Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
СПОСОБ СТАНДАРТИЗАЦИИ ХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА (ВАРИАНТЫ), НАБОР ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ СТАНДАРТИЗАЦИИ АТФ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО АНАЛИЗА
СПОСОБ СТАНДАРТИЗАЦИИ ХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА (ВАРИАНТЫ), НАБОР ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ СТАНДАРТИЗАЦИИ АТФ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО АНАЛИЗА

СПОСОБ СТАНДАРТИЗАЦИИ ХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА (ВАРИАНТЫ), НАБОР ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ СТАНДАРТИЗАЦИИ АТФ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО АНАЛИЗА

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Облучают фоточувствительное производное анализируемого вещества вспышкой видимого света определенной длины и интенсивности. При этом измеряют количество выделившегося анализируемого вещества. Измеренное количество используют в качестве стандарта. Использование изобретения позволяет повысить точность анализа. 4 с. и 19 з.п.ф-лы, 4 ил., 2 табл.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2135586
Класс(ы) патента: C12Q1/66, G01N33/96
Номер заявки: 96121570/13
Дата подачи заявки: 06.04.1995
Дата публикации: 27.08.1999
Заявитель(и): БИ-АР-ЭФ Интернешнл (GB)
Автор(ы): Симпсон Уильям Джон (GB); Пай Джулиан Марк (GB)
Патентообладатель(и): БИ-АР-ЭФ Интернешнл (GB)
Описание изобретения: Изобретение относится к способам калибровки химических анализов и, в частности, но не исчерпываясь этим, к способу калибровки анализов особоважных веществ в аналитической микробиологии, например, калибровки анализа на аденозин 5'-трифосфат (АТР).
Точное обнаружение и количественное определение отдельных веществ или микроорганизмов в аналитических целях являются необходимыми лабораторными методами. Определение и измерение количества загрязняющих веществ или загрязняющих микроорганизмов в целях контроля продукта или процесса или безопасности пищевых продуктов имеют первостепенную важность в пищевой промышленности и при производстве напитков. Оценка микробиологической массы важна также в ряде других прикладных областей, включая переработку отходов, мониторинг процессов стерилизации и контроль качества воздуха. В многих случаях целесообразно иметь возможность оценивать степень микробиологического или химического загрязнения за возможно более короткий период времени.
Для определения и измерения количеств интересующих веществ пригодны многочисленные методы анализа, например ферментативные анализы, анализы ферментов, связывающих иммуносорбент (ELISA), спектрофотометрические анализы, люминесцентные анализы, флуоресцентные анализы, хроматографические анализы, анализы, основанные на измерении изменения плоскости поляризации света, производимой испытуемым образом, ион-селективные анализы (включая титриметрические анализы) и колориметрические анализы. Конкретный способ анализа, используемый в том или ином случае, зависит от аналитического вещества, которое необходимо определить и количественно измерить.
Существенным является то, что конкретный выбранный способ анализа должен быть настолько точным и воспроизводимым, насколько это возможно. Для достижения максимальной точности таких анализов важным является стандартизация или калибровка этого анализа. Целый ряд факторов может влиять на анализируемую реакцию и может порождать источники ошибок, поэтому влияние этих факторов должно быть минимизировано или учтено.
Известны способы стандартизации, в которых используют радиоактивные изотопы для стандартизации скорее контрольно-измерительной аппаратуры, чем собственно анализа (per se). Примером такой стандартизации с помощью радиоактивных изотопов является световой эталон Biolink Light Standard [1]. Такие эталоны основаны на активированных газообразным тритием люминофорах, испускающих свет в определенном спектральном диапазоне и обладающих предсказуемым послесвечением при длительном хранении. Такие приборы служат только как вспомогательные при калибровке самих фотометров.
В равной степени важно то, что анализ per se также откалиброван или стандартизован так, что могут быть учтены отклонения в образце и в составе реагентов.
Например, аденозин 5'-трифосфат (АТФ) является важным аналитическим веществом в микробиологических анализах. АТФ находят в живых клетках, но не в мертвых, и его присутствие в образце может быть индикатором микробиологического загрязнения.
Одним широко используемым способом проведения анализа на присутствие АТФ является способ биолюминесценции. В присутствии очищенного фермента (люциферазы), полученного от американского жука-светлячка, Photinus pyralis, подложки, D-люциферина и достаточного количества ионов магния и растворенного кислорода имеет место следующая реакция

(АТФ = аденозин 5'-трифосфат; Mg - ионы магния; O2 -кислород; АМФ = аденозин 5'- монофосфат; PPi - неорганический фосфат; CO2 - двуокись углерода).
При соответствующих условиях количество света, испущенного во время реакции, прямо пропорционально концентрации АТФ и может быть зарегистрировано чувствительным фотодетектором. Это является основой АТФ-биолюминесцентного анализа.
Анализы на присутствие АТФ, использующие реакцию с люциферазой жука-светлячка, могут быть калиброваны двумя способами [2].
В соответствии со способом внешней калибровки выход света, испущенного в реакции реагента на основе люциферазы жука-светлячка с образцом, может быть сравнен со светом, полученным от реакции реагента на основе люциферазы жука-светлячка с известным количеством АТФ, с помощью калибровочной кривой.
Хотя этот способ удобен и требует минимума манипуляций с реагентами, он также подвержен ошибкам. Это происходит вследствие того, что вывод света от реакций с люциферазой жука-светлячка непосредственно связан со скоростью реакции. Несмотря на то, что концентрация АТФ действительно дает основной вклад в управление скоростью реакции, она не является единственным определяющим фактором. Ингибиторы, присутствующие в образце (например, ионы металлов, ионы водорода) могут уменьшать скорость реакции, а стимуляторы, такие как очищающие вещества (детергенты), могут увеличивать скорость реакции [3]. Кроме этого, активность, присущая самому реагенту на основе люциферазы жука-светлячка, сможет варьироваться из-за непостоянных условий при производстве или в процессе работы. Даже тогда, когда на скорость реакции ничто не влияет, в реакционной смеси могут присутствовать вещества, которые в значительной степени поглощают произведенный свет, приводя, таким образом, к ошибке. Некоторые вещества, особенно Zn2+, в дополнение к уменьшению каталитической активности люциферазы жука-светлячка изменяют также длину волны света, произведенного в реакции. Это может вызывать уменьшение количества детектируемого некоторыми типами фотометров света [4], испускаемого в реакции.
Все эти источники ошибок могут быть устранены, если отказаться от подхода, связанного с эталонной кривой, в пользу способа внутренней стандартизации. В своем простейшем виде этот способ включает добавление известного количества АТФ, содержащегося в малом объеме жидкости, к инициированной реакции с люциферазой жука-светлячка. Выход света от образца с одной люциферазой и от образца с люциферазой и АТФ сравнивается и затем рассчитывается содержание АТФ в образце. Этот способ освобождает оператора от анализа ошибок, связанных с непостоянным составом образца.
Например, в заявке ЕР 0309429 A2, C 12 Q 1/66, 1984 предложен способ химического анализа, включающий измерение величины исследуемой в анализе характеристики, связанной с количеством анализируемого вещества, в частности, предложен способ АТФ-биолюминесцентного анализа, включающий смешивание исследуемого образца, содержащего АТФ, с реагентом, содержащим люциферазу-люциферин жука-светлячка, и измерение света, испускаемого полученной смесью. Предложен также набор для проведения АТФ-биолюминесцентного анализа.
Основой этого способа, однако, является использование стабильного эталонного раствора АТФ. Ведется много споров относительно стабильности таких эталонных растворов АТФ. Некоторые исследователи заявляют, что такие разбавленные растворы АТФ нестабильны и не должны подвергаться воздействию света и/или храниться во льду. Проблемы также могут возникнуть из-за плохого обращения с раствором. Несомненно наибольшую угрозу стабильности эталонных растворов АТФ представляет присутствие загрязняющих микроорганизмов в растворе. АТФ быстро утилизируется многими микроорганизмами [5], и, следовательно, их устранение из эталонных растворов АТФ является существенным. Стерильность оборудования является обязательной. Хотя предварительно взвешенные ампулы с АТФ могут быть куплены у некоторых производителей, специализирующихся на выпуске люминесцентных реагентов, их использование не является широко распространенным вследствие этих отмеченных ограничений. Эти проблемы становятся еще более важными, когда АТФ-биолюминесцентные анализы применяются в критических с точки зрения безопасности областях, таких как контроль чистоты продуктов и качества воздуха.
Несмотря на то, что проблемы стандартизации анализа проиллюстрированы с помощью АТФ-биолюминесцентного способа, они в равной степени относятся и к другим способам анализа.
Задачей настоящего изобретения является решение проблем стандартизации химических анализов, в частности, путем использования способа внутренней фотостандартизации.
Указанная задача решается тем, что в способе стандартизации химического анализа, включающем измерение величины исследуемой в анализе характеристики, связанной с количеством анализируемого вещества, осуществляют добавление к исследуемому образцу заранее определенного количества фоточувствительного производного анализируемого вещества с последующим измерением величины исследуемой в анализе характеристики, связанной с количеством анализируемого вещества, облучение смеси образец/фоточувствительное производное вспышкой видимого света заранее определенной длительности и интенсивности для освобождения из фоточувствительного производного известного количества анализируемого вещества, повторное измерение величины исследуемой характеристики, расчет изменения в измерениях величины исследуемой характеристики и использование значения в качестве стандарта для определения количества анализируемого вещества, исходно присутствующего в образце.
Задачей настоящего изобретения также является решение проблемы стандартизации химических анализов с помощью процедуры фотокалибрационных серий.
Указанная задача решается тем, что в способе стандартизации химического анализа, включающем измерение величины исследуемой в анализе характеристики, связанной с количеством анализируемого вещества, осуществляют облучение заранее определенного количества фоточувствительного производного анализируемого вещества вспышкой видимого света заранее определенной длительности и интенсивности для освобождения из фоточувствительного производного известного количества анализируемого вещества с последующим измерением величины исследуемой в анализе характеристики, связанной с количеством анализируемого вещества, использование полученного значения в качестве стандарта, с которым сравнивают результаты анализа образца.
Предпочтительно до стадии фотолиза иметь фоточувствительное производное в растворе, хотя при некоторых обстоятельствах может быть желательным использование фоточувствительного производного в высушенном состоянии.
В случаях, когда желательна процедура многоточечной калибровки, интенсивность и/или длительность вспышки видимого света при повторении операции облучения с последующим измерением величины исследуемой характеристики может варьироваться таким образом, чтобы компенсировать уменьшение количества фоточувствительного производного, пригодного для фотолиза.
Кроме того, задачей настоящего изобретения является способ стандартизации АТФ-биолюминесцентного анализа.
Указанная задача решается тем, что в способе стандартизации химического анализа путем смешивания исследуемого образца, содержащего АТФ, с реагентом, содержащим люциферазу-люциферин жука-светлячка, и измерением света, испускаемого полученной смесью, дополнительно осуществляют предварительное введение заранее определенного количества фоточувствительного производного АТФ в реагент люцифераза-люциферин жука-светлячка, измерение света, вызываемого возникающей реакцией, сопровождающейся люминесценцией, облучение смеси образец/реагент вспышкой видимого света заранее определенной длительности и интенсивности для освобождения из фоточувствительного производного известного количества АТФ, повторное измерение света, вызываемое возникающей реакцией, сопровождающейся люминесценцией, расчет изменения в измерениях эмиссии света, и использование рассчитанного значения в качестве стандарта для определения количества АТФ, исходно присутствующего в образце.
Настоящий способ, нерадиоактивный, использующий методику фотостандартизации, обладает преимуществами перед существующими до этого способами стандартизации в отношении (1) точности и правильности результатов; (2) проверки результатов и (3) удобства для пользователя.
Кроме того, задачей настоящего изобретения является набор для проведения стандартизации АТФ-биолюминесцентного анализа.
Указанная задача решается тем, что предложен набор для проведения стандартизации АТФ-биолюминесцентного анализа, включающий фоточувствительное производное АТФ и реагент люцифераза-люциферин жука-светлячка.
Повышенная точность является результатом устранения ошибок, связанных с добавлением стандартного аналитического вещества с помощью пипетки, и компенсации любых изменений в оптическом или каталитическом тушении, связанном с разбавлением образца. Возможность использования простой обоснованной схемы стандартизации должна вероятно дать выигрыш в виде облегчения проверки результатов, что имеет значение в отношении законодательства в области продовольствия и стандартов и некоторых критических с точки зрения безопасности применений. Повышенное удобство для пользователя является результатом того, что для осуществления такого анализа нет необходимости в отдельном стандартном растворе аналитического вещества. Более того, стандартизация анализа может быть полностью независима от способа обнаружения или количественного определения интересуемого аналитического вещества.
Для использования в физиологических исследованиях было создано множество биологически интересных синтетических соединений, в которых присутствует фоточувствительная химическая связь. Когда одно из этих соединений подвергается действию короткой вспышки света большой интенсивности, освобождается продукт реакции. Фоточувствительное соединение, из которого может освободиться интересующая молекула или ион, называется соединением - "иммобилизатором". Следовательно, АТФ освобождается из "Иммобилизатора" АТФ, Ca2+ освобождается из "иммобилизатора" Ca2+ и так далее. Такие фоточувствительные производные аналитического вещества удобны для целей настоящего изобретения, и их использование вместе с лампой-фотовспышкой высокой интенсивности или лазера, работающего в режиме модулированной добротности и удаления частоты, обеспечивает удобные и не требующие вторжения способы стандартизации и химического анализа. Обнаружение того, что коммерчески доступные лампы-фотовспышки могут давать эффективное освобождение молекул аналитического вещества из исходного вещества-"иммобилизатора", было ранее неизвестно.
В соответствии с первым предпочтительным способом осуществления настоящего изобретения предварительно определенное количество соединения-иммобилизатора может быть добавлено к анализируемому образцу или к буферному раствору, используемому для разбавления исследуемого образца. Затем измеряют конкретную анализируемую характеристику. Измеряемая в ходе анализа тестовая характеристика зависит от рассматриваемого анализа, это может быть, например, излучаемый свет, выделенное тепло, изменение цвета или другие характеристики.
Затем заранее заданное количество свободного соединения освобождается из иммобилизованного соединения путем экспозиции смеси вспышкой света заранее определенной интенсивности и длительности. Тестируемая характеристика может быть измерена повторно, и изменение значений тестируемой характеристики может быть рассчитано. Рассчитанное значение может быть затем использовано в качестве стандарта для определения количества аналитического вещества, изначально присутствующего в образце.
Альтернативно, в другом предпочтительном способе настоящего изобретения интервал стандартных концентраций рассматриваемого соединения может быть получен варьированием степени фотолиза в одном концентрированном растворе иммобилизованного соединения. Таким образом могут быть приготовлены калибровочные серии, например, на микротитровой пластине без использования пипетки для приготовления различных объемов стандартных растворов аналитического вещества. В соответствии с этой схемой для тестовых анализов можно было бы следовать общепринятой процедуре анализа, однако в отдельных анализах стандартизацию можно осуществить путем фотолиза иммобилизатора аналитического вещества перед проведением самого анализа.
Соответственно, этот общий метод фотостандартизации может быть использован с широким набором методов анализа, включая анализы фермента, связывающего иммуносорбент (ELISA), ферментативные анализы, спектрофотометрические анализы, флуоресцентные анализы, анализы, основанные на измерении изменений вращения плоскости поляризации света тестируемого образца, ион-селективные анализы (включая титриметрические анализы) и колориметрические анализы.
В случаях, когда требуется максимально возможная точность и тщательность тестовых процедур, может потребоваться выполнение многоточечной калибровки, а не одноточечной калибровки. Это может быть достигнуто получением калибровочных серий путем проведения раздельного фотолиза в различных концентрированных растворах одного иммобилизованного соединения (в идеальном случае на микротитровой пластине или ее эквиваленте). Варьируя степень фотолиза, например, применяя одну, две, три или четыре вспышки заранее определенной интенсивности и длительности, получают набор калибровочных стандартов.
Однако этот подход не пригоден там, где измерение и калибровка должны осуществляться в одной и той же пробирке, не влияя друг на друга, и где аналитическое вещество должно присутствовать на особом шаге проведения анализа, таким как начало процедуры анализа. Возможно, однако, осуществление многоточечной калибровки некоторых анализов, в которых используется одна пробирка, таких как АТФ-биолюминесцентный анализ. Эта возможность появляется в результате того, что такие процедуры анализа пригодны до момента, когда аналитическое вещество освобождается в тестируемый раствор. При некоторых обстоятельствах многоточечная калибровка анализов с одной пробиркой может превосходить с точки зрения правильности и точности одноточечную калибровку этих тестов.
Предлагая такие процедуры важно оптимизировать соотношения между общим количеством иммобилизованного материала, принимающего участие в фотолизе, и интенсивностью источника света. В случае анализов, которые стандартизируются с помощью одноточечной процедуры калибровки, желательно использовать в реакции как можно меньшее количество материала-иммобилизатора и максимизировать превращение иммобилизованного материала в аналитическое вещество, используя свет с интенсивностью, достаточной для освобождения > 50% аналитического вещества из иммобилизованного материала. Однако в случае анализов, которые следует стандартизировать посредством многоточечной калибровки, важно ограничить превращение иммобилизатора аналитического вещества в свободное аналитическое вещество к первой стадии фотолиза, используя свет с интенсивностью, способной привести к освобождению только 1-2% аналитического вещества при облучении. Следовательно, чтобы быть уверенным, что освобождено достаточное количество аналитического вещества, полная концентрация иммобилизованного материала, участвующего в анализе, должна быть выше, чем в случае реагентов, созданных для использования с одноточечными калибровками.
При использовании световых вспышек фиксированной интенсивности и длительности количество аналитического вещества, освобожденного с каждой последующей вспышкой, уменьшается. Варьируя интенсивность и/или длительность вспышки, возможно компенсировать уменьшение количества иммобилизованного материала, участвующего в фотолизе, что приводит тем самым к образованию одинаковых количеств аналитического вещества на каждой стадии и дает линейные калибровочные серии.
На практике количество аналитического вещества, освобождаемого при стандартных условиях фотолиза, может быть определено с помощью отдельно приготовленной стандартной кривой, полученной с использованием непроизводной формы аналитического вещества. Концентрация фоточувствительного аналитического вещества в реакции может быть выбрана такой, чтобы высвободить определенное количество аналитического вещества, или для получения того же результата может быть выбрана интенсивность и/или длительность световой вспышки.
Некоторые материалы фосфоресцируют при облучении вспышкой света высокой интенсивности, такие как полученные с применением ламп вспышек. Интенсивность такой фосфоресценции зависит от материала. В анализах, в которых оценки концентрации аналитического вещества производятся с помощью измерения испущенного света (например, анализы, основанные на биолюминесцении, хемилюминесценции и флуоресценции), фосфоресценция является источником помех. Способы минимизации или корректировки такого вмешательства включают в себя следующие (заметим, что одновременно может быть использовано более одного пути).
Первый путь состоит во введении запаздывания по времени между временем фотолиза и временем измерения. Логарифм интенсивности фосфоресценции уменьшается пропорционально логарифму прошедшего времени. В результате оказывается достаточным промежутка времени в несколько секунд для уменьшения измеренной эмиссии света до значения, которое приемлемо для многих типов анализов.
Второй путь состоит или в фильтрации света, используемого для облучения образца (или использование монохроматического света, такого, например, как от лазерного источника), или в фильтрации света, испущенного материалом кюветы. Оба пути могут быть одинаково эффективными в зависимости от используемых материалов.
Третий путь заключается в отборе материалов, которые обладают низким потенциалом возбуждения фосфоресценции при их облучении в соответствии с процедурой фотостандартизации.
Материалы, используемые в обычной лаборатории, значительно различаются по своим характеристикам при облучении стандартым источником полихроматического света в виде лампы фотовспышки.
Еще одним путем является корректировка результата, полученного после фотолиза для света, испускаемого в результате фосфоресценции. Это может быть достигнуто с использованием электронного вычислительного устройства при условии, что (1) известна собственная фосфоресценция материала, (2) материалы отобраны так, чтобы удовлетворить стандартным требованиям спецификации, и (3) стандартизировано время, в которое проводятся измерения после облучения светом.
Большинство иммобилизованных материалов, коммерчески доступных, либо произведенных в лаборатории с использованием известных способов, загрязнены в большей или меньшей степени "неиммобилизованными" продуктами. Присутствие "неиммобилизованных" продуктов должно быть уменьшено до технически незначительных уровней для того, чтобы оптимальным образом реализовать методику фотостандартизации. В случае иммобилизатора АТФ загрязняющие молекулы АТФ должны быть устранены (превращены в АДФ и АМФ, которые не реагируют с люциферазой жука-светлячка) путем осуществления взаимодействия иммобилизатора АТФ с ферментом расщепления АТФ, таким как апираза в растворенной или фиксированной форме. Иначе, реагент люциферин-люцифераза, содержащий АТФ-иммобилизатор, может выдерживаться в течение 8-10 часов или больше при 4oC. В течение этого времени люцифераза жука-светлячка катализирует гидролиз АТФ, но не влияет на уровень мобилизованного АТФ. АТФ также может быть удален с использованием любого из известных в настоящее время способов препаративной химии, включая хроматографию, избирательное осаждение или экстракцию. Сходные способы могут быть использованы для обработки иммобилизованных форм других аналитических веществ перед использованием их для фотостандартизирующих анализов, в которых часто применяются методы, которые в большинстве случаев известны.
В некоторых случаях может быть желательной более высокая степень чистоты материала-иммобилизатора. Например, в случае 1-(2-нитрофенил)этилового эфира АТФ коммерчески доступный материал состоит из пары диастереоизомеров, так как нитрофенильная группа, используемая в качестве фотонеустойчивого "иммобилизатора", может присоединиться к АТФ с образованием двух различных конфигураций. Хотя эти два стереоизомера обладают идентичными фотохимическими свойствами, в некоторых применениях использование только одного из них может дать преимущество. Например, взаимодействие каждого стереоизомера или, точнее, его способность образовывать комплексы с включениями компонентов реагентов, участвующих в анализе, таких как α-,β-,γ- циклодекстрин, будет различным для каждого стереоизомера. Некоторые коммерчески доступные реагенты люциферазы жука-светлячка содержат циклодекстрины (см. , например, [6]). Стереоизомеры иммобилизованных веществ могут быть отделены друг от друга с использованием известных способов.
Предполагается, что при некоторых обстоятельствах фиксированное количество иммобилизованного соединения может быть высушенным путем вымораживания на предметах, используемых для проведения анализа. Примеры таких предметов включают кончики пипеток одноразового пользования, одноразовые кюветы для образцов и одноразовые бумажные диски и ленты. Используемое иммобилизованное соединение, которое было высушено вымораживанием на этом предмете, растворяется при контакте с жидкостью, например исследуемым образцом или реагентом для анализа. Заранее заданное количество аналитического вещества может освободиться из молекулы-иммобилизатора в любое время под действием фотолиза как в случае, когда иммобилизованное соединение находится в высушенном состоянии, так и в случае, когда оно находится в растворе. Этот путь стандартизации особенно важен в случаях, когда иммобилизованное соединение не обладает требуемой стабильностью в водном растворе. В высушенном состоянии стабильность большинства иммобилизованных соединений по отношению к окислению заметно увеличивается.
В ферментативных анализах, таких, в которых аналитическое вещество превращается в другое соединение в результате ферментативной реакции, превращение аналитического вещества может сочетаться с уменьшением флавин нуклеотида, такого как никотинамид аденин динуклеотида, или с возникновением соединения, такого как АТФ. Иммобилизованная форма "вторичного" аналитического вещества (например, NADH или АТФ) может быть введена в реакционную смесь и высвобождена, при желании, с помощью фотолиза. В результате стандартизация таких анализов достигается без необходимости приготовления отдельных растворов стандартных материалов, позволяя экономить время и усилия оператора.
Примеры аналитических веществ, которые могут быть стандартизированы одним или большим числом вышеупомянутых путей, включают в себя АТФ, аденозин монофосфат (АМФ), циклический аденозин монофосфат (ЦАМФ), аденозин дифосфат (АДФ), гуанозин тифосфат (ГТФ), субстраты (подложки) для люминогенных реакций (такие, как D-люциферин), ингибиторы люминогенных реакций (такие, как L-люциферин), органические кислоты (такие, как щавелевая кислота), жирные кислоты (такие, как араходоновая кислота), аминокислоты (такие, как фенилаланин), сахара (такие, как глюкоза), фосфаты сахара (такие, как глюкоза-6-фосфат), пестициды (такие, как атразин), природные токсиканты (такие, как охратоксин А), антибиотики (такие, как бензилпенициллин) и фармакологически интересные соединения (такие, как допамин, норепинефрин, серотонин, тестостерон и интерферон). Этот перечень не претендует на то, чтобы быть исчерпаемым, и приведен с целью иллюстрации.
Были синтезированы различные фоточувствительные производные АТФ, способные освобождать АТФ. Одним из примеров таких АТФ-производных является нитрофеноловый эфир АТФ, содержащий фотогидролизуемую эфирную связь (фиг. 1). Другие представители этой группы соединений могли бы быть заменены нитрофенолом. Еще одним примером подходящего производного АТФ является 1-(4,5-диметокси-2-нитрофенил)-диазоэтан (ДМНФЭ).
Иммобилизованный АТФ был использован во множестве исследовательских приложений, относящихся к ряду областей, включающих в себя изучение биохимии мышц [7] . Ранее он не был предложен или применен для целей калибровки биохимических или микробиологических анализов.
Выход АТФ из АТФ-иммобилизатора, как было показано, не зависит от pH в диапазоне pH 6-9; более того, было показано, что захватчик АТФ удобен для работы, так как он растворим в воде при нейтральном pH и заметно не участвует в фотолизе под действием неяркого дневного света в течение нескольких минут [8].
Для того, чтобы прокалибровать АТФ биолюминесцентную реакцию в соответствии со способом, предлагаемым в настоящем изобретении, соединение иммобилизованного АТФ вводят в реагент люциферазы жука-светлячка в заранее определенной концентрации. Люцифераза жука-светлячка не проявляет какой-то каталитической активности по отношению к иммобилизованному АТФ (см. Пример 1) и, следовательно, без добавления АТФ не возникает излучения света от такого препарата люциферазы. Реагент может быть использован для проведения высокочувствительных анализов АТФ следующим образом:
Образец и реагент смешивают в одноразовой кювете фотометра. Образец может состоять из водной жидкости любого происхождения или может быть специально приготовленным "экстрактом", полученным как результат обработки любым из ряда агентов, созданных для освобождения АТФ из живых организмов. Свет, испускаемый при люминесцентной реакции, измеряют с помощью фотометра. Известное количество АТФ затем освобождается в реакционной смеси при облучении кюветы вместе с ее содержимым вспышкой видимого света высокой интенсивности, создаваемой, например, лампой фотовспышкой. Затем кювету опять помещают в фотометр и еще раз измеряют эмиссию света от реакции с участием люциферазы. Так как вспышка света вызывает освобождение известного количества АТФ из находящегося в кювете клеткообразного АТФ, количество света, отвечающего за присутствие этого известного количества АТФ, может быть рассчитано по разнице. Затем может быть рассчитано количество АТФ, исходно присутствующее в реакционной смеси.
Следующие примеры, не ограничивающие настоящее изобретение, описывают изобретение более подробно.
Пример 1. Использование иммобилизованного АТФ для стандартизации анализов на АТФ.
Иммобилизованный АТФ (Calblochem, США, прод. N 119127, 5 мг) был растворен в 0,5 мл стерильной деионизованной воды. Полученная исходная смесь хранилась охлажденной до - 20oC до момента использования. Перед использованием раствор разбавили в отношении 1:1000 стерильной деионизованной водой. К 3 мл коммерчески доступного реагента люцифераза-люциферин (реагент Biotrace ХТ, Biotrace Ltd., Bridgend, Великобритания) добавили 200 мкл исходного раствора иммобилизованного АТФ для получения контрольного реагента или 200 мкл концентрированного раствора иммобилизованного АТФ с образованием реагента иммобилизованного АТФ. Затем реагенты выдерживались в термостате при температуре 20oC в течение 1-6 часов.
В разные моменты времени после приготовления реагентов в чистую одноразовую кювету фотометра помещали стерильную деионизованную воду, к которой затем добавляли 100 мкл контрольного реагента или реагента иммобилизованного АТФ. Свет, испускаемый при протекании реакции, измеряли с помощью фотометра Biotrace M3 (Biotrace Ltd., Bridgend, Великобритания), который интегрировал световой сигнал в течение 10 сек после запаздывания в 2 сек. Затем раствор АТФ (10 мкл, 0,1 мкМ) добавляли к реакционной смеси и световой выход измеряли второй раз. Кювету вместе с ее содержимым подвергали затем действию интенсивной световой вспышки от импульсной лампы Hanimex 325A2 (Hanimex, Великобритания) и световой выход от реакции измеряли третий раз.
В таблице 1 представлены полученные значения светового выхода. Эти результаты показывают, что: (1) иммобилизованный АТФ не конкурирует с АТФ на активных центрах люциферазы жука-светлячка, как это видно из сходности полученных световых сигналов при добавлении 1 пикомоль АТФ к обоим реагентам (средние значения, n=5): 1302 отн.ед. при добавлении 1 пикомоля АТФ в отсутствие иммобилизованного АТФ и 1304 отн.ед. при добавлении 1 пикомоля АТФ в присутствии 95.2 пикомоля клеткообразного АТФ; (2) вспышка света высокой интенсивности не влияет на скорость реакции с участием люциферазы жука-светлячка, что подтверждает тот факт, что отклик реагента на добавление 1 пикомоля АТФ не меняется после облучения (1308 отн. ед. перед облучением, 1276 отн. ед. после облучения, разница может быть объяснена исключительно естественным уменьшением люминесценции, связанным с такими реакциями); (3) облучение реагента иммобилизованного АТФ вспышкой света высокой интенсивности приводит к увеличению содержания АТФ в анализе, эквивалентному 1.171 пикомоля АТФ на анализ. Анализы могут быть калиброваны на основе этого ответного сигнала. Калибровка анализов этим способом (по отношению к 1 пикомолю АТФ, добавленному к реакции) давала значение 1.00±0.08 пикомоля АТФ на анализ (среднее значение ± среднеквадратичное отклонение, n=5) с ошибками, случайно распределенными во времени. В случае контрольных анализов, стандартизованных с помощью стандартной кривой (используя данные, полученные с реагентом, приготовленным за 1 час до этого), было получено значение 0.93 ± 0.06 пикомоля АТФ на анализ с отдельными данными, показывающими заметное уменьшение по отношению ко времени с момента приготовления реагента (вследствие уменьшения каталитической активности люциферазы).
Будучи однажды введенным в реагент люциферазы, иммобилизованный АТФ мог освободить АТФ за счет самопроизвольного гидролиза в результате ферментативного действия, и/или за счет фотолиза. Результаты, приведенные в примере 1, показывают, что освобождение АТФ в соответствии с первыми двумя механизмами пренебрежимо мало и при облучении вспышкой света высокой интенсивности, даваемой лампой-вспышкой, АТФ быстро высвобождается из присутствующего иммобилизатора АТФ.
Замечания к таблице 1
1. Фотовспышка высокой интенсивности (производимая лампой-вспышкой Hanimex 325A2, Hanimex, Великобритания) не вызывает люминесценции ни от пустых кювет, ни от кювет, содержащих тестовые растворы, такие как вода или иммобилизованный АТФ, или реагенты люцифераза-люциферин при отсутствии иммобилизованного АТФ.
2. Из "фотостандарта" АТФ (иммобилизованного АТФ) высвобождалось 1.171 пикомоля АТФ на анализ при облучении фотовспышкой высокой интенсивности.
Это дает скорость превращения иммобилизованного АТФ, присутствующего в анализе, 1,23%.
3. Подобные результаты были получены при проведении анализов в присутствии АТФ экстрактанта на основе детергента (разбавитель красок (растворитель для отмывания кистей) ХТ, Biotrace Ltd., Bridgend, Великобритания) вместо воды в качестве матрицы образца, показывая тем самым, что этот способ стандартизации совместим с использованием таких реагентов.
Пример 2. Во втором эксперименте проводилась аналогичная серия анализов. В этих экспериментах контрольный реагент и реагент люциферин-люциферазы иммобилизованный АТФ перед использованием выдерживали в термостате в течение 6 часов. В качестве испытуемой смеси, к которой добавляли реагент перед введением АТФ и/или облучением светом, использовали стерильную деионизованную воду или смесь воды и 0.1 М буферного раствора натрий 3,3'-диметилглютарата (pH 4.00). Эти условия эксперимента были выбраны для получения ряда значений pH в окончательном анализе. Результаты таблицы 2 показывали, что в присутствии повышенных количеств буферного раствора световой выход от реакций с 1 пикомоля АТФ уменьшался. Таким образом, если применяли подход, основанный на стандартной кривой, и результаты относили к полученным с использованием воды в качестве матрицы образца, были очевидны существенные ошибки. В крайнем случае было получено значение 0.05 пикомоля АТФ на анализ, т.е. одна двадцатая правильной величины. Результаты, основанные на методике фотостандартизации, также имели ошибки, но намного меньшей величины.
Следующие данные показывают дополнительные преимущества способа фотостандартизации. Реагент люцифераза/люциферин, который содержал иммобилизованный АТФ, приготавливали добавлением иммобилизованного АТФ к реагенту Biotrace MLX (Biotrace, Великобритания) до концентрации, при которой каждые 100 мкл реагента содержали 43.1 пикомоля иммобилизованного АТФ (т.е. 431 наномоль/л). Этот реагент помещали в термостат при 4oC на всю ночь, чтобы уменьшить темновую светоэмиссию. Анализ проводили следующим образом. АТФ добавляли к серии ампул (1 пикомоль на ампулу в 10 мкл стерильной деионизованной воды), затем добавляли 290 мкл раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУК) в буфере HEPES/EDTA (значение pH буфера составляло 7.75). Окончательные концентрации ТХУК в растворе после добавления составили 2.5 г/л, 1.25 г/л и 0.25 г/л.
Люминесценцию инициировали в случае каждого образца добавлением 100 мкл модифицированного реагента люцифераза-люциферин. Получаемый выход света регистрировался фотометром Biotrace Multilite. Затем кювету извлекали из фотометра и подвергали воздействию вспышки света высокой интенсивности с использованием лампы-фотовспышки, которую устанавливали в приборе нашей собственной конструкции (порядковый номер 005). Затем кювету опять помещали в фотометр и второй раз измеряли свет, испущенный при реакции.
Содержание АТФ в каждой ампуле рассчитывали в предположении, что каждый шаг фотолиза приводит к возникновению 1.15 пикомоля АТФ. Все тесты были проведены дважды.
Полученные результаты см. в конце описания.
Замечание: результаты не скорректированы на несущественный по величине выход света от холостого реагента.
Результаты показывают, что ТХУК в больших концентрациях сильно препятствовала эмиссии света. Оценки содержания АТФ, основанные только на эмиссии света, имели бы большую погрешность. Однако результаты, основанные на фотостандартизации, обладали как воспроизводимостью, так и точностью.
Пример 3. Приготовление стандартных растворов известной концентрации с использованием иммобилизованного АТФ и варьируя количество света.
Иммобилизованный АТФ (Calbiochem, США) растворяли в стерильной деионизованной воде до конечной концентрации в 14,4 мкмол/л. Порции (300 мкл) раствора помещали в чистые одноразовые кюветы, затем облучали от одной до 10 вспышками с применением фотовспышки Hanimex. После фотолиза растворы анализировали с помощью добавления 100 мкл реагента люцифераза/люциферин (реагент Biotrace MLX, Biotrace plc, Великобритания). Испускаемый свет измеряли с помощью фотометра Biotrace Multilite, который интегрировал световой сигнал в течение 10 секунд после задержки в 2 секунды.
Результаты представлены на фиг. 2.
Результаты на фиг. 2 показывают, что "калибровочная кривая" может быть построена этим способом. Кривая аналогична той, которая могла бы быть получена путем использования пипетки для приготовления одинаковых объемов стандартных растворов АТФ с различными концентрациями в различных кюветах. Описанный способ фотостандартизации позволил получить тот же результат с существенной экономией усилий оператора. Способ также по своей природе не требует вторжения.
Пример 4. Демонстрация фосфоресценции кюветы.
Различные типы кювет, включая поставленные фирмой Lumac bv (Landgraaf, Нидерланды) и фирмой Biotrace plc (Bridgend, Великобритания), подвергали воздействию вспышек полихроматического света высокой интенсивности от лампы-фотовспышки, установленной в камере для образца нашей собственной конструкции. После облучения каждую кювету немедленно помещали в камеру для образца в фотометре Biotrace Multilite и полученную эмиссию света (которая была связана с фосфоресценцией материала кюветы) измеряли в течение периода в 100 секунд. Каждый эксперимент повторяли три раза. На фиг. 3 показано уменьшение фосфоресценции кюветы с течением времени.
Результаты на фиг. 3 показывают, что интенсивность фосфоресценции от кювет Lumac заметно больше, чем от кювет Biotrace. Кроме того, временной ход фосфоресценции был одинаковым для кювет одного типа. Эксперименты с использованием антистатической подушки показали, что эмиссия света от кювет не была результатом разряда статического электричества.
Используя различные фильтры для источника света можно минимизировать уровень. Кюветы, полученные от Lumac bv, облучали вспышками света высокой интенсивности, который в некоторых случаях сначала проходил через фильтр, затем кюветы помещали в фотометр Biotrace Multilite. Испускаемый свет измеряли через интервалы времени. Фиг. 4 показывает уменьшение фосфоресценции с течением времени для кювет, облученных фильтрованным светом. Ответные сигналы на фильтрованный свет показывают, что свет в ультрафиолетовой области спектра ответственен за фосфоресценцию кюветы. Ряд материалов изучался с точки зрения фосфоресценции, вызванной нефильтрованным светом. Первоначальная эмиссия света от таких материалов лежала в диапазоне от 30 отн.ед. до 5239 отн.ед. (измерения проводили с 10-секундным интегрированием на фотометре Biotrace Multilite). Эти результаты демонстрируют следующее:
1. Фосфоресценция кювет может приводить к значительной эмиссии света, наблюдаемой от образцов, подвергаемых условиям облучения светом, обычным для фотостандартизационных анализов.
2. Различные типы кювет различаются в своей способности фосфоресцировать под воздействием света высокой интенсивности.
3. Пропускание света через фильтр может минимизировать фосфоресценцию (хотя должное внимание должно быть уделено длине волны света, необходимого для инициирования освобождения аналитического вещества из материала-"иммобилизатора"),
4. Логарифм скорости уменьшения фосфоресценции от таких кювет оказывается линейной функцией времени.
Пример 5. Удаление свободного АТФ из иммобилизованного АТФ с использованием фермента, разрушающего АТФ
Раствор иммобилизованного АТФ (14.3 ммол/л; 10 мкл) добавляли к 1 мл буфера Lumit (HEPES/EDTA/Mg буфер, pH 7.75; Lumac bv), содержащего 5 мкл/мл раствора апиразы. Картофельная апираза была коммерческим препаратом (Somase), полученным от Lumac bv, и ее состав был изменен добавлением 1 мл буфера Lumit к ампуле апиразы. В различные моменты времени 20 мкл этого раствора помещали в чистые одноразовые кюветы фотометра, содержащие 300 мкл стерильной деионизованной воды. Свет, эмиттированный образцом, измеряли с помощью фотометра Biotrace Multilite (Biotrace, Великобритания). Затем кювету извлекали из фотометра и помещали в осветительный прибор нашей собственной конструкции. После облучения одной вспышкой от фотовспышки кювету возвращали в фотометр и эмиссию света измеряли еще раз. Проводили контрольные эксперименты для наблюдения за выходом света от реакций, в которых к образцу иммобилизованного АТФ перед добавлением раствора апиразы добавляли буфер Lumit.
Полученные результаты см. в конце описания.
Замечание: фотометр не способен измерять световые сигналы, превышающие 1000000 отн.ед. Значения, приближающиеся к этому пределу, могут выходить за границы линейности.
Эти результаты показывают, что апиразу можно использовать для удаления загрязняющего АТФ из запасов иммобилизованного АТФ. Различия в результатах могут быть отнесены за счет ошибок измерений при высоких использованных уровнях АТФ.
Пример 6. Стандартизация анализов с использованием высушенного вымораживанием в одноразовых кюветах для образцов клеткообразного материала.
Раствор иммобилизованного АТФ (14.3 ммол/л; 10 мкл) добавляли к 1 мл буфера HEPES/EDTA/Mg, pH 7.75 (буфер Lumit, Lumac bv), и добавляли 5 мл раствора картофельной апиразы. Картофельная апираза была коммерческим препаратом (Somase), полученным от Lumac bv, и ее состав был изменен добавлением 1 мл буфера Lumit к ампуле апиразы. Раствор иммобилизованного АТФ, содержащий апиразу, выдерживали в термостате при 20oC в течение 40 минут, затем разбавляли 1:1 буфером Lumit. Порции (1 мкл) раствора помещали в чистые одноразовые пластиковые кюветы (полученные от Biotrace plc). Эта процедура приводила к появлению в каждой кювете 143 пикомоля иммобилизованного АТФ. Кюветы затем помещали в вакуумную сушилку и высушивались вымораживанием при 55oC под вакуумом в течение двух часов.
После высушивания вымораживанием кюветы испытывали следующим образом. Стерильную деионизованную воду (300 мкл) добавляли в каждую кювету, затем добавляли в каждую кювету 100 мкл реагента люцифераза/люциферин (реагент Biotrace MLX, Biotrace plc). Испускаемый свет регистрировался фотометром Biotrace Multilite, затем освобождался АТФ из присутствующего иммобилизованного АТФ с помощью лампы фотовспышки, содержащейся в приборе, сконструированном в BRF International (порядковый номер 002). Следующие результаты, полученные на кюветах-репликах, см. в конце описания.
АТФ мог также освобождаться из высушенного вымораживанием материала, содержащегося в кювете, с помощью вспышки перед добавлением в кювету любого образца или реагентов. При проведении таких анализов были получены следующие результаты, которые приведены в конце описания.
Эти результаты показывают, что АТФ может быть освобожден из иммобилизованного АТФ даже в присутствии очень малых количеств воды. Таким образом, при желании, могут разрабатываться схемы анализов, в которых АТФ или другие аналитические вещества освобождаются из молекулы-иммобилизатора до перехода к какой-либо жидкой фазе анализа. В некоторых случаях это может быть удобным способом стандартизации некоторых анализов.
Пример 7. Приготовление серий стандартных растворов известной концентрации с использованием иммобилизованной арахидоновой кислоты и варьированием количества света.
Иммобилизованную арахидоновую кислоту (Molecular Probes Inc., USA; продукт N A-7062) растворяли в буфере HEPES/EDTA (pH 7.75) до конечной концентрации в 14.4 мкмол/л. Порции (100 мкл) раствора помещали в чистые одноразовые ампулы, подвергали затем действию от одной до 10 вспышек, даваемых лампой-вспышкой Hanimex. После фотолиза растворы анализировали с использованием любого метода, подходящего для количественного определения арахидоновой кислоты, такого как HPLC, GC/MS, TLC или специальных ферментативных методов.
Таким способом может быть построена "калибровочная кривая", аналогичная полученной созданием одинаковых объемов стандартных растворов с различными концентрациями в отдельных ампулах с помощью пипетки. Описанный фотостандартизационный способ позволяет добиться того же результата при существенной экономии усилий оператора. Способ по своей природе также не требует вторжения.
Пример 8. Приготовление серий стандартных растворов известной концентрации с использованием иммобилизованного пенициллина V и варьированием количества света.
Иммобилизованный пенициллин V (Molecular Probes Inc., США: продукт N P-7061) растворяли в буфере HEPES/EDTA (pH 7.75) до конечной концентрации в 14.4 мкмол/л. Порции (100 мкл) раствора помещали в чистые одноразовые ампулы, подвергали затем действию от одной до 10 вспышек, даваемых лампой-вспышкой Hanimex. После фотолиза растворы анализировали с использованием любого метода, подходящего для количественного определения пенициллина V, например, используя анализ ELISA.
Таким способом может быть построена "калибровочная" кривая, аналогичная полученной созданием одинаковых объемов стандартных растворов с различными концентрациями в отдельных ампулах с помощью пипетки. Способ фотостандартизации, изложенный в настоящем изобретении, позволяет достичь таких же результатов при значительной экономии работы оператора. Способ также не приводит к загрязнению окружающей среды.
Примеры других "иммобилизованных" аналитических веществ, которые можно использовать аналогично примерам 7 и 8, включают "иммобилизованную" аспарагиновую кислоту (Molecular Probes Inc USA: product number A-2505), "иммобилизованный" L-лизин (Molecular Probes Inc USA: product number B-7099), "иммобилизованный" L-эпинефрин (Molecular Probes Inc USA: product number D-7064), "иммобилизованный" L-фенилаланин (Molecular Probes Inc USA: product number D-7093) и "иммобилизованный" D-люциферин (Molecular Probes Inc USA: product number L-7085).
Литература
1. Leaback, DH, Easy-to-use light standards as aids to luminometry, Szalay, A. A. et al (Eds) pp 33-37 - Bioluminescence, Status Report. Proceedings of VII International Symposium of Bioluminescence and Chemiluminescence John Wiley & Sons, Chichester 1993).
2. Jago, P.H., Stanfield, G.Simpson, W.J. & Hammond, J.R.M. 1989. In АТФ Luminescence; Rapid Methods In Microbiology, Society of Applied Bacteriology Technical Series, Vol. 26, Stanley P.E.et al (eds) pp 53-61.
3. Simpson, W.J. and Hammond, J.R.M. 1991. Journ. Chemilumin.& Biolumin. , 6,97-106.
4. Denberg, J. L. & McELroy, W.D. 1978. Arch. Biochem. Biophys. 141, 668-675.
5. Karl, D.M. 1980. Microbiol. Rev. 44, 739-796.
6. Lundin, A, Anson, J & Kau, P АТФ extractants neutralized by cyclodextrins Campbell, A K et al (Eds) pp 399-402 In Bioluminescence and Chemiluminescence, Fundamental and Applied Aspects, Proceedings of the 8th International symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence, John Wiley & Sons, Chichester, 1994.
7. Goldman, Y.E., Hibbard, M.G., McCray, J.A. & Trentham, D.R. 1982, Nature, 300,701-705.
8. McCray, J. A., Herbette, L. Kihara, T. & Trentham, D.R. 1980, Proc. Natl. Acad., Sci., USA, 77, 7237-7241.
Формула изобретения: 1. Способ стандартизации химического анализа путем измерения величины исследуемой в анализе характеристики, связанной с количеством анализируемого вещества, отличающийся тем, что он включает добавление к исследуемому образцу заранее определенного количества фоточувствительного производного анализируемого вещества с последующим измерением величины исследуемой в анализе характеристики, связанной с количеством анализируемого вещества, облучение смеси образец/фоточувствительное производное вспышкой видимого света заранее определенной длительности и интенсивности для освобождения из фоточувствительного производного известного количества анализируемого вещества, повторное измерение величины исследуемой характеристики, расчет изменения в измерениях величины исследуемой характеристики и использование рассчитанного значения в качестве стандарта для определения количества анализируемого вещества, исходно присутствующего в образце.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что не менее одного раза повторяют операции облучения смеси образец/фоточувствительное производное вспышкой видимого света и измерения величины исследуемой характеристики с расчетом изменения в измеренных величинах исследуемой характеристики и использованием рассчитанного значения в качестве стандарта для определения количества анализируемого вещества в образце.
3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что в качестве фоточувствительного производного анализируемого вещества используют иммобилизованную форму этого анализируемого вещества.
4. Способ по п.3, отличающийся тем, что производное анализируемого вещества предварительно обрабатывают для уменьшения загрязнений неиммобилизованными формами производного анализируемого вещества.
5. Способ по любому по пп.1-4, отличающийся тем, что иммобилизованную форму производного анализируемого вещества высушивают вымораживанием на носителе.
6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что он включает дополнительную операцию для компенсации любой фосфоресценции, присущей материалам или оборудованию, используемым в анализе.
7. Способ стандартизации химического анализа путем измерения величины исследуемой в анализе характеристики, связанной с количеством анализируемого вещества, отличающийся тем, что он включает облучение заранее определенного количества фоточувствительного производного анализируемого вещества вспышкой видимого света заранее определенной длительности и интенсивности для освобождения из фоточувствительного производного известного количества анализируемого вещества с последующим измерением величины исследуемой в анализе характеристики, связанной с количеством анализируемого вещества, использование полученного значения в качестве стандарта, с которым сравнивают результаты анализа образца.
8. Способ по п.7, отличающийся тем, что не менее одного раза повторяют операции облучения заранее определенного количества фоточувствительного производного анализируемого вещества вспышкой видимого света заранее определенной длительности и интенсивности и измерения величины исследуемой в анализе характеристики, связанной с количеством анализируемого вещества, с расчетом изменения в измеренных величинах исследуемой характеристики и использованием рассчитанных значений в качестве стандарта, с которым сравнивают результаты анализа образца.
9. Способ по п.7 или 8, отличающийся тем, что в качестве фоточувствительного производного анализируемого вещества используют иммобилизованную форму анализируемого вещества.
10. Способ по любому из пп.7-9, отличающийся тем, что производное анализируемого вещества предварительно обрабатывают для уменьшения загрязнения неиммобилизованными формами производного этого анализируемого вещества.
11. Способ по любому из пп.7-10, отличающийся тем, что иммобилизованное производное анализируемого вещества высушивают вымораживанием на носителе.
12. Способ по любому из пп.7-11, отличающийся тем, что он включает дополнительную операцию для компенсации любой фосфоресценции, присущей материалам или оборудованию, используемым в анализе.
13. Способ стандартизации химического анализа путем смешивания исследуемого образца, содержащего АТФ, с реагентом, содержащим люциферазу-люциферин жука-светлячка, и измерением света, испускаемого полученной смесью, отличающийся тем, что он дополнительно включает предварительное введение заранее определенного количества фоточувствительного производного АТФ в реагент люцифераза-люциферин жука-светлячка, измерение света, вызываемого возникающей реакцией, сопровождающейся люминесценцией, облучение смеси образец/реагент вспышкой видимого света заранее определенной длительности и интенсивности для освобождения из фоточувствительного производного известного количества АТФ, повторное измерение света, вызываемое возникающей реакцией, сопровождающейся люминесценцией, расчет изменения в измерениях эмиссии света, и использование рассчитанного значения в качестве стандарта для определения количества АТФ, исходно присутствующего в образце.
14. Способ по п.13, отличающийся тем, что не менее одного раза повторяют операции облучения смеси образец/реагент вспышкой видимого света заранее определенной длительности и интенсивности и повторного измерения света, испускаемого смесью исследуемого образца с реагентом, с расчетом изменения в измеренных величинах эмиссии света с использованием рассчитанного значения в качестве стандарта для определения количества АТФ, исходно присутствующего в образце.
15. Способ по п.13 или 14, отличающийся тем, что в качестве фоточувствительного производного АТФ используют иммобилизованную форму АТФ.
16. Способ по п.15, отличающийся тем, что в качестве иммобилизованной формы АТФ используют нитрофеноловый эфир АТФ.
17. Способ по любому из пп.13-16, отличающийся тем, что реагент люцифераза-люциферин, содержащий иммобилизованный АТФ, предварительно обрабатывают выдерживанием в термостате при 4oC в течение 8-10 ч для удаления загрязняющих молекул АТФ.
18. Способ по любому из пп.13-16, отличающийся тем, что иммобилизованный АТФ предварительно обрабатывают разрушающим АТФ ферментом для удаления молекул, загрязняющих АТФ.
19. Способ по любому из пп.13-18, отличающийся тем, что он включает дополнительную операцию для компенсации любой фосфоресценции, присущей материалам или оборудованию, используемом в анализе.
20. Способ по любому из пп.13-18, отличающийся тем, что иммобилизованный АТФ высушивают вымораживанием на носителе.
21. Набор для проведения стандартизации АТФ биолюминесцентного анализа, включающий фоточувствительное производное АТФ и реагент люцифераза-люциферин жука-светлячка.
22. Набор по п.21, отличающийся тем, что он дополнительно включает буферный раствор для анализа.
23. Набор по п.21 или 22, отличающийся тем, что он дополнительно включает фотометр и источник света высокой интенсивности.