=д“=целлюлоза типа 3 (выпускаема€ Collaborative Research Inc. Biomedicals Product Division) готовитс€ согласно рекомендаци€м изготовител€. –Ќ  помещаетс€ на подготовленную олиго=д“, легко встр€хиваетс€ и нагреваетс€ при 65oC в течение 1 мин.
—успензи€ прибавл€етс€ к 0,5 ћ NaCl и осторожно перемешиваетс€ в течение 10 мин. «атем суспензи€ центрифугируетс€ 1 мин при 1000 об/мин, надосадочна€ жидкость сливаетс€, а осадок 2 раза промываетс€ 1 мл буфера TE, содержащего 0,5 ћ NaCl. Ќадосадочна€ жидкость сливаетс€. Ёлюирование полиаденилированной –Ќ  достигаетс€ суспендированием осадка вместе с шариками целлюлозы в 1 мл буфера TE, нагреванием этой суспензии до 60oC в течение 1 мин и перемешиванием в течение 10 мин. ѕоследующее центрифугирование (1 мин при 1000 об/мин) позвол€ет, с одной стороны, собрать надосадочную жидкость, содержащую свободную растворенную м-–Ќ , и осадок с целлюлозы с другой стороны. ¬есь комплекс этих операций, начина€ с элюировани€, повтор€етс€. ѕолученные таким образом надосадочные жидкости собираютс€, избыток целлюлозы удал€етс€ центрифугированием, а надосадочна€ жидкость осаждаетс€ этанолом, содержащим NaCl, по обычной технологии (Maniatis op. prec.).
ѕример 3. —оздание банка кƒЌ .
»сход€ из м-–Ќ , выделенных по методу, описанному в предыдущем примере, создаетс€ банк кƒЌ  в векторе pTZ 19R (выпускаемом PHARMACIA). Ётот вектор €вл€етс€ плазмидой, содержащей полилинкер, имеющий уникальный сайт рестрикции.
»спользованна€ техника клонировани€ описана в работе Caput et. al. Proc. Natl. Acad/ Sci. (USA) (1986) 83, 1670-1674). ќна состоит из переваривани€ вектора с помощью PstI, достраивани€ цепочки поли oC к выступающему 3'-концу и последующей рестрикции с помощью BAmHI. ‘рагмент векторной плазмиды очищаетс€ на колонке с сефарозой CL4B (PHARMACIA). ќн включает цепочку поли- dC на одном конце, а другой конец €вл€етс€ "липким" типа Bam HI. — другой стороны, m–Ќ  подвергаетс€ обратной транскрипции, начина€ с праймер=участка, последовательность которого 5' <GATCCGGGCCCT (12) <3. “аким образом, кƒЌ  оказываютс€ представленными на своем 5' конце последовательностью GATCC, комплементарной липкому концу BamHI.
√ибриды ƒЌ =–Ќ , полученные в результате действи€ обратной транскриптазы, подвергаютс€ щелочному гидролизу, позвол€ющему освободитьс€ от –Ќ . ќднонитевые кƒЌ  очищаютс€ на колонке с сефарозой CL4B и подвергаютс€ воздействию концевой трансферазы с целью прибавлени€ поли=dG 3' конца, кƒЌ  ввод€тс€ в виде простой нити в вектор, подготовленный способом, описанным выше. —ледующий олигонуклеотид (адаптор), комплементарный праймеру, необходим дл€ генерации сайта Bam HI, "открытого" на 5' конце кƒЌ . ѕосле гибридизации вектора кƒЌ  и адаптора рекомбинантные молекулы сшиваютс€ под действием лигазы фага T4. ѕолученный таким способом пул плазмид служит дл€ трансформации штамма MC 1061 и отбора по резистивности к ампициллину (Casabadom Chou et Cohen, J. Bact. (1980) 143 р. 971 980).
ѕример 4.
ќчистка экстрактивной уратоксидазы A. flavus и ее характеристика.
ѕолучение экстрактивной уратоксидазы из A. flavus (uricozyme Zaboratcries Clin. midy), обладающей специфической уратоксидазной активностью 8 ед./мл (специфическа€ уратоксидазна€ активность это отношение активности уратоксидазы, измеренной по тесту, описанному в примере 9, к массе общего белка, измеренной по методу Bradford: Anal. Biochem. 72, 248-254), включала очистку хроматографией на колонке привитой агарозы Redagarose 120 (SIGMA), концентрирование ультрафильтрацией и фильтрацию на полиакриламидагарозном геле Ultrogel ACA 44 (IBF) по следующему протоколу.
Ётап 1: афинна€ хроматографи€ на привитой агарозе
“емпература: 4oC
 олонка: PHARMACIA к 50/30;
диаметр 50 мм;
длина 33 см
—мола: Red 120 агароза (3000 CI/R 0503 SIGMA);
объем гел€ 410 мл, высота гел€ 20 см.
”равновешивающий буфер: глицин/NaOH 20 мћ, pH 8,3.
Ёлюирующий буфер: глицин/ NaOH 20 мћ, NaCI 2ћ, pH 8,3.
–асход кондиционировани€: 250 мл/ч
‘ункциональный расход: 160 мл/ч
Ёлюционный расход: 60 мл/ч
¬ верхнюю часть колонки внос€т раствор урикозима с помощью насоса с посто€нным расходом. ѕосле адсорбции колонку промывают двум€ объемами буфера уравновешивани€. Ёлюируют градиентом следующего состава: глицин, NaOH, 20 мћ, pH 8,3 /глицин, NaOH, 20 мћ + NaCI 2ћ, pH 8,3. ќбщий объем градиента равен 10 объемам колонки. –егистраци€ хроматографировани€ велась при 280 нм; пул уратоксидазы собиралс€ после отбора фракций, обладающих активностью, большей или равной 16 ед./мг.
Ётап 2: концентрирование пула уратоксидазы ультрафильтрацией при помощи системы Ѕиопасс, состо€щей из мембраны дл€ ультрафильтрации 10 кƒа.
Ётап 3:
“емпература: 4oC
 олонка PHARMACIA к50/100,
диаметр 50 мм,
длина 100 см.
—мола: полиакриламид агароза с амино- и гидроксильными группами - ”льтрагель ACA 44 (IBF), объем гел€ 1,6 л, высота гел€ 80 см.
”равновешивающий буфер: глицин/BaOH 20 мћ, pH 8,3.
–асход кондиционировани€: 40 мл/ч
‘ункциональный расход: 24 мл/ч
— помощью насоса с посто€нным расходом на колонку нанос€т пул концентрированной уратоксидазы. ѕосле нанесени€ образца продолжают пропускать через колонку буфер следующего состава: глицин ЌaOH 20 мћ, pH 8,3. ѕосле хроматографии промывают 2ћ ЌaCI до уровн€ поглощени€ при 280 нм < 0,05. ’ран€т в NaCl 2ћ при 4oC. –егистраци€ процесса хроматографировани€ производитс€ при длине волны 280 нм.
ѕул уратоксидазы собираетс€ после объединени€ фракций, обладающих следующими общими свойствами: специфическа€ уратоксидазна€ активность больше или равна 20 ед./мг. “олько две полосы электрофореза при денатурирующих услови€х и про€влени€ нитратом серебра: интенсивна€ полоса 33 34 кƒа; слаба€ полоса 70 71 кƒа.
2. ’арактеристика очищенной экстрактивной уратоксидазы A. flavus.
„астичное секвенирование.
ƒл€ того чтобы получить информацию о последовательности аминокислот в очищенной экстрактивной уратоксидазе, позвол€ющую синтезировать зонды, необходимые дл€ клонировани€ кƒЌ , была предприн€та попытка пр€мого аминоконцевого секвенировани€ белка. ќна не удалась по причине блокировани€ N-концевой аминогруппы (см. ниже).
“огда было осуществлено частичное секвенирование уратоксидазы: расщепление белка протеолитическими ферментами (трипсин и протеаза V8 золотистого стафилококка): разделение полученных пептидов жидкостной хроматографии при высоком давлении (∆’¬ƒ) с обратной фазой; определение последовательности очищенных пептидов.
√идролиз уратоксидазы трипсином, последующие очистка и секвенирование проводились следующим образом. ”ратоксидаза (9 мг/мл в карбонатно-аммонийном буфере 10 мћ, pH 8,9) была переварена трипсином (Worthington. “–— ) в весовом соотношении уратоксидаза/трипсин 30:1 при 30oC в течение 24 ч. ѕосле гидролиза трипсином 60 г переваренной уратоксидазы было непосредственно нанесено на колонку ∆’¬ƒ с обратной фазой с привитым кремнием Ѕраунли Gl8 (колонка 10 х 0,2 см), уравновешенную смесью 1%-ный ацетонитрил (об/об) и 0,1% -на€ трифторуксусна€ кислота (об/об) в воде. «атем пептиды были элюированы линейным градиентом ацетонитрила в 0,1%-ном растворе трифторуксусной кислоты (об/об) в воде, с увеличением концентрации ацетонитрила от 1 до 60% за 60 мин и расходом 150 mл мин. Ќа выходе из колонки пептиды раздел€лись по измерению оптической плотности при 218 нм.
 рива€ элюировани€ представлена на фиг. 1, где номера, следующие за буквой "“" (трипсин) соответствует установленным пикам.
 аждый пик был собран и сохран€лс€ при -20oC до начала анализа на секвенаторе белков (модель Applied Biosystems), снабженным хроматографом (модель 430 Applied Biosystems), который посто€нно анализирует фенилтиогидантоиновые производные, образующиес€ после каждого цикла расщеплени€.
¬ табл. 1 показаны пептидные последовательности дев€ти вы€вленных пиков.
√идролиз уратоксидазы протеазой V8, последующую очистку и секвенирование пептидов осуществл€ли следующим образом. ”ратоксидаза (в концентрации 2 мг/мл в ацетат-аммонийном буфере 100 мћ, pH 6,8) была переварена протеазой V8 S. aureux (Ѕоерингер-ћангейм) в соотношении оксидаза/протеаза V8 60:1 при 30oC в течение 72 ч 160 μг переваренной оксидазы было затем нанесено на колонку с обратной фазой с привитым кремнием Ѕраунли G18 (колонка 10 х 0,2 см), уравновешенную смесью 1%-ного ацетонитрила и 0,1%-ной трифторуксусной кислоты в воде. ѕептиды были затем элюированы линейным градиентом ацетонитрала в растворе трифторуксусной кислоты в воде (0,1% (об/об)) с изменением концентрации ацетонитрила от 1 до 60% за 60 мин, при расходе 150 μл/мл.. Ќа выходе из колонки пептиды обнаруживались путем измерени€ оптической плотности при 218 нм.
 рива€ элюировани€ представлена на фиг. 2. ÷ифры, следующие за буквой "V" (протеаза V8), соответствуют обнаруженным пикам.
 аждый пик был собран и хранилс€ при -20oC до начала анализа на упом€нутом выше секвенаторе белков.
¬ табл. 1 представлены также последовательности пептидов из п€ти обнаруженных пиков.
—пецифическа€ активность.
ќчищенна€ экстрактивна€ уратоксидаза обладает специфической активностью пор€дка 30 ед./мг.
Ёлектрофорез в денатурирующих услови€х.
Ёлектрофорез очищенной экстрактивной уратоксидазы на полиакриламидном геле в присутствии SDS с последующим про€влением серебром позволил увидеть весьма интенсивную полосу примерно 33 34 кƒа, а также полосу очень слабой интенсивности 70 71 кƒа.
ќпределение изоэлектрической точки.
ѕоследовательность операций: использование гелей, готовых к употреблению, LKB Ampholines Gel Plates dt Pharmacia со значени€ми pH (3,5 9,5) и (5 8); нанесение 10 μл контрольных белков LKB (спектр изоэлектрических точек контрольных белков от 3,5 до 9,5) и очищенной уратоксидазы в количестве 4 μг и 8 μг цикл 1,5 ч, 6oC; окраска голубым куммасси (0,1%) в 25%-ном этаноле и 8% -ной уксусной кислоте с последующим обеспечиванием раствором, содержащем 25% этанола и 8% уксусной кислоты; оценка результатов: на каждой из двух сопоставленных полос наблюдаютс€ изоэлектрические точки 8,1 и 7,9.
јнализ на двумерном геле.
јнализ на двумерном геле позвол€ет разделить белки вначале по их изоэлектрическим точкам, а затем по молекул€рным массам.
ѕротокол.
ќбразец: раствор очищенной экстрактивной уратоксидазы в глициновом буфере, 20 мћ, pH 8,3.
ѕодготовка образца: два образца (5 и 10 μг уратоксидазы; высушивание центрифугированием в вакууме, помещение в 5 μл лизирующего буфера следующего состава: мочевина 2,5 ћ; (3-(3-холамидопропил)диметиламмоний)-1-пропансульфонат ’јѕ— (Sigma) (2% (об./об), амфотерные амфолины (LKB) с интервалом pH 5-8 и 3,5-9,5 (4,4%) и β -маркаптоэтанол 5%
»зоэлектрофокусирование.
ѕриготовление раствора, содержащего 9,5 ћ мочевину, 5% CHAPS, амфолины LKB (pH (3,5 9,5) 1% pH (5 8) 1%), 3,5% акриламид/бис-акриламид (28,4/1,7%) и H2O. –аствор фильтруют и дегазируют, затем добавл€ют 0,075% тетраметилэтилендиамин (PHARMAKIA) и 0,015% персульфат аммони€. –аствор выливают в трубки (16 х 0,12 см) и провод€т полимеризацию в течение ночи при 20oC.
 атодный раствор: NaOH 0,1ћ дегазированный, анодный раствор: H3PO4 25мћ. ѕредцикл 45 мин, 4 мј (вольтаж 300 B _→ 1 000B); скопление образцов на уровне катода; цикл 19 ч при 1000 B и при 20oC. √ели вынимаютс€ и уравновешиваютс€ 10 мин при 20oC в буфере (трис 0,375 ћ, pH 8,8 SDS 3% дитиотрейтол 50 мћ).
ƒенатурирующий гель PAGE/SDS.
ѕриготовление раствора, содержащего акриламид/бисакриламид (30/0,8%) с конечной концентрацией 15% трис-HCl (pH 8,8), 0,375 ћ, H2O. –аствор фильтруетс€ и дегазируетс€, а затем к нему добавл€етс€ SDS (0,1%), персульфатаммони€ 0,05% и “≈ћ≈ƒ 0,05%) ѕолимеризаци€ в течение ночи при 4oC (гель 16 х 20 х 0,015 см). √ель изоэлектрофокусировани€ после уравновешивани€ на поверхность гел€ PAGE/SDS. Ёлектрофорезный буфер: трис-HCl 25 мћ, pH 8,3, глицин 0,192ћ, SDS O, 1%); ÷икл 100 мј 6 ч, при 6oC. √ель фиксируетс€ в 50%-ном метаноле, 10% -ной уксусной кислоте, затем окрашиваютс€ нитратом серебра (методика Blum H. Electrophoresis 1987, 8, –. 93-99). √ель сканируетс€ на видеоанализаторе 2000/Kodak дл€ определени€ оптической плотности и поверхности каждого п€тна, а следовательно, дл€ подсчета количественного соотношени€ между п€тнами. ћол€рна€ масса белка определ€етс€ при использовании двумерного гел€ в присутствии контрольных белков.
–езультаты следующие: наблюдаетс€ два п€тна с молекул€рной массой, близкой к 33,5 кƒа. Ѕольша€ часть изоэлектрических точек близка к 8,0 интенсивностью 5,2, меньша€ часть близка к 7,4 с интенсивностью 0,41.
ќпределение аминоконцевой последовательности и массы блокирующей аминоконцевой группы проводилось следующим образом.
јминоконцева€ последовательность анализировалась при помощи секвенатора (Applied Biosystem модель 470 ј), снабженного анализатором фенилтиогидантоиновых остатков (Applied Biosystem модель 120ј). ќчищенна€ уратоксидаза (200 рмоль) была помещена в секвенатор в присутствии 20 рмоль β лактоглобулина (контрольного белка). Ќе было обнаружено никакой аминоконцевой последовательности, уратоксидазы (аминоконцева€ последовательность белка-контрол€ при этом была обнаружена). —ледовательно, аминоконец уратоксидазы A. FLAVUS заблокирован.
ќпределение структуры аминоконцевого пептида из 32-х аминокислот и массы блокирующей N-концевой группы.
–асщепление цианогенбромидом.
ќчищенна€ экстрактивна€ уратоксидаза с фильтрационного гел€ переносилась на гель, полученный сшивкой декстрана эпихлоргидрином, —ефадекс G25 (pD 10 - PHARMACIA), уравновешенный раствором, содержащим 7% муравьиную кислоту. ÷ентрифугированием в вакууме концентраци€ муравьиной кислоты повышаетс€ до 70% затем прибавл€ют бромистый цианоген до конечной концентрации 0,2ћ; реакцию провод€т в течение 20 ч под аргоном, в темноте, при комнатной температуре.
–азделение пептидных продуктов, расщепление белка ионообменной хроматографией.
ѕептиды были разделены на ионообменной колонке с гидрофильной моно-S-смолой (PHARMACIA).
Ѕуфер A: ацетат аммони€ 10 мћ, pH 6,2.
Ѕуфер B: ацетат аммони€ 1 ћ, pH 6,2.
–асход: 0,6 мл/мин, определение пиков путем измерени€ оптической плотности при 278 нм.
√радиенты: от 0% до 100% "B" за 30 мин сбор фракций по 1 мл.
‘ракции, полученные на этапе ионообмена, были проанализированы на PAGE/SDS по методике, описанной Schagger ct Uon Jagow (1987) Anal, Biochem. 166 р. 368-379.
ќчистка N-концевого пептида ∆’¬ƒ с обратной фазой и определение его массы при помощи масспектрометрии.
ѕептид, полученный на этапе ионообменной хроматографии и имеющий молекул€рную массу примерно 400 Da (PAGE/SDS), был очищен на колонке ∆’¬ƒ с обратной фазой.
–асход: 0,3 мл/мин, определение циклов путем измерени€ оптической плотности при 218 нм.
Ѕуфер A: H2O/0,1% TFA (трифторуксусна€ кислота)
Ѕуфер B: ацетонитрил/0,1% TFA.
√радиент от 1 до 50% "¬" за 60 мин.
ѕосле первого этапа ∆’¬ƒ с обратной фазой белок собираетс€ и вновь очищаетс€ на той же колонке, но с другим градиентом.
√радиент от 1 до 50% "B" за 10 мин.
ѕолученный пик подвергаетс€ масс-спектрометрическому анализу бомбардировкой быстрыми атомами (FAB/MS) с матрицей глицерин+тиоглицерин.
–асщепление N-концевого пепетида химотрипсином и анализ полученных аминокислот, разделенных ∆’¬ƒ с обратной фазой.
ƒл€ определени€ структуры пептида, очищенного с помощью ∆’¬ƒ с обратной фазой, он был переварен химотрипсином. ѕолученные пептиды были разделены с помощью ∆’¬ƒ с обратной фазой на колонке Ѕэкман јльтекс C18 (250 x 2,1 мм).
–асход 0,5 мл/мин; определение пиков измерением оптической плотности при 218 нм.
Ѕуфер A: H2O/0,11% TFA.
Ѕуфер B: ацетонитрил/0,08% TFA.
√радиент от 1 до 50% за 60 мин; и сбор пиков.
’имотрипсиновые пептиды идентифицируют аминокислотным анализом на анализаторе Applied Biosystem (модель 420-130A).
–езультаты следующие: представленные ниже результаты, установленные после определени€ структуры кƒЌ  уратоксидазы A.flavus и последовательности аминокислот (см. пример 6), невозможно пон€ть без освещени€ следующих вопросов:
ћасс-спектрометри€ аминоконцевого пептида.
«амечена разница, близка€ к 42-м единицам атомной массы, между двум€ массами, определ€емыми масс-спектрометрией (3684 и 3666), и теоретически определенными молекул€рными массами, исход€ из "выведенной" на основе последовательности кƒЌ  аминокислотной цепи уратоксидазы A.flavus (с учетом отщеплени€ аминоконцевой метиониновой группы):
Ser Ala Val Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Val Arg Val Tyr Lys Val His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Val Gln Thr Val Tyr Gly
(3642 или 3624) (см. последовательность 1).
—ледовательно, на N-концевом серине имеетс€ блокирующа€ группа, котора€ и сообщает дополнительную массу, приблизительно равную 42 ат. ед. м. и возможно, €вл€етс€ результатом ацетилировани€ последнего (масса CH3CO-масса H-42 ат.ед.м).
јнализ химотрипсиновых пепетидов.
јнализ позволил продемонстрировать повторно, что в структуру концевого пептида, полученного "переваром" цианогенбромидом, входит последовательность 1, определенна€ выше.
ѕолна€ последовательность аминокислот уратоксидазы приведена в последовательности 6.
ѕример 5. Ѕактерии.
ѕодготовка маркированных зондов.
ƒва пуда зондов, выведенных из последовательности аминокислот белка, были синтезированы при помощи синтезатора ƒЌ  Biosearch 4600. ѕервый пул соответствует последовательности His-Tyr-Phe-Clu-Ile-Asn (часть последовательности “ 27), и имеет от 5' к 3'-концу нуклеотидную последовательность

Ётот пул образован 48 различными олигонуклеотидами.
¬торой пул соответствует последовательности аминокислотных остатков Gln-PHe-Trp-Gly-Phe-Leu (часть последовательности V5), имеет от 5' к 3'-концу нуклеотидную последовательность

Ётот пул образован 64 олигонуклеотидами.
«онды были маркированы концевой дезоксинуклеотидтрансферазой (TdT).
–еакци€ осуществл€етс€ при использовании 100 нг смеси олигонуклеотидов в растворе объемом 1 мл, приготовленном на буфере " обальт" (поставл€емом в 10-кратной концентрации IBI Inc: 1,4 M кокодилат R pH 7,2: 300 мћ дитиотреитол, 1 μл фермента дезоксинуклеотидил-терминал-трансферазы и 50 μCi дезоксицитидилтрифосфата /dCTP/, маркированного P32).
–еакцию проводили при 37oC в течение 10 мин и останавливали добавлением 1 μл Ёƒ“ј 0,5 ћ.
Ёкстрагировали фенолом и диализовали на колонке с Ѕиогель P 10 (Ѕиоред: 150 1050).
√ибридизаци€ и определение колоний, содержащих кƒЌ  уратоксидазы.
ѕримерно 40000 колоний было проанализировано при помощи гибридизационной техники in situ разработанной Grunstein et Hogness (1975, Proc. Natl. Acad, Sci. (USA), 423961). ѕ€ть из этих колоний были выведены и очищены. »з каждой п€ти колоний была изолирована плазмидна€ ƒЌ ; ее анализировали рестрикцией BamHI или Hind III или BamHI Hind III одновременно.
ѕосле анализа на агарозном геле вы€снилось, что 5 плазмид были линеаризованы при помощи Bam HI и Hind III. ƒвойное расщепление позволило высвободить фрагмент, соответствующий целой клонированной ƒЌ . –азмер этого фрагмента приближаетс€ к 1,2 кв в трех случа€х и к 0,9 кв в двух других. ƒл€ последующего анализа были отобраны и субклонированы один из фрагментов 0,9 кв и один из фрагментов размером 1,2 кв (см. пример 6).
ѕример 6. ќпределение последовательности кƒЌ  уратоксидазы.
ќдин из фрагментов размером 0,9 кв (клон 9A) и один из фрагментов размером 1,2 кв (клон 9C) были субклонированы в репликативную форму ƒЌ  фага ћ13. ƒЌ  клонов ћ13, содержаща€ фрагменты 0,9 и 1,2 кв, была расщеплена с получением вставок. (CycloneI Biosystem iBi). ѕоследние были секвенированы известным методом (Sanger et. al. PNAS-USA-1977, 14, 5463-67).
Ќуклеотидна€ последовательность клона 9C представлена на фиг. 3. —трелкой обозначено начало клона 9A и нуклеотидным символом со звездочкой нуклеотиды клона 9A, не идентичные таковым клона 9C (после приведени€ в соответствие двух последовательностей по сайтам рестрикции AccI и Bam HI) (см. пример 10).
Ѕыло отмечено, что нуклеотидна€ последовательность более длинного фрагмента (клон 9C) перекрывает таковую более короткого (клон 9A) и имеет два отличи€ (фиг. 3). ќдно из них "молчащее", а другое представл€ет собой замещение триптофана на глицин. –азличатьс€ они могут, име€ или разницу в м–Ќ  (пример 2) или погрешность обратной транскрипции, используемой при создании банка кƒЌ  (см. пример 3). —еквенирование геномной ƒЌ  уратоксидазы A. flavus показало, что более веро€тной €вл€етс€ погрешность при обратной транскрипции.
¬ случае более длинного фрагмента кодон ATG (в положении 109 на фиг. 3) начинает собой открытую рамку считывани€, соответствующую полипептиду из 302 аминокислот с молекул€рной массой около 34240 Da, последовательность которого соответствует секвенированной части последовательности очищенной уратоксидазы A. flavus (см. пример 40.
Ќа фиг. 4 представлена структура ƒЌ , открываема€ кодоном ATG, и кодируемый ею полипептид. —трелками показаны пептиды, секвенированные (пример 4) после гидролиза уратоксидазы A. flavus трипсином или протеазой V8.
ѕолипептид заканчиваетс€ триплетом Ser Lys Leu типичным дл€ ферментов с пероксисомальной локализацией. (Gould S.J. et al. Cell Biology 108 (1989) 1657 1664).
ѕример 7.  онструкци€ вектора экспрессии кƒЌ  уратоксидазы.
Ѕыла сконструирована плазмида p466, представл€юща€ вектор экспрессии дл€ E. coli. ќна содержала фрагмент p8R 327, включающий источник репликации гена резистентности к ампициллину, синтетический промотор E. coli (R. Rodrigueg et m. Chamberlin "Promoters Structure and Function (1982 Preager), последовательность Shine Dalgarno полилинкер, представленный уникальными сайтами Nde 1 и Kpn 1, терминатор транскрипции (полученный из фага fd) b uty Laci,
ѕлазмида была сконструирована на основе плазмиды дл€ экспрессии hGH в E. coli (p462) путем замены фрагмента, несущего ген hGH на кƒЌ  уратоксидазы.
Ќиже будет более детально описана конструкци€ плазмиды p466. ѕри ознакомлении с ней следует обращатьс€ к фиг. 5 9.
Ќа фиг. 5 представлена карта рестрикции плазмиды p163.1.
–азличные сегменты рестрикции отмечены в произвольной манере на фиг. 6.
Ќа фиг. 7 представлена карта рестрикции плазмиды p160, фрагменты которой Pvu I(I) Xhol-Bam (HI(I) и Pvul-ORI-BamHI происход€т соответственно из плазмид p163, 1 и pBR 327, а малый фрагмент которой Bam Hi(2) Bam HI(I) €вл€етс€ фрагментом 3, описанным ниже.
‘иг. 8 представл€ет карту рестрикции плазмиды p373,2.
–азличные сегменты регистрации отмечены в произвольной манере на фиг. 9.
‘иг. 10 представл€ет карту рестрикции плазмиды p466/ —интетический фрагмент Bgi II Hind III, описанный ниже, представлен в виде
‘иг. 11 представл€ет карту рестрикции плазмиды p466, где фрагмент, содержащий последовательность, кодирующую уратоксидазу, обозначен как
 онструкци€ плазмиды p373,2.
–абота проводилась с фрагментами, полученными из известных плазмид, а также с фрагментами, приготовленными с помощью синтеза, согласно широко используемым в насто€щее врем€ технологи€м. »спользуемые технологии клонировани€ описаны T.Maniatis, E.F. Fritsch et J. Sambrook, Cold spribg Harbor Zaboratory (1982). —интез олигонуклеотидов осуществл€лс€ при помощи синтезатора ƒЌ  ¬iosearch 4600.
ѕлазмида p163,1 (фиг. 5), описанна€ в за€вке EP A 0245138 и депонированна€ в CNCM под N 1 530 с датой 17.02.1986, была подвергнута расщеплению Pvu 1 и BamHI. Ёта плазмида содержит ген, кодирующий hGH. ‘рагмент Pvu 1 BamHI (фрагмент 1), содержащий сайт рестрикции XhoI, представленный на фиг. 5, был очищен.
ѕлазмида pBR327, хорошо известна€ специалистам (Soberon, X, и др. Gene, 9 (1980) 287 305), была рестрицирована PVu 1 и Bam HI. ‘рагмент PvuI BamHI (фрагмент 2), содержащий источник репликции, был очищен.
«атем был подготовлен фрагмент 3, который €вл€етс€ фрагментом Bam HI (I) Bam HI(2), содержащим ген lac i и его промотор (см. последовательность 7).  онцы нитей помечены цифрами 1 и 2 дл€ уточнени€ ориентации фрагмента в плазмидах, описанных в фиг. 7 и 8.
‘рагменты 1, 2, 3 были лигированы таким образом, чтобы получалась плазмида p160, представленна€ на фиг. 7.
Ёта плазмида была подвергнута частичному расщеплению Hinc II и Pst 1. Ѕольший фрагмент, содержащий источник репликации (представлен на фиг. 7), был затем лигирован с фрагментом 4 (представлен последовательностью 8), €вл€ющимс€ синтетическим фрагментом ƒЌ , несущим кодирующую последовательность дл€ 44 первых аминокислот естественного предшественника, а перед этой последовательностью регул€торные сайты.
¬ данном фрагменте аминокислоты обозначены следующим образом: A аланин; C цистеин; D асп.к-та; E глутаминова€ кислота; F фенилаланин; M - метионин; N аспарагин; P пролин; Q глутамин; R арагинин; G глицин; H гистидин; I изолейцин; K лизин; L лийцин; S серин; T треонин; V - валин; W триптофан; Y тирозин.
¬ этом фрагменте подчеркнуты последовательности 35 (TTGCTT) b -10 (TATAAT) промоторной последовательности и последовательность Shine и Dalgarno, хорошо известна€ специалистам.
“ак как получена плазмида p380,1.
ѕлазмида p380,1 была затем подвергнута рестрикции ферментами Cla I и NdeI с тем, чтобы исключить малый фрагмент ClaI NdeI фрагмента 4 и заменить его фрагментом Cla I NdeI, как показано ниже:

ѕолученна€ плазмида €вл€етс€ плазмидой p373.2 (фиг. 8).
 онструирование плазмиды p466.
ѕлазмида p373.2 была подвергнута расщеплению ферментам BdI II и Hind III. ѕолученный в результате большой фрагмент был очищен и лигирован с фрагментом синтетической ƒЌ , указанной в последовательности 9.
Ётот фрагмент включает "липкие" концы BgI III и Hind III. —формированна€ таким образом нова€ плазмида p462 (фиг. 10) включает сайт Kpn I и сайт NdeI, которые будут затем использованы дл€ встраивани€ фрагмента, несущего кƒЌ  уратоксидазы, в экспрессионный вектор.
√ибридна€ плазмида, полученна€ из pNZ19R, несуща€ фрагмент кƒЌ  размером 1,2 kb (клон 9C), (см. пример 3), включает уникальный сайт Kpn I. —айт локализован на несколько пар оснований позади сайта клонировани€ кƒЌ . ƒруга€ часть кƒЌ  уратоксидазы содержит сайт AccI, расположенный вблизи 5' конца.
Ѕыл выделен и очищен фрагмент AccI-Kpn I, включающий самую большую часть этой кƒЌ . — другой стороны, были синтезированы дл€ комплементарных олигонуклеотида со структурой

предназначенные дл€ восстановлени€ 5' конца кƒЌ . ѕолученный таким образом синтетический фрагмент обладает концами NdeI и Acc II. ‘рагмент и синтетическа€ последовательность были лигированы с экспрессионным вектором, купированным Kpn I и Nde I. “акое лигирование трех фрагментов позволило получить вектор экспрессии, названный p466 (фиг. 11).
“аким образом, плазмида p466 содержит в своей конструкции последовательность ƒЌ , кодирующую уратоксидазу и обозначенную в приложении как последовательность X (нуклеотиды, отличные от нуклеотидов изолированной ƒЌ  A. flavus, подчеркнуты; эти отличи€ были введены в синтетический фрагмент AccI Kpn I дл€ того, чтобы после ATG получить последовательность более близкую к встречающимс€ в гене прокариотов).
ѕример 8. Ёкспресси€ кƒЌ  уратоксидазы.
Ўтамм E.coli K 12 RRI (Belhesda Research Lab. Inc.) был трансформирован плазмидой p466 и плазмидой негативного контрол€ pBR 322 с получением устойчивости к ампициллину. ”стойчивые к ампициллину колонии были получены в двух случа€х. »з каждой колонии двух типов была выращена культур в среде LB + ампициллин 100 μг/мл. ѕосле культивировани€ в течение ночи при 37oC (с перемешиванием) обе культуры были 100-кратно разбавлены в среде (LB + ампициллин 100 μг/мл. ). ѕосле 1 ч культивировани€ был добавлен 1 мћ »ѕ“√ (изопропил- β -D тиогалактозид), после чего культивирование проводили еще 3 ч.
»ммунодетекци€ уратоксидазы с помощью ¬естерн-блота.
ѕоследовательность операции следующа€.
»з среды культивировани€, полученной спуст€ 3 ч после введени€ »ѕ“√, отбирали аликвоту, соответствующую 0,2 мл с DO 1. ѕоследнюю центрифугировали и удал€ли надосадочную жидкость. ќсадок подвергали ¬естерн-блоттингу, технологи€ которого хорошо известна специалистам и включает следующие этапы:
растворение осадка кип€чением в течение 10 мин в буфере, состо€щем из “рис HCl 0,125 ћ, pH 6,8, SDS 4% голубого бромфенолового 0,002% глицерина 20% b -меркаптоэтанола 10% (по протоколу, описанному Laemmli U.K.Laemmli, Nature, 227 (1970) 680-685),
электрофоретическое разделение различных белков, содержащихс€ в растворе, по протоколу, описанному Laemmli U.K.Laemmli, Nature, 227 (1970), 680-685),
перенесение указанных протеинов, содержащихс€ в геле, на фильтр из нитроцеллюлозы (по технологии H. Towbin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76 (1979) 4350-4354).
»ммунодетекци€ осуществл€лась по технологии Burnette (W.W.Burnette. Ana. Biochem. 112 (1981) 195-203), и включала в себ€ следующие процедуры:
промывку целлюлозного фильтра в течение 10 мин буфером A (“рис HCl 10 мћ, NaCl 170 мћ, KCl 1 мћ),
контактирование нитроцеллюлозного фильтра в течение 30 мин при 37oC с буфером B (буфер A с бычьим сывороточным альбумином из расчета 3 г на 100 мл),
контактирование нитроцеллюлозного фильтра в течение 1 ч при 37oC с иммуносывороткой (поликлональные антитела к уратоксидазе A.flavus,
промывание нитроцеллюлозного фильтра буфером B,
контактирование нитроцеллюлозного фильтра в течение 1 ч при 37oC с раствором белка G, меченого йодом 125 (0,1 мк и/мл),
промывание фильтра буфером A,
высушивание фильтра между двум€ абсорбирующими листками,
экспонирование с рентгеновской пленкой,
промывку пленки.
–езультаты следующие.
ќтмечено, что штамм, трансформированный плазмидой p466, производит белок с молекул€рной массой, приближающейс€ и 33 кƒа, который взаимодействует с антителами, к уратоксидазе A.flavus и отсутствует у контрольного штамма.
ѕример 9. ќпределение активности уратоксидазы.
»з среды культивировани€, полученной спуст€ 3 ч после добавлени€ »ѕ“√, берут аликвоту, соответствующую эквиваленту 0,5 мл с DO 1. ≈е центрифугируют и удал€ют надосадочную жидкость. ќсадок раствор€ют в 1мл буфера “Ёј (триэтаноламин), 0,05 ћ, pH 8,9. —успензию клеток два раза озвучивают во льду в течение 30 с на ”«=излучателе W10 (мощность 8, интенсивность 4). Ёкстракт центрифугируют при 10000 g в течение 10 мин, а надосадочную жидкость используют дл€ анализа.
ќписанные ниже операции осуществл€ют на четырех произвольно отобранных колони€х E.coli трансформированных плазмидой p466 (колонии A1, B1, C1, D1), и на одной колонии, трансформированной плазмидой pBR322.
ѕринцип.
—лед€т за превращением мочевой кислоты в аллантоин по уменьшению поглощени€ при 292 нм. –еакци€ такова:

–еактивы.
Ѕуфер “Ёј 0,05 ћ, pH 8,9/Ёƒ“ј:
растворитель 7,5 г “Ёј (см. ссылку 287.46.266) в 400 мл дистиллированной воды,
растворитель 0,372 г комплексона I (ћерк, ссылка 8418) в 50 мл дистиллированной воды,
объединить оба раствора и довести до 500 мл (раствор I),
установить pH этого раствора 8,9 при помощи HCl 0,2 N,
довести до 1000 мл дистиллированной водой (раствор 2)
»сходный раствор мочевой кислоты:
растворить 100 мг мочевой кислоты (Carbiochem 6671) в 50 мл раствора 1,
помощью HCl 0,2 N довести pH до 8,9,
довести до 100 мл дистиллированной водой.
ѕоученный раствор может хранитьс€ неделю при 4oC.
—убстратный раствор мочевой кислоты:
вз€ть 1,5 мл исходного раствора мочевой кислоты и разбавить 100 мл буфера “Ёј (реактив дл€ пролабоанализа (ссылка 287,46,266).
Ётот раствор должен быть использован в течение дн€.
ѕоследовательность операции следующа€
¬ кварцевую кювету спектрофотометра, установленного на 292 нм, помещают и термостатируют при 30oC следующие объемы:
600 μл субстратного раствора мочевой кислоты (подогретого до 30oC),
100 μл описанной выше надосадочной жидкости, к которой добавлено 200 μл “Ёј, pH 8,9 (подогретого до 30oC).
ѕеремешивают и провод€т изменение оптической плотности каждые 30 с. в течение 5 мин. ѕри этом вывод€т ΔE изменение оптической плотности в минуту.
–езультаты следующие:
јктивность уратоксидазы, выраженна€ в ед./мл, до 1 высчитываетс€ из измерений ΔE по следующей формуле

в которой символами Vr, d, I, VPE последовательно представл€ют реагирующий объем (0,9 мл), уровень разведени€ (20, коэффициент пропускани€ мочевой кислоты на 292 нм (12,5) и объем вз€той пробы (0,3 мл).
ѕолученные результаты приведены в табл.2.
»з данных табл. 2 видно, что клетки E.coli, трансформированные плазмидой p466, способны в присутствии »ѕ“√ продуцировать полипептид с уратоксидазной активностью.
ѕример 10.  онструкци€ трех экпрессионных векторов дл€ экспрессии кƒЌ  уратоксидазы в дрожжах (плазмиды pEMR 469, pEMR 473 и pEMR 515).
–абота проводилась с фрагментами, полученными из известных плазмид, а также с фрагментами, полученными синтетическим путем по широко используемым в насто€щее врем€ технологи€м. »спользование техники клонировани€ описаны T. Maniatis, b F.Fritsch et J. Sambrook b "Molecular cloning, aloboratory manual"
(Cold Spring Harbor laboratoty, (1989). —интез олигонуклеотидов осуществл€лс€ с помощью синтезатора ƒЌ  Biosearch 4600.
ѕоследующее описание будет легче пон€ть при помощи фиг.12, 13 и 14, на которых представлены карты рестрикции плазмиды pEMR414, а также плазмид pEMR469 и pEMR473. —имволы, использованные в фигурах, будут по€снены ниже. ¬ случае, если сайт наращиваетс€ при помощи полимеразы  ленова, он помечаетс€ индектом "о"; сайты лигировани€ помещены в скобки.
 онструкци€ плазмиды pEMR 469.
Ёта плазмида была сконструирована на основе челночного вектора E.coli - дрожжей pEMR414, последовательным лигированием следующих элементов:
фрагмент PSt I Hind III (обозначен на фиг. 12 как ++++) из плазмиды pJDB 207, (Beggs, 1978: Gene Cloning in Yeast, p. 175-203 в: Jenetic Engineering Vol. 2 Williamson Academic Press, London, UK), включающий начальную часть гена устойчивости к ампициллину Amp R от pBR 322 (Sutcliffe 1979. Cold Spring Simp. Quart Biol 43, 779) и фрагмент 2 эндогенной формы B, несущий ген LEU 2, от S. cerevisial, частично делетированный в области промотора (называемого LEU 2d), локус STB (REP 3) и источник репликации плазмиды 2 μ (Hartley et Danelson, 1980, Nature, 286, 860-865).  онец Hind III этого фрагмента наращивали при помощи полимеразы  ленова. Ќа фиг. 12 он обозначен Hind III.
фрагмент Hind III Sma I (обозначен как

на фиг. 12 хромосомы дрожжей, содержащий ген URA 3 с его промотором (Rose t al, 1984, Gene, 29 p. 113-124). Ётот фрагмент происходит из плазмиды pFLI (Chevallir et al, 1980, Gene, 11, 11-19).  онец Hind III был восстановлен благодар€ действию полимеразы  ленова.
фрагмент Sam I Bam HI (обозначен как ====== на фиг. 12), содержащий синтетический вариант промотора гена ADH2, отличающийс€ от природного варианта, описанного Russel et Smith (Russel et af, 1983). J.Biol Chem. 258, 2674-2682), только несколькими парами оснований, предназначенных дл€ интродукции сайтов рестрикции. (≈стественна€ последовательность может быть использована с малоотличающимис€ результатами). ѕоследовательность этого фрагмента представлена как последовательность 11.
фрагмент Bgl II Hind III (обозначен как на фиг. 12), содержащий 3'-конец гена PGK дрожжей. Ётот фрагмент €вл€етс€ продуктом полного перевара Hind III фрагмента хромосомной ƒЌ  дрожжей с помощью Bgl II, несущего ген PGK, описанный Hitgeman et fl (1982, Nucleic Acid Res, 10, 7791-808). ¬ результате расщеплени€ получаютс€ два фрагмента Hind III Bgl II, меньший из которых (примерно 0,4 кв), несущий 3'-конец гена PGK дрожжей используетс€. ѕоследовательность его описана авторами Hytgemann et al. (указан выше). ‘рагмент, представл€ющий собой Bgl II -сайт, клонирован в сайт Bam HI предыдущего фрагмента. “аким образом, сайты Bam HI и Bgl II исчезают, а сайт Hind III, обработанный полимеразой  ленова, клонируютс€ в сайт PVU III фрагмента PVU II Pstl pBR322, описанного ниже:
фрагмент Pvu II Pst I (обозначен на фиг. 12) pBR 322, содержащий источник репликации и концевую часть гена устойчивости к ампициллину (AmpR).
“аким образом, плазмида pEMR 414 состоит из следующих элементов:
источник репликации и ген устойчивости к ампициллину AmpR, обеспечивающие репликацию и селекцию плазмиды в клетках E.cоli.
источник репликации дл€ дрожжей (ARS), локус STB гена Leu2 S.cerevisiae без промотора и ген Ura 3 с промотором S.cerevisiae, обеспечивающие репликацию и селекцию плазмиды S. cerevisiae, а также эффективность делени€ в клетках, содержащих эндогенную плазмиду 2 μ.
ѕлазмида pEM R414 была подвергнута полному расщеплению NheI и ClaI. ћалый фрагмент Nhel-Clal, содержащий ген Ura 3, называнием ниже фрагмента A, был очищен.
ѕлазмида pEM R414 была подвергнута полному перевариванию ферментами NdlI и BamHI. Ѕольшой фрагмент NheI-BamHI, содержащий в частности, ген Leu 2d и источник репликации плазмиды pBR 322, называемый ниже фрагментом B, был очищен.
Ѕыл приготовлен синтетический фрагмент ClaI-AccI, содержащий начало последовательности кƒЌ  уратоксидазы (клон 9c) с помощью модификации, произведенными с целью введени€ кодонов, привычных дл€ дрожжей (Sharp et al. 1986, Nucl. Ac. Res. Vol. H, 13, pp 5125-5143), без изменени€ основной последовательности аминокислот. —труктура этого фрагмента, называемого далее фрагмент C, имеет последовательность 12, в которой подчеркнутые нуклеотиды модифицированы по отношению к клону 9C.
ѕлазмида клона 9C (фиг.3) была подвергнута перевариванию ферментами AccI и BamHI. ‘рагмент AccI-BamHI, содержащий конец кƒЌ  уратоксидазы, называемый ниже фрагмент D, был очищен. ќн имеет структуру, изображенную последовательностью 13.
‘рагменты A, B, C и D были лигированы с получением плазмиды pEMR 469, представленной на фиг. 13, имеющем те же обозначени€, что и на фиг. 12; новые фрагменты AccI и AccI-BavHl обозначены:
 онструирование плазмиды pEMR 473.
ѕлазмида pRM 469 была подвергнута полному расщеплению MluI и SphI. Ѕольшой фрагмент MluI-SphI, содержащий ген уратоксидазы, затем был лигирован синтетическим фрагментом с последовательностью 14, соответствующим начальной части (200 n.h.) последовательности элемента TATA промотора GAL, 7 S.cerevisiae.
ѕолученна€ таким образом плазмида pEMR 473 представлена на фиг. 14, имеющем те же обозначени€, что и рис. 13; новый фрагмент MluI-SphI обозначен
 онструирование плазмиды pEMR 515.
ѕлазмида pEMR 473 была подвергнута частичному расщеплению ферментом XbaI и полному перевариванию ферментом MluI. Ѕольшой фрагмент XbaI MluI был очищен. Ётот фрагмент содержит последовательности источника репликации и локус STB 2 μ ген Leu 2d, ген устойчивости к ампициллину AmpR, источник репликации pBR 322 и кассету экспрессии уратоксидазы. ѕри этом он не содержит ни гена URA 3, ни части 2 m заключенной между Xba I и NheI.
Ѕольшой фрагмент XbaI NluI был рециклизоан через адаптор, содержащий "липкие" концы модифицированного сайта Xba I и сайта Mlu I, и имеющий следующую структуру.

ѕолученна€ таким образом плазмида содержит лишь один из трех элементов сайта FRT мишени рекомбиназы, кодируемой геном Flu 2 μ
ѕлазмиды pEMR 469, pENR 473 и Pemr 513 имеют фрагмент ƒЌ , кодирующий уратоксидазу, со структурой, изображенной последовательностью 15.
ѕример 11. “рансформаци€ штамма дрожжей EMY 761 плазмидами pEMr 469, pEMR 473 и pEMR 515. “рансформаци€ штаммов дрожжей EMY500 и GRF 18 плазмидой pEMR 515. “рансформаци€ с селекцией на прототрофию урацила или прототрофию лейцина.
¬ качестве штаммов реципиентов использовали три неизогенных штамма Saccharomyces cerevisiae:
штамм EMY 761 (Mat a Leu 2, ura 3, his 3 gal);
штамм EMY 500 (Mat a Leu 2, ura 3, pep 4);
штамм GRF18 (Mat a Leu 2, his 3).
Ўтамм GRF хорошо известен специалистам (Gerry Fink, Mit, USA). Ўтаммы EMY761 и EMY500 родственны штамму GRF18. ќни получены последовательным скрещиванием штамма GRF со штаммом ura 3, полученным из штамма FL 100 (депонирован в ATCC под N 28 383), и со штаммом 2OB12 (Mat a tsp 1, pep 4) описанным E. W. Jones et al. (1971( Jenetics, 85, 23).
Ўтамм CRF 18 можно получить очисткой от плазмиды pEMR515 штамма CPF 18 pEMR 515 (leu+), депонированного с CNCM под N 1-920, 28.12.1989, а штамм EMY500 очисткой от плазмиды pEMR 515 штамма EMY500 pEMR 515 (leu+), депонированного в CNCM под N 1-919, 28.12.1989.
Ўтаммы содержат мутации (Leu 2 и ura 3), делающие из доступными дл€ комплементации дефективным маркером селекции Leu 2d и маркером селекции ura 3, представленными в каждой из плазмид pEMR 469 и pEMR 473.
“рансформаци€ с селекцией на прототрофию по урацилу.
 летками штамма EMY761 засе€ли 100 мл среды, называемой среда YPG жидка€ (см. табл. 3). ѕри достижении плотности клеток, равной 107 кл/мл, на них воздействовали 0,2 M ацетатом лити€ дл€ трансформации по технологии, хорошо известной специалистам и описанной ITO e fl, (ITO et al. 1983, J. Bacteriology, 153, 163-168).
 летки EMY761 трансформировали примерно 1 mг каждой из плазмид pEMR 469 и pEMR 473. “рансформированные клетки отбирались культивированием на среде, именуемой твердой средой без урацила. ¬ыделили трансформанты EMY761 pEMR 469 (ura+) и EMY761 pEMR473 (ura+).
“рансформаци€ с селекцией на прототрофию по лейцину.
ѕри трансформации использовалс€ вариант технологии, описанной Beggs et al. (Beggs et al. (1978), Nature 275, 104-109), согласно которой дрожжи подвергали протопластированию в присутствии осмотического стабилизатора, сорбитола в концентрации 1 ћ.
“очный протокол трансформации представлен ниже:
200 мл жидкой среды YPG засевали примерно 5·106 клеток культуры в стационарной фазе и культуру, инокулированную таким образом, выдерживали в течение ночи при 30oC при перемешивании;
когда культура достигала плотности примерно 107 клеток/мл, ее центрифугировали при 4000 об/мин в течение 5 мин и осадок промывали 1 ћ сорбитолом;
клетки суспендировали в 5 мл 1ћ р-ра сорбитола, содержащего 25 мћ Ёƒ“ј в 50 мћ дитиотреитола и инкубировали 10 мин при 30oC;
клетки промывали 1 раз 10 мл 1ћ сорбитола и суспендировали в 20 мл сорбитола, добавл€ли зимолиазу-100“ (полученную частичной очисткой на афинной колонке надосадочной жидкости культуры Arthobacter luteus и содержащей β -1,3-глюкан-ламинарипентагидролазу, выпускаемую Seykagaku Cogyo Co. Ztd) до конечной концентрации 20 mг/мл и инкубировали суспензию при комнатной температуре примерно 15o.
клетки ресуспендировали в 20 мл среды, содержащей сорбитол, именуемой "среда YPG-сорбитол", и инкубировали 20 мин при 30oC и легком помешивании;
центрифугировали 3 мин при 2500 об/мин;
ресуспендировали в 9 мл буфера дл€ трансформации (сорбитол 1ћ, трис-HCl pH 7,5, 10 мћ, и CaCl2 10 мћ);
прибавили 0,1 мл клеток и 5 μл р-ра ƒЌ  (около 5 μг и оставили полученную суспензию на 10 15 мин при комнатной температуре;
прибавили 1 мл раствора 20% полиэтиленгликоль (PEG 4000) в трис-HCl pH 7,5, 10 мћ, и CaCl2 10 мћ;
0,1 мл полученной суспензии наливают в пробирку, содержащую твердую среду регенерации без лейцина, предварительно расплавленную и содержащуюс€ жидкой при 45oC. —успензию наливают на чашку ѕетри, содержащую затвердевший слой из 15 мл твердой среды регенерации без лейцина;
предыдущий этап повтор€ют с остатком суспензии, полученной на ранее предыдущем этапе.
“рансформированные колонии начинают по€вл€тьс€ на 3-й день.
“аким образом были получены трансформированные EMY 761 pEMR469 (leu+, EMY 761 pEMR 473 (leu+), EMY762 pEMR 515 (leu+), GRF18 pEMR 515 (leu+) и EMY500 pEMR 515 (leu+).
ќсновные среды, использованные в примерах 11, 12, 13, 14:
тверда€ среда без урацила
»спользуетс€ 7,6 г дрожжей азотисных оснований без аминокислот (Yeast nitrogen base wiyhout Omino Acids de DiFCO), 5,0 г гидролизата казеина (Casamino Acids de DiTCO), 10 г глюкозы, 20 г агара.
—мешать все ингредиенты в дистиллированной воде, довести до конечного объема 1 л дистиллированной водой. јвтоклавировать 15 мин при 120oC.
жидка€ среда без урацила
»спользуетс€ предыдущий состав без агара. јвтоклавируетс€ 15 мин при 120oC.
тверда€ среда без лейцина
»спользуетс€ 6,7 г дрожжевых азотистых оснований без аминокислот (Yeast nitrogen Base wiyhout Amino Acids de DiFCO), а также (в мг): 20 аденина, 20 урацила, 20 1-триптофана, 20 1-гистидина, 20 1-аргинина, 20 1-метионина, 30 1-тирозина, 30 1-изолейцина, 30 1-лизина, 50 1-фенилаланина, 100 1-глутаминовой кислоты, 150 1-валина, 400 1-лейцина, 20 г глюкозы, 20 г агара.
—мешать все ингредиенты в дистиллированной воде. ƒовести конечный объем дистиллированной водой до 1 л. јвтоклавировать 15 мин при 120oC. ѕосле автоклавировани€ добавить 200 мг 1-треонина и 100 мг аспарагиновой кислоты.
тверда€ среда регенерации без лейцина
»спользовали предыдущий состав, прибавив 30 г агара вместо 20 и добавить в смесь 182 г сорбитола.
жидка€ среда без лейцина
»спользовали состав твердой среды без лейцина, лишенный агара. јвтоклавировать 15 мин при 120oC. ѕосле автоклавировани€ добавить 200 мг 1-треонина и 100 мг 1-аспарагиновой кислоты.
жидка€ YP-среда
»спользовали 10 г экстракта дрожжей (Bacto-yeast extract de DiFCO), 20 г пептона (Bacto-peptone de DiFCO).
—мешать ингредиенты в дистиллированной воде. ƒовести конечный объем дистиллированной водой до 1 л. јвтоклавировать 15 мин при 120oC.
жидка€ YPG среда
»спользовали предыдущий состав, в который после автоклавировани€ добавили глюкозу в концентрации 20 г/л.
среда YPG-сорбитол
»спользовали состав YPG, в которой после автоклавировани€ добавили сорбитол в концентрации 1ћ.
среда yp-этанол-глицерол
»спользовали состав жидкой среды YP. ѕосле автоклавировани€ добавили 10 мл 100%-ного этанола (1% конечный) и 30 г глицерина.
-среда yp этанол-глицерин-галактоза
»спользовали состав жидкой YP. ѕосле автоклавировани€ добавили 10 мл 100%-ного этанола, 30 г глицерола и 30 г галактозы.
ѕример 12. Ёкспресси€ кƒЌ  уратоксидазы в колбе Ёрленмейера штаммами EMY761 pEMR 469 (ura+), EMY761 pEMR473 (ura+), EMY761 pEMR 469 (leu+), EMY761 pEMR 473 (leu+). »ммунодетекци€. ¬естерн Ѕлот. ќпределение активности уратоксидазы.
Ёкспресси€ кƒЌ  уратоксидазы.
Ўтаммы, селектированные на среде без урацила.
»з каждого штамма EMY761 pEMR469 (ura+) и EMY761 pEMR473 (ura+) была получена культура в 20 мл жидкой среды без урацила (см. пример 11). ѕосле поддержани€ в течение ночи при 30oC и перемешивании обе культуры центрифугировали в течение 10 мин на 7000 об/мин. ќсадки помещали в дистиллированную воду и снова центрифугировали в течение 10 мин при 7000 об/мин. Ёкспрессию уратоксидазы индуцировали помещением клеток в 20 мл среды YP этанол-глицерин (см. пример 11) дл€ штамма EMY 761 pEMR 469 (ura+) и 20 мл среды YP этанол-глицерин-галактоза (пример 11) дл€ штамма EMY 761 pEMR 473 (ura+).  ультуры выдерживали 22 ч при 30oC при перемешивании.
Ўтаммы, селектированные на среде без лейцина.
¬начале из одной колонии каждого их двух штаммов EMY 761 pEMR 469 (Leu +) и EMY 761 pEMR 473 (Leu +) были получены культуры в 20 мл жидкой среды без лейцина (пример 11). Ёто позволило получить и поддерживать на достаточно высоком уровне количество копий плазмид, использу€ селекцию по комплементации мутации Leu 2 геном Leu 2d плазмидами pEMR 469 и pEMR 473.
ѕосле ночи при 30oC и перемешивании обе культуры были центрифугированы в течение 10 мин при 700 об/мин. ќсадки были помещены в 10 мл дистиллированной воды и снова центрифугированы 10 мин при 7000 об/мин. Ёкспресси€ уратоксидазы индуцировалась путем помещени€ клеток в 20 мл среды YP этанол-глицерин дл€ штамма EMY 761 pEMR 469 (Leu +) и 20 мл среды YP этанол-глицерин-галактоза дл€ штамма EMY761 pEMR 473 (Leu +).  ультуры выдерживались при 30oC и перемешивании 22 ч.
 онтрольный штамм.
Ќетрансформированный штамм EMY 761, был культивирован, как указано выше. — одной стороны, он подвергс€ индукции в 10 мл жидкой среды YP этанол-глицерин, а с другой стороны, индукции в 10 мл среды YP этанол-глицерин-галактоза.
ѕодготовка образцов.
 ультивированные клетки ценрифугировали, надосадочна€ жидкость удал€лась. ќсадок помещалс€ в 10 мл дистиллированной воды и центрифугировалс€ 10 мин на 7000 об/мин. ѕромытые таким образом осадки помещались в 1 мл “Ёј буфера с pH 8,9. ќтобранные таким образом клетки (≈ 300 μл) были лизированы в присутствии стекл€нных шариков. Ёту смесь гомогенизировали по 1 мин 4 раза, перед каждым размельчением образцы на 30 с. помещали в лед. — помощью пастеровской пипетки жидкость была отобрана из пробирок и помещена в микрообъем. Ўарики затем промывали примерно 200 μл буфера “Ёј, pH 8,9 и смыв добавл€ли к упом€нутому лизату. ѕосле этого лизат центрифугировали в микрообъеме 5 мин 7000 об/мин. Ќадосадочную жидкость осторожно сливали и сохран€ли при -20oC дл€ ¬естерн-блота, определени€ активности уратоксидазы и протеинов. ќсадок лизированных клеток хранилс€ отдельно при -20oC дл€ ¬естерн-блота.
ƒругие аликвоты культур были перед индукцией обработаны таким образом: 2 мл культуры центрифугировали 10 мин при 7000 об/мин. ќсадки помещали в 500 μл дистиллированной воды и снова центрифугировали 5 мин при 7000 об/мин. ќсадки помещали примерно в 200 μл буфера “Ёј. pH 8,9, и лизировали, как было описано выше, в присутствии стекл€нных шариков. Ќадосадочные жидкости и осадки лизированных клеток хранились отдельно при -20oC.
»ммунодетекци€ уратоксидазы с помощью ¬естерн-блота.
ѕоследовательность операций следующа€.
ќсадки и надосадочна€ жидкость различных образцов обрабатывалась в соответствии с техникой, хорошо известной специалистам и включающей следующие этапы:
-растворение осадка кип€чением (10 мин в растворе, состо€щем из трис-HCl 0,125 M, pH 6,8, SDS 4% бромфенолового синего 0,002% глицерина 20% β -меркаптоэтанола 10% ) (по описанию Laemmli (U.K.Laemmli, Nature, 227, (1970), 680-685), этап примен€лс€ только дл€ осадков;
-электрофоретическое разделение белков, содержащихс€ в растворе, по описанию Laemmli (U.K.Laemmli, Nature, 227, (1970), 680 685);
-перенос упом€нутых белков, наход€щихс€ в геле на нитроцеллюлозный фильтр (по технологии H. Towbin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) 4350-4354).
»ммунодетекци€ осуществл€лась по технологии Burnetti (W.W. Burnetti, Ana. Biochem. 112 (1981) 195 203).
–езультаты следующие.
ѕоказано, что штаммы EMY761 pEMR 469 (ura+), EMY 761 pEMR 473 (ura+), EMY 761 pEMR 469 (Leu+), EMY 761 pEMR 473 (Leu+) продуцируют белок молекул€рной массы, приближающейс€ к 33 кƒј, который распознаетс€ антителами, направленными против уратоксидазы A.flavus, и отсутствует у контрольного штамма.
ќтмечено также, что неиндуцированные штаммы не продуцируют или продуцируют очень мало описанного выше белка.
—равнение содержани€ данного протеина дл€ осадков и надосадочной жидкости позвол€ет сделать вывод, что около 80% белка находитс€ в лизате в растворенной форме.
4. ќпределение активности уратоксидазы.
јктивность уратоксидазы измер€лась в надосадочной жидкости лизированных клеток, согласно последовательности операции, описанной в примере 9.
ѕолученные результаты приведены в табл. 3. ¬ ней представлена активность уратоксидазы в U/мл дл€ каждого штамма, индуцированного в глицерин-этаноле в глицерин-этанолгалактозе или неиндуцированного.
»з данных табл. 3 €сно видно, что клетки дрожжей, трансформированные плазмидами pEMR469 и pEMR473, способны после индукции продуцировать уратоксидазную активность.
ќпределение общего белка лизата.
ƒл€ определени€ общего белка надосаточной жидкости лизированных клеток использовали Kit protein assay BioRAD. ќно основываетс€ на том, что в присутствии белка максимальное поглощение раствора бриллиантового синего ( омасси g-250) перемещаетс€ от 465 к 595 нм, (Reisner et al. Anal. Biochem. 64, 509- (1975)).
–езультаты следующие.
ќсновные полученные результаты приведены в табл. 4. ƒл€ каждого индуцированного в глицерин-этаноле, глицерин-этанол-галактозе или неиндуцированного штамма определено количество общих растворенных белков, а также процентное соотношение уратоксидазы и общего белка супернатанта (при допущении, что специфическа€ активность рекомбинантного белка идентична таковой у уратоксидазы, полученной из A. flavus 304/).
”становлено, что уровень продукции уратоксидазы колеблетс€ от 5 до 20% в зависимости от трансформирующего агента и способа селекции.
ѕример 13. ‘ерментна€ экспресси€ в объеме 2,5 л кƒЌ  с использованием штамма EMY761 pEMR473 (ura+).
ѕротокол ферментации.
—реда дл€ посева. »з колонии штамма EMY761 pEMR473 (ura+) в 200 мл жидкой среды без урацила (пример 11) была получена колони€.  ультура развивалась в течение ночи при перемешивании до значени€ плотности около 3.
—остав культивировани€ (A) Ќа 1 л воды, очищенной на аппарате типа millig, г:
√люкоза 30
√лицерин 30
√идролизат казеина (Casamina acids de DiFCO) 30
азотистые основани€ дрожжей (Yсast Nitrogen Base de DiFCO) 15
экстракт дрожжей (Yeast extract de DiFCO) 2,5
K2HPO4 3
MgSO4 · 2H2O 0,5
ƒополнительна€ среда (B) Ќа 100 мл воды, очищенной на аппарате типа milliq, г:
√лицерин 30
√идролизат пептона (le Primatene de G. Sheffield) 30
јзотисные основани€ дрожжей (Yeast Nitrogen Base de DiFCO) 15
Ёкстракт дрожжей (Yeast extract de DiFCO) 5
K2HPO4 3
MgSO4 · 2H2O 0,5
ѕараметры ферментации
Ѕиореактор общим объемом 2,5 л, снабженный двум€ турбинами. ”слови€: температура 30oC, pH 5; парциальное давление кислорода 30 мм рт. ст. расход воздуха 1 л/мин.
Ѕиореактор заполн€етс€ 1,5 л среды A и засеваетс€ 150 мл инокул€та. ѕосле уменьшени€ оптической плотности глюкозы от 17 до 2,5 осуществл€ют индукцию прибавлением 150 мл галактозы 20% вес/объем. Ќарастание продолжаетс€, затем ввод€т аддитивную среду B до значени€ до около 30. Ќарастание продолжаетс€ четверть часа, сбор осуществл€етс€ до 104.
ѕодготовка и анализ образцов.
ќбразцы готов€т по способу, описанному в примере 9, из ферментной культуры. Ѕыло вз€то две порции, перва€ спуст€ 7 ч после индукции, втора€ спуст€ 22 ч после индукции. Ќа этих двух лизатах, полученных после разрушени€ клеток, были проведены тексты, описанные в примере 9:
иммунодетектаци€ ¬естерн-блотом,
определение биологической активности,
определение общего белка.
ѕолучены следующие результаты.
»ммунодетекци€ с помощью ¬естерн-блота
”становлено, что штамм EMY761 pEMR473 (ura+), культивированный в двух литрах среды, продуцирует белок с кажущейс€ молекул€рной массой, приближающейс€ к 33 кƒа, распознаваемый антителами, направленными против уратоксидазы A. flavus и приготовленными методом, хорошо известным специалистам: Vaitukaitis et al. (1981) "Methods in Enzymology" Academic Press. New York, Vol. 73, p 46).
” контрольного штамма названный белок отсутствует.
ќпределение биологической активности.
ѕолученные результаты приведены в табл. 5.
ѕоказано, что штамм EMY761 pEMR473 (ura+) после индуцировани€ в ходе ферментации продуцирует белок с уратоксидазной активностью.
ќпределение общего белка
–езультаты приведены в таблице 6.
–езультаты показывают, что уровень синтеза уратоксидазы штаммом EMY761 pEMR473 (ura+), культивированном в большом объеме составл€ет примерно 5% общего белка спуст€ 7 ч и 21 ч после индуцировани€.
ѕример 14. Ёкспресси€ в колбе Ёрленмейера кƒЌ  уратоксидазы штаммами EMY761 pEMR515 (Leu+), EMY500 pEMY515 (Leu+), GRF18 pEMR515 (Leu+).
 олони€ каждого из трех штаммов была культивирована в 20 мл жидкой среды без лейцина. ѕосле культивировани€ в течение ночи при 30oC и перемешивани€ три культуры были центрифугированы 10 мин при 7000 об/мин.  леточные осадки были растворены в 10 мл стерильной дистиллированной воды и снова центрифугированы в течение 10 мин. Ёкспресси€ уратоксидазы была индуцирована посевом клеток в 20 мл среды YP этанол-глицерин-галактоза (табл. 1).  ультуры растили 20 ч при перемешивании в температуре 30oC. ¬ качестве контрол€ была использована культура каждого штамма-хоз€ина, не подвергавшегос€ трансформации.
 летки каждой из 6-ти культур были осаждены центрифугированием, надосадочна€ жидкость сливалась. ќсадки были помещены в 10 мл дистиллированной воды и центрифугировались 10 мин при 7000 об/мин. «атем они были промыты и помещены в примерно 1 мл буфера “Ёј, pH 8,9, а измельчение и удаление частиц центрифугированием осуществл€лось согласно примеру 9.
Ќадосадочна€ жидкость после центрифугировани€ каждой из культур использовалась как и прежде дл€ определени€ уратоксидазы и общего белка. ѕолученные результаты сведены в табл. 7.
–езультаты показывают, что можно получить высокий уровень экспрессии уратоксидазы с трем€ неизогенными штаммами реципиентами, трансформированными векторами экспрессии согласно изобретению.
ѕример 15. ‘ерментна€ экспресси€ в объеме 2,5 л кƒЌ  уратоксидазы с использованием штамма EMY500 pEMR515. ќчистка и частична€ характеристика рекомбинантной уратоксидазы.
 ультивирование в 2,5 л штамма EMY500 pEMR515.  ультивирование штамма EMY500 pEMR515 производитс€ следующим образом.
‘аза прекультуры в маслом объеме.
»з 1 мл раствора в среде, содержащей 20% глицерина, штамм EMY500 pEMR515 с числом клеток, соответствующим ≈2,35, засевают колбу Ёрленмейера (500 мл), содержащую 90 мл среды роста автоклавируемой фазы MCPA с добавлением 1,28 г ћЁ— (2-/N-морфолино/-этансульфонова€ кислота), Sigma N M 8250 и 10 мл фильтруемой фазы среды роста MCPF. —остав сред MCPA и MCPF будет представлен далее. ѕосле 24 инкубации при помешивании и 30oC оптическа€ плотность культуры была примерно 7.
‘азы ферментного культивировани€.
ќписанна€ выше культура используетс€ дл€ засева ферментатора объемом 2,5 л, содержащего среду культурировани€ следующего состава: 900 мл MCPA + 200 мл MCPF. pH при культивировании регулируетс€ ферментатором и составл€ет 5,5. ѕосле 6 7 ч культивировани€ при 30oC добавл€ют равномерно в течение 9 ч 72 мл раствора глюкозы (500 г/л), что в целом составл€ет 36 г глюкозы.
‘аза экспрессии.
¬ описанную выше смесь добавл€ют 190 мл экспрессионной среды автоклавируемой фазы MEPA и 150 мл фильтруемой фазы экспрессионной среды MEPF (состав представлен далее).  ультивирование продолжаетс€ 5 ч. «атем в течение 20 ч равномерно прибавл€ют 150 мл раствора, содержащего 30 г галактозы, 15 г глицерина и 36 г этанола. “аким образом достигаетс€ DO, близкое к 160.
—остав сред роста и экспрессии приведен в табл. 8-13 соответственно.
—реда роста, автоклавируема€ фаза (MCPA) указаны в табл. 8.
—писок микроэлементов 1 представлен в табл. 9.
ƒобавить к раствору 100 мл концентрированной HCl. ƒовести до 1000 мл.
—реда роста, фильтруема€ фаза (MCPF) указана в табл. 10.
ƒл€ растворени€ нагреть, охладить, добавить витамины 1 и фильтровать на фильтре с размером 0,2 m
—писок витаминов 1 представлен в табл. 11.
ƒовести до 100 мл после растворени€.
‘ильтровать в холодных стерильных услови€х на фильтре размером 0,2 m
—реда экспрессии, автоклавируема€ фаза (ћ≈–ј) представлена в табл. 12.
”становить pH 5,5 при помощи H2SO4 (конц.) или  ќЌ (конц.). јвтоклавировать 20 мин при 120oC.
—реда экспрессии, фильтруема€ фаза (MEPF) указаны в табл. 13.
ƒл€ растворени€ нагреть, остудить, добавить витамины и профильтровать.
ƒробление клеток.
ѕосле 20 ч индуцировани€ оптическа€ плотность, измер€ема€ на 600 нм культуры, равна 98,800 г, ферментного сусла центрифугируютс€ 5 мин при 10000 об/мин, а клеточный осадок помещаетс€ в 80 мл лизирующего буфера (глицин 20 мм, pH 8,5).  летки измельчаютс€ при 4oC, 2 раза по 2,5 мин в микроизмельчителе (Vibrogen Zellmiihle V14) в присутствии шариков с диаметром 0,5 мм в объеме, равном объему раствора лизируемых клеток. ѕосле измельчени€ надосадочна€ жидкость собираетс€, а шарики 2 раза промывают 80 мл лизирующего буфера. 210 мл объединенного лизата содержат общих белков приблизительно 3 мг/мл и уратоксидазной активности около 7,7 u/мл (процентное соотношение уратоксидазы к общему белку около 8,5% если исходить из предположительной специфической активности фермента 30 u/мг).
ќчистка рекомбинантной уратоксидазы.
ѕротокол очистки
ѕолученный лизат подвергаетс€ очистке в 2 этапа:
Ётап 1:
јнионообменна€ хроматографи€.
 олонка:
ƒЁј— (диэтиламиносульфат)-сефароза fase flour (PHARMACIA ref. 17.07.09.91)
”плотненный гель занимает объем 70 мл.
–азделение осуществл€етс€ при комнатной температуре, собранные фракции хран€тс€ при 0oC.
”слови€ разделени€. »спользуют градиент ионной силы хлорида натри€ между буфером 1 (борат Na 10 мћ, pH 9,2) и буфером 2 (борат Na 10 мћ, хлорид Na 1M), Ѕуферы предварительно дегазируют и хран€т при 0oC. ¬ каждый буфер добавл€ют эквивалент 0,02% азида. ќбъем неочищенного экстракта 10 мл. Ёлюирование ведут буфером 1 до полного сбора уратоксидазы (фракции по 10 мл), котора€ не задерживаетс€ колонкой.
ѕигменты и загр€зн€ющие белки затем удал€ютс€ элюированием буфером 2.
ќчистка сопровождаетс€ измерением оптической плотности элюента при 214 нм.
Ётап 2: ∆идкостна€ хроматографи€ высокого давлени€ с обратной фазой.  олонка: на основе привитого кремни€ CB, јквапор ќƒ-300 (100 · 2,1 мм) Brownlee Applied Biosystems).
”слови€ операции.
Ёлюант 1: ультраочищенна€ вода с 0,1% трифторуксусной кислотой (“‘”).
Ёлюант 2: ацетонитрил (спектрометрического или эквивалентного качества) с 0,08% “‘”.
–асход: 0,3 мл/мин,
√радиент от 35% ацетонитрил /“‘” до 70% ацетонитрил/ “‘” за 20 мин, поддерживают при 70% в течение 5 мин. »нжектированное количество равно 1 мл за цикл.
—бор фракций. –азделение сопровождаетс€ измерением оптической плотности при 218 нм.
–езультаты следующие.
ƒо и после первого этапа очистки образец анализировалс€ жидкостной хроматографией на привитом кремнии CB, јквапор ќƒ-300, описанном выше, с таким же градиентом и использованием объема образца 50 mл ¬ качестве эталона использовали очищенную уратоксидазу A. flavus.
¬ исходном лизате уратоксидаза составл€ла 63% от общего белка. ѕосле первого этапа очистки уратоксидаза составл€ла уже 84% общего белка.
¬есь образец, полученный после второго этапа, содержащий более 84% уратоксидазы, был использован дл€ частичной характеристики, описанной ниже.
„астична€ характеристика рекомбинантной уратоксидазы.
јминокислотный анализ.
јнализ аминокислот гидролиза отчищенной рекомбинантной уратоксидазы был осуществлен на анализаторе Applied Biosystems модели 420-130ј. –аспределение аминокислот было количественно сравнимо с предполагаемой структурой (нет значительных отличий). “акой же результат наблюдалс€ и дл€ уратоксидазы A. flavus экстрактивной и очищенной (полученной в примере 4).
ѕептидна€ карта.
ѕептидна€ карта после переваривани€ трипсином была получена дл€ очищенной рекомбинантной уратоксидазы и дл€ очищенной экстрактивной уратоксидазы, описанной в примере 4, при следующих услови€х.
√отовитс€ раствор уратоксидазы в концентрации около 1 мг/мл и одномоментно раствор трипсина с концентрацией 1 мг/мл. ќба раствора соедин€ютс€ в пропорции энзим/субстрат как 1/30 и инкубируютс€ в течение 8 ч при комнатной температуре. “рипсиновый гидролизат затем подвергаетс€ ∆’¬ƒ с обратной фазой на колонке с привитым кремнием C 18,5 μм m, lichrosorb (250 · 4,6 мм) (Hichrom-ref RP18-5-250 A), снабженной детектором ”‘ на 218 нм, соединенным с регистрирующим устройством. ѕрилагаетс€ градиент от 1% ацетонитрила /“‘” до 60% ацетонитрил/“‘” за 120 мин, затем разделение поддерживаетс€ при 60% в течение 5 мин. ѕолученные пептидные карты весьма сходны между собой.
ќпределение блокирующего характера аминоконцевой структуры.
јминоконцева€ структура была проанализирована с помощью секвенатора Applied Biosystems модели 470ј, снабженного анализатором фенилтиогидантоиновых остатков Applied Biosystems модели 120ј. ќчищенна€ рекомбинантна€ уратоксидазы (200 рмоль) была помещена в секвенатор в присутствии 20 рмоль β - лактоглобулина (белок контрол€).
јминоконцева€ структура, соответствующа€ структуре уратоксидазы, не была определена (аминоконцева€ структура белка контрол€ определ€лась).
“аким образом, рекомбинантна€ уратоксидаза, как и экстрактивна€, имеет заблокированный N=конец.
ѕример 16.  онструирование вектора p SV 860 дл€ экспрессии кƒЌ  уратоксидазы в животных клетках.
Ётот вектор был получен путем лигировани€ малого фрагмента AccI-SnaBI, содержащего кодирующую ƒЌ  дл€ уратоксидазы, за исключением 16-ти первых аминокислот, вз€того из плазмиды p466 (экспрессионный вектор уратоксидазы A. flavus дл€ E. coli), с синтетическим фрагментом Hind III AccI с получением фрагмента Hind III Sna I, содержащего полную структуру, кодирующую уратоксидазу A. flavus и нетранслируемый 5'-конец, способствующий экспрессии в животных клетках; инсерции фрагмента Hind III SnaBI между сайтами Hind III и SnaBI множественного сайта клонировани€ вектора экспрессии дл€ животных клеток pSE1.
Ќиже последовательно рассмотрено конструирование плазмиды p466, плазмиды pSE1 и сборка плазмиды pSV860.
 онструирование плазмиды p466 и ее структура были детально описаны выше, в примере 7.
 онструирование экспрессионного вектора pSE, дл€ животных клеток.
¬ работе были использованы фрагменты, полученные из известных плазмид и фрагменты, приготовленные синтетическим путем с помощью широко используемых в насто€щее врем€ методов. »спользованные технологии клонировани€ описаны (J. Maniatis, E.F.Fritsch et J. Sambrook b "Molecular Cloning, a Zaboratcry Manual" (Cold Spring Harbor Zaboratory, 1984). —интез олигонуклеотидов был осуществлен при помощи синтезатора ƒЌ  Bioscarcr 4600.
—ледующее ниже описание станет более пон€тным при обращении к фиг. 15, на которой представлена карта сборки плазмиды pSE1 (сайты, исчезнувшие при лигировании, заключены в скобки). »спользованные на фиг. 15 символы будут объ€снены ниже.
ѕлазмида была сконструирована путем последовательного лигировани€ следующих элементов:
фрагмента PVU II PVU II размером 2,525 кв (обозначен на фиг. 15) полученного полным расщеплением плазмиды pTZ18R (PHARMACIA) при помощи PVU 1. Ётот фрагмент содержит источник репликации фага FI (обозначен ORIF1 на фиг. 15), ген (обозначен AmpR на фиг. 15) устойчивости к ампициллину и источник репликации ORi pBR 322 на фиг. 15), обеспечивающий данной плазмиды в E.cjli. ѕервый сайт PVU II исчезает при лигировании со свободным сайтом EcjRV (также исчезающим) фрагмента, описанного в 7).
фрагмента PVU II Hpa I размером 1,060 kb (обозначен 00000 на фиг. 15) ƒЌ  аденовируса типа 5 между позици€ми 11299 (сайт рестрикции PVU II) и 10239 (сайт рестрикции HpfI) (Dekker * Van Ortondt, Gene, 27, 1984, 115-120), содержащий последовательности ƒЌ  VA-I и VA II. —вободный сайт HpaI исчезает при лигировании со свободным сайтом PVU II (также исчезающим) фрагмента, описанного в 3).
фрагмента PVU II Hind III (размером 0,344 kb) (обозначен на фиг. 15 ), полученный из ƒЌ  вируса SV40 после полной рестрикции. Ётот фрагмент содержит источник репликации и ранний промотор вируса SV40 (B.J. Byrne et al. PNAS, USA (1983), 80, 721-725).
—айт Hind III исчезает при лигировании с лигирующим сайтом фрагмента, описанного в 4).
синтетического фрагмента сайта, лигирующегос€ с Hind Hind III размером 0,419 kb (обозначен на фиг. 15 ==== ),
структура которого представлена в последовательности 16, примыкающего к 5' нетранслируемой области вируса HTLVI (Weiss et al. "Molecular Biology of Tomor Viruses part 2-2e ed. 1985 Cold Spring Habor Zaboratory, p, 1957).
синтетического фрагмента Hind III " сайт лигировани€ Bam HI" (обозначен на фиг. 15), содержащего промотор PHK-полимеразы фага T7, а также полилинкер, включающий сайт клонировани€ Sma II (см. последовательность 17),
фрагмента BamHI BcII размером 0,24 kb (обозначен ) на фиг. 15) - малого фрагмента, полученного после полного перевара ферментами BcII и Bam HI вируса SV40, содержащего сайт полиаденилировани€ последнего. (M.Fitzgerald et al. Cell, 24, 1981, 251-260). —айты BamHI и Bc II исчезают после лигировани€ с соответствующим сайтом лигировани€ Bam HI фрагмента, описанного в 5) и сайтом Bam HI (также исчезающего из фрагмента, описанного в 7).
фрагмента Bam HI-EcoRI размером 0,19 kb (обозначен на фиг. 15)-малого фрагмента, полученного из плазмиды pBR322 после полного перевара ферментами EcoRI и BamHl.
 онструирование плазмиды pSV 860.
ѕлазмида p466 (фиг.11) была подвергнута полному расщеплению ферментами Acc 1 и Sma B1. ћалый фрагмент Acc1 Sna B1, содержащий последовательность ƒЌ , кодирующую уратоксидазу, за исключением первых 16 аминоконцевых кислот, был очищен и лигирован с синтетическим фрагментом Hind III Accl в последовательность 18.
Ёто легирование позвол€ет получить фрагмент Hind III SmaBI, содержащий последовательность, кодирующую уратоксидазу, идентичную таковой клона 9C и нетранслируемую 5'-последовательность, способствующую экспрессии в животных клетках (Kojak M. Nucl. Acids Res. 12, 2, 1984, 857 872).
‘рагмент Hind III Sna BI имеет структуру, характеризуемую последовательностью 19.
‘рагмент Hind III Sna BI вводитс€ затем в вектор pSE1, предварительно инкубированный с ферментами Hind III и SmaI. ѕолученна€ таким образом плазмида pSV 860 представлена на фиг. 16, имеющим те же обозначени€, что и фиг. 15; новый фрагмент Hind III Sna BI был

обозначен (сайты Sna BI и Sma I исчезли при лигировании).
ѕример 17. Ёкспресси€ кƒЌ  уратоксидазы в клетки COS.
ќпределение активности уратоксидазы в лизате клеток.
 летки COS €вл€ютс€ клетками почек обезь€ны, вырабатывающими антиген T к вирусу SV 40 (Gluman, J. Cell, 23, 1981, 175 182). Ёти клетки осуществл€ют репликацию векторов, содержащих источник репликации ƒЌ  вируса SV 40.
“рансфекци€ клеток COS и экспресси€ кƒЌ  уратоксидазы. 4х105 клеток COS нанос€тс€ на чашку ѕетри диаметром 6 см (Corning) в 5 мл среды Dulbecco, называемой далее DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium de Gibco), котора€ содержит 0,6 г/л глутамина, 3,7 г/л MaHCO3 и дополнена фетальной сывороткой теленка (GIBCO) из расчета 5% ѕосле примерно 16 ч культивировани€ при 37oC в атмосфере, содержащей 5% двуокиси углерода, среда культивировани€ удал€лась, а клетки промывались 3 мл буфера PSB (фосфатно-солевой буфер). «атем туда добавл€ли следующую смесь: 1000 μл (DMEM + 10% GIBCO), 110 μл диаэтиламиноацетилдекстрана средней молекул€рной массы 500 000 с концентрацией 2 мг/мл (PHARMACIA), 1,1 μл 100 мм хлороквина (Sigma) и 3 μг ƒЌ  или плазмиды pSV 860, или плазмиды pSE1 (дл€ контрол€). ѕосле 5 ч инкубации при 37oC в атмосфере, содержащей 5% двуокиси углерода, смесь отдел€лась от клеток. ƒалее добавл€ли 2 мл буфера PSB, содержащего 10% диметилсульфоксида (спектроскопического качества, Merck). ѕосле 1 мин инкубации при комнатной температуре смесь отдел€лась, а клетки 2 раза промывались буфером PSB. «атем добавл€ли 5 мл DMEM, GIBCO из расчета 2% »нкубаци€ продолжалась 4 дн€ при 37oC в атмосфере, содержащей 5% двуокиси углерода.
ѕодготовка образцов.
—реда культивировани€ отсасывалась, а клетки COS 2 раза промывались 3 мл буфера PSB.  летки затем собирали путем соскабливани€ резиновым шпателем ("Policeman") в 1 мл буфера PSB. ѕосле соскабливани€ чашка промывалась 1 мл буфера PSB. ќбе клеточные суспензии соедин€ли и центрифугировали 10 мин при 10000 об/мин. Ќадосадочную жидкость удал€ли, а осадок клеток суспендировали в 1 мл триэтаноламинового буфера (“Ёј), 0,05 ћ, pH 8,9 / Ёƒ“ј.
 летки лизировались озвучиванием на льду циклами по 10 с от источника звука (le Vibra Cell de Sonics and Materials Inc. USA), установленного на мощность 12 W.  леточный лизат центрифугировалс€ 10 мин при 10000 об/мин, надосадочную жидкость собирали дл€ определени€ уратоксидазы.
ќпределение уратоксидазной активности.
»змерение уратоксидазной активности проводилось по описанию примера 9.
–езультаты приведены в табл. 14.
ќпределено, что клетки COS, трансфецированные носителем кƒЌ  уратоксидазы плазмидой pSV 860, вырабатывают примерной равный природной уратоксидазе уровень активности, в то врем€ как в контроле никакой уратоксидазой активности не обнаружилось. Ќиже приведены последовательности 1 19.
‘ормула изобретени€: 1. ѕолипептид, обладающий уратоксидазной активностью, полученный путем культивировани€ штаммов, трансформированных рекомбинантными плазмидными ƒЌ , содержащими фрагмент ƒЌ  уратоксидазы, кодирующий следующую аминокислотную последовательность ј, приведенную на с. 314, которой необ€зательно предшествует метионин, со специфической уратоксидазной активностью по крайней мере 16 ед/мг, с молекул€рной массой 33,5 кд и изоэлектрической точкой, близкой к 8,0.
2. ѕолипептид по п.1, отличающийс€ тем, что он обладает специфической уратоксидазной активностью 30 ед/мг.
3. ѕолипептид по п.1 или 2, отличающийс€ тем, что он имеет степень чистоты, определенную путем жидкостной хроматографии на колонке с — 8-привитым силикагелем, выше 80%
4. ѕолипептид по любому из пп.1 3, отличающийс€ тем, что он содержит блокирующую группу, предпочтительно молекул€рной массы, близкой к 43 единицам атомной массы, на аминоконцевом серине.
5. ‘рагмент ƒЌ , обеспечивающий экспрессию полипептида, обладающего уратоксидазной активностью, в клетках Escherichia coli и имеющий следующую нуклеотидную последовательность Ѕ, приведенную на с.314.
6. ¬ектор экспрессии р 466, содержащий:
фрагмент ƒЌ  по п.5;
большой фрагмент Nde I Hind III векторной плазмиды – 373.2, содержащей ген резистентности к ампициллину и область начала репликации плазмиды pBR 322;
фрагмент Bam H I Hind III векторной плазмиды р 373.2;
синтетический фрагмент Hind III KPn I с последовательностью —, приведенную на с.315;
фрагмент Kpn I Acc I из клона 9—;
синтетический фрагмент Acc I Nde I с последовательностью ƒ;
фрагменты Nde I Hinc II; Hinc II Xho I; Xho I Pvu I; Pvu I Pst I и Pst I BamH I векторной плазмиды р. 373.2.
7. Ўтамм Escherichia coli K12RR1/p 466, продуцирующий полипептид, обладающий уратоксидазной активностью.
8. ‘рагмент ƒЌ , обеспечивающий экспрессию полипептида, обладающего уратоксидазной активностью, в клетках дрожжей, и имеющий следующую нуклеотидную последовательность ≈, приведенную на с.315.
9. ¬ектор экспрессии pEMR 515, содержащий:
фрагмент ƒЌ  по п.8;
фрагмент Xba I MI и I векторной плазмиды PEMR 473, несущий источник репликации локус STB величиной 2 μ, ген LEU 2d, ген резистентности к ампициллину и область начала репликации плазмиды pBR 322 с рециркул€ризованной адаптором последовательностью

10. Ўтамм дрожжей Saccharomuces cerevisiae CNSM 1 920, продуцирующий полипептид, который обладает уратоксидазной активностью.
11. Ўтамм дрожжей Saccharomyces cerevisial CNCM 1 919, продуцирующий полипептид, который обладает уратоксидазной активностью.
12. ‘рагмент ƒЌ , обеспечивающий экспрессию полипептида, обладающего уратоксидазной активностью, и имеющего при культивировании в COS клетках следующую нуклеотидную последовательность F, приведенную на с.316.
13. ‘рагмент ƒЌ  по п.12, отличающийс€ тем, что ’ 0 или ’ AGC TTG CCG CCACT.
14. ¬ектор акспрессии psV 860, содержащий:
фрагмент ƒЌ  по п.12 или п.13;
фрагмент Acc I SnaBI векторной плазмиды р 466;
синтетический фрагмент Hind III ACC I с последовательностью:

фрагмент Hind III Sma I векторной плазмиды pSE I, несущей источник репликации фага fI, ген резистентности к ампициллину и сточник репликации плазмиды pBR 322.
15. Ўтамм культивируемых животных клеток COS I p SV 860, продуцирующий обладающий уратоксидазной активностью полипептид.
16. —пособ получени€ полипептида с уратоксидазной активностью, предусматривающий культивирование штамма продуцента вышеуказанного полипептида, выделение и очистку целевого продукта, отличающийс€ тем, что в качестве продуцента используют штамм по пп.7, 10, 11 или 15.