Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК РАСТЕНИЙ RUBIA CORDIFOLIA L., ПРОДУЦЕНТ АНТРАХИНОНОВ
ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК РАСТЕНИЙ RUBIA CORDIFOLIA L., ПРОДУЦЕНТ АНТРАХИНОНОВ

ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК РАСТЕНИЙ RUBIA CORDIFOLIA L., ПРОДУЦЕНТ АНТРАХИНОНОВ

Патент Российской Федерации
Суть изобретения: Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения ценных биологически активных веществ, антрахинонов, которые являются эффективным средством для лечения почечнокаменной болезни и заболеваний печени. Штамм культивируемых клеток растений Rubia cordifolia L. (марены сердцелистной) получен в Биолого-почвенном институте ДВО РАН и депонирован во Всероссийской коллекции клеточных культур высших растений при Институте физиологии растений РАН под индексом RС-I. Штамм RC-I получен из дикорастущего растения марены сердцелистной, собранного в Анучинском районе Приморского края. Штамм представляет собой каллусную ткань рыхлой консистенции желто-оранжевого цвета. Штамм выращивают в накопительном режиме на агаризованной питательной среде. Штамм RС-I является высокопродуктивным источником антрахиноновых пигментов-муньистина и пурпурина. Среднее содержание пигментов составляет 0,89% от массы сухих клеток. 3 табл.
Поиск по сайту

1. С помощью поисковых систем

   С помощью Google:    

2. Экспресс-поиск по номеру патента


введите номер патента (7 цифр)

3. По номеру патента и году публикации

2000000 ... 2099999   (1994-1997 гг.)

2100000 ... 2199999   (1997-2003 гг.)
Номер патента: 2141525
Класс(ы) патента: C12N5/04, A61K35/78, C12P19/00, C09B61/00
Номер заявки: 98113512/13
Дата подачи заявки: 06.07.1998
Дата публикации: 20.11.1999
Заявитель(и): Биолого-почвенный институт Дальневосточного отделения РАН; Тихоокеанский институт биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН
Автор(ы): Чернодед Г.К.; Булгаков В.П.; Лауве Л.С.; Журавлев Ю.Н.; Мищенко Н.П.; Федореев С.А.; Глазунов В.П.; Денисенко В.А.
Патентообладатель(и): Биолого-почвенный институт Дальневосточного отделения РАН; Тихоокеанский институт биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН
Описание изобретения: Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения ценных биологически активных веществ, в частности антрахинонов, которые являются эффективным средством для лечения почечнокаменной болезни и заболеваний печени. Поиск новых гепатопротекторных веществ и особенно лекарственных веществ, разрушающих и выводящих камни из почек, является актуальной задачей для медицины и фармацевтической промышленности.
Марена сердцелистная Rubia cordifolia L. (синоним: марена пурпурная Rubia purpuria DC.) - растение семейства мареновых (Rubiaceae), произрастает в странах Восточной Азии, Пакистане, на территории России - в Приморском крае. Экстракты из корней марены сердцелистной, содержащие антрахиноны, обладают способностью растворять и удалять камни из почек и мочевого пузыря (Gilani А. Н. , Janbaz К.Н., Zaman М., Lateef A., Suria A., Ahmed H.R. Possible presence of calcium channel blocker(s) in Rubia cordifolia: an indigenous medicinal plant. J. Pak. Med. As- soc. 1994. V. 44. P. 82-85). Известно, что антрахиноны обладают гепато- защитным действием (Gilani А.Н., Janbaz К.Н. Effect of Rubia cordifolia extract on acetaminophen and CCl4-induced hepatotoxicity. Phytotherapy Res. 1995. V. 9. P. 372-375).
Известно, что антрахиноны синтезируются в культурах растительных клеток. Так, пурпурин, ализарин и люцидин вырабатывается культурой корней растения Rubia tinctorum (Sato К., Yamazaki Т., Okuyama Е., Yoshihira К., Shimomura К. Antraquinone production by transformed root culture of Rubia tinctorum: influence of phytohormones and sucrose concentration // Phytochemistry. 1991. V. 30. N 5. P. 1507-1509 (прототип). Известно, что из каллусной культуры растений Cinchona ledgeriana выделено до 15 различных антрахинонов (Wijnsma R., Verpoorte R., Mulder-Krieger Th., Svepdsen A. Antraquinones in callus cultures of Cinchona ledgeriana // Phytochemistry. 1984. V. 23, N 10, P. 1507-1509). Известно, что набор антрахинонов продуцирует культура клеток Morinda citrifolia (Leistner E. Biosynthesis of morindone and alizarin in intact and cell suspension cultures of Morinda citrifolia // Phytochemistry. 1973. V. 12. P. 1669-1674). Однако в силу того, что некоторые антрахиноны обладают мутагенным действием, создание культур, синтезирующих большой набор антрахинонов, нежелательно. Проблема создания клеточного штамма, продуцента антрахинонов, заключается в том, чтобы культура продуцировала определенный набор антрахинонов, не обладающих мутагенным действием.
Задача изобретения - получение нового источника антрахинонов, штамма культивируемых клеток растения Rubia cordifolia L., продуцента антрахинонов.
Штамм получен в Биолого-почвенном институте ДВО РАН и депонирован во Всероссийской коллекции клеточных культур высших растений при Институте физиологии растений РАН под номером ВСКК(ВР) 60. Наименование штамма - RC-1.
Штамм характеризуется следующими признаками.
Родословная штамма: стеблевые апексы дикорастущего растения марены сердцелистной, собранного в Анучинском районе Приморского края. Для получения и культивирования каллусов использовали питательную среду следующего состава, мг/л воды:
NH4NO3 - 350-450
KNO3 - 1500-2300
K2HPO4 - 150-190
CaCl2·6H2O - 600-730
MgSO4·7H2O - 350-390
H3BO4 - 4,2-8,0
MnSO4·4H2O - 15,6-26,7
CuSO4·5H2O - 0,02-0,03
CoCl2·2H2O - 0,02-0,03
ZnSO4·7H2O - 6,0-10,3
Na2MoO4·2H2O - 0,2-0,3
KJ - 0,52-0,90
FeSO4·7H2O - 25,0-30,6
Na2EDTA·2H2O - 33,6-41,0
Мезо-инозит - 80-120
Тиамина гидрохлорид - 0,15-0,25
Никотиновая кислота - 0,4-0,6
Пиридоксина гидрохлорид - 0,4-0,6
6-бензиламинопурин - 0,45-0,55
α- нафтилуксусная кислота - 1,5-2,5
Казеина гидролизат - 40-60
Сахароза - 24000-26000
Агар - 5800-6200
Вода - До 1 л
pH среды 5,6-5,8 до автоклавирования
Число пассажей к моменту паспортизации и депонирования: 20.
Штамм представляет собой каллусную ткань рыхлой консистенции желто-оранжевого цвета. Ростовой индекс и продуктивность по сырой и сухой биомассе представлена в таблице 1. Каллусы выращиваются в накопительном режиме на агаризованной питательной среде.
Стандартные условия культивирования: температура 25±1oC, относительная влажность воздуха (70±10%), освещенность - отсутствует, сосуды для выращивания - колбы Эрленмейера объемом 100 мл, объем питательной среды 30 мл, либо культуральные сосуды объемом 200 мл, содержащие 60 мл питательной среды. Кратность рассева 1:10.
Цитологические характеристики. Ткань представляет собой популяцию, состоящую на 20-86% из клеток меристематического типа округлой, овальной, треугольной и неправильной формы, имеющих средние размеры 81 х 62 мкм и из клеток паренхимного типа (содержание 14-80%) округлой, овальной, вытянутой, подковообразной, треугольной, трапециевидной и неправильной формы, имеющих средние размеры 193 х 103 мкм. Максимум митотической активности наблюдается на 36 сутки культивирования. Митотический индекс составляет 8,8%.
Кариологическая характеристика
Распределение клеток по числу хромосом, % клеток в модальном классе (см. таблицу 1a)
Диплоидный набор хромосом - 38. Маркерных хромосом не отмечено.
Соотношение живых и мертвых клеток, %: живых 25-90, мертвых - 10-75.
Способность к морфогенезу: отсутствует.
Качественная и количественная характеристика биосинтеза вторичных продуктов. Штамм продуцирует пигменты антрахиноновой группы, пурпурин и муньистин. Пурпурин и муньистин не обладают мутагенным действием. Отмечено также присутствие в следовых количествах других пигментов.
Пример. 1 г каллусной ткани штамма RC-1 помещают в культуральные флаконы объемом 200 мл, содержащие 60 мл питательной среды следующего состава, мг/л воды:
NH4NO3 - 400
KNO3 - 1900
K2HPO4 - 170
CaCl2·6H2O - 665
MgSO4·7H2O - 370
H3BO4 - 6,2
MnSO4·4H2O - 22,3
CuSO4·5H2O - 0,025
CoCl2·2H2O - 0,025
ZnSO4·7H2O - 8,6
Na2MoO4·2H2O - 0,25
KJ - 0,83
FeSO4·7H2O - 27,8
Na2EDTA·2H2O - 37,3
Мезо-инозит - 100
Тиамина гидрохлорид - 0,2
Никотиновая кислота - 0,5
Пиридоксина гидрохлорид - 0,5
6-бензиламинопурин - 0,5
α- нафтилуксусная кислота - 2,0
Казеина гидролизат - 100
Сахароза - 25000
Агар - 6000
Вода дистиллированная - До 1 л
(pH среды 5,6 до автоклавирования). Ткань культивируют в течение 30 суток при температуре 25oC, относительной влажности воздуха 70%, в темноте. Затем извлекают из сосудов, высушивают в токе нагретого до 60oC воздуха и экстрагируют трехкратно кипящим метиловым спиртом. Метиловый спирт удаляют под вакуумом. Остаток красно-оранжевого цвета представляет собой неочищенную сумму антрахиноновых пигментов. Колоночной хроматографией на сефадексе LH-20 в системе хлороформ - метанол (10:1) получают фракции двух основных пигментов. После удаления под вакуумом растворителей антрахиноны кристаллизуют из соответствующих растворителей. Структуры полученных пигментов установлены на основании физико-химических свойств и спектральных данных:
Муньистин. C15H8O6. Молекулярная масса 284,22.
Золотистые пластинки (хлороформ), температура плавления 231-233oC.
УФ-спектр (этанол),λ (нм), (lgε): 248 (4,52), 289 (4,30), 424 (3,76).
ИК-спектр (KBr), ν (см-1): 3190, 1698, 1675, 1631, 1587. Масс-спектр m/z, %: 284 M+ (11), 283 [M-1]+, (60), 267 (35), 266 (99), 241 (46), 240 (100), 238 (80), 212 (40), 184 (50). ПМР-спектр (CDCl3): 7,47 (с., 1H, Н-4), 7,84 (м. , 2H, Н-6, Н-7), 8,33 (м., 2H, Н-5, H- 8), 11,44 (шир. с., ОН), 13,13 (с. , ОН), 16,52 (с. , ОН). 13-ЯМР-спектр (DMSO-d6): 107,1, 109,3, 113,6, 126,1, 126,4, 132,5, 133,1, 133,9, 134,3, 134,9 162,3, 163,1, 167,0, 181,4, 184,5.
Пурпурин. C14H8O5. Молекулярная масса 256.21.
Красные кристаллы, т. пл. 262oC.
УФ-спектр (этанол), λ (нм), (lgε): 203 (4,35), 257 (4,46), 296 (3,91) 459 (плечо), 485 (3,85), 521 (плечо). ИК-спектр (CH2Cl2), ν (см-1): 1623, 1588. Масс-спектр m/z, %: 256 M+, (100), 228 (100), 186 (17). ПМР-спектр (CDCl3): 6,83 (с. , 1H, H-3), 7,83 (м., 2H, Н-6, Н-7), 8,35 (м., 2H, Н-5, Н-8), 12,24 (с., ОН), 12,28 (с., ОН). 13-ЯМР-спектр (DMSO-d6): 104,9, 109,6, 112,1, 125,9,126,1, 132,2, 133,1, 133,6, 134,4, 149,2, 156,7, 160,2, 182,7, 186,1.
Количество пурпурина и муньистина, продуцируемое штаммом на протяжении года культивирования, представлено в таблице 2. Среднее содержание этих двух пигментов составило 0,89% от массы сухих клеток. Штамм характеризуется стабильным соотношением муньистина и пурпурина (таблица 2).
Таким образом, использование предложенного штамма марены сердцелистной RC-1 позволяет получить антрахиноновые пигменты биотехнологическим способом.
Формула изобретения: Штамм культивируемых клеток растений Rubia cordifolia L., продуцент антрахинонов.