Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
Патент на изобретение №2456996

(19)

RU

(11)

2456996

(13)

C1

(51) МПК A61K39/00 (2006.01)

C07K14/28 (2006.01)

C12P21/00 (2006.01)

C12R1/63 (2006.01)

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ Статус: по данным на 27.08.2012 - действует Пошлина:

(21), (22) Заявка: 2011123073/10, 07.06.2011

(24) Дата начала отсчета срока действия патента:

07.06.2011

Приоритет(ы):

(22) Дата подачи заявки: 07.06.2011

(45) Опубликовано: 27.07.2012

(56) Список документов, цитированных в отчете о

поиске: SU 1505022 A1, 15.10.1991. RU 2231364 C2, 27.04.2004. RU 2159251 C1, 20.11.2000. UZ 0000002862, 31.10.2005. RU 2401301 C1, 10.10.2010.

Адрес для переписки:

410005, г.Саратов, ул. Университетская, 46, РосНИПЧИ "Микроб"

(72) Автор(ы):

Захарова Татьяна Львовна (RU),

Киреев Михаил Николаевич (RU),

Ливанова Людмила Федоровна (RU),

Заднова Светлана Петровна (RU),

Смирнова Нина Ивановна (RU)

(73) Патентообладатель(и):

Федеральное государственное учреждение здравоохранения "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере зищиты прав потребителей и благополучия человека ("РосНИПЧИ "Микроб") (RU)

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОЧИЩЕННОЙ В-СУБЪЕДИНИЦЫ ХОЛЕРНОГО ТОКСИНА ИЗ РЕКОМБИНАНТНОГО ШТАММА VIBRIO CHOLERAE

(57) Реферат:

Изобретение раскрывает способ получения основного протективного антигена холерного вибриона В-субъединицы холерного токсина. Способ включает в себя осаждение белковой фракции из фильтрата бульонной культуры рекомбинантного штамма не 01 серогруппы Vibrio cholerae KM93 (ГК «Микроб»). Из осажденной белковой фракции выделяют В-субъединицу и очищают ее с помощью трех ступеней колоночной гель-проникающей хроматографии на геле TSK HW-60. Очищенный препарат В-субъединицы применяют для получения антитоксических сывороток, высокоспецифических иммуноглобулинов и диагностических тест-систем, а также в качестве компонента, добавляемого к вакцинным препаратам. Использование изобретения позволит повысить выход высокоочищенного нативного иммуногенного препарата В-субъединицы холерного токсина. 2 ил., 1 табл.

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии и может быть использовано для получения основного протективного антигена холерного вибриона В-субъединицы холерного токсина, применяемого в дальнейшем для получения антитоксических сывороток, высокоспецифических иммуноглобулинов и диагностических тест-систем, а также в качестве компонента, добавляемого к вакцинным препаратам.

Известно, что В-субъединица холерного токсина является основным фактором иммуногенности, обеспечивающим формирование антитоксического иммунитета при холере, что позволяет использовать ее в качестве иммунизирующего агента при создании эффективных профилактических и диагностических препаратов. Современная тенденция развития вакцинопрофилактики характеризуется получением вакцин с химически определенным составом и регулируемой иммуногенностью, новыми повышенными требованиями к безвредности и чистоте антигенных препаратов, предполагающими разработку достаточно совершенных технологических методов их выделения.

Известен способ получения очищенного препарата В-субъединицы, основанный на выделении ее из очищенного холерного токсина с помощью гельфильтрации на сефадексе G-75 (Lai C.Y., Mendez E., Chang D. Chemistry of cholera toxin: the subunit structure/ J.Infect. Dis. - 1976. - V.133. - S23-S30), при котором разделение токсина на субъединицы происходит в кислой среде (рН 3,2) в присутствии мочевины в высокой концентрации, что приводит к денатурации белка и требует последующего ренатурирования и диализа. При выделении В-субъединицы описанным способом происходит частичная утрата ею своих нативных иммуногенных свойств.

Известен способ очистки В-субъединицы с помощью аффинной хроматографии с использованием колонки лизо-GM 1 -ганглиозида (Dertzbaugh M.T., Macrina F.L., Cholera toxin B-subunit gene fusion: Structure and functional analysis of the chimeric protein// Infect. Immun. - 1990. - V.58.N1 - P.70-79), также предусматривающий выделение В-субъединицы из предварительно полученного очищенного холерного токсина, при этом в качестве лиганда в способе используют GM 1- ганглиозиды, имеющие сродство к В-субъединице холерного токсина. Для приготовления GM 1- ганглиозидов, которые химически пришиваются к афинным хроматографическим носителям, требуются высококвалифицированные специалисты-химики.

Вышеописанные способы являются трудоемкими и многоэтапными процессами, требующими наличия дорогостоящих хроматографических сорбентов, реактивов и оборудования. Кроме того, препараты В-субъединицы обладают остаточной токсичностью из-за присутствия в них примесей субъединицы А, это снижает качество получаемых в дальнейшем препаратов.

Наиболее близким к заявляемому способу является получение очищенной В-субъединицы холерного токсина из рекомбинантного штамма Vibrio cholerae (Захарова Т.Л., Ливанова Л.Ф., Заднова С.П., Смирнова Н.И./ Биотехнология, 2003, 5, С.53-56), при котором основная стадия очистки осуществляется с помощью ионообменной хроматографии на фосфоцеллюлозе. Этот метод основан на использовании рекомбинантного штамма - продуцента В-субъединицы, лишенного продукции субъединицы А, штамм выращивают в реакторе методом глубинного культивирования. Затем из фильтрата бульонной культуры осаждают белковую фракцию и выделяют из нее В-субъединицу на колонке с фосфоцеллюлозой - ионообменником, который перед каждым использованием подвергают обработке кислотой, щелочью, промывают водой, уравновешивают буферным раствором, это создает определенные трудности, связанные с затратой материальных средств и времени. Недостатком метода также является то, что только небольшая часть от исходной концентрации В-субъединицы связывается с катионообменником в процессе хроматографии, а большее количество антигена утрачивается.

В связи с вышеизложенным очевидна актуальность разработки более эффективного способа выделения и очистки важнейшего холерного протективного антигена - В-субъединицы холерного токсина.

Задачей изобретения является разработка простого, экономичного и эффективного способа получения высокоочищенного нативного иммуногенного препарата В-субъединицы холерного токсина.

Технический результат заключается в упрощении технологии получения очищенной В-субъединицы, увеличении ее выхода с сохранением нативных иммуногенных свойств.

Технический результат достигается способом получения очищенной В-субъединицы холерного токсина из фильтрата бульонной культуры рекомбинантного штамма холерного вибриона, выращенного методом глубинного культивирования, включающим осаждение белковой фракции с последующим выделением из нее и очисткой В-субъединицы, которую согласно заявляемому изобретению осуществляют с помощью трех ступеней колоночной гель-проникающей хроматографии на геле TSK HW-60.

Новым в заявляемом способе является применение на основном этапе очистки целевого продукта метода гель-проникающей хроматографии на геле TSK HW-60 в три ступени. При использовании указанного метода колонку с гелем используют многократно, промывая после каждого применения буферным раствором. По способу прототипу, при котором на основном этапе очистки применяется метод ионообменной хроматографии, фосфоцеллюлозу снимают с колонки после каждого использования и регенерируют последовательной обработкой растворами щелочи и кислоты с многократным промыванием после каждой стадии дистиллированной водой, далее уравновешивают буферным раствором и вновь вносят на колонку и промывают буфером до достижения точного значения рН. Таким образом, при использовании метода ионообменной хроматографии для очистки В-субъединицы необходимо использовать ряд реактивов и методических приемов, которые не требуются при применении колоночной гельпроникающей хроматографии, что значительно снижает материальные и трудовые затраты при получении очищенного препарата В-субъединицы. Относительная простота исполнения сопровождается другими значительными преимуществами используемого метода. Применение TSK-геля HW-60, обладающего высокой механической стабильностью, обеспечивает высокоскоростное выделение антигена при минимальном разведении образца и полное сохранение нативных свойств В-субъединицы. Опытным путем авторами установлено, что применение трех ступеней очистки указанным методом необходимо и достаточно для того, чтобы обеспечить максимальный выход очищенной В-субъединицы из общей белковой фракции.

Заявляемый способ получения очищенной В-субъединицы холерного токсина из рекомбинантного штамма V.cholerae подробно расписан в примере 1.

В предлагаемом способе получения очищенной В-субъединицы холерного токсина для решения поставленной задачи применяют следующие последовательно сменяющиеся операции. Проводят глубинное культивирование рекомбинантного штамма V.cholerae. В работе был использован штамм не O1 серогруппы V.cholerae KM93, содержащий гибридную плазмиду рIЕМ3 с клонированными генами vctB, детерминирующими синтез В-субъединицы холерного токсина (депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб»). Источником В-субъединицы служит фильтрат бульонной культуры указанного штамма. Из фильтрата бульонной культуры штамма осаждают общую белковую фракцию снижением рН до 4,0 в присутствии 0,25% гексаметафосфата натрия, перемешивая в течение 2 ч при комнатной температуре. Далее отделяют осадок центрифугированием и суспендируют его в 0,1 М фосфатном буфере рН 7,0. Затем полученную суспензию диализуют против 50 объемов 0,007 М фосфатного буфера рН 7,0, в течение 24 ч и удаляют нерастворимые примеси центрифугированием. Полученный препарат подвергают гельпроникающей хроматографии на колонке с TSK-гелем HW-60 в три ступени. Элюцию осуществляют 0,007 М фосфатным буфером рН 7,0, фракционируя по 5 мл. Фракции спектрофотометрировали при 280 нм и анализировали в реакции иммунодиффузии (РИД) по Оухтерлони с антисывороткой к В-субъединице холерного токсина. На первой ступени очистки В-субъединица обнаруживалась в начальной половине второго пика (фиг.1). На второй ступени фракции, содержащие В-субъединицу, объединяли, концентрировали и вновь наносили на колонку. Эту процедуру повторяли до тех пор, пока В-субъединица не сходила с колонки одним самостоятельным пиком. Для этого потребовалось три ступени очистки на TSK-геле HW-60. Полученный целевой продукт диализовали против 0,9% хлорида натрия, разливали по 1 мл в ампулы и лиофильно высушивали. Выход очищенной В-субъединицы от общего количества белка в исходном препарате составил 30% (тогда как у прототипа - 20%).

На фиг.1а) представлены профили элюции первой (В-субъединица обнаруживалась в начале второго пика) и на фиг.1б) - профили третьей (В-субъединица выходила отдельным пиком) ступени очистки. По оси ординат - оптическая плотность при 280 нм, по оси абсцисс - объем элюата в мл.

После каждой ступени очистки препарата чистоту В-субъединицы анализировали методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле, в результате чего выяснили, что трех ступеней очистки достаточно для получения лишенного примесей препарата В-субъединицы холерного токсина.

Препарат, полученный заявляемым способом, обладает следующими свойствами. В полученном препарате содержится 200 мкг/мл белка (по методу Лоури). По данным диск-электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия в конечном целевом продукте обнаруживается одна белковая полоса, идентичная по расположению полосе коммерческой В-субъединицы холерного токсина с молекулярной массой 58 кДа, отсуствуют другие примеси, что является свидетельством гомогенности и чистоты. По титру специфической активности в РИД по Оухтерлони полученный препарат также не отличается от коммерческой В-субъединицы, которая взята в качестве эталона, от В-субъединицы, полученной способом - прототипом, и от В-субъединицы, выделенной ранее из целого токсина методом Lai C.Y. В кожной пробе Крейга на остаточную токсичность очищенная предлагаемым способом В-субъединица, также как и выделенная способом - прототипом, не вызывала образование инфильтрата, что указывает на полное отсутствие в ней фактора кожной проницаемости (таблица).

Пример 2. Оценка иммунологической активности.

Иммунологическая активность очищенной В-субъединицы была подтверждена получением кроличьей антисыворотки. Для этого было проиммунизировано 6 кроликов породы «Шиншилла» весом 2,5 кг. Иммунизацию животных проводили путем введения 200 мкг очищенного препарата В-субъединицы внутрикожно в область спины двукратно с интервалом в один месяц. Антигенность очищенной В-субъединицы холерного токсина определялась путем выявления в сыворотке крови антитоксических антител в РИД по Оухтерлони с очищенным препаратом В-субъединицы холерного токсина. Было установлено, что полоса преципитации образовывалась не только с цельной сывороткой, но и в разведении ее 1:64-1:128. Из этого следует, что очищенная В-субъединица холерного токсина обладает антигенностью, в результате чего была получена антисыворотка, содержащая значительное количество антител, о чем свидетельствует высокий уровень ее активности (1:64-1:128).

Специфичность сыворотки оценивалась в реакции пассивного иммунного гемолиза (РПИГ) на плотной среде. На чашки с синказным агаром методом реплик наносили бактериальные колонии штамма V.cholerae KM93 - продуцента В-субъединицы холерного токсина, и высокотоксигенный штамм V.cholerae 569B (положительные контроли), а также штамма V.cholerae 509, не продуцирующего ни холерный токсин, ни его В-субъединицу, и E.coli M17, которые были использованы в качестве отрицательного контроля. Через 18 часов инкубации чашки с выросшими макроколониями указанных штаммов заливали слоем синказного агара с добавлением полученной антисыворотки. Через 2-3 часа вокруг макроколоний штаммов V.cholerae KM93 и 569B, продуцирующих, соответственно лишь только В-субъединицу холерного токсина, либо В-субъединицу в составе холерного токсина образовывалась зона гемолиза в результате специфического взаимодействия антител и антигена, приводящего в присутствии комплемента к лизису эритроцитов. Вокруг макроколоний V.cholerae 509, не продуцирующего холерный токсин, и макроколоний E.coli M17 эта зона отсутствовала. На основании проведенных данных следует считать, что антисыворотка к В-субъединице холерного токсина специфична, поскольку имеющиеся в ней антитела не взаимодействовали ни с одним другим антигеном, находящимся на поверхности штаммов V.cholerae 509 и E.coli M17, взятых в качестве отрицательного контроля.

Таблица

Способ получения очищенной В-субъединицы холерного токсина из рекомбинантного штамма Vibrio cholera

Свойства препаратов В-субъединицы холерного токсина

В-субъединица холерного токсина, полученная способом - прототипом

В-субъединица холерного токсина, полученная заявляемым способом

Специфическая активность по титру РИД с антисывороткой к В-субъединице холерного токсина

1/64

1/64

Чистота по данным диск-электрофореза в ПААГ

Одна белковая полоса - 58 кДа

Одна белковая полоса - 58 кДа

Остаточная токсичность в кожной пробе Крейга

Инфильтрат отсутствует

Инфильтрат отсутствует

Процент выхода очищенной В-субъединицы от общего количества белка

20%

30%

Формула изобретения

Способ получения очищенной В-субъединицы холерного токсина из фильтрата бульонной культуры рекомбинантного штамма холерного вибриона, выращенного методом глубинного культивирования, включающий осаждение белковой фракции с последующим выделением из нее и очисткой В-субъединицы, отличающийся тем, что очистку В-субъединицы осуществляют с помощью трех ступеней колоночной гель-проникающей хроматографии на геле TSK HW-60.

РИСУНКИ